一种定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量pcr引物和探针及其应用
一种定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量pcr引物和探针及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物病原检测技术领域。更具体地，涉及一种定量检测柑橘半穿刺线 虫的实时荧光定量PCR引物和探针及其应用。
【背景技术】
[0002] 在柑橘根围有多种的植物寄生线虫，但只有少数的几种能对柑橘的产量造成影 响。其中柑橘半穿刺线虫危害最严重的一种线虫，因此，这种线虫也被称为柑橘线虫。柑 橘半穿刺线虫（ira/75·)分布广泛，目前在世界各个主要的柑橘种植 区域都发现该种线虫。刘国坤指出在中国的80%以上的柑橘种植园中都有该种线虫存在。 柑橘半穿刺线虫危害后会引起柑橘的"慢性衰退病"，该种病能造成超过30%以上的产量损 失。
[0003] 柑橘"慢性衰退病"的诊断非常困难，因为该病的症状主要是黄化、萎蔫、植株生长 缓慢、叶片较小和较少、果实较小和产量下降，这些症状与由于缺水或缺乏营养导致的症状 类似。目前，准确的诊断该病的唯一方法就是鉴定土壤中是否存在柑橘半穿刺线虫，以及判 断这种线虫的种群数量是否达到了危害阈值。这就需要进行土壤采样，然后鉴定线虫种类 和测量柑橘半穿刺线虫的数量。目前，柑橘半穿刺线虫的鉴定主要还是通过形态学的方法， 然而通过形态学鉴定半穿刺线虫需要认真的观察线虫的形态和测量线虫线虫不同结构的 大小，这要求鉴定的人员有多年的线虫鉴定经验，专业要求很高。同时由于在土壤中往往会 有多种线虫同时存在，因此在测定柑橘半穿刺线虫的数量时容易造成把其他种类线虫也计 算为柑橘半穿刺线虫。此外，对每一份样品中的线虫数量都通过人力进行计算是一件非常 耗费时间的工作，往往还会造成测量很不准确，不适于同时鉴定和定量大批的样品。
[0004] 刘国坤首先开发出一种通过PCR方法鉴定柑橘半穿刺线虫的方法，但是该方法不 能实现定量检测的要求。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有柑橘半穿刺线虫检测技术的不足，提供一种 准确、快速、特异性好、敏感性强的定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR方法。
[0006] 本发明的目的是提供一种定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR引物和 探针。
[0007] 本发明另一目的是提供上述引物和探针的应用。
[0008] 本发明上述目的通过以下技术方案实现： 本发明公开了一组定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR引物和探针，所述引 物包括上游引物TsFl和下游引物TsR2,上游引物TsFl的序列如SEQ ID NO. 1所示，下游 引物TsR2的序列如SEQ ID NO. 2所示；所述探针为Tsprol，探针Tsprol的序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0009] 其中，所述探针Tsprol的5'端标记有报告荧光基团FAM，3'端标记有淬灭荧光基 团 ECL。
[0010] 上述定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR引物和探针在检测和/或定量 检测柑橘半穿刺线虫方面的应用也在本发明的保护范围之内。
[0011] 上述定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR引物和探针在制备检测和/或 定量检测柑橘半穿刺线虫的试剂或试剂盒方面的应用也应在本发明的保护范围之内。
[0012] 应用时，所述引物的优选退火温度为60°C。
[0013] 本发明还以上述引物和探针建立了一种定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定 量PCR方法。
[0014] PCR反应体系为：I yL DNA，上下游引物TsFl和TsR2各0· 2 μΜ，探针Tsprol 0· 10 μ Μ，10 μ L实时荧光定量PCR预混试剂和余量ddH20,共20 μ L。
[0015] PCR反应条件为：预变性95°C 2min ;95°C 15s，退火温度60°C 15s和72°C 15s，共 30循环； 其中，所述实时荧光定量PCR预混试剂包含有实时荧光定量PCR反应所需要的DNA聚 合酶，缓冲液和dNTP。
[0016] 另外以上述引物和探针构建的柑橘半穿刺线虫的检测试剂盒也在本发明保护范 围之内。
[0017] 优选地，所述试剂盒还包括实时荧光定量PCR反应所需要的DNA聚合酶、缓冲液和 dNTP〇
[0018] 更优选地，所述试剂盒为实时荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒的反应体系和反应 程序同上所述实时荧光定量PCR方法的反应体系和反应程序。
[0019] 上述实时荧光PCR方法或上述检测试剂盒在定量检测柑橘半穿刺线虫方面的应 用也在本发明保护范围之内。
[0020] 在实际应用工作中，利用本发明所设计的引物和探针检测柑橘半穿刺线虫时，大 致工作流程如下：首先提取待测样品的DNA，再利用本发明设计的引物和探针或本发明建 立的实时荧光PCR方法进行检测。对于待测样品DNA没有特殊的要求，按照本领域常规方 法提取得到的样品DNA均可用于检测。
[0021] 本发明具有以下有益效果： 本发明公开了一组定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR引物和探针，不仅能 够在定性检测的同时，对柑橘半穿刺线虫进行定量分析，而且对柑橘半穿刺线虫有非常好 的特异性和灵敏性。
[0022] 利用该引物和探针可以从混合线虫样品中特异性的检测出柑橘半穿刺线虫，所述 混合线虫样品包括任意几种线虫的混合样品。另外，利用该引物和探针还可以从感染混合 线虫的基质样品中特异性的检测出柑橘半穿刺线虫，所述基质样品包括柑橘半穿刺线虫可 以感染或生存的任何介质，如土壤、培养基、苗木组织等等。
[0023] 而且，利用该引物和探针对柑橘半穿刺线虫的检测灵敏性可达到0. 1条线虫的灵 敏度，并且是从上述任意的混合线虫样品或基质中进行检测，灵敏性非常好，有着非常好的 应用前景。
【附图说明】
[0024] 图1为电泳检测不同退火温度对扩增效率的影响。
[0025] 图2为电泳条带亮度分析不同退火温度对扩增效率的影响。
[0026] 图3为定量柑橘半穿刺线虫数量的标准曲线；R2表示相关系数；E表示引物的扩 增效率。Y轴表示的是Ct值，X轴表示的是柑橘半穿刺线虫的数量。
[0027] 图4为样品中混合有不同种类的线虫对检测和定量柑橘半穿刺线虫的影响。图中 Ts表示仅含有1条柑橘半穿刺线虫，Ts+Ce表示含有1条柑橘半穿刺线虫和100条秀丽小 杆线虫，Ts+Pc表示含有1条柑橘半穿刺线虫和100条咖啡短体线虫，Ce、Pc分别表示仅含 有100条秀丽小杆线虫线虫或100条咖啡短体线虫，CK表示加入灭菌水作为模板。Y轴表 示的是荧光值，X轴表示的是循环数。
[0028]
【具体实施方式】
[0029] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明 做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试 剂、方法和设备。
[0030] 除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
[0031] 实施例1弓丨物设计和反应条件优化 1、引物设计 根据NCBI中柑橘半穿刺线虫的ITS DNA序列（基因登录号为：FJ969705、⑶433381 JNl 12270、JNl 12269、⑶433403、⑶433405 )设计 了引物 TsFl 和 TsR2,以及特异探针 Tsprol0
[0032] 引物和探针的序列为 上游引物TsFl的序列如SEQ ID NO. 1所示 5' -GATGCTTTTGCCCCGTTGTG-3' 下游引物TsR2的序列如SEQ ID NO. 2所示 5' -GGTAAGAGCCGAGAAGGACA-3， 探针Tsprol的序列如SEQ ID NO. 3所示 5' -FAM-TCTACCAGGTTGAGCAGAGTCCTT-ECL-3'。
[0033] 2、引物反应条件优化 (1)使用柑橘半穿刺线虫DNA作为模板，分别以不同的退火温度进行PCR扩增，优化上 述引物的退火温度。
[0034] 所述DNA的提取按照本领域常规方法进行。本实施例是采用Subbotin et al. (2008)所述方法进行，具体如下：通过离心法收集线虫或在体视镜下挑取1条线虫，然后加 入 16 yL 灭菌双蒸水，2 yL 10XPCR buffer (无 Mg2+)(购于 Takara)和 2 yL 蛋白 酶K (600 mAnson U/mL)(购于Takara)，接着用针头切割线虫，随后把该混合物置于65°C 中 Ih 和 95°C 中 15min。
[0035] PCR 反应体系为：1 μ L DNA，上下游引物 TsFl 和 TsR2 各 0· 2 μ M，10 μ L Taq Mix 和余量ddH20,共20 yL。
[0036] PCR反应条件为：预变性95°C 2min;95°C 15s，退火温度56°C~66°C 15s和 72°C 15s，共 30 循环。
[0037] (2)将10 yL PCR产物用1%琼脂糖电泳分离，结果如附图1所示，表明该组特异引 物都能扩增出柑橘半穿刺线虫ITS DNA，条带大小与预测相符合。
[0038] 然后使用软件AlphaEaseFC读取条带亮度，确定扩增效率最高的退火温度，结果 如附图2所示，在退火温度为60度时，该组引物的扩增效率最高。
[0039] 实施例2实时荧光PCR的反应体系的特异性 1、根据实施例所设计的引物和探针，建立了一种检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光PCR 方法： PCR反应体系为：IyL DNA，上下游引物TsFl和TsR2各0.2 μΜ，探针Tsprol 0.10 μ Μ，10 μ L实时荧光定量PCR预混试剂和余量ddH20,共20 μ L。
[0040] PCR反应条件为：预变性95°C 2min ;95°C 15s，退火温度60°C 15s和72°C 15s，共 30循环； 其中，所述实时荧光定量PCR预混试剂包括实时荧光定量PCR反应所需要的DNA聚合 酶，缓冲液和dNTP。
[0041] 2、特异性检测 为验证本发明引物和探针，以及实时荧光PCR方法的有效性和特异性，本实施例分别 以多个不同种群的柑橘半穿刺线虫和其他非靶标线虫的DNA为模板，进行检测，所用线虫 的具体种类如表1所示。
[0042] 表1实验中使用的线虫种群及对应的Ct值
结果如表1所示，本发明所述的实时荧光PCR方法能有效的检测不同种群的靶标线虫 (柑橘半穿刺线虫)。并且对非靶标不会有非特异性的扩增，即对非靶标线虫均呈现阴性。 [0043]同时，本发明所述的体系能有效的检测到单条的靶标线虫，满足实际的检测和定 旦电商 里插女O
[0044] 实施例3实时荧光定量PCR反应体系的灵敏性及定量柑橘半穿刺线虫的标准曲 线 在体视镜下挑取100条的柑橘半穿刺线虫，按照上述方法提取DNA，然后对该DNA样品 进行梯度稀释(如表2所示)。
[0045] 表2制作标准曲线使用的DNA样品浓度和对应的Ct值
2、以上述各稀释浓度的DNA样品进行实时荧光PCR扩增，PCR反应体系和条件与实施 例2相同。
[0046] 结果如附图3所示，在扩增0. 1~100条靶标线虫时都呈现良好的线性关系，说明该 体系能准确的定量样品中线虫的数量。
[0047]另外，结果也说明了本发明所述的体系的检测柑橘半穿刺线虫的灵敏性能够达到 到〇. 1条的灵敏度。
[0048] 实施例4混合线虫样品检测 因为从田间分离的土样中经常含有多种不同的线虫，因此，我们还测试了在混合线虫 的样本中能不能准确的检测和定量靶标线虫。
[0049] 1、我们做了三个实验组： (1) 把1条柑橘半穿刺线虫加入到含有100条秀丽小杆线虫(一种在土壤中常见的腐生 线虫）的土样中； (2) 把1条柑橘半穿刺线虫加入到含有100条咖啡短体线虫的土样中； (3) 把1条柑橘半穿刺线虫加入到不含其他线虫的土样中。
[0050] 同时我们还使用了只含有100条秀丽小杆线虫和只含有100条咖啡短体线虫的样 品作为对照。
[0051] 2、对分别对上述三个实验组进行实时荧光PCR扩增，测试本发明体系的扩增效率 是否会受到非靶标线虫的影响。
[0052] 结果显示，在含有100条秀丽小杆线虫或咖啡短体线虫的样本中，本发明所述的 方法仍然能准确的检测并定量1条的柑橘半穿刺线虫（附图4所示)，这说明本发明所述的 实时荧光PCR方法能准确地同时检测和定量样品中靶标线虫(柑橘半穿刺线虫）的数量，而 且不受其他非靶标线虫的影响。
[0053] 实施例5田间土壤样品的检测 1、从田间土壤样品中检测并定量柑橘半穿刺线虫的数量，分别从阳江6个不同的柑橘 园，以及佛闪、阳山和湖南的柑橘园采集到柑橘根围土壤样品9份。
[0054] (1)把获得的9份土样，取100克经过贝曼漏斗法分离和显微镜鉴定，确定有两份 土样中含有柑橘半穿刺线虫(见表3,显微镜法确定结果是4号和5号样品含有柑橘半穿刺 线虫)。
[0055] (2)另外把上述9份土样，各取1克使用PowerSoil? DNA提取试剂盒（PowerSoil? DNA Isolation Kit，购自 MO BIO Laboratories，Inc.)提取 DNA，然后使用 PowerClean ? DNA 纯化试剂盒（PowerClean? DNA Clean-up Kit，购自 MO BIO Laboratories，Inc.)纯化 上述获得的DNA，最后定容至20 μ L，再使用本发明上述实时荧光PCR方法进行鉴定和定量 检测。
[0056] 2、结果如表3所示 表3
结果显示，显微镜法显示阳性的样品，本发明的实时荧光定量PCR方法能更快速的检 测出来，并进行定量。
[0057] 同时，对于1、2、3、6、7号样品柑橘半穿刺线虫的数量太少或已经死亡，显微镜法 没有办法鉴定出来。这不仅说明了本发明的实时荧光定量PCR方法的灵敏度高，而且能够 避免因采集的样品中线虫的存活情况对检测结果的影响，对于实际工作中柑橘半穿刺线虫 的早期检测和预防具有重要的意义。
【主权项】
1. 一组定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR引物和探针，其特征在于，所述 引物包括上游引物TsFl和下游引物TsR2,上游引物TsFl的序列如SEQ ID NO. 1所示，下游 引物TsR2的序列如SEQ ID NO. 2所示；所述探针为Tsprol，探针Tsprol的序列如SEQ ID NO. 3所示。2. 根据权利要求1所述实时荧光定量PCR引物和探针，其特征在于，所述探针Tsprol 的5'端标记有报告荧光基团FAM，3'端标记有淬灭荧光基团ECL。3. 权利要求1所述定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR引物和探针在检测 和/或定量检测柑橘半穿刺线虫方面的应用。4. 权利要求1所述定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR引物和探针在制备 检测和/或定量检测柑橘半穿刺线虫的试剂或试剂盒方面的应用。5. -种定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，PCR反应所 用的引物和探针为权利要求1所述引物和探针。6. 根据权利要求5所述实时荧光定量PCR方法，其特征在于，PCR反应体系为：lyL DNA，上下游引物TsFl和TsR2各0. 2yM，探针Tsprol0. 10yM，10yL实时荧光定量 PCR预混试剂和余量CldH2O，共20yL; PCR反应条件为：预变性95°C2min;95°C15s，退火温度60°C15s和72°C15s，共30 循环； 其中，所述实时荧光定量PCR预混试剂包含有实时荧光定量PCR反应所需要的DNA聚 合酶，缓冲液和dNTP。7. -种柑橘半穿刺线虫的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有权利要求1所 述引物和探针。8. 根据权利要求7所述检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括实时荧光定量 PCR反应所需要的DNA聚合酶、缓冲液和dNTP。9. 根据权利要求7所述检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为实时荧光PCR检测试 剂盒，该试剂盒的反应体系和反应程序同权利要求6所述。10. 权利要求5所述实时荧光PCR方法或权利要求7所述检测试剂盒在定量检测柑橘 半穿刺线虫方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了一组定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR引物和探针及其应用。所述引物包括上游引物TsF1和下游引物TsR2，序列分别如SEQ ID NO.1～2所示；所述探针为Tspro1，探针Tspro1的序列如SEQ ID NO.3所示。利用上述引物和探针建立的实时荧光定量PCR方法不仅能够特异的从混合线虫样品或基质中检测并定量柑橘半穿刺线虫，而且检测灵敏性可达到单条线虫的灵敏度，对实际应用工作，如检验检疫工作，有着重要的推广应用价值。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894248
【申请号】CN201510269940
【发明人】卓侃, 廖金铃, 林柏荣, 王宏洪
【申请人】华南农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月25日
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物病原检测技术领域。更具体地，涉及一种定量检测柑橘半穿刺线 虫的实时荧光定量PCR引物和探针及其应用。
【背景技术】
[0002] 在柑橘根围有多种的植物寄生线虫，但只有少数的几种能对柑橘的产量造成影 响。其中柑橘半穿刺线虫危害最严重的一种线虫，因此，这种线虫也被称为柑橘线虫。柑 橘半穿刺线虫（ira/75·)分布广泛，目前在世界各个主要的柑橘种植 区域都发现该种线虫。刘国坤指出在中国的80%以上的柑橘种植园中都有该种线虫存在。 柑橘半穿刺线虫危害后会引起柑橘的"慢性衰退病"，该种病能造成超过30%以上的产量损 失。
[0003] 柑橘"慢性衰退病"的诊断非常困难，因为该病的症状主要是黄化、萎蔫、植株生长 缓慢、叶片较小和较少、果实较小和产量下降，这些症状与由于缺水或缺乏营养导致的症状 类似。目前，准确的诊断该病的唯一方法就是鉴定土壤中是否存在柑橘半穿刺线虫，以及判 断这种线虫的种群数量是否达到了危害阈值。这就需要进行土壤采样，然后鉴定线虫种类 和测量柑橘半穿刺线虫的数量。目前，柑橘半穿刺线虫的鉴定主要还是通过形态学的方法， 然而通过形态学鉴定半穿刺线虫需要认真的观察线虫的形态和测量线虫线虫不同结构的 大小，这要求鉴定的人员有多年的线虫鉴定经验，专业要求很高。同时由于在土壤中往往会 有多种线虫同时存在，因此在测定柑橘半穿刺线虫的数量时容易造成把其他种类线虫也计 算为柑橘半穿刺线虫。此外，对每一份样品中的线虫数量都通过人力进行计算是一件非常 耗费时间的工作，往往还会造成测量很不准确，不适于同时鉴定和定量大批的样品。
[0004] 刘国坤首先开发出一种通过PCR方法鉴定柑橘半穿刺线虫的方法，但是该方法不 能实现定量检测的要求。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有柑橘半穿刺线虫检测技术的不足，提供一种 准确、快速、特异性好、敏感性强的定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR方法。
[0006] 本发明的目的是提供一种定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR引物和 探针。
[0007] 本发明另一目的是提供上述引物和探针的应用。
[0008] 本发明上述目的通过以下技术方案实现： 本发明公开了一组定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR引物和探针，所述引 物包括上游引物TsFl和下游引物TsR2,上游引物TsFl的序列如SEQ ID NO. 1所示，下游 引物TsR2的序列如SEQ ID NO. 2所示；所述探针为Tsprol，探针Tsprol的序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0009] 其中，所述探针Tsprol的5'端标记有报告荧光基团FAM，3'端标记有淬灭荧光基 团 ECL。
[0010] 上述定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR引物和探针在检测和/或定量 检测柑橘半穿刺线虫方面的应用也在本发明的保护范围之内。
[0011] 上述定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR引物和探针在制备检测和/或 定量检测柑橘半穿刺线虫的试剂或试剂盒方面的应用也应在本发明的保护范围之内。
[0012] 应用时，所述引物的优选退火温度为60°C。
[0013] 本发明还以上述引物和探针建立了一种定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定 量PCR方法。
[0014] PCR反应体系为：I yL DNA，上下游引物TsFl和TsR2各0· 2 μΜ，探针Tsprol 0· 10 μ Μ，10 μ L实时荧光定量PCR预混试剂和余量ddH20,共20 μ L。
[0015] PCR反应条件为：预变性95°C 2min ;95°C 15s，退火温度60°C 15s和72°C 15s，共 30循环； 其中，所述实时荧光定量PCR预混试剂包含有实时荧光定量PCR反应所需要的DNA聚 合酶，缓冲液和dNTP。
[0016] 另外以上述引物和探针构建的柑橘半穿刺线虫的检测试剂盒也在本发明保护范 围之内。
[0017] 优选地，所述试剂盒还包括实时荧光定量PCR反应所需要的DNA聚合酶、缓冲液和 dNTP〇
[0018] 更优选地，所述试剂盒为实时荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒的反应体系和反应 程序同上所述实时荧光定量PCR方法的反应体系和反应程序。
[0019] 上述实时荧光PCR方法或上述检测试剂盒在定量检测柑橘半穿刺线虫方面的应 用也在本发明保护范围之内。
[0020] 在实际应用工作中，利用本发明所设计的引物和探针检测柑橘半穿刺线虫时，大 致工作流程如下：首先提取待测样品的DNA，再利用本发明设计的引物和探针或本发明建 立的实时荧光PCR方法进行检测。对于待测样品DNA没有特殊的要求，按照本领域常规方 法提取得到的样品DNA均可用于检测。
[0021] 本发明具有以下有益效果： 本发明公开了一组定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR引物和探针，不仅能 够在定性检测的同时，对柑橘半穿刺线虫进行定量分析，而且对柑橘半穿刺线虫有非常好 的特异性和灵敏性。
[0022] 利用该引物和探针可以从混合线虫样品中特异性的检测出柑橘半穿刺线虫，所述 混合线虫样品包括任意几种线虫的混合样品。另外，利用该引物和探针还可以从感染混合 线虫的基质样品中特异性的检测出柑橘半穿刺线虫，所述基质样品包括柑橘半穿刺线虫可 以感染或生存的任何介质，如土壤、培养基、苗木组织等等。
[0023] 而且，利用该引物和探针对柑橘半穿刺线虫的检测灵敏性可达到0. 1条线虫的灵 敏度，并且是从上述任意的混合线虫样品或基质中进行检测，灵敏性非常好，有着非常好的 应用前景。
【附图说明】
[0024] 图1为电泳检测不同退火温度对扩增效率的影响。
[0025] 图2为电泳条带亮度分析不同退火温度对扩增效率的影响。
[0026] 图3为定量柑橘半穿刺线虫数量的标准曲线；R2表示相关系数；E表示引物的扩 增效率。Y轴表示的是Ct值，X轴表示的是柑橘半穿刺线虫的数量。
[0027] 图4为样品中混合有不同种类的线虫对检测和定量柑橘半穿刺线虫的影响。图中 Ts表示仅含有1条柑橘半穿刺线虫，Ts+Ce表示含有1条柑橘半穿刺线虫和100条秀丽小 杆线虫，Ts+Pc表示含有1条柑橘半穿刺线虫和100条咖啡短体线虫，Ce、Pc分别表示仅含 有100条秀丽小杆线虫线虫或100条咖啡短体线虫，CK表示加入灭菌水作为模板。Y轴表 示的是荧光值，X轴表示的是循环数。
[0028]
【具体实施方式】
[0029] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明 做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试 剂、方法和设备。
[0030] 除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
[0031] 实施例1弓丨物设计和反应条件优化 1、引物设计 根据NCBI中柑橘半穿刺线虫的ITS DNA序列（基因登录号为：FJ969705、⑶433381 JNl 12270、JNl 12269、⑶433403、⑶433405 )设计 了引物 TsFl 和 TsR2,以及特异探针 Tsprol0
[0032] 引物和探针的序列为 上游引物TsFl的序列如SEQ ID NO. 1所示 5' -GATGCTTTTGCCCCGTTGTG-3' 下游引物TsR2的序列如SEQ ID NO. 2所示 5' -GGTAAGAGCCGAGAAGGACA-3， 探针Tsprol的序列如SEQ ID NO. 3所示 5' -FAM-TCTACCAGGTTGAGCAGAGTCCTT-ECL-3'。
[0033] 2、引物反应条件优化 (1)使用柑橘半穿刺线虫DNA作为模板，分别以不同的退火温度进行PCR扩增，优化上 述引物的退火温度。
[0034] 所述DNA的提取按照本领域常规方法进行。本实施例是采用Subbotin et al. (2008)所述方法进行，具体如下：通过离心法收集线虫或在体视镜下挑取1条线虫，然后加 入 16 yL 灭菌双蒸水，2 yL 10XPCR buffer (无 Mg2+)(购于 Takara)和 2 yL 蛋白 酶K (600 mAnson U/mL)(购于Takara)，接着用针头切割线虫，随后把该混合物置于65°C 中 Ih 和 95°C 中 15min。
[0035] PCR 反应体系为：1 μ L DNA，上下游引物 TsFl 和 TsR2 各 0· 2 μ M，10 μ L Taq Mix 和余量ddH20,共20 yL。
[0036] PCR反应条件为：预变性95°C 2min;95°C 15s，退火温度56°C~66°C 15s和 72°C 15s，共 30 循环。
[0037] (2)将10 yL PCR产物用1%琼脂糖电泳分离，结果如附图1所示，表明该组特异引 物都能扩增出柑橘半穿刺线虫ITS DNA，条带大小与预测相符合。
[0038] 然后使用软件AlphaEaseFC读取条带亮度，确定扩增效率最高的退火温度，结果 如附图2所示，在退火温度为60度时，该组引物的扩增效率最高。
[0039] 实施例2实时荧光PCR的反应体系的特异性 1、根据实施例所设计的引物和探针，建立了一种检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光PCR 方法： PCR反应体系为：IyL DNA，上下游引物TsFl和TsR2各0.2 μΜ，探针Tsprol 0.10 μ Μ，10 μ L实时荧光定量PCR预混试剂和余量ddH20,共20 μ L。
[0040] PCR反应条件为：预变性95°C 2min ;95°C 15s，退火温度60°C 15s和72°C 15s，共 30循环； 其中，所述实时荧光定量PCR预混试剂包括实时荧光定量PCR反应所需要的DNA聚合 酶，缓冲液和dNTP。
[0041] 2、特异性检测 为验证本发明引物和探针，以及实时荧光PCR方法的有效性和特异性，本实施例分别 以多个不同种群的柑橘半穿刺线虫和其他非靶标线虫的DNA为模板，进行检测，所用线虫 的具体种类如表1所示。
[0042] 表1实验中使用的线虫种群及对应的Ct值
结果如表1所示，本发明所述的实时荧光PCR方法能有效的检测不同种群的靶标线虫 (柑橘半穿刺线虫)。并且对非靶标不会有非特异性的扩增，即对非靶标线虫均呈现阴性。 [0043]同时，本发明所述的体系能有效的检测到单条的靶标线虫，满足实际的检测和定 旦电商 里插女O
[0044] 实施例3实时荧光定量PCR反应体系的灵敏性及定量柑橘半穿刺线虫的标准曲 线 在体视镜下挑取100条的柑橘半穿刺线虫，按照上述方法提取DNA，然后对该DNA样品 进行梯度稀释(如表2所示)。
[0045] 表2制作标准曲线使用的DNA样品浓度和对应的Ct值
2、以上述各稀释浓度的DNA样品进行实时荧光PCR扩增，PCR反应体系和条件与实施 例2相同。
[0046] 结果如附图3所示，在扩增0. 1~100条靶标线虫时都呈现良好的线性关系，说明该 体系能准确的定量样品中线虫的数量。
[0047]另外，结果也说明了本发明所述的体系的检测柑橘半穿刺线虫的灵敏性能够达到 到〇. 1条的灵敏度。
[0048] 实施例4混合线虫样品检测 因为从田间分离的土样中经常含有多种不同的线虫，因此，我们还测试了在混合线虫 的样本中能不能准确的检测和定量靶标线虫。
[0049] 1、我们做了三个实验组： (1) 把1条柑橘半穿刺线虫加入到含有100条秀丽小杆线虫(一种在土壤中常见的腐生 线虫）的土样中； (2) 把1条柑橘半穿刺线虫加入到含有100条咖啡短体线虫的土样中； (3) 把1条柑橘半穿刺线虫加入到不含其他线虫的土样中。
[0050] 同时我们还使用了只含有100条秀丽小杆线虫和只含有100条咖啡短体线虫的样 品作为对照。
[0051] 2、对分别对上述三个实验组进行实时荧光PCR扩增，测试本发明体系的扩增效率 是否会受到非靶标线虫的影响。
[0052] 结果显示，在含有100条秀丽小杆线虫或咖啡短体线虫的样本中，本发明所述的 方法仍然能准确的检测并定量1条的柑橘半穿刺线虫（附图4所示)，这说明本发明所述的 实时荧光PCR方法能准确地同时检测和定量样品中靶标线虫(柑橘半穿刺线虫）的数量，而 且不受其他非靶标线虫的影响。
[0053] 实施例5田间土壤样品的检测 1、从田间土壤样品中检测并定量柑橘半穿刺线虫的数量，分别从阳江6个不同的柑橘 园，以及佛闪、阳山和湖南的柑橘园采集到柑橘根围土壤样品9份。
[0054] (1)把获得的9份土样，取100克经过贝曼漏斗法分离和显微镜鉴定，确定有两份 土样中含有柑橘半穿刺线虫(见表3,显微镜法确定结果是4号和5号样品含有柑橘半穿刺 线虫)。
[0055] (2)另外把上述9份土样，各取1克使用PowerSoil? DNA提取试剂盒（PowerSoil? DNA Isolation Kit，购自 MO BIO Laboratories，Inc.)提取 DNA，然后使用 PowerClean ? DNA 纯化试剂盒（PowerClean? DNA Clean-up Kit，购自 MO BIO Laboratories，Inc.)纯化 上述获得的DNA，最后定容至20 μ L，再使用本发明上述实时荧光PCR方法进行鉴定和定量 检测。
[0056] 2、结果如表3所示 表3
结果显示，显微镜法显示阳性的样品，本发明的实时荧光定量PCR方法能更快速的检 测出来，并进行定量。
[0057] 同时，对于1、2、3、6、7号样品柑橘半穿刺线虫的数量太少或已经死亡，显微镜法 没有办法鉴定出来。这不仅说明了本发明的实时荧光定量PCR方法的灵敏度高，而且能够 避免因采集的样品中线虫的存活情况对检测结果的影响，对于实际工作中柑橘半穿刺线虫 的早期检测和预防具有重要的意义。
【主权项】
1. 一组定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR引物和探针，其特征在于，所述 引物包括上游引物TsFl和下游引物TsR2,上游引物TsFl的序列如SEQ ID NO. 1所示，下游 引物TsR2的序列如SEQ ID NO. 2所示；所述探针为Tsprol，探针Tsprol的序列如SEQ ID NO. 3所示。2. 根据权利要求1所述实时荧光定量PCR引物和探针，其特征在于，所述探针Tsprol 的5'端标记有报告荧光基团FAM，3'端标记有淬灭荧光基团ECL。3. 权利要求1所述定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR引物和探针在检测 和/或定量检测柑橘半穿刺线虫方面的应用。4. 权利要求1所述定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR引物和探针在制备 检测和/或定量检测柑橘半穿刺线虫的试剂或试剂盒方面的应用。5. -种定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，PCR反应所 用的引物和探针为权利要求1所述引物和探针。6. 根据权利要求5所述实时荧光定量PCR方法，其特征在于，PCR反应体系为：lyL DNA，上下游引物TsFl和TsR2各0. 2yM，探针Tsprol0. 10yM，10yL实时荧光定量 PCR预混试剂和余量CldH2O，共20yL; PCR反应条件为：预变性95°C2min;95°C15s，退火温度60°C15s和72°C15s，共30 循环； 其中，所述实时荧光定量PCR预混试剂包含有实时荧光定量PCR反应所需要的DNA聚 合酶，缓冲液和dNTP。7. -种柑橘半穿刺线虫的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有权利要求1所 述引物和探针。8. 根据权利要求7所述检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括实时荧光定量 PCR反应所需要的DNA聚合酶、缓冲液和dNTP。9. 根据权利要求7所述检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为实时荧光PCR检测试 剂盒，该试剂盒的反应体系和反应程序同权利要求6所述。10. 权利要求5所述实时荧光PCR方法或权利要求7所述检测试剂盒在定量检测柑橘 半穿刺线虫方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了一组定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR引物和探针及其应用。所述引物包括上游引物TsF1和下游引物TsR2，序列分别如SEQ ID NO.1～2所示；所述探针为Tspro1，探针Tspro1的序列如SEQ ID NO.3所示。利用上述引物和探针建立的实时荧光定量PCR方法不仅能够特异的从混合线虫样品或基质中检测并定量柑橘半穿刺线虫，而且检测灵敏性可达到单条线虫的灵敏度，对实际应用工作，如检验检疫工作，有着重要的推广应用价值。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894248
【申请号】CN201510269940
【发明人】卓侃, 廖金铃, 林柏荣, 王宏洪
【申请人】华南农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月25日
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