质粒型载体、基因启动子活性的检测方法、及分析试剂盒的制作方法
质粒型载体、基因启动子活性的检测方法、及分析试剂盒的制作方法
【专利说明】质粒型载体、基因启动子活性的检测方法、及分析试剂盒
[0001] 本申请是申请号为201210248486. 1、申请日为2012年7月18日的同名申请的分 案申请。
[0002] 【相关申请的交叉引用】
[0003] 本申请基于2011年8月25日提交的在先日本专利申请No. 2011-183896,并要求 其优先权，其全部内容通过引用并入本文。 【技术领域】
[0004] 本实施方式涉及质粒型载体、基因启动子活性的检测方法、及分析试剂盒。 【【背景技术】】
[0005] 人基因组的碱基序列被确定以来，以基因组信息作为基础的疾病的新的诊断法的 开发被期待。例如，由基于基因组的碱基序列信息的基因解析，发现了以癌为首的多种疾病 关联基因。这些的疾病关联基因或疾病关联蛋白质作为癌等的疾病的诊断用生物标记物 (bio-marker)而被关注。但是，由生物标记物检测的诊断由于在疾病的早期得不到必然充 分的生物标记物的表达等的原因，得不到稳定的结果是现状。
[0006] 疾病的早期诊断，即便从治愈率的升高或患者的负担轻减的方面来看，也对今后 的医疗不可或缺。作为早期诊断的一种方法，可举出检测在疾病的早期表达的基因的启动 子活性的变化的方法。通过基因启动子的活性变化，基因的表达概率被控制。基因启动子 的活性相比疾病关联基因或疾病关联蛋白质的表达更早期被观察到。
[0007] 作为检测细胞内的基因启动子的活性的方法，可举出报告子基因分析（reporter gene assay)。报告子基因分析是将连结用于可视化启动子的活性的报告子基因的表达盒 整合到所述启动子之下游的报告子载体导入被检细胞而基于报告子蛋白质的活性定量化 所述启动子的活性的方法。作为报告子基因，采用萤光素酶基因或半乳糖苷酶基因、荧 光蛋白质基因等。
[0008] 但是，例如，在疾病早期，基因启动子的活性变化而处于前疾病化的状态的细胞是 极其少数。为诊断采集的血液或组织中含所述细胞的概率说不上高。因此，需求在疾病的 早期诊断等，高灵敏度的检测技术。
[0009] 现在，作为高灵敏度的报告子基因分析，报告了由基因启动子和荧光蛋白质整合 到病毒（Virus)的基因组的病毒型报告子载体的方法。在此报告子基因分析中，通过在感 染病毒载体的宿主细胞之内部增殖所述病毒载体，增加荧光蛋白质的表达量，使报告子基 因分析高灵敏度化。但是，病毒型报告子载体在向宿主细胞的所述载体的导入中利用病毒 的感染能力。因此，有病毒型报告子载体感染操作者的危险性。从而，病毒型报告子载体的 操作不简便，安全性成为课题。
[0010] 另一方面，质粒型报告子载体相比病毒型报告子载体更操作简便，并且也不具有 感染性而安全性高。使用质粒型报告子载体的报告子基因分析也有很多报告。期待向疾病 的早期诊断的质粒型报告子载体的适用。但是，质粒型载体与病毒型报告子载体不同，在宿 主细胞之内部不增殖，因此其检测灵敏度有问题。
[0011]【现有技术文献】
[0012] 【非专利文献 l】KojimaT.、JCU2009 年、第 119 卷、P3172-81 【
【发明内容】
】
[0013] 【发明要解决的技术课题】
[0014] 实施方式的目的是提供可以高灵敏度检测基因启动子的活性的质粒型载体、基因 启动子的检测方法、及分析试剂盒。
[0015] 【解决课题的技术方案】
[0016] 本实施方式中涉及的质粒型载体具备：基因启动子；以及第1基因，其编码配置在 上述基因启动子之下游的，用于可视化上述基因启动子的活性的报告子蛋白质；以及第2 基因，其编码配置在上述基因启动子之下游的复制起始蛋白质；以及内部核糖体结合序列， 其配置在上述第1基因和上述第2基因之间；以及转录终止信号序列，其编码用于终止上 述第1基因和上述第2基因的转录的信号；以及复制起始序列，其被上述复制起始蛋白质识 别。
[0017] 【发明效果】
[0018] 以高灵敏度检测基因启动子的活性。 【【附图说明】】
[0019] 图1是示本实施方式中涉及的质粒型载体的结构的模式图。
[0020] 图2是示使用图1的质粒型载体的，基因启动子活性的检测方法（报告子基因分 析）的全过程的图。
[0021] 图3是示本实施方式中涉及的质粒型载体pCMV-Luc-IRES-LT的制备方法的典型 流程的模式图。
[0022] 图4A是示本实施方式的实施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT的结构的模式图。
[0023] 图4B是示本实施方式的实施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT-E107K的结构的模式 图。
[0024] 图4C是示本实施方式的实施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT-D402E的结构的模式 图。
[0025] 图5是示本实施方式中涉及的阴性对照用的载体pCMV-Luc的制备方法的典型流 程的模式图。
[0026] 图6是示本实施方式的实施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV-Luc中的LT 蛋白质的表达量的检测结果的图。
[0027] 图7A是示本实施方式的实施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV-Luc的拷贝 数的比较结果的图，是示pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV-Luc的溴化乙锭染色照片的图。
[0028] 图7B是示本实施方式的实施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV-Luc的拷贝 数的比较结果的图，是示用于pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV-Luc的拷贝数的比较的图。
[0029] 图8是示本实施方式的实施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV-Luc的报告子 蛋白质的发光信号的检测结果的图。
[0030] 图9是示本实施方式的实施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT和 pCMV-Luc-IRES-LT-E107K和 pCMV-Luc-IRES-LT-D402E 的对 pCMV-Luc 的报告子蛋白质的信 号强度的比较结果的图。
[0031] 图10是示使用以往例中涉及的非扩增型的报告子载体的，基因启动子活性的检 测方法的全过程的图。
[0032] 【符号说明】
[0033] 1…质粒型载体、10···基因启动子、21···报告子基因、23···内部核糖体结合序列 (IRES)、25···复制起始蛋白质基因、27···转录终止信号序列、30···复制起始序列
[0034] 【实施方式】
[0035] 本实施方式中涉及的质粒型载体含：基因启动子、第1基因、第2基因、内部核糖 体结合序列、转录终止信号序列、及复制起始序列。第1基因编码配置在基因启动子之下游 的，用于可视化基因启动子的活性的报告子蛋白质。第2基因编码配置在基因启动子之下 游的复制起始蛋白质。内部核糖体结合序列配置在第1基因和第2基因之间。转录终止信 号序列编码用于终止第1基因和第2基因的转录的信号。复制起始序列被复制起始蛋白质 识别。
[0036] 以下，参照【附图说明】本实施方式中涉及的质粒型载体、基因启动子的检测方法、及 分析试剂盒。
[0037] 本实施方式中涉及的质粒型载体是通过检测对象的基因启动子在活化的宿主细 胞中特异性地自身扩增来增强检测信号的质粒型的报告子载体。
[0038] 【质粒型载体的结构】
[0039] 图1是示作为本实施方式中涉及的自身扩增型报告子载体的质粒型载体1的结 构的模式图。如图1所示，本实施方式中涉及的质粒型载体1有成为检测对象的基因启动 子10。在成为检测对象的基因启动子10之下游，配置有用于转录及翻译的碱基序列20。 碱基序列20含：报告子基因21、内部核糖体结合序列（IRES :internal ribosome entry site) 23、复制起始蛋白质基因25和转录终止信号序列27。在报告子基因21和复制起始蛋 白质基因25之间配置有IRES23。复制起始蛋白质基因25之下游配置有转录终止信号序列 27。另外，质粒型载体1在通过报告子基因21或复制起始蛋白质基因25的侧的基因启动 子10和转录终止信号序列27之间以外的部位有复制起始序列30。再有，IRES23之上游配 置有报告子基因21，下游配置有复制起始蛋白质基因25,但本实施方式不限于此。例如，在 IRES23之上游配置有复制起始蛋白质基因25,下游配置有报告子基因21也可。此时，报告 子基因21之下游配置有转录终止信号序列27也可。
[0040] 以下，对于质粒型载体1中含有的每种要素进行详细的说明。
[0041] 检测对象的基因启动子10是有RNA聚合酶的结合序列的喊基序列。基因启动子 10活化与RNA聚合酶的结合序列功能性地连结的基因的转录。基因启动子10根据目的使 用任意的基因启动子即可。例如，如疾病的早期诊断是目的，作为基因启动子10,可使用在 疾病的早期活化的任意的疾病关联基因启动子。具体而言，在疾病是癌的情况中，作为基因 启动子10,可利用c-fos或(31^(：、〇)13、〇)44、〇)90、511 &11、药物抗性转运蛋白基因仏8〇6、 MDR)等的基因启动子等。如果环境刺激、例如，有害化学物质、温度、氧化应激的检测是目 的，作为基因启动子10,可使用响应对象的环境刺激而活化的基因启动子。具体而言，在环 境刺激是有害化学物质的情况中，作为基因启动子10,可利用细胞色素 P450的基因启动子 等。再有，基因启动子10含任意的增强子也可。增强子是与基因启动子10连结的碱基序 列。增强子有由基因启动子10增强基因的转录的活化的功能。
[0042] 报告子基因21是编码报告子蛋白质的基因（碱基序列）。报告子基因21有可视 化基因启动子10的活性的作用。作为报告子基因21，可适用在所述技术领域已知的所有的 报告子基因。作为报告子基因21，可简单地测定作为其翻译产物的报告子蛋白质的活性，优 选测定背景低。具体而言，作为报告子基因21，可举出发 光酶基因或，荧光蛋白质基因、发色 酶基因、活性氧生成酶基因、重金属结合蛋白质基因等。报告子基因21可根据报告子蛋白 质的检测装置适宜选择。
[0043] 复制起始蛋白质基因25是编码复制起始蛋白质的基因。复制起始蛋白质是可在 宿主细胞中，在DNA的复制起始中发挥功能的蛋白质。作为复制起始蛋白质，例如，可为来 源于感染宿主细胞而扩增的病毒的蛋白质，可为与宿主细胞相同的动物种的蛋白质、或者 可为与宿主细胞不同的动物种的蛋白质。
[0044] IRES23是用于将作为报告子基因21的翻译产物的报告子蛋白质和作为复制起始 蛋白质基因25的翻译产物的复制起始蛋白质个别地合成可能地将报告子基因21和复制起 始蛋白质基因25转录成单一的mRNA(双顺反子的mRNA)的碱基序列。更具体而言，IRES23 是在哺乳类细胞中，不依赖mRNA的5 '末端帽结构，在mRNA之内部与核糖体结合而开始蛋白 质的翻译的碱基序列。IRES23通过配置在2个基因之间，合成双顺反子的mRNA。即，IRES23 整合到2个基因之间，从而此2个基因编码的2种的蛋白质以1个mRNA被翻译出。例如， 作为 IRES23,可举出脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus，ECMV)的 IRES 等。本 实施方式中涉及的IRES23配置在报告子基因21和复制起始蛋白质基因25之间，将报告子 基因21和复制起始蛋白质基因25连结。从而，由1个双顺反子的mRNA翻译出报告子蛋白 质和复制起始蛋白质。
[0045] 转录终止信号序列27是编码用于终止上游的报告子基因21和复制起始蛋白质基 因25的转录的信号的碱基序列。转录终止信号序列27只要在哺乳动物的基因的转录终止 中发挥功能即可。例如，作为转录终止信号序列27,可举出例如，猿猴病毒40 (Simianvirus 40, SV40)之后期聚（A)附加信号序列、牛生长激素基因的聚（A)附加信号序列等。但是， 本实施方式中涉及的转录终止信号序列27不限于此。只要作为转录终止信号的功能不受 损害，作为转录终止信号序列27,使用这些的基因序列改变的也可。
[0046] 复制起始序列30是被通过复制起始蛋白质基因25的表达而合成的复制起始蛋白 质识别可能的喊基序列。复制起始蛋白质通过识别，结合复制起始序列30而质粒型载体1 的复制开始。复制起始序列30是来源于与复制起始蛋白质的生物种相同的源的也可，来源 于不同的源的也可。
[0047] 例如，向人或猴等的灵长类的细胞导入质粒型载体1时，作为复制起始蛋白质基 因25可使用SV40的大T抗原（LT)基因，作为复制起始序列30可使用SV40的ori序列。 或者，向人或猴等的灵长类的细胞导入质粒型载体1时，作为复制起始蛋白质基因25,可使 用爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr Virus，EBV)的EBNA-I蛋白质，作为复制起始序列 30,可使用EB病毒潜在复制起点（oriP)。另外，向小鼠等的啮齿类的细胞导入质粒型载体 1时，作为复制起始蛋白质基因25,可使用小鼠多瘤病毒（polyomavirus，PyV)的大T抗原 (LT)基因，作为复制起始序列30,可使用PyV核心起点序列。
[0048] 如上所述，本实施方式中涉及的质粒型载体1与报告子基因21和复制起始蛋白质 25和复制起始序列30含在相同的载体内。由此，本实施方式中涉及的质粒型载体1作为自 身扩增型的报告子载体发挥功能。
[0049] 【基因启动子活性的检测】
[0050] 本实施方式中涉及的基因启动子10的活性的检测方法（报告子基因分析）是使 用本实施方式中涉及的质粒型载体（自身扩增型报告子载体）1，检测成为检测对象的基因 启动子10的活性。
[0051] 图2是示使用本实施方式中涉及的质粒型载体的报告子基因分析的全过程的图。
[0052] 如图2所示，首先，将质粒型载体1导入宿主细胞。作为将质粒型载体1导入宿主 细胞的方法，使用已知的细胞工程学方法。例如，作为质粒型载体1的宿主细胞的导入方 法，可使用生物化学方法或物理化学方法。作为生物化学方法，可举出使用阳离子脂质的脂 转染法、使用磁性粒子的磁转染法、及使用氯化钙的方法等。作为物理化学方法，可举出例 如，电穿孔法等。作为质粒型载体1的向宿主细胞的导入方法，不仅可单独使用上述的生物 化学方法或物理化学方法，也可互相组合。例如，组合作为生物化学方法的脂转染法和磁转 染法也可，组合作为生物化学方法的脂转染法和作为物理化学方法的电穿孔法也可。
[0053] 将质粒型载体1导入宿主细胞之后，在宿主细胞可分裂及增殖的培养条件下，将 宿主细胞培养经历任意的期间。此培养条件成为质粒型载体1可扩增的条件。在此培养期 间中，宿主细胞的状态或宿主细胞所在的环境满足基因启动子10固有的活化条件时，基因 启动子10活化。如此，在满足活化条件的宿主细胞（革G细胞）中基因启动子10在活化状 态时，在IRES23中连结的报告子基因21和复制起始蛋白质基因25转录成双顺反子的mRNA 而翻译。通过此转录和翻译，合成报告子蛋白质（测定对象的信号）和复制起始蛋白质。复 制起始蛋白质识别，结合复制起始序列30,募集（recruit)宿主细胞中含有的DNA复制中 涉及的多个蛋白质（DNA复制装置）。由募集的多个蛋白质，在宿主细胞内进行质粒型载体 1的复制。如此，质粒型载体1在宿主细胞内一次一次重复复制，扩增拷贝数。伴随拷贝数 的扩增，由质粒型载体1合成的报告子蛋白质的数也增加。
[0054] 另一方面，宿主细胞不满足基因启动子10的活化条件时，基因启动子10不活化。 在不满足活化条件的宿主细胞（非靶细胞）中报告子基因21和复制起始蛋白质基因25不 转录及翻译。从而，不合成报告子蛋白质和复制起始蛋白质。此时，在非靶细胞中不出测定 信号。由于不合成复制起始蛋白质，所以质粒型载体1不可进行复制。
[0055] 如此，本实施方式中涉及的质粒型载体1限定在满足基因启动子10的活化条件的 宿主细胞（靶细胞）内进行自身扩增。接下来，对于如图10所示的，以往型的质粒型载体 (非扩增型报告子载体）进行考虑。以往型的质粒型载体无复制起始蛋白质基因和复制起 始序列，即便在靶细胞内也不可自身扩增。从而，本实施方式中涉及的质粒型载体1相比以 往型的质粒型载体，可增加靶细胞中的报告子蛋白质、即测定对象的信号。由此，报告子基 因分析的高灵敏度化成为可能。
[0056] 接下来，对于报告子蛋白质的表达量的检测详细地说明。如上所述，作为报告子基 因21，可选择发光酶基因、荧光蛋白质基因、发色酶基因、活性氧生成酶基因、重金属结合蛋 白质基因等。
[0057] 发光酶基因是编码催化发光反应的酶蛋白质的基因。作为发光酶基因，可举出例 如，萤光素酶基因。萤光素酶基因的翻译产物是萤光素酶。萤光素酶使用作为底物之一种 的荧光素进行发光反应。
[0058] 荧光蛋白质基因是编码荧光蛋白质的基因。作为荧光蛋白质基因，可举出例如，蓝 色荧光蛋白质基因、绿色荧光蛋白质基因、红色荧光蛋白质基因。作为蓝色荧光蛋白质基因 的翻译产物的蓝色荧光蛋白质发蓝色的荧光。作为绿色荧光蛋白质基因的翻译产物的绿色 荧光蛋白质发绿色的荧光。作为红色荧光蛋白质基因的翻译产物的红色荧光蛋白质发红色 的焚光。
[0059] 发色酶基因是编码催化发色反应的酶蛋白质的基因。作为发色酶基因，可举出 例如，β-半乳糖苷酶基因。作为β-半乳糖苷酶基因的翻译产物的β-半乳糖苷酶使用 5_溴-4-氯-3-吲哚基-β -D-吡喃半乳糖（X-Gal)或〇-硝基苯基-β -D-吡喃半乳糖 (ONPG)等的底物进行发色反应。
[0060] 发光酶基因、荧光蛋白质基因、及发色酶基因的翻译产物可通过光学检测装置检 测。具体而言，在报告子基因21是萤光素酶基因的情况中，从宿主细胞提取萤光素酶蛋白 质，向提取的萤光素酶蛋白质加底物。通过光度计测定含萤光素酶蛋白质和底物的溶液的 发光强度。在报告子基因是荧光蛋白质基因的情况中，例如，激光照射到宿主细胞。通过激 光的照射，由宿主细胞内的荧光蛋白质发出荧光。通过荧光测定装置测定发出的荧光的强 度。或者，在报告子基因是荧光蛋白质基因的情况中，如以下一样测定荧光的强度也可。首 先，向含从宿主细胞提取的荧光蛋白质的提取液照射激光。通过激光的照射，从提取液中的 荧光蛋白质发生荧光。通过荧光测定装置测定此荧光的强度。在报告子基因是半乳糖 苷酶基因的情况中，提取半乳糖苷酶蛋白质，向提取的半乳糖苷酶蛋白质加底物。 通过吸光度测定装置测定含β-半乳糖苷酶蛋白质和底物的溶液的吸光度。
[0061] 活性氧生成酶基因是编码生成活性氧的酶的基因。作为活性氧生成酶基因，可举 出例如，一氧化氮合成酶基因或黄嘌呤氧化酶基因等。作为一氧化氮合成酶基因的翻译产 物的一氧化氮合成酶和作为黄嘌呤氧化酶基因的翻译产物的黄嘌呤氧化酶生成活性氧。
[0062] 活性氧可用电子自旋共振装置（ESR(electron spin resonance)装置）等检测。 由ESR装置的方法中，活性氧的发生量被直接测定也可，利用特异性的自旋捕获剂测定也 可。利用自旋捕获剂时，首先，活性氧生成酶被自旋捕获剂捕获。然后，由捕获的活性氧生 成酶发生的活性氧的发生量由ESR装置测定。
[0063] 重金属结合蛋白质基因是编码与重金属特异性地结合的蛋白质的基因。与重金属 结合的蛋白质的发生量可通过磁共振成像（MRI :magnetic resonance imaging)装置或正 电子断层摄影（PET :positron emission computed tomography)装置或放射线断层摄影 装置（CT :computed tomography)装置等的图像诊断装置来测定。重金属结合蛋白质的发 生量，例如，如以下一样进行。首先，将可测定的重金属预先加到宿主细胞的培养液中。接 下来，清洗宿主细胞，从宿主细胞提取重金属结合蛋白质。接下来，将提取的重金属结合蛋 白质用与加到培养液的重金属对应的图像诊断装置摄像。图像诊断装置发生与重金属结合 蛋白质相关的图像。图像诊断装置对发生的图像实施图像处理而测定重金属结合蛋白质的 量。再有，重金属结合蛋白质在宿主细胞之内部表 达也可，在宿主细胞之外表面表达也可。
[0064] 作为重金属结合蛋白质基因，例如，在利用编码结合铁或钆或其络合物化合物等 的强磁性金属的蛋白质的基因时，作为图像诊断装置，可为MRI装置等的核磁共振装置。此 时，作为重金属结合蛋白质基因，与上述的络合物化合物等的强磁性金属特异性地结合的 抗体基因或单链抗体基因等也可。具体而言，作为重金属结合蛋白质基因，作为铁结合蛋白 质的铁蛋白或转铁蛋白、或者对钆有结合能的单链抗体是适当的。
[0065] 作为重金属结合蛋白质基因，例如，在利用编码结合锶或铜、锝、镓、或者它们的络 合物化合物等的放射性同位素金属的蛋白质的基因时，作为图像诊断装置，可为PET装置 或CT装置等的放射线测定装置。此时，作为重金属结合蛋白质基因，使用与上述的络合物 化合物等的放射性同位素金属特异性地结合的抗体基因或单链抗体基因也可。
[0066] 如此，根据本实施方式涉及的报告子基因分析，可将从质粒型载体1的报告子蛋 白质的表达量通过根据报告子蛋白质的检测装置来测定。然后，通过利用检测装置的表达 量的测定值和阈值的比较，可检测基因启动子10的活性的有无。例如，当表达量的测定值 相比阈值更大时，作为检测基因启动子10的活性，当表达量的测定值相比阈值更小时，作 为检测不到基因启动子10的活性即可。阈值，根据基因启动子10或报告子基因21、宿主细 胞等而可由使用者任意地设定。
[0067] 如上所述，基因启动子10可根据检测对象任意地选择。例如，在癌的诊断的情况 中，作为基因启动子10，可使用例如，c-fos或c-myc、⑶13、⑶44，⑶90、Snai 1、药物抗性转 运蛋白基因（ABCG、MDR)等的癌关联基因的基因启动子。由此，在癌细胞中质粒型载体1扩 增，报告子蛋白质的表达量增加，所以可以高灵敏度检测宿主细胞中含有的癌细胞。作为 其他例，在环境刺激的检测的情况中，作为基因启动子10,可使用环境特异性的启动子。由 此，通过给宿主细胞化学物质或温度、氧化应激等的所望的环境刺激，质粒型载体1在细胞 内扩增，报告子蛋白质的表达量增加，所以可以高灵敏度检测环境刺激。
[0068] 另外，可作为宿主细胞使用的细胞，可适用例如，来源于含人及猴的灵长类、含小 鼠及大鼠的啮齿类等的细胞。另外，作为这些的细胞，也可适用株化细胞或初代培养细胞。 作为灵长类来源的株化细胞的例，可举出人肝癌来源的Huh-7或H印G2、人血球细胞来源的 Jurkat或HL60、人乳腺癌来源的MCF-7、猴肾脏来源的CV-I、或者这些的亚克隆或基因改变 细胞等。作为啮齿类来源的株化细胞的例，可举出小鼠肝癌来源的Hepa-Ι、小鼠神经芽肿来 源的Neur 〇2a、大鼠褐色细胞肿来源的PC12、或者这些的亚克隆或基因改变细胞等。作为初 代培养细胞的例，可举出肝脏或肺或肾脏等的消化系统、白血球等的循环系统、甲状腺等的 内分泌系统、或者脑或脊髓等的脑神经系统的器官来源的初代培养细胞或组织干细胞等。
[0069] 本实施方式中涉及的报告子基因分析中使用的宿主细胞根据种类选择整合到质 粒型载体1的复制起始蛋白质基因25和复制起始序列30的即可。例如，在复制起始蛋白 质基因25是SV40的LT蛋白质基因，复制起始序列30是SV40ori的情况中，或者在复制起 始蛋白质基因25是EBV的EBNA-I蛋白质，复制起始序列30是EBV的oriP的情况中，作为 宿主细胞，优选人或猴等的灵长类来源的细胞。另外，在复制起始蛋白质基因25是PyV的 LT蛋白质，复制起始序列30是PyV核心起点序列的情况中，作为宿主细胞，优选小鼠等的啮 齿类来源的细胞。
[0070] 如果质粒型载体1和宿主细胞的动物种的组合正确，细胞的种类不特别限定。宿 主细胞是例如，株化细胞或初代培养细胞也可。另外，宿主细胞所来源的组织也不特别限 定。这根据成为检测对象的基因启动子10的种类选择即可。
[0071] 如此，通过使用本实施方式中涉及的质粒型载体1，使提供高灵敏度的遗传启动子 10的活性的检测方法、即高灵敏度的报告子基因分析成为可能。
[0072] 【分析试剂盒】
[0073] 本实施方式中涉及的分析试剂盒在本实施方式中涉及的报告子基因分析中使用。
[0074] 本实施方式中涉及的分析试剂盒有本实施方式中涉及的质粒型载体1和检测试 剂。检测试剂是用于检测细胞内的质粒型载体1中含有的编码报告子蛋白质的报告子基因 21的表达的试剂。另外，本实施方式中涉及的分析试剂盒再有导入试剂或提取试剂也可。 导入试剂是用于将质粒型载体1导入细胞的试剂。提取试剂是用于从细胞提取报告子蛋白 质的试剂。另外，本实施方式中涉及的分析试剂盒含反应容器或培养容器也可。反应容器 是用于进行由检测试剂或导入试剂、提取试剂的反应的容器。培养容器是用于培养导入质 粒型载体1的宿主细胞的容器。再者，本实施方式中涉及的分析试剂盒再含用于培养的培 养基或缓冲液也可。
[0075] 如此，本实施方式中涉及的分析试剂盒，通过在本实施方式中涉及的报告子基因 分析中使用，使得以高灵敏度检测基因启动子10的活性成为可能。 【实施例】
[0076] 【1.质粒型载体的碱基序列】
[0077] 接下来，将人或猴等的灵长类的细胞作为宿主细胞时作为具体例举出，对于本 实施方式中涉及的质粒型载体进行说明。作为此具体例中涉及的质粒型载体1，采用 pCMV-Luc-IRES-LT。作为此pCMV-Luc-IRES-LT的复制起始蛋白质基因25,采用SV40的 LT基因；作为复制起始序列30,采用作为LT基因的翻译产物的LT蛋白质可识别的碱基序 列。另外，作为pCMV-Luc-IRES-LT的基因启动子10,采用巨细胞病毒（Cytomegarovirus) 的启动子；作为报告子基因21，采用萤的萤光素酶基因；作为IRES23,采用脑心肌炎病毒的 IRES ;作为转录终止信号序列27,采用牛生长激素基因的转录终止信号序列。
[0078] SV40的LT基因的碱基序列示于序列表的SEQ ID NO: 1(野生型）。LT基因的碱 基序列，只要不失LT蛋白质的DNA复制起始的功能，无与SEQ ID NO: 1的碱基序列完全地 一致的必要。例如，制备将有提尚DNA复制起始的功能的可能性之任意的变异导入LT基因 的碱基序列的变异型LT基因，将所述基因整合到质粒型载体1也可。这样的变异型LT基 因的碱基序列的例示于序列表的SEQ ID NO: 2 (变异型1)、SEQ ID NO: 3 (变异型2)、及SEQ ID NO:4 (变异型3)。SEQ ID NO: 2涉及的变异型LT基因相比SEQ ID NO: 1涉及的LT基 因，将第319碱基从鸟嘌呤（G)取代为腺嘌呤（A)，将第321碱基从腺嘌呤（A)取代为鸟嘌 呤（G)。由此碱基的取代，作为SEQ ID N0:2涉及的LT基因的翻译产物的LT蛋白质相比 作为SEQ ID NO: 1涉及的LT基因的翻译产物的LT蛋白质，将第107氨基酸从谷氨酸取代 为赖氨酸而成。所述变异是不损害LT蛋白质的DNA复制功能，抑制LT蛋白质与Rb蛋白质 (有癌化抑制功能的蛋白质）的相互作用的变异的例。SEQ ID N0:3涉及的变异型LT基因 相比SEQ ID NO: 1涉及的LT基因，将第1206碱基从胸腺嘧啶⑴取代为鸟嘌呤（G)。由 此碱基的取代，作为SEQ ID N0:3涉及的LT基因的翻译产物的LT蛋白质相比作为SEQ ID NO: 1涉及的LT基因的翻译产物的LT蛋白质，将第402氨基酸从天冬氨酸取代为谷氨酸而 成。所述变异是不损害LT蛋白质的DNA复制功能，抑制LT蛋白质与p53蛋白质（有癌化 抑制功能的蛋白质）的相互作用的变异的例。SEQ ID N0:4是通过向SEQ ID NO: 1涉及的 LT基因导入SEQ ID NO: 2的取代和SEQ ID NO: 3的取代的两方而制备的变异型LT基因。 上述的变异型LT基因，作为一例，只要是有提高DNA复制起始的功能的可能性的变异，取代 的碱基或氨基酸序列的种类或位置无与其中示的变异型LT基因完全地一致的必要。
[0079] 在复制起始蛋白质基因25是SV40的LT基因的情况中，作为复制起始序列30,例 如，SV40的ori序列是适当的。SV40的ori序列之一例示于序列表的SEQ ID N0:5。此碱 基序列，只要不失复制起始的功能，也无与SEQ ID N0:5的碱基序列必然完全地一致的必 要。
[0080] LT基因或，变异型LT基因、SV40的ori序列等的碱基序列可通过已知的基 因工程学方法取得。例如，可向这些取得对象的碱基序列通过利用特异性的引物组的 PCR(polymerase chain reaction:聚合酶链式反应），扩增含取得对象的碱基序列的DNA 而取得。或者，将取得对象的碱基序列的全部人工地合成也可。另外利用已经整合到载体 的也可。
[0081] 另外，作为基因启动子10的巨细胞病毒的启动子之一例不于序列表的SEQ ID NO:6,作为报告子基因21的萤的萤光素酶基因之一例示于序列表的SEQ ID NO: 7,脑心肌炎 病毒的IRES之一例示于序列表的SEQ ID N0:8,牛生长激素基因的转录终止信号序列之一 例示于序列表的SEQ ID N0:9。再有，本实施方式中涉及的质粒型载体1不限于这些的基因 或碱基序列。另外，基因或信号的碱基序列，只要不失其功能，不与上述序列编号所示的碱 基序列完全地一致也可。
[0082] 【2.载体的制备】
[0083] 接下来，对于质粒型载体pCMV-Luc-IRES-LT的制备方法进行说明。图3是示质粒 型载体pCMV-Luc-IRES-LT的制备方法的典型流程的模式图。
[0084] 如图 3 所示，利用载体PGV-B2 (TOYOB-Net)和载体pBSII-IRES 和载体pCMV-LT(w/ oZeo)。载体PGV-B2含萤的萤光素酶基因41。载体pBSII-IRES含脑心肌炎病毒的IRES43。 载体pCMV-LT有CMV(巨细胞病毒）的基因启动子（CMV启动子）45、LT基因47、牛生长激 素基因的转录终止信号序列49、及SV40ori序列51。
[0085] 首先， 用限制酶SacI和限制酶XbaI将PGV-B2消化而切出萤光素酶基因41。同样 地，用限制酶SacI和限制酶XbaI将pBSII-IRES切断。然后，通过将从PGV-B2切出的萤光 素酶基因41用T4连接酶连结到用限制酶SacI和限制酶XbaI切断的pBSII-IRES而制备 pBSII-Luc-IRES〇
[0086] 接下来，将pBSII-Luc-IRES用限制酶PstI切断。将用限制酶PstI切断 的pBSII-Luc-IRES的3'突出末端用T4DNA聚合酶平滑化。平滑化之后，通过将 pBSII-Luc-IRES用限制酶NheI切断，将由萤光素酶基因41和IRES43组成的DNA片段从 pBSII-Luc-IRES切出。另一方面，对pCMV-LT也实施对pBSII-Luc-IRES实施的处理。即，将 pCMV-LT用限制酶PstI切断，将3'突出末端用T4DNA聚合酶平滑化，将pCMV-LT用限制酶 NheI切断。然后，通过将从pBSII-Luc-IRES切出的DNA片段用T4连接酶连结到pCMV-LT，制 备本实施方式中涉及的质粒型载体pCMV-Luc-IRES-LT。由上述的处理，pCMV-Luc-IRES-LT 含：CMV启动子45、萤光素酶基因41、IRES43、LT基因47、转录终止信号序列49、及复制起 始序列51。萤光素酶基因41、IRES43、LT基因47、及转录终止信号序列49整合到CMV启动 子45之下游。
[0087] 另外，再者，作为其他质粒型载体1，制备了将上述的质粒型载体 pCMV-Luc-IRES-LT 的 LT 基因重组为变异型 LT 基因的 pCMV-Luc-IRES-LT-E107K 和 pCMV-Luc-IRES-LT-D402E。图 4A 是示 pCMV-Luc-IRES-LT 的结构的模式图，图 4B 是示 pCMV-Luc-IRES-LT-E107K 的结构的模式图，图 4C 是示 pCMV-Luc-IRES-LT-D402E 的结构的 模式图。如图4A所示，pCMV-Luc-IRES-LT的LT基因47的第319碱基是鸟嘌呤（G)，第321 碱基是腺嘌呤（A)，第1206碱基是胸腺嘧啶（T)。如图4B所示，pCMV-Luc-IRES-LT-E107K 的LT基因47^的第319碱基是腺嘌呤（A)，第321碱基是鸟嘌呤（G)，第1206碱基是胸腺 嘧啶（T)。如图4C所示，pCMV-Luc-IRES-LT-D402E的LT基因47"的第319碱基是鸟嘌 呤（G)，第321碱基是腺嘌呤（A)，第1206碱基是鸟嘌呤（G)。pCMV-Luc-IRES-LT-E107K 是由质粒的位点特异性变异导入法，通过将pCMV-Luc-IRES-LT的LT基因的第319碱基 从鸟嘌呤（G)取代为腺嘌呤（A)，将第321碱基从腺嘌呤（A)取代为鸟嘌呤（G)来制备。 pCMV-Luc-IRES-LT-D402E是由质粒的位点特异性变异导入法，通过将pCMV-Luc-IRES-LT 的LT基因的第1206碱基从胸腺嘧啶（T)取代为鸟嘌呤（G)来制备。
[0088] 以上结束对本实施方式中涉及的质粒型载体1的制备方法的具体例的说明。
[0089] 作为与质粒型载体1、或者重组为变异型LT基因的质粒型载体1 一同导入宿主细 胞的阴性对照用的载体，制备了 pCMV-Luc。图5是示载体pCMV-Luc的制备方法的典型流程 的模式图。如图5所示，pCMV-Luc由pCMV-LT(w/oZeo)和载体PGV-B2制备。pCMV-LT含： CMV启动子61、LT基因63、转录终止信号序列65、及SV40ori序列67。PGV-B2含萤光素酶 基因69。pCMV-Luc可通过重组pCMV-LT的LT基因63和PGV-B2的萤光素酶基因69来制 备。
[0090] 具体而言，首先，用限制酶HindIII和限制酶XbaI将PGV-B2切断而切出萤光素酶 基因69。同样地，用限制酶HindIII和限制酶XbaI将pCMV-LT切断，从pCMV-LT除去LT基 因63。然后，通过将切出的萤光素酶基因69用T4连接酶连结到用限制酶HindIII和限制 酶XbaI切断的pCMV-LT而制备阴性对照用的载体pCMV-Luc。即，pCMV-Luc含：CMV启动子 61、萤光素酶基因69、转录终止信号序列65、及SV40ori序列67。萤光素酶基因69和转录 终止信号序列65整合到CMV启动子61之下游。如此，pCMV-Luc不含复制起始蛋白质基因 和复制起始序列，作为非自身扩增型的报告子载体发挥功能。
[0091] 【3.宿主细胞中的LT蛋白质的表达】
[0092] 向人肝癌细胞（Huh-7)导入 pCMV-Luc-IRES-LT 和 pCMV-Luc。如上所述，pCMV-Luc 作为对pCMV-Luc-IRES-LT的阴性对照用的载体导入。
[0093] 各质粒型载体的向细胞的导入用脂转染（Iipofection)法进行。作为质粒型载体 的导入试剂，使用脂质体2000 (life Technologies公司）。脂转染的操作根据试剂的手册。 简言之，将含悬浮于50 μ 1的Opti-MEM的I. 0 μ 1的阳离子脂质（脂质体2000)、及0. 6 μ g 的 pCMV-Luc-IRES-LT 或(λ 4 μ g 的 pCMV-Luc、及(λ 2 μ g 的 DNA (pUC19)的 50 μ 1 的 Opti-MEM 混合而形成脂质体/载体复合物。脂质体/载体复合物形成后，通过将此复合物液50 μ I 加到在培养板（24孔板）预先培养一晚的培养基（Huh-7 (以8. 0 X IO4细胞/孔接种）），向 细胞导入 pCMV-Luc-IRES-LT。
[0094] 自脂转染48小时后，从培养板去除培养基，将培养基内的细胞悬浮于磷酸缓冲液 (PBS)中。悬浮后，将含磷酸缓冲液和细胞的悬浮液以角速度14, OOOrpm经5分钟用离心分 离器离心分离，从悬浮液回收细胞沉淀。向此细胞沉淀加 SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠-聚丙 烯酰胺凝胶电泳法）用的细胞溶解液，在沸腾水中经5分钟温育（incubate)。其后，用8% 的SDS-PAGE进行电泳。电泳后，用水下型印迹装置将凝胶中的蛋白质转印（印迹：blot)到 PVDF 膜，将 PVDF 膜用 BLOCK ACE (DainipponSumitomoPharma)封闭（blocking)。封闭后， 向第一抗体溶液（500倍稀释的小鼠抗LT单克隆抗体（Clone9E10, Sigma))浸PVDF膜，于 室温经1小时反应。然后，将PVDF膜用Tris缓冲食盐水（TBS)清洗3次。
[0095] 清洗后，将PVDF膜内的LT蛋白质的表达量用ABC试剂盒（Alkaline phosphatase Universal，VECTASTAIN)测定。ABC试剂盒的操作根据销售厂商的手册。PVDF膜（酶标记 第二抗体）用BCIP/NBT(KPL公司）发色。
[0096] 图6是示pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV-Luc中的LT蛋白质的信号的检测结果的图。 如图6所示，在pCMV-Luc中，检测不到LT蛋白质的表达。另一方面，在pCMV-Luc-IRES-LT 中，特异性地检测到LT蛋白质的表达。在图6的例中，LT蛋白质的信号的分子量测定为约 82kDa〇
[0097] 【4.质粒型载体的扩增】
[0098] 通过与上述的3同样的方法，向Huh-7细胞导入同拷贝数的pCMV-Luc-IRES-LT和 pCMV-Luc。自脂转染72小时后，使用Dneasy试剂盒（Qiagen)从细胞提取DNA。DNA的提 取操作根据试剂盒的手册。提取的DNA溶液200 μ 1之中，将I. 0 μ 1作为模板进行PCR，扩 增pCMV-Luc-IRES-LT、或者pCMV-Luc的部分碱基序列。以下示PCR中使用的引物的碱基序 列。
[0099] 正向引物：5 ' -CGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCC-3 '
[0100] 反向引物：5 ' -CCAGCATGCCTGCTATTGTCTTCCC-3 '
[0101] 将PCR反应后的DNA溶液用0. 8 %的琼脂糖凝胶电泳。电泳后，将含DNA溶液的凝 胶用溴化乙锭染色，将染色的凝胶的照片摄影。然后，将在溴化乙锭染色照片描出的条带的 染色强度用图像解析软件（ImageJ)数值化。
[0102] 图7A及图7B示自向细胞导入质粒型载体72小时后的相对pCMV-Luc的 pCMV-Luc-IRES-LT的拷贝数（条带的染色强度）的比较结果。图7A示pCMV-Luc和 pCMV-Luc-IRES-LT 的溴化乙锭染色照片。图 7B 示用于 pCMV-Luc 和 pCMV-Luc-IRES-LT 的拷贝数的比较的图（染色强度比的图）。如图7A所示，可从溴化乙锭染色照片发现， pCMV-Luc-IRES-LT的照片的辉度相比pCMV-Luc更高。从而，pCMV-Luc-IRES-LT的信号强 度相比pCMV-Luc更高。另外，如图7B所示，pCMV-Luc-IRES-LT的信号强度相比pCMV-Luc 更高。从此图可发现，pCMV-Luc-IRES-LT的拷贝数扩增到pCMV-Luc的拷贝数的4. 2倍。
[0103] 【5.报告子基因分析-1-(萤光素酶分析）】
[0104] 通过与上述的3同样的方法，用脂转染法向Huh-7细胞和猴肾癌细胞（CV-I)分别 导入同拷贝数的pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV-Luc，在培养板培养。从脂转染72小时后，从 培养板去除培养基，将各细胞用PBS清洗2次后，添加作为用于从细胞提取萤光素酶（报 告子蛋白质）的提取试剂的细胞溶解液（Pica Gene细胞裂解缓冲液LCβ，TOYOB-Net公 司）。于室温经15分钟将细胞和细胞溶解液的悬浮液温育之后，通过以角速度15, OOOrpm 经5分钟将悬浮液用离心分离器离心分离，从悬浮液去除细胞残渣。然后，向去除细胞残渣 的悬浮液之上清加萤光素酶底物溶液（PicaGeneLT2. 0, TOYOB-Net公司）之后，将添加作为 检测试 剂的萤光素酶底物溶液（荧光素溶液）的上清的发光强度用光度计（MithrasLB940， Berthold公司）测定。
[0105] 图8是示pCMV-Luc和pCMV-Luc-IRES-LT的报告子蛋白质的信号强度的比较结 果的图。如图8所示，在宿主细胞是Huh-7的情况中，相对pCMV-Luc的pCMV-Luc-IRES-LT 的报告子蛋白质的信号强度是约5. 7倍。在宿主细胞是CV-I的情况中，相对pCMV-Luc的 pCMV-Luc-IRES-LT的报告子蛋白质的信号强度是约19. 8倍。如此，本实施方式中涉及的质 粒型载体相比非扩增型的质粒型载体最大可表达约19. 8倍的报告子蛋白质。从而本实施 方式中涉及的报告子基因分析相比以往型的报告子基因分析可以高灵敏度检测基因启动 子的活性。
[0106] 【6.报告子基因分析-2-(萤光素酶分析）】
[0107] 通过与上述的3同样的方法，向猴肾癌细胞（CV-I)通过脂转染法导入同拷贝数的 pCMV-Luc-IRES-LT 和 pCMV-Luc-IRES-LT-E107K 和 pCMV-Luc-IRES-LT-D402E 和 pCMV-Luc， 在培养板上培养。自脂转染72小时后，从培养板去除培养基，将各细胞用PBS清洗2次后， 添加作为用于从细胞提取萤光素酶（报告子蛋白质）的提取试剂的细胞溶解液（PicaGene 细胞裂解缓冲液LC β，TOYOB-Net公司）。于室温经15分钟将细胞和细胞溶解液的悬浮液 温育之后，通过以角速度15, OOOrpm经5分钟将悬浮液用离心分离器离心分离，从悬浮液去 除细胞残渣。然后，向去除细胞残渣的悬浮液的上清加萤光素酶底物溶液（PicaGeneLT2. 0， TOYOB-Net公司）之后，将添加作为检测试剂的萤光素酶底物溶液（荧光素溶液）的上清的 发光强度用光度计（MithrasLB940, Berthold公司）测定。
[0108] 图 9 是示相对 pCMV-Luc-IRES-LT 和 pCMV-Luc-IRES-LT-E107K 和 pCMV-Luc-IRES-LT-D402E的pCMV-Luc的报告子蛋白质的信号强度的比较结果的图。 如图 10 所示，相对 pCMV-Luc 的 pCMV-Luc-IRES-LT 和 pCMV-Luc-IRES-LT-E107K 和 pCMV-Luc-IRES-LT-D402E的报告子蛋白质的信号强度分别是约20倍和约108倍和约177 倍。如此，本实施方式中涉及的质粒型载体，通过使用变异型LT基因，相比非扩增型的质粒 型载体最大可表达约177倍的报告子蛋白质。从而本实施方式中涉及的报告子基因分析相 比以往型的报告子基因分析可以高灵敏度检测基因启动子的活性。
[0109] 【效果】
[0110] 如上所述，本实施方式中涉及的质粒型载体1有：成为检测对象的基因启动子10、 报告子基因21、IRES23、复制起始蛋白质基因25、转录终止信号序列27、及复制起始序列 30。报告子基因21、IRES23、复制起始蛋白质基因25、及转录终止信号序列27配置在基因 启动子10之下游。IRES23将报告子基因21和复制起始蛋白质基因25连结。从而，将质粒 型载体1导入满足基因启动子10的活化条件的宿主细胞时，伴随基因启动子10的活化而 质粒型载体1重复复制，同时每种质粒型载体1中报告子蛋白质被合成。从而，相比以往的 非扩增型报告子载体，本实施方式中涉及的质粒型载体1可增大由基因启动子10的活性所 致而合成的报告子蛋白质的表达量、即，测定信号的表达量。另外，本实施方式中涉及的质 粒型载体1利用质粒，所以相比利用病毒的载体，无感染等的危险性，处理简便。
[0111] 本实施方式中涉及的报告子基因分析是，在伴随质粒型载体1中含有的基因启动 子10的活性而质粒型载体1可扩增的条件下培养宿主细胞，测定在培养的宿主细胞内的质 粒型载体1中含有的报告子基因21的表达量。从而，本实施方式中涉及的报告子基因分析 相比利用以往的非扩增型报告子载体的报告子基因分析，可以高灵敏度检测基因启动子的 活性。
[0112] 另外，本实施方式中涉及的分析试剂盒含：质粒型载体1 ;及用于检测宿主细胞中 的，质粒型载体1中含有的报告子基因21的表达的试剂。从而，本实施方式中涉及的分析 试剂盒相比利用以往的非扩增型报告子载体的分析试剂盒，可以高灵敏度检测基因启动子 的活性。
[0113] 例如，将在疾病早期的前疾病化状态的细胞中特异性地活化的基因启动子10整 合到质粒型载体1时，可相比以往大幅地增大在此前疾病化状态的细胞的每单位个数的报 告子蛋白质的表达量。由表达量的增大，可容易地检测报告子蛋白质的表达，结果可容易地 检测基因启动子10的活性。如此，通过本实施方式，可以高灵敏度检测极微量的病变细胞 的变化。
[0114] 而且，通过本实施方式，可提供可以高灵敏度检测基因启动子的活性的质粒型载 体、基因启动子的检测方法、及分析试剂盒。
[0115] 已描述了特定实施方式，这些实施方式仅以例示的方式提供，且不旨在限制本发 明的范围。本文描述的新实施方式可以各种其他方式实施，此外，可实施本文描述的实施方 式的各种改变而不脱离本发明的精神。随附的权利要求及它们的等同体旨在覆盖此类形式 及修饰，它们落在本发明的范围和精神之内。
【主权项】
1. 不以获得下述细胞的主体的疾病诊断结果或健康状况为直接目的的、基因启动子活 性的体外检测方法，所述方法具备： 将下述的质粒型载体导入细胞， 伴随上述质粒型载体中含有的基因启动子的活性而上述质粒型载体可扩增地，在上述 细胞分裂增殖的条件下培养上述细胞，以及 测定在上述培养的细胞内的，上述质粒型载体中含有的报告子基因的表达量， 所述质粒型载体，其具备： 基因启动子、以及 第1基因，其编码配置在上述基因启动子之下游的，用于可视化上述基因启动子的活 性的报告子蛋白质、以及 第2基因，其编码配置在上述基因启动子之下游的复制起始蛋白质、以及 内部核糖体结合序列，其配置在上述第1基因和上述第2基因之间、以及 转录终止信号序列，其编码用于终止上述第1基因和上述第2基因的转录的信号、以及 复制起始序列，其被上述复制起始蛋白质识别，且 将所述第1基因、第2基因构成双顺反子，由同一所述基因启动子启动，以使报告子基 因和内部核糖体结合序列与复制起始蛋白质基因被转录成单一的mRNA。2. 权利要求1所述的方法，其中上述第1基因是萤光素酶基因、0 -半乳糖苷酶基因、 一氧化氮合成酶基因、黄嘌呤氧化酶基因、蓝色荧光蛋白质基因、绿色荧光蛋白质基因、红 色荧光蛋白质基因、或者重金属结合蛋白质基因。3. 权利要求1所述的方法，其中 上述第2基因是猿猴病毒40的大T抗原基因， 上述复制起始序列是猿猴病毒40的复制起始序列。4. 权利要求3所述的方法，其中上述大T抗原基因是由SEQIDNO: 1所示的碱基序列 组成的大T抗原基因、或者，将有提高DNA复制起始的功能的可能性的任意的变异导入SEQ IDNO: 1所示的碱基序列的变异型的大T抗原基因。5. 权利要求4所述的方法，其中上述变异型的大T抗原基因由SEQIDNO: 2、SEQID N0:3、或者SEQIDN0:4所示的碱基序列组成。6. 权利要求1所述的方法，其中 上述第2基因是爱泼斯坦-巴尔病毒的EBNA-I基因， 上述复制起始序列是爱泼斯坦-巴尔病毒的复制起始序列。7. 权利要求1所述的方法，其中 上述第2基因是小鼠多瘤病毒的大T抗原基因， 上述复制起始序列是小鼠多瘤病毒的复制起始序列。8. 权利要求1所述的方法，其中上述基因启动子是在疾病的早期活化的基因启动子、 或者，响应环境刺激而活化的基因启动子。9. 权利要求1所述的检测方法，其中上述细胞是人或猴来源的细胞。10. 权利要求1所述的检测方法，其中上述细胞是小鼠或大鼠来源的细胞。11. 权利要求1所述的检测方法，其中 上述报告子基因是萤光素酶基因、0 -半乳糖苷酶基因、蓝色荧光蛋白质基因、绿色荧 光蛋白质基因、或者红色荧光蛋白质基因， 上述测定是作为上述表达量，利用光学检测装置测定上述报告子基因的翻译产物的发 光量或荧光量。12. 权利要求1所述的检测方法，其中 上述报告子基因是一氧化氮合成酶基因、或者黄嘌呤氧化酶基因， 上述测定是，作为上述表达量，将由上述报告子基因的翻译产物生成的活性氧量利用 电子自旋共振装置测定。13. 权利要求1所述的检测方法，其中 上述报告子基因是重金属结合蛋白质基因， 上述测定是，作为上述表达量，将与上述报告子基因的翻译产物结合的重金属量利用 磁共振成像装置、核医学诊断装置、或者X射线计算机断层摄影装置测定。14. 权利要求1所述的检测方法，其中上述质粒型载体通过由上述质粒型载体中含有 的第2基因的表达而合成的复制起始蛋白质与上述质粒型载体中含有的复制起始序列结 合而自身扩增。15. 权利要求1所述的检测方法，其中上述细胞是处于在疾病早期的前疾病化状态的 细胞。16. 权利要求1所述的检测方法，其中上述基因启动子可在上述细胞分裂增殖的条件 下具有活性。
【专利摘要】本发明的课题是以高灵敏度检测基因启动子的活性。本实施方式中涉及的质粒型载体含：基因启动子、第1基因、第2基因、内部核糖体结合序列、转录终止信号序列、及复制起始序列。第1基因编码配置在基因启动子之下游的，用于可视化基因启动子的活性的报告子蛋白质。第2基因编码配置在基因启动子之下游的复制起始蛋白质。内部核糖体结合序列配置在第1基因和第2基因之间。转录终止信号序列编码用于终止第1基因和第2基因的转录的信号。复制起始序列被复制起始蛋白质识别。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894249
【申请号】CN201510271625
【发明人】赤星英一, 石原美津子
【申请人】株式会社东芝, 东芝医疗系统株式会社
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2012年7月18日
【公告号】CN102952819A, EP2562258A1, EP2562258B1, US9040294, US20130230872, US20150203853
【专利说明】质粒型载体、基因启动子活性的检测方法、及分析试剂盒
[0001] 本申请是申请号为201210248486. 1、申请日为2012年7月18日的同名申请的分 案申请。
[0002] 【相关申请的交叉引用】
[0003] 本申请基于2011年8月25日提交的在先日本专利申请No. 2011-183896,并要求 其优先权，其全部内容通过引用并入本文。 【技术领域】
[0004] 本实施方式涉及质粒型载体、基因启动子活性的检测方法、及分析试剂盒。 【【背景技术】】
[0005] 人基因组的碱基序列被确定以来，以基因组信息作为基础的疾病的新的诊断法的 开发被期待。例如，由基于基因组的碱基序列信息的基因解析，发现了以癌为首的多种疾病 关联基因。这些的疾病关联基因或疾病关联蛋白质作为癌等的疾病的诊断用生物标记物 (bio-marker)而被关注。但是，由生物标记物检测的诊断由于在疾病的早期得不到必然充 分的生物标记物的表达等的原因，得不到稳定的结果是现状。
[0006] 疾病的早期诊断，即便从治愈率的升高或患者的负担轻减的方面来看，也对今后 的医疗不可或缺。作为早期诊断的一种方法，可举出检测在疾病的早期表达的基因的启动 子活性的变化的方法。通过基因启动子的活性变化，基因的表达概率被控制。基因启动子 的活性相比疾病关联基因或疾病关联蛋白质的表达更早期被观察到。
[0007] 作为检测细胞内的基因启动子的活性的方法，可举出报告子基因分析（reporter gene assay)。报告子基因分析是将连结用于可视化启动子的活性的报告子基因的表达盒 整合到所述启动子之下游的报告子载体导入被检细胞而基于报告子蛋白质的活性定量化 所述启动子的活性的方法。作为报告子基因，采用萤光素酶基因或半乳糖苷酶基因、荧 光蛋白质基因等。
[0008] 但是，例如，在疾病早期，基因启动子的活性变化而处于前疾病化的状态的细胞是 极其少数。为诊断采集的血液或组织中含所述细胞的概率说不上高。因此，需求在疾病的 早期诊断等，高灵敏度的检测技术。
[0009] 现在，作为高灵敏度的报告子基因分析，报告了由基因启动子和荧光蛋白质整合 到病毒（Virus)的基因组的病毒型报告子载体的方法。在此报告子基因分析中，通过在感 染病毒载体的宿主细胞之内部增殖所述病毒载体，增加荧光蛋白质的表达量，使报告子基 因分析高灵敏度化。但是，病毒型报告子载体在向宿主细胞的所述载体的导入中利用病毒 的感染能力。因此，有病毒型报告子载体感染操作者的危险性。从而，病毒型报告子载体的 操作不简便，安全性成为课题。
[0010] 另一方面，质粒型报告子载体相比病毒型报告子载体更操作简便，并且也不具有 感染性而安全性高。使用质粒型报告子载体的报告子基因分析也有很多报告。期待向疾病 的早期诊断的质粒型报告子载体的适用。但是，质粒型载体与病毒型报告子载体不同，在宿 主细胞之内部不增殖，因此其检测灵敏度有问题。
[0011]【现有技术文献】
[0012] 【非专利文献 l】KojimaT.、JCU2009 年、第 119 卷、P3172-81 【
【发明内容】
】
[0013] 【发明要解决的技术课题】
[0014] 实施方式的目的是提供可以高灵敏度检测基因启动子的活性的质粒型载体、基因 启动子的检测方法、及分析试剂盒。
[0015] 【解决课题的技术方案】
[0016] 本实施方式中涉及的质粒型载体具备：基因启动子；以及第1基因，其编码配置在 上述基因启动子之下游的，用于可视化上述基因启动子的活性的报告子蛋白质；以及第2 基因，其编码配置在上述基因启动子之下游的复制起始蛋白质；以及内部核糖体结合序列， 其配置在上述第1基因和上述第2基因之间；以及转录终止信号序列，其编码用于终止上 述第1基因和上述第2基因的转录的信号；以及复制起始序列，其被上述复制起始蛋白质识 别。
[0017] 【发明效果】
[0018] 以高灵敏度检测基因启动子的活性。 【【附图说明】】
[0019] 图1是示本实施方式中涉及的质粒型载体的结构的模式图。
[0020] 图2是示使用图1的质粒型载体的，基因启动子活性的检测方法（报告子基因分 析）的全过程的图。
[0021] 图3是示本实施方式中涉及的质粒型载体pCMV-Luc-IRES-LT的制备方法的典型 流程的模式图。
[0022] 图4A是示本实施方式的实施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT的结构的模式图。
[0023] 图4B是示本实施方式的实施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT-E107K的结构的模式 图。
[0024] 图4C是示本实施方式的实施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT-D402E的结构的模式 图。
[0025] 图5是示本实施方式中涉及的阴性对照用的载体pCMV-Luc的制备方法的典型流 程的模式图。
[0026] 图6是示本实施方式的实施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV-Luc中的LT 蛋白质的表达量的检测结果的图。
[0027] 图7A是示本实施方式的实施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV-Luc的拷贝 数的比较结果的图，是示pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV-Luc的溴化乙锭染色照片的图。
[0028] 图7B是示本实施方式的实施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV-Luc的拷贝 数的比较结果的图，是示用于pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV-Luc的拷贝数的比较的图。
[0029] 图8是示本实施方式的实施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV-Luc的报告子 蛋白质的发光信号的检测结果的图。
[0030] 图9是示本实施方式的实施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT和 pCMV-Luc-IRES-LT-E107K和 pCMV-Luc-IRES-LT-D402E 的对 pCMV-Luc 的报告子蛋白质的信 号强度的比较结果的图。
[0031] 图10是示使用以往例中涉及的非扩增型的报告子载体的，基因启动子活性的检 测方法的全过程的图。
[0032] 【符号说明】
[0033] 1…质粒型载体、10···基因启动子、21···报告子基因、23···内部核糖体结合序列 (IRES)、25···复制起始蛋白质基因、27···转录终止信号序列、30···复制起始序列
[0034] 【实施方式】
[0035] 本实施方式中涉及的质粒型载体含：基因启动子、第1基因、第2基因、内部核糖 体结合序列、转录终止信号序列、及复制起始序列。第1基因编码配置在基因启动子之下游 的，用于可视化基因启动子的活性的报告子蛋白质。第2基因编码配置在基因启动子之下 游的复制起始蛋白质。内部核糖体结合序列配置在第1基因和第2基因之间。转录终止信 号序列编码用于终止第1基因和第2基因的转录的信号。复制起始序列被复制起始蛋白质 识别。
[0036] 以下，参照【附图说明】本实施方式中涉及的质粒型载体、基因启动子的检测方法、及 分析试剂盒。
[0037] 本实施方式中涉及的质粒型载体是通过检测对象的基因启动子在活化的宿主细 胞中特异性地自身扩增来增强检测信号的质粒型的报告子载体。
[0038] 【质粒型载体的结构】
[0039] 图1是示作为本实施方式中涉及的自身扩增型报告子载体的质粒型载体1的结 构的模式图。如图1所示，本实施方式中涉及的质粒型载体1有成为检测对象的基因启动 子10。在成为检测对象的基因启动子10之下游，配置有用于转录及翻译的碱基序列20。 碱基序列20含：报告子基因21、内部核糖体结合序列（IRES :internal ribosome entry site) 23、复制起始蛋白质基因25和转录终止信号序列27。在报告子基因21和复制起始蛋 白质基因25之间配置有IRES23。复制起始蛋白质基因25之下游配置有转录终止信号序列 27。另外，质粒型载体1在通过报告子基因21或复制起始蛋白质基因25的侧的基因启动 子10和转录终止信号序列27之间以外的部位有复制起始序列30。再有，IRES23之上游配 置有报告子基因21，下游配置有复制起始蛋白质基因25,但本实施方式不限于此。例如，在 IRES23之上游配置有复制起始蛋白质基因25,下游配置有报告子基因21也可。此时，报告 子基因21之下游配置有转录终止信号序列27也可。
[0040] 以下，对于质粒型载体1中含有的每种要素进行详细的说明。
[0041] 检测对象的基因启动子10是有RNA聚合酶的结合序列的喊基序列。基因启动子 10活化与RNA聚合酶的结合序列功能性地连结的基因的转录。基因启动子10根据目的使 用任意的基因启动子即可。例如，如疾病的早期诊断是目的，作为基因启动子10,可使用在 疾病的早期活化的任意的疾病关联基因启动子。具体而言，在疾病是癌的情况中，作为基因 启动子10,可利用c-fos或(31^(：、〇)13、〇)44、〇)90、511 &11、药物抗性转运蛋白基因仏8〇6、 MDR)等的基因启动子等。如果环境刺激、例如，有害化学物质、温度、氧化应激的检测是目 的，作为基因启动子10,可使用响应对象的环境刺激而活化的基因启动子。具体而言，在环 境刺激是有害化学物质的情况中，作为基因启动子10,可利用细胞色素 P450的基因启动子 等。再有，基因启动子10含任意的增强子也可。增强子是与基因启动子10连结的碱基序 列。增强子有由基因启动子10增强基因的转录的活化的功能。
[0042] 报告子基因21是编码报告子蛋白质的基因（碱基序列）。报告子基因21有可视 化基因启动子10的活性的作用。作为报告子基因21，可适用在所述技术领域已知的所有的 报告子基因。作为报告子基因21，可简单地测定作为其翻译产物的报告子蛋白质的活性，优 选测定背景低。具体而言，作为报告子基因21，可举出发 光酶基因或，荧光蛋白质基因、发色 酶基因、活性氧生成酶基因、重金属结合蛋白质基因等。报告子基因21可根据报告子蛋白 质的检测装置适宜选择。
[0043] 复制起始蛋白质基因25是编码复制起始蛋白质的基因。复制起始蛋白质是可在 宿主细胞中，在DNA的复制起始中发挥功能的蛋白质。作为复制起始蛋白质，例如，可为来 源于感染宿主细胞而扩增的病毒的蛋白质，可为与宿主细胞相同的动物种的蛋白质、或者 可为与宿主细胞不同的动物种的蛋白质。
[0044] IRES23是用于将作为报告子基因21的翻译产物的报告子蛋白质和作为复制起始 蛋白质基因25的翻译产物的复制起始蛋白质个别地合成可能地将报告子基因21和复制起 始蛋白质基因25转录成单一的mRNA(双顺反子的mRNA)的碱基序列。更具体而言，IRES23 是在哺乳类细胞中，不依赖mRNA的5 '末端帽结构，在mRNA之内部与核糖体结合而开始蛋白 质的翻译的碱基序列。IRES23通过配置在2个基因之间，合成双顺反子的mRNA。即，IRES23 整合到2个基因之间，从而此2个基因编码的2种的蛋白质以1个mRNA被翻译出。例如， 作为 IRES23,可举出脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus，ECMV)的 IRES 等。本 实施方式中涉及的IRES23配置在报告子基因21和复制起始蛋白质基因25之间，将报告子 基因21和复制起始蛋白质基因25连结。从而，由1个双顺反子的mRNA翻译出报告子蛋白 质和复制起始蛋白质。
[0045] 转录终止信号序列27是编码用于终止上游的报告子基因21和复制起始蛋白质基 因25的转录的信号的碱基序列。转录终止信号序列27只要在哺乳动物的基因的转录终止 中发挥功能即可。例如，作为转录终止信号序列27,可举出例如，猿猴病毒40 (Simianvirus 40, SV40)之后期聚（A)附加信号序列、牛生长激素基因的聚（A)附加信号序列等。但是， 本实施方式中涉及的转录终止信号序列27不限于此。只要作为转录终止信号的功能不受 损害，作为转录终止信号序列27,使用这些的基因序列改变的也可。
[0046] 复制起始序列30是被通过复制起始蛋白质基因25的表达而合成的复制起始蛋白 质识别可能的喊基序列。复制起始蛋白质通过识别，结合复制起始序列30而质粒型载体1 的复制开始。复制起始序列30是来源于与复制起始蛋白质的生物种相同的源的也可，来源 于不同的源的也可。
[0047] 例如，向人或猴等的灵长类的细胞导入质粒型载体1时，作为复制起始蛋白质基 因25可使用SV40的大T抗原（LT)基因，作为复制起始序列30可使用SV40的ori序列。 或者，向人或猴等的灵长类的细胞导入质粒型载体1时，作为复制起始蛋白质基因25,可使 用爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr Virus，EBV)的EBNA-I蛋白质，作为复制起始序列 30,可使用EB病毒潜在复制起点（oriP)。另外，向小鼠等的啮齿类的细胞导入质粒型载体 1时，作为复制起始蛋白质基因25,可使用小鼠多瘤病毒（polyomavirus，PyV)的大T抗原 (LT)基因，作为复制起始序列30,可使用PyV核心起点序列。
[0048] 如上所述，本实施方式中涉及的质粒型载体1与报告子基因21和复制起始蛋白质 25和复制起始序列30含在相同的载体内。由此，本实施方式中涉及的质粒型载体1作为自 身扩增型的报告子载体发挥功能。
[0049] 【基因启动子活性的检测】
[0050] 本实施方式中涉及的基因启动子10的活性的检测方法（报告子基因分析）是使 用本实施方式中涉及的质粒型载体（自身扩增型报告子载体）1，检测成为检测对象的基因 启动子10的活性。
[0051] 图2是示使用本实施方式中涉及的质粒型载体的报告子基因分析的全过程的图。
[0052] 如图2所示，首先，将质粒型载体1导入宿主细胞。作为将质粒型载体1导入宿主 细胞的方法，使用已知的细胞工程学方法。例如，作为质粒型载体1的宿主细胞的导入方 法，可使用生物化学方法或物理化学方法。作为生物化学方法，可举出使用阳离子脂质的脂 转染法、使用磁性粒子的磁转染法、及使用氯化钙的方法等。作为物理化学方法，可举出例 如，电穿孔法等。作为质粒型载体1的向宿主细胞的导入方法，不仅可单独使用上述的生物 化学方法或物理化学方法，也可互相组合。例如，组合作为生物化学方法的脂转染法和磁转 染法也可，组合作为生物化学方法的脂转染法和作为物理化学方法的电穿孔法也可。
[0053] 将质粒型载体1导入宿主细胞之后，在宿主细胞可分裂及增殖的培养条件下，将 宿主细胞培养经历任意的期间。此培养条件成为质粒型载体1可扩增的条件。在此培养期 间中，宿主细胞的状态或宿主细胞所在的环境满足基因启动子10固有的活化条件时，基因 启动子10活化。如此，在满足活化条件的宿主细胞（革G细胞）中基因启动子10在活化状 态时，在IRES23中连结的报告子基因21和复制起始蛋白质基因25转录成双顺反子的mRNA 而翻译。通过此转录和翻译，合成报告子蛋白质（测定对象的信号）和复制起始蛋白质。复 制起始蛋白质识别，结合复制起始序列30,募集（recruit)宿主细胞中含有的DNA复制中 涉及的多个蛋白质（DNA复制装置）。由募集的多个蛋白质，在宿主细胞内进行质粒型载体 1的复制。如此，质粒型载体1在宿主细胞内一次一次重复复制，扩增拷贝数。伴随拷贝数 的扩增，由质粒型载体1合成的报告子蛋白质的数也增加。
[0054] 另一方面，宿主细胞不满足基因启动子10的活化条件时，基因启动子10不活化。 在不满足活化条件的宿主细胞（非靶细胞）中报告子基因21和复制起始蛋白质基因25不 转录及翻译。从而，不合成报告子蛋白质和复制起始蛋白质。此时，在非靶细胞中不出测定 信号。由于不合成复制起始蛋白质，所以质粒型载体1不可进行复制。
[0055] 如此，本实施方式中涉及的质粒型载体1限定在满足基因启动子10的活化条件的 宿主细胞（靶细胞）内进行自身扩增。接下来，对于如图10所示的，以往型的质粒型载体 (非扩增型报告子载体）进行考虑。以往型的质粒型载体无复制起始蛋白质基因和复制起 始序列，即便在靶细胞内也不可自身扩增。从而，本实施方式中涉及的质粒型载体1相比以 往型的质粒型载体，可增加靶细胞中的报告子蛋白质、即测定对象的信号。由此，报告子基 因分析的高灵敏度化成为可能。
[0056] 接下来，对于报告子蛋白质的表达量的检测详细地说明。如上所述，作为报告子基 因21，可选择发光酶基因、荧光蛋白质基因、发色酶基因、活性氧生成酶基因、重金属结合蛋 白质基因等。
[0057] 发光酶基因是编码催化发光反应的酶蛋白质的基因。作为发光酶基因，可举出例 如，萤光素酶基因。萤光素酶基因的翻译产物是萤光素酶。萤光素酶使用作为底物之一种 的荧光素进行发光反应。
[0058] 荧光蛋白质基因是编码荧光蛋白质的基因。作为荧光蛋白质基因，可举出例如，蓝 色荧光蛋白质基因、绿色荧光蛋白质基因、红色荧光蛋白质基因。作为蓝色荧光蛋白质基因 的翻译产物的蓝色荧光蛋白质发蓝色的荧光。作为绿色荧光蛋白质基因的翻译产物的绿色 荧光蛋白质发绿色的荧光。作为红色荧光蛋白质基因的翻译产物的红色荧光蛋白质发红色 的焚光。
[0059] 发色酶基因是编码催化发色反应的酶蛋白质的基因。作为发色酶基因，可举出 例如，β-半乳糖苷酶基因。作为β-半乳糖苷酶基因的翻译产物的β-半乳糖苷酶使用 5_溴-4-氯-3-吲哚基-β -D-吡喃半乳糖（X-Gal)或〇-硝基苯基-β -D-吡喃半乳糖 (ONPG)等的底物进行发色反应。
[0060] 发光酶基因、荧光蛋白质基因、及发色酶基因的翻译产物可通过光学检测装置检 测。具体而言，在报告子基因21是萤光素酶基因的情况中，从宿主细胞提取萤光素酶蛋白 质，向提取的萤光素酶蛋白质加底物。通过光度计测定含萤光素酶蛋白质和底物的溶液的 发光强度。在报告子基因是荧光蛋白质基因的情况中，例如，激光照射到宿主细胞。通过激 光的照射，由宿主细胞内的荧光蛋白质发出荧光。通过荧光测定装置测定发出的荧光的强 度。或者，在报告子基因是荧光蛋白质基因的情况中，如以下一样测定荧光的强度也可。首 先，向含从宿主细胞提取的荧光蛋白质的提取液照射激光。通过激光的照射，从提取液中的 荧光蛋白质发生荧光。通过荧光测定装置测定此荧光的强度。在报告子基因是半乳糖 苷酶基因的情况中，提取半乳糖苷酶蛋白质，向提取的半乳糖苷酶蛋白质加底物。 通过吸光度测定装置测定含β-半乳糖苷酶蛋白质和底物的溶液的吸光度。
[0061] 活性氧生成酶基因是编码生成活性氧的酶的基因。作为活性氧生成酶基因，可举 出例如，一氧化氮合成酶基因或黄嘌呤氧化酶基因等。作为一氧化氮合成酶基因的翻译产 物的一氧化氮合成酶和作为黄嘌呤氧化酶基因的翻译产物的黄嘌呤氧化酶生成活性氧。
[0062] 活性氧可用电子自旋共振装置（ESR(electron spin resonance)装置）等检测。 由ESR装置的方法中，活性氧的发生量被直接测定也可，利用特异性的自旋捕获剂测定也 可。利用自旋捕获剂时，首先，活性氧生成酶被自旋捕获剂捕获。然后，由捕获的活性氧生 成酶发生的活性氧的发生量由ESR装置测定。
[0063] 重金属结合蛋白质基因是编码与重金属特异性地结合的蛋白质的基因。与重金属 结合的蛋白质的发生量可通过磁共振成像（MRI :magnetic resonance imaging)装置或正 电子断层摄影（PET :positron emission computed tomography)装置或放射线断层摄影 装置（CT :computed tomography)装置等的图像诊断装置来测定。重金属结合蛋白质的发 生量，例如，如以下一样进行。首先，将可测定的重金属预先加到宿主细胞的培养液中。接 下来，清洗宿主细胞，从宿主细胞提取重金属结合蛋白质。接下来，将提取的重金属结合蛋 白质用与加到培养液的重金属对应的图像诊断装置摄像。图像诊断装置发生与重金属结合 蛋白质相关的图像。图像诊断装置对发生的图像实施图像处理而测定重金属结合蛋白质的 量。再有，重金属结合蛋白质在宿主细胞之内部表 达也可，在宿主细胞之外表面表达也可。
[0064] 作为重金属结合蛋白质基因，例如，在利用编码结合铁或钆或其络合物化合物等 的强磁性金属的蛋白质的基因时，作为图像诊断装置，可为MRI装置等的核磁共振装置。此 时，作为重金属结合蛋白质基因，与上述的络合物化合物等的强磁性金属特异性地结合的 抗体基因或单链抗体基因等也可。具体而言，作为重金属结合蛋白质基因，作为铁结合蛋白 质的铁蛋白或转铁蛋白、或者对钆有结合能的单链抗体是适当的。
[0065] 作为重金属结合蛋白质基因，例如，在利用编码结合锶或铜、锝、镓、或者它们的络 合物化合物等的放射性同位素金属的蛋白质的基因时，作为图像诊断装置，可为PET装置 或CT装置等的放射线测定装置。此时，作为重金属结合蛋白质基因，使用与上述的络合物 化合物等的放射性同位素金属特异性地结合的抗体基因或单链抗体基因也可。
[0066] 如此，根据本实施方式涉及的报告子基因分析，可将从质粒型载体1的报告子蛋 白质的表达量通过根据报告子蛋白质的检测装置来测定。然后，通过利用检测装置的表达 量的测定值和阈值的比较，可检测基因启动子10的活性的有无。例如，当表达量的测定值 相比阈值更大时，作为检测基因启动子10的活性，当表达量的测定值相比阈值更小时，作 为检测不到基因启动子10的活性即可。阈值，根据基因启动子10或报告子基因21、宿主细 胞等而可由使用者任意地设定。
[0067] 如上所述，基因启动子10可根据检测对象任意地选择。例如，在癌的诊断的情况 中，作为基因启动子10，可使用例如，c-fos或c-myc、⑶13、⑶44，⑶90、Snai 1、药物抗性转 运蛋白基因（ABCG、MDR)等的癌关联基因的基因启动子。由此，在癌细胞中质粒型载体1扩 增，报告子蛋白质的表达量增加，所以可以高灵敏度检测宿主细胞中含有的癌细胞。作为 其他例，在环境刺激的检测的情况中，作为基因启动子10,可使用环境特异性的启动子。由 此，通过给宿主细胞化学物质或温度、氧化应激等的所望的环境刺激，质粒型载体1在细胞 内扩增，报告子蛋白质的表达量增加，所以可以高灵敏度检测环境刺激。
[0068] 另外，可作为宿主细胞使用的细胞，可适用例如，来源于含人及猴的灵长类、含小 鼠及大鼠的啮齿类等的细胞。另外，作为这些的细胞，也可适用株化细胞或初代培养细胞。 作为灵长类来源的株化细胞的例，可举出人肝癌来源的Huh-7或H印G2、人血球细胞来源的 Jurkat或HL60、人乳腺癌来源的MCF-7、猴肾脏来源的CV-I、或者这些的亚克隆或基因改变 细胞等。作为啮齿类来源的株化细胞的例，可举出小鼠肝癌来源的Hepa-Ι、小鼠神经芽肿来 源的Neur 〇2a、大鼠褐色细胞肿来源的PC12、或者这些的亚克隆或基因改变细胞等。作为初 代培养细胞的例，可举出肝脏或肺或肾脏等的消化系统、白血球等的循环系统、甲状腺等的 内分泌系统、或者脑或脊髓等的脑神经系统的器官来源的初代培养细胞或组织干细胞等。
[0069] 本实施方式中涉及的报告子基因分析中使用的宿主细胞根据种类选择整合到质 粒型载体1的复制起始蛋白质基因25和复制起始序列30的即可。例如，在复制起始蛋白 质基因25是SV40的LT蛋白质基因，复制起始序列30是SV40ori的情况中，或者在复制起 始蛋白质基因25是EBV的EBNA-I蛋白质，复制起始序列30是EBV的oriP的情况中，作为 宿主细胞，优选人或猴等的灵长类来源的细胞。另外，在复制起始蛋白质基因25是PyV的 LT蛋白质，复制起始序列30是PyV核心起点序列的情况中，作为宿主细胞，优选小鼠等的啮 齿类来源的细胞。
[0070] 如果质粒型载体1和宿主细胞的动物种的组合正确，细胞的种类不特别限定。宿 主细胞是例如，株化细胞或初代培养细胞也可。另外，宿主细胞所来源的组织也不特别限 定。这根据成为检测对象的基因启动子10的种类选择即可。
[0071] 如此，通过使用本实施方式中涉及的质粒型载体1，使提供高灵敏度的遗传启动子 10的活性的检测方法、即高灵敏度的报告子基因分析成为可能。
[0072] 【分析试剂盒】
[0073] 本实施方式中涉及的分析试剂盒在本实施方式中涉及的报告子基因分析中使用。
[0074] 本实施方式中涉及的分析试剂盒有本实施方式中涉及的质粒型载体1和检测试 剂。检测试剂是用于检测细胞内的质粒型载体1中含有的编码报告子蛋白质的报告子基因 21的表达的试剂。另外，本实施方式中涉及的分析试剂盒再有导入试剂或提取试剂也可。 导入试剂是用于将质粒型载体1导入细胞的试剂。提取试剂是用于从细胞提取报告子蛋白 质的试剂。另外，本实施方式中涉及的分析试剂盒含反应容器或培养容器也可。反应容器 是用于进行由检测试剂或导入试剂、提取试剂的反应的容器。培养容器是用于培养导入质 粒型载体1的宿主细胞的容器。再者，本实施方式中涉及的分析试剂盒再含用于培养的培 养基或缓冲液也可。
[0075] 如此，本实施方式中涉及的分析试剂盒，通过在本实施方式中涉及的报告子基因 分析中使用，使得以高灵敏度检测基因启动子10的活性成为可能。 【实施例】
[0076] 【1.质粒型载体的碱基序列】
[0077] 接下来，将人或猴等的灵长类的细胞作为宿主细胞时作为具体例举出，对于本 实施方式中涉及的质粒型载体进行说明。作为此具体例中涉及的质粒型载体1，采用 pCMV-Luc-IRES-LT。作为此pCMV-Luc-IRES-LT的复制起始蛋白质基因25,采用SV40的 LT基因；作为复制起始序列30,采用作为LT基因的翻译产物的LT蛋白质可识别的碱基序 列。另外，作为pCMV-Luc-IRES-LT的基因启动子10,采用巨细胞病毒（Cytomegarovirus) 的启动子；作为报告子基因21，采用萤的萤光素酶基因；作为IRES23,采用脑心肌炎病毒的 IRES ;作为转录终止信号序列27,采用牛生长激素基因的转录终止信号序列。
[0078] SV40的LT基因的碱基序列示于序列表的SEQ ID NO: 1(野生型）。LT基因的碱 基序列，只要不失LT蛋白质的DNA复制起始的功能，无与SEQ ID NO: 1的碱基序列完全地 一致的必要。例如，制备将有提尚DNA复制起始的功能的可能性之任意的变异导入LT基因 的碱基序列的变异型LT基因，将所述基因整合到质粒型载体1也可。这样的变异型LT基 因的碱基序列的例示于序列表的SEQ ID NO: 2 (变异型1)、SEQ ID NO: 3 (变异型2)、及SEQ ID NO:4 (变异型3)。SEQ ID NO: 2涉及的变异型LT基因相比SEQ ID NO: 1涉及的LT基 因，将第319碱基从鸟嘌呤（G)取代为腺嘌呤（A)，将第321碱基从腺嘌呤（A)取代为鸟嘌 呤（G)。由此碱基的取代，作为SEQ ID N0:2涉及的LT基因的翻译产物的LT蛋白质相比 作为SEQ ID NO: 1涉及的LT基因的翻译产物的LT蛋白质，将第107氨基酸从谷氨酸取代 为赖氨酸而成。所述变异是不损害LT蛋白质的DNA复制功能，抑制LT蛋白质与Rb蛋白质 (有癌化抑制功能的蛋白质）的相互作用的变异的例。SEQ ID N0:3涉及的变异型LT基因 相比SEQ ID NO: 1涉及的LT基因，将第1206碱基从胸腺嘧啶⑴取代为鸟嘌呤（G)。由 此碱基的取代，作为SEQ ID N0:3涉及的LT基因的翻译产物的LT蛋白质相比作为SEQ ID NO: 1涉及的LT基因的翻译产物的LT蛋白质，将第402氨基酸从天冬氨酸取代为谷氨酸而 成。所述变异是不损害LT蛋白质的DNA复制功能，抑制LT蛋白质与p53蛋白质（有癌化 抑制功能的蛋白质）的相互作用的变异的例。SEQ ID N0:4是通过向SEQ ID NO: 1涉及的 LT基因导入SEQ ID NO: 2的取代和SEQ ID NO: 3的取代的两方而制备的变异型LT基因。 上述的变异型LT基因，作为一例，只要是有提高DNA复制起始的功能的可能性的变异，取代 的碱基或氨基酸序列的种类或位置无与其中示的变异型LT基因完全地一致的必要。
[0079] 在复制起始蛋白质基因25是SV40的LT基因的情况中，作为复制起始序列30,例 如，SV40的ori序列是适当的。SV40的ori序列之一例示于序列表的SEQ ID N0:5。此碱 基序列，只要不失复制起始的功能，也无与SEQ ID N0:5的碱基序列必然完全地一致的必 要。
[0080] LT基因或，变异型LT基因、SV40的ori序列等的碱基序列可通过已知的基 因工程学方法取得。例如，可向这些取得对象的碱基序列通过利用特异性的引物组的 PCR(polymerase chain reaction:聚合酶链式反应），扩增含取得对象的碱基序列的DNA 而取得。或者，将取得对象的碱基序列的全部人工地合成也可。另外利用已经整合到载体 的也可。
[0081] 另外，作为基因启动子10的巨细胞病毒的启动子之一例不于序列表的SEQ ID NO:6,作为报告子基因21的萤的萤光素酶基因之一例示于序列表的SEQ ID NO: 7,脑心肌炎 病毒的IRES之一例示于序列表的SEQ ID N0:8,牛生长激素基因的转录终止信号序列之一 例示于序列表的SEQ ID N0:9。再有，本实施方式中涉及的质粒型载体1不限于这些的基因 或碱基序列。另外，基因或信号的碱基序列，只要不失其功能，不与上述序列编号所示的碱 基序列完全地一致也可。
[0082] 【2.载体的制备】
[0083] 接下来，对于质粒型载体pCMV-Luc-IRES-LT的制备方法进行说明。图3是示质粒 型载体pCMV-Luc-IRES-LT的制备方法的典型流程的模式图。
[0084] 如图 3 所示，利用载体PGV-B2 (TOYOB-Net)和载体pBSII-IRES 和载体pCMV-LT(w/ oZeo)。载体PGV-B2含萤的萤光素酶基因41。载体pBSII-IRES含脑心肌炎病毒的IRES43。 载体pCMV-LT有CMV(巨细胞病毒）的基因启动子（CMV启动子）45、LT基因47、牛生长激 素基因的转录终止信号序列49、及SV40ori序列51。
[0085] 首先， 用限制酶SacI和限制酶XbaI将PGV-B2消化而切出萤光素酶基因41。同样 地，用限制酶SacI和限制酶XbaI将pBSII-IRES切断。然后，通过将从PGV-B2切出的萤光 素酶基因41用T4连接酶连结到用限制酶SacI和限制酶XbaI切断的pBSII-IRES而制备 pBSII-Luc-IRES〇
[0086] 接下来，将pBSII-Luc-IRES用限制酶PstI切断。将用限制酶PstI切断 的pBSII-Luc-IRES的3'突出末端用T4DNA聚合酶平滑化。平滑化之后，通过将 pBSII-Luc-IRES用限制酶NheI切断，将由萤光素酶基因41和IRES43组成的DNA片段从 pBSII-Luc-IRES切出。另一方面，对pCMV-LT也实施对pBSII-Luc-IRES实施的处理。即，将 pCMV-LT用限制酶PstI切断，将3'突出末端用T4DNA聚合酶平滑化，将pCMV-LT用限制酶 NheI切断。然后，通过将从pBSII-Luc-IRES切出的DNA片段用T4连接酶连结到pCMV-LT，制 备本实施方式中涉及的质粒型载体pCMV-Luc-IRES-LT。由上述的处理，pCMV-Luc-IRES-LT 含：CMV启动子45、萤光素酶基因41、IRES43、LT基因47、转录终止信号序列49、及复制起 始序列51。萤光素酶基因41、IRES43、LT基因47、及转录终止信号序列49整合到CMV启动 子45之下游。
[0087] 另外，再者，作为其他质粒型载体1，制备了将上述的质粒型载体 pCMV-Luc-IRES-LT 的 LT 基因重组为变异型 LT 基因的 pCMV-Luc-IRES-LT-E107K 和 pCMV-Luc-IRES-LT-D402E。图 4A 是示 pCMV-Luc-IRES-LT 的结构的模式图，图 4B 是示 pCMV-Luc-IRES-LT-E107K 的结构的模式图，图 4C 是示 pCMV-Luc-IRES-LT-D402E 的结构的 模式图。如图4A所示，pCMV-Luc-IRES-LT的LT基因47的第319碱基是鸟嘌呤（G)，第321 碱基是腺嘌呤（A)，第1206碱基是胸腺嘧啶（T)。如图4B所示，pCMV-Luc-IRES-LT-E107K 的LT基因47^的第319碱基是腺嘌呤（A)，第321碱基是鸟嘌呤（G)，第1206碱基是胸腺 嘧啶（T)。如图4C所示，pCMV-Luc-IRES-LT-D402E的LT基因47"的第319碱基是鸟嘌 呤（G)，第321碱基是腺嘌呤（A)，第1206碱基是鸟嘌呤（G)。pCMV-Luc-IRES-LT-E107K 是由质粒的位点特异性变异导入法，通过将pCMV-Luc-IRES-LT的LT基因的第319碱基 从鸟嘌呤（G)取代为腺嘌呤（A)，将第321碱基从腺嘌呤（A)取代为鸟嘌呤（G)来制备。 pCMV-Luc-IRES-LT-D402E是由质粒的位点特异性变异导入法，通过将pCMV-Luc-IRES-LT 的LT基因的第1206碱基从胸腺嘧啶（T)取代为鸟嘌呤（G)来制备。
[0088] 以上结束对本实施方式中涉及的质粒型载体1的制备方法的具体例的说明。
[0089] 作为与质粒型载体1、或者重组为变异型LT基因的质粒型载体1 一同导入宿主细 胞的阴性对照用的载体，制备了 pCMV-Luc。图5是示载体pCMV-Luc的制备方法的典型流程 的模式图。如图5所示，pCMV-Luc由pCMV-LT(w/oZeo)和载体PGV-B2制备。pCMV-LT含： CMV启动子61、LT基因63、转录终止信号序列65、及SV40ori序列67。PGV-B2含萤光素酶 基因69。pCMV-Luc可通过重组pCMV-LT的LT基因63和PGV-B2的萤光素酶基因69来制 备。
[0090] 具体而言，首先，用限制酶HindIII和限制酶XbaI将PGV-B2切断而切出萤光素酶 基因69。同样地，用限制酶HindIII和限制酶XbaI将pCMV-LT切断，从pCMV-LT除去LT基 因63。然后，通过将切出的萤光素酶基因69用T4连接酶连结到用限制酶HindIII和限制 酶XbaI切断的pCMV-LT而制备阴性对照用的载体pCMV-Luc。即，pCMV-Luc含：CMV启动子 61、萤光素酶基因69、转录终止信号序列65、及SV40ori序列67。萤光素酶基因69和转录 终止信号序列65整合到CMV启动子61之下游。如此，pCMV-Luc不含复制起始蛋白质基因 和复制起始序列，作为非自身扩增型的报告子载体发挥功能。
[0091] 【3.宿主细胞中的LT蛋白质的表达】
[0092] 向人肝癌细胞（Huh-7)导入 pCMV-Luc-IRES-LT 和 pCMV-Luc。如上所述，pCMV-Luc 作为对pCMV-Luc-IRES-LT的阴性对照用的载体导入。
[0093] 各质粒型载体的向细胞的导入用脂转染（Iipofection)法进行。作为质粒型载体 的导入试剂，使用脂质体2000 (life Technologies公司）。脂转染的操作根据试剂的手册。 简言之，将含悬浮于50 μ 1的Opti-MEM的I. 0 μ 1的阳离子脂质（脂质体2000)、及0. 6 μ g 的 pCMV-Luc-IRES-LT 或(λ 4 μ g 的 pCMV-Luc、及(λ 2 μ g 的 DNA (pUC19)的 50 μ 1 的 Opti-MEM 混合而形成脂质体/载体复合物。脂质体/载体复合物形成后，通过将此复合物液50 μ I 加到在培养板（24孔板）预先培养一晚的培养基（Huh-7 (以8. 0 X IO4细胞/孔接种）），向 细胞导入 pCMV-Luc-IRES-LT。
[0094] 自脂转染48小时后，从培养板去除培养基，将培养基内的细胞悬浮于磷酸缓冲液 (PBS)中。悬浮后，将含磷酸缓冲液和细胞的悬浮液以角速度14, OOOrpm经5分钟用离心分 离器离心分离，从悬浮液回收细胞沉淀。向此细胞沉淀加 SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠-聚丙 烯酰胺凝胶电泳法）用的细胞溶解液，在沸腾水中经5分钟温育（incubate)。其后，用8% 的SDS-PAGE进行电泳。电泳后，用水下型印迹装置将凝胶中的蛋白质转印（印迹：blot)到 PVDF 膜，将 PVDF 膜用 BLOCK ACE (DainipponSumitomoPharma)封闭（blocking)。封闭后， 向第一抗体溶液（500倍稀释的小鼠抗LT单克隆抗体（Clone9E10, Sigma))浸PVDF膜，于 室温经1小时反应。然后，将PVDF膜用Tris缓冲食盐水（TBS)清洗3次。
[0095] 清洗后，将PVDF膜内的LT蛋白质的表达量用ABC试剂盒（Alkaline phosphatase Universal，VECTASTAIN)测定。ABC试剂盒的操作根据销售厂商的手册。PVDF膜（酶标记 第二抗体）用BCIP/NBT(KPL公司）发色。
[0096] 图6是示pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV-Luc中的LT蛋白质的信号的检测结果的图。 如图6所示，在pCMV-Luc中，检测不到LT蛋白质的表达。另一方面，在pCMV-Luc-IRES-LT 中，特异性地检测到LT蛋白质的表达。在图6的例中，LT蛋白质的信号的分子量测定为约 82kDa〇
[0097] 【4.质粒型载体的扩增】
[0098] 通过与上述的3同样的方法，向Huh-7细胞导入同拷贝数的pCMV-Luc-IRES-LT和 pCMV-Luc。自脂转染72小时后，使用Dneasy试剂盒（Qiagen)从细胞提取DNA。DNA的提 取操作根据试剂盒的手册。提取的DNA溶液200 μ 1之中，将I. 0 μ 1作为模板进行PCR，扩 增pCMV-Luc-IRES-LT、或者pCMV-Luc的部分碱基序列。以下示PCR中使用的引物的碱基序 列。
[0099] 正向引物：5 ' -CGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCC-3 '
[0100] 反向引物：5 ' -CCAGCATGCCTGCTATTGTCTTCCC-3 '
[0101] 将PCR反应后的DNA溶液用0. 8 %的琼脂糖凝胶电泳。电泳后，将含DNA溶液的凝 胶用溴化乙锭染色，将染色的凝胶的照片摄影。然后，将在溴化乙锭染色照片描出的条带的 染色强度用图像解析软件（ImageJ)数值化。
[0102] 图7A及图7B示自向细胞导入质粒型载体72小时后的相对pCMV-Luc的 pCMV-Luc-IRES-LT的拷贝数（条带的染色强度）的比较结果。图7A示pCMV-Luc和 pCMV-Luc-IRES-LT 的溴化乙锭染色照片。图 7B 示用于 pCMV-Luc 和 pCMV-Luc-IRES-LT 的拷贝数的比较的图（染色强度比的图）。如图7A所示，可从溴化乙锭染色照片发现， pCMV-Luc-IRES-LT的照片的辉度相比pCMV-Luc更高。从而，pCMV-Luc-IRES-LT的信号强 度相比pCMV-Luc更高。另外，如图7B所示，pCMV-Luc-IRES-LT的信号强度相比pCMV-Luc 更高。从此图可发现，pCMV-Luc-IRES-LT的拷贝数扩增到pCMV-Luc的拷贝数的4. 2倍。
[0103] 【5.报告子基因分析-1-(萤光素酶分析）】
[0104] 通过与上述的3同样的方法，用脂转染法向Huh-7细胞和猴肾癌细胞（CV-I)分别 导入同拷贝数的pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV-Luc，在培养板培养。从脂转染72小时后，从 培养板去除培养基，将各细胞用PBS清洗2次后，添加作为用于从细胞提取萤光素酶（报 告子蛋白质）的提取试剂的细胞溶解液（Pica Gene细胞裂解缓冲液LCβ，TOYOB-Net公 司）。于室温经15分钟将细胞和细胞溶解液的悬浮液温育之后，通过以角速度15, OOOrpm 经5分钟将悬浮液用离心分离器离心分离，从悬浮液去除细胞残渣。然后，向去除细胞残渣 的悬浮液之上清加萤光素酶底物溶液（PicaGeneLT2. 0, TOYOB-Net公司）之后，将添加作为 检测试 剂的萤光素酶底物溶液（荧光素溶液）的上清的发光强度用光度计（MithrasLB940， Berthold公司）测定。
[0105] 图8是示pCMV-Luc和pCMV-Luc-IRES-LT的报告子蛋白质的信号强度的比较结 果的图。如图8所示，在宿主细胞是Huh-7的情况中，相对pCMV-Luc的pCMV-Luc-IRES-LT 的报告子蛋白质的信号强度是约5. 7倍。在宿主细胞是CV-I的情况中，相对pCMV-Luc的 pCMV-Luc-IRES-LT的报告子蛋白质的信号强度是约19. 8倍。如此，本实施方式中涉及的质 粒型载体相比非扩增型的质粒型载体最大可表达约19. 8倍的报告子蛋白质。从而本实施 方式中涉及的报告子基因分析相比以往型的报告子基因分析可以高灵敏度检测基因启动 子的活性。
[0106] 【6.报告子基因分析-2-(萤光素酶分析）】
[0107] 通过与上述的3同样的方法，向猴肾癌细胞（CV-I)通过脂转染法导入同拷贝数的 pCMV-Luc-IRES-LT 和 pCMV-Luc-IRES-LT-E107K 和 pCMV-Luc-IRES-LT-D402E 和 pCMV-Luc， 在培养板上培养。自脂转染72小时后，从培养板去除培养基，将各细胞用PBS清洗2次后， 添加作为用于从细胞提取萤光素酶（报告子蛋白质）的提取试剂的细胞溶解液（PicaGene 细胞裂解缓冲液LC β，TOYOB-Net公司）。于室温经15分钟将细胞和细胞溶解液的悬浮液 温育之后，通过以角速度15, OOOrpm经5分钟将悬浮液用离心分离器离心分离，从悬浮液去 除细胞残渣。然后，向去除细胞残渣的悬浮液的上清加萤光素酶底物溶液（PicaGeneLT2. 0， TOYOB-Net公司）之后，将添加作为检测试剂的萤光素酶底物溶液（荧光素溶液）的上清的 发光强度用光度计（MithrasLB940, Berthold公司）测定。
[0108] 图 9 是示相对 pCMV-Luc-IRES-LT 和 pCMV-Luc-IRES-LT-E107K 和 pCMV-Luc-IRES-LT-D402E的pCMV-Luc的报告子蛋白质的信号强度的比较结果的图。 如图 10 所示，相对 pCMV-Luc 的 pCMV-Luc-IRES-LT 和 pCMV-Luc-IRES-LT-E107K 和 pCMV-Luc-IRES-LT-D402E的报告子蛋白质的信号强度分别是约20倍和约108倍和约177 倍。如此，本实施方式中涉及的质粒型载体，通过使用变异型LT基因，相比非扩增型的质粒 型载体最大可表达约177倍的报告子蛋白质。从而本实施方式中涉及的报告子基因分析相 比以往型的报告子基因分析可以高灵敏度检测基因启动子的活性。
[0109] 【效果】
[0110] 如上所述，本实施方式中涉及的质粒型载体1有：成为检测对象的基因启动子10、 报告子基因21、IRES23、复制起始蛋白质基因25、转录终止信号序列27、及复制起始序列 30。报告子基因21、IRES23、复制起始蛋白质基因25、及转录终止信号序列27配置在基因 启动子10之下游。IRES23将报告子基因21和复制起始蛋白质基因25连结。从而，将质粒 型载体1导入满足基因启动子10的活化条件的宿主细胞时，伴随基因启动子10的活化而 质粒型载体1重复复制，同时每种质粒型载体1中报告子蛋白质被合成。从而，相比以往的 非扩增型报告子载体，本实施方式中涉及的质粒型载体1可增大由基因启动子10的活性所 致而合成的报告子蛋白质的表达量、即，测定信号的表达量。另外，本实施方式中涉及的质 粒型载体1利用质粒，所以相比利用病毒的载体，无感染等的危险性，处理简便。
[0111] 本实施方式中涉及的报告子基因分析是，在伴随质粒型载体1中含有的基因启动 子10的活性而质粒型载体1可扩增的条件下培养宿主细胞，测定在培养的宿主细胞内的质 粒型载体1中含有的报告子基因21的表达量。从而，本实施方式中涉及的报告子基因分析 相比利用以往的非扩增型报告子载体的报告子基因分析，可以高灵敏度检测基因启动子的 活性。
[0112] 另外，本实施方式中涉及的分析试剂盒含：质粒型载体1 ;及用于检测宿主细胞中 的，质粒型载体1中含有的报告子基因21的表达的试剂。从而，本实施方式中涉及的分析 试剂盒相比利用以往的非扩增型报告子载体的分析试剂盒，可以高灵敏度检测基因启动子 的活性。
[0113] 例如，将在疾病早期的前疾病化状态的细胞中特异性地活化的基因启动子10整 合到质粒型载体1时，可相比以往大幅地增大在此前疾病化状态的细胞的每单位个数的报 告子蛋白质的表达量。由表达量的增大，可容易地检测报告子蛋白质的表达，结果可容易地 检测基因启动子10的活性。如此，通过本实施方式，可以高灵敏度检测极微量的病变细胞 的变化。
[0114] 而且，通过本实施方式，可提供可以高灵敏度检测基因启动子的活性的质粒型载 体、基因启动子的检测方法、及分析试剂盒。
[0115] 已描述了特定实施方式，这些实施方式仅以例示的方式提供，且不旨在限制本发 明的范围。本文描述的新实施方式可以各种其他方式实施，此外，可实施本文描述的实施方 式的各种改变而不脱离本发明的精神。随附的权利要求及它们的等同体旨在覆盖此类形式 及修饰，它们落在本发明的范围和精神之内。
【主权项】
1. 不以获得下述细胞的主体的疾病诊断结果或健康状况为直接目的的、基因启动子活 性的体外检测方法，所述方法具备： 将下述的质粒型载体导入细胞， 伴随上述质粒型载体中含有的基因启动子的活性而上述质粒型载体可扩增地，在上述 细胞分裂增殖的条件下培养上述细胞，以及 测定在上述培养的细胞内的，上述质粒型载体中含有的报告子基因的表达量， 所述质粒型载体，其具备： 基因启动子、以及 第1基因，其编码配置在上述基因启动子之下游的，用于可视化上述基因启动子的活 性的报告子蛋白质、以及 第2基因，其编码配置在上述基因启动子之下游的复制起始蛋白质、以及 内部核糖体结合序列，其配置在上述第1基因和上述第2基因之间、以及 转录终止信号序列，其编码用于终止上述第1基因和上述第2基因的转录的信号、以及 复制起始序列，其被上述复制起始蛋白质识别，且 将所述第1基因、第2基因构成双顺反子，由同一所述基因启动子启动，以使报告子基 因和内部核糖体结合序列与复制起始蛋白质基因被转录成单一的mRNA。2. 权利要求1所述的方法，其中上述第1基因是萤光素酶基因、0 -半乳糖苷酶基因、 一氧化氮合成酶基因、黄嘌呤氧化酶基因、蓝色荧光蛋白质基因、绿色荧光蛋白质基因、红 色荧光蛋白质基因、或者重金属结合蛋白质基因。3. 权利要求1所述的方法，其中 上述第2基因是猿猴病毒40的大T抗原基因， 上述复制起始序列是猿猴病毒40的复制起始序列。4. 权利要求3所述的方法，其中上述大T抗原基因是由SEQIDNO: 1所示的碱基序列 组成的大T抗原基因、或者，将有提高DNA复制起始的功能的可能性的任意的变异导入SEQ IDNO: 1所示的碱基序列的变异型的大T抗原基因。5. 权利要求4所述的方法，其中上述变异型的大T抗原基因由SEQIDNO: 2、SEQID N0:3、或者SEQIDN0:4所示的碱基序列组成。6. 权利要求1所述的方法，其中 上述第2基因是爱泼斯坦-巴尔病毒的EBNA-I基因， 上述复制起始序列是爱泼斯坦-巴尔病毒的复制起始序列。7. 权利要求1所述的方法，其中 上述第2基因是小鼠多瘤病毒的大T抗原基因， 上述复制起始序列是小鼠多瘤病毒的复制起始序列。8. 权利要求1所述的方法，其中上述基因启动子是在疾病的早期活化的基因启动子、 或者，响应环境刺激而活化的基因启动子。9. 权利要求1所述的检测方法，其中上述细胞是人或猴来源的细胞。10. 权利要求1所述的检测方法，其中上述细胞是小鼠或大鼠来源的细胞。11. 权利要求1所述的检测方法，其中 上述报告子基因是萤光素酶基因、0 -半乳糖苷酶基因、蓝色荧光蛋白质基因、绿色荧 光蛋白质基因、或者红色荧光蛋白质基因， 上述测定是作为上述表达量，利用光学检测装置测定上述报告子基因的翻译产物的发 光量或荧光量。12. 权利要求1所述的检测方法，其中 上述报告子基因是一氧化氮合成酶基因、或者黄嘌呤氧化酶基因， 上述测定是，作为上述表达量，将由上述报告子基因的翻译产物生成的活性氧量利用 电子自旋共振装置测定。13. 权利要求1所述的检测方法，其中 上述报告子基因是重金属结合蛋白质基因， 上述测定是，作为上述表达量，将与上述报告子基因的翻译产物结合的重金属量利用 磁共振成像装置、核医学诊断装置、或者X射线计算机断层摄影装置测定。14. 权利要求1所述的检测方法，其中上述质粒型载体通过由上述质粒型载体中含有 的第2基因的表达而合成的复制起始蛋白质与上述质粒型载体中含有的复制起始序列结 合而自身扩增。15. 权利要求1所述的检测方法，其中上述细胞是处于在疾病早期的前疾病化状态的 细胞。16. 权利要求1所述的检测方法，其中上述基因启动子可在上述细胞分裂增殖的条件 下具有活性。
【专利摘要】本发明的课题是以高灵敏度检测基因启动子的活性。本实施方式中涉及的质粒型载体含：基因启动子、第1基因、第2基因、内部核糖体结合序列、转录终止信号序列、及复制起始序列。第1基因编码配置在基因启动子之下游的，用于可视化基因启动子的活性的报告子蛋白质。第2基因编码配置在基因启动子之下游的复制起始蛋白质。内部核糖体结合序列配置在第1基因和第2基因之间。转录终止信号序列编码用于终止第1基因和第2基因的转录的信号。复制起始序列被复制起始蛋白质识别。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894249
【申请号】CN201510271625
【发明人】赤星英一, 石原美津子
【申请人】株式会社东芝, 东芝医疗系统株式会社
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2012年7月18日
【公告号】CN102952819A, EP2562258A1, EP2562258B1, US9040294, US20130230872, US20150203853
最新回复(0)