rs492594的基因型的检测方法及其应用
rs492594的基因型的检测方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种rs492594的基因型的检测方法及其应用，属于生物医药领域，
【背景技术】
[0002] 噻唑烷二酮类药物又称为胰岛素增敏剂，是临床上常用的口服降糖药物。噻唑 烷二酮类药物包括吡格列酮、曲格列酮、罗格列酮等，这些药物具有相似的化学结构，即2， 4-噻唑烷二酮结构，不同的药物区别在于具有不同的侧链取代基。但是这些化合药物的安 全性不尽相同，目前仍在临床上广泛使用的只有吡格列酮。噻唑烷二酮类药物是过氧化物 酶体增殖物激活受体γ (PPARy)激动剂。PPARy激活后发生结构上的变化，可招募多种共 激活物与之结合，发挥不同的生物学作用，包括增加外周组织的胰岛素敏感性，减轻骨骼肌 和肝脏的脂肪沉积，促进骨骼肌对循环中葡萄糖的利用，抑制肝糖输出。也有研宄提示噻唑 烷二酮类药物可保护胰腺β细胞功能。
[0003] 目前临床上虽然有多种口服降糖药物，但是一方面难以做到个体化治疗使药物发 挥最大疗效，另一方面由于副作用的发生限制了某些降糖药物的使用。药物作用差异主要 是个体在药物效应和代谢相关的遗传背景差异所决定的。通过研宄口服降糖药物的药物遗 传学，可以采用遗传信息为个体化用药提供理论依据。吡格列酮是目前市场上仍在使用的 噻唑烷二酮类药物。研宄显示，它除了降低血糖、延缓糖尿病前期进展为糖尿病，还有抗炎 和抗动脉粥样硬化，具有潜在的心血管保护作用。同时也有导致水肿、体重增加、骨折风险 增加和心力衰竭的不良反应。吡格列酮的适应症是所有2型糖尿病，但由于2型糖尿病病 因和发病机制的异质性，如果不加细分，必然有少部分病人出现不良反应或疗效不佳，导致 患者医疗费用增加和因不良反应导致的身心危害。因此，找出对该药敏感的2型糖尿病特 殊群体，使用个体化的药物剂量，可能对病人带来更多收益。
[0004] G6PC2基因位于2q24. 3,编码葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基2。该蛋白在胰腺β细 胞特异性表达，细胞研宄中并没有发现该蛋白有磷酸水解酶的活性，而是细胞免疫介导的 自身免疫性糖尿病的主要靶蛋白。在动物实验中敲除G6PC2基因后导致葡萄糖激酶的相 对活化，改变了葡萄糖刺激的胰岛素分泌状态。国内外多项2型糖尿病人群中的研宄曾发 现G6PC2基因和空腹血糖或2型糖尿病发病风险相关。其中一个SNP位点rs492594位于 G6PC2基因的第5号外显子上，是一个错义突变（c. 655G > C，Val219Leu)，根据PubMed中 国人分型数据，rs492594的次要等位基因 G频率为0. 463。
【发明内容】
[0005] 本发明一个所要解决的技术问题是预测吡格列酮的降血糖效果。
[0006] 为了解决以上技术问题，本发明提供检测人基因组中rs492594SNP位点的基因型 的产品或检测人基因组中rs570876SNP位点的基因型的产品在制备预测吡格列酮干预后 对人的降血糖效果的产品中的应用。
[0007] 上述应用具体体现在如下：
[0008] rs492594 SNP位点GG基因型的待测糖尿病患者在吡格列酮干预后血糖下降程 度、HbAlc下降程度和/或胰岛素抵抗水平下降程度高于或候选高于rs492594 SNP位点 CC基因型或rs492594 SNP位点GC基因型的待测糖尿病患者在吡格列酮干预后血糖下降 程度、HbAlc (糖化血红蛋白）下降程度和/或胰岛素抵抗水平下降程度；所述GG基因型为 rs492594SNP位点为G的纯合体，所述GC基因型为rs492594SNP位点为G和C的杂合体，所 述CC基因型为rs492594SNP位点为C的纯合体；
[0009] rs570876 SNP位点AA基因型的待测糖尿病患者在吡格列酮干预后血糖下降程 度、HbAlc下降程度和/或胰岛素抵抗水平下降程度高于或候选高于rs570876 SNP位点 TT基因型或rs570876 SNP位点AT基因型的待测糖尿病患者在吡格列酮干预后血糖下降 程度、HbAlc (糖化血红蛋白）下降程度和/或胰岛素抵抗水平下降程度；所述AA基因型为 rs570876SNP位点为A的纯合体，所述AT基因型为rs570876SNP位点为A和T的杂合体，所 述TT基因型为rs570876SNP位点为T的纯合体；
[0010] 上述吡格列酮干预后血糖下降程度为【（吡格列酮干预前血糖与吡格列酮干预后 血糖的差值）/吡格列酮干预前血糖】*100% ;
[0011] 上述吡格列酮干预后HbAlc下降程度为【（吡格列酮干预前HbAlc与吡格列酮干 预后HbAlc的差值）/吡格列酮干预前HbAlc】*100%。
[0012] 上述血糖为0GTT2小时血糖。
[0013] 啦格列酮干预是指服用一年，每天剂量为30mg。
[0014] 上述降血糖效果体现在如下（1)-(3)其中至少任一所示：
[0015] (1)吡格列酮干预后人的血糖浓度下降程度；
[0016] ⑵吡格列酮干预后人的糖化血红蛋白浓度下降程度；
[0017] (3)吡格列酮干预后人的胰岛素抵抗水平下降程度；
[0018] 降血糖效果好体现在如下A' -C'其中至少任一所示：
[0019] A'、吡格列酮干预后人的血糖浓度下降程度高；
[0020] B'、吡格列酮干预后人的糖化血红蛋白浓度下降程度高；
[0021] C'、吡格列酮干预后人的胰岛素抵抗水平下降程度高。
[0022] 吡格列酮对rs492594位点的基因型为GG的人的降血糖效果好于吡格列酮对 rs492594位点的基因型为CG或CC的人的降血糖效果。
[0023] 吡格列酮对rs570876位点的基因型为AA的人的降血糖效果好于吡格列酮对 rs492594位点的基因型为AT或TT的人的降血糖效果。
[0024] 本发明另一个所要解决的技术问题是筛查对吡格列酮敏感的糖尿病前期患者。
[0025] 为了解决以上技术问题，本发明提供检测人基因组中rs492594SNP位点的基因型 的产品或检测人基因组中rs570876SNP位点的基因型的产品在制备筛查对吡格列酮敏感 的糖尿病前期患者的产品中的应用。
[0026] 对吡格列酮相对敏感的糖尿病前期患者体现在吡格列酮干预后血糖下降程度高、 HbAlc下降程度高和/或胰岛素抵抗水平下降程度高。
[0027] 上述应用中，所述产品为序列1和序列2所示的DNA分子。
[0028] 本发明第三个所要解决的技术问题是检测人基因组中rs492594SNP位点的基因 型。
[0029] 为了解决以上技术问题，本发明提供检测人基因组中rs570876SNP位点的基因型 的产品在制备检测人基因组中rs492594SNP位点的基因型的产品中的应用。
[0030] 本发明第四个所要解决的技术问题是检测人基因组中rs492594SNP位点的基因 型。
[0031] 为了解决以上技术问题，本发明提供一种检测人基因组中rs492594SNP位点的基 因型的方法，1)直接测序；
[0032] 2)检测待测人基因组中rs570876SNP位点的基因型，根据所述待测人基因组中 rs570876SNP位点的基因型确定所述待测人基因组中rs492594SNP位点的基因型。
[0033] 上述2)所示的方法，包括如下步骤：
[0034] 1)用扩增含有rs570876SNP位点DNA片段的引物对所述待测人基因组DNA进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物；
[0035] 2)用ApoI酶切所述PCR产物，得到酶切产物，根据所述酶切产物大小判断所述待 测人基因组中rs570876SNP位点的基因型，再根据所述rs570876SNP位点的基因型确定所 述rs492594SNP位点的基因型。
[0036] 上述方法中，所述扩增含有rs492594SNP位点DNA片段的引物对由序列1所示的 DNA分子和序列2所不的DNA分子组成；
[0037] 所述根据所述酶切产物大小判断所述待测人基因组中rs570876SNP位点的基因 型，再根据所述rs570876SNP位点的基因型确定所述rs492594SNP位点的基因型为如下：若 所述酶切产物仅含有307bp和396bp大小的目的片段，则所述人基因组中rs570876SNP位 点的基因型为AA，所述人基因组中rs492594SNP位点的基因型为GG ;若所述酶切产物含有 307bp、396bp和703bp 3条DNA片段，则所述人基因组中rs570876SNP位点的基因型为AT， 所述人基因组中rs492594SNP位点的基因型为GC ;若所述酶切产物仅含有703bp DNA片段， 则所述人基因组中rs570876SNP位点的基因型为TT，所述人基因组中rs492594SNP位点的 基因型为CC。
[0038] 所述rs570876SNP位点的核苷酸为序列3或序列4的第308位核苷酸；
[0039] 所述rS492594SNP位点的核苷酸为序列7的第501位核苷酸或G6PC2基因的 GenBank Accession Number NCBI Reference Sequence:NG_011682. 1(2014 年 5 月 4 日） 的第11427位脱氧核糖核苷酸。
[0040] 所述方法为非诊断目的和非治疗目的的方法。
[0041] 所述307bp大小的目的片段的核苷酸序列为序列5 ;
[0042] 所述396bp大小的目的片段的核苷酸序列为序列6 ;
[0043] 所述703bp大小的目的片段的核苷酸序列为序列4所示的DNA分子。
[0044] 本发明第五个所要解决的技术问题是制备预测吡格列酮对人的降血糖效果的产 品或制备筛查对吡格列酮敏感的糖尿病患者产品。
[0045] 为了解决以上技术问题，本发明提供了人基因组中rs570876位点的基因型和/或 rs492594位点的基因型在制备预测吡格列酮对人的降血糖效果的产品中的应用；
[0046] 或，
[0047] 人基因组中rs570876位点的基因型和/或rs492594位点的基因型在制备筛查对 吡格列酮敏感的糖尿病患者的产品中的应用。
[0048] 本发明第六个所要解决的技术问题是检测人基因组中rs492594位点的基因型和 /或检测人基因组中rs570876位点的基因型的产品。
[0049] 为了解决以上技术问题，本发明提供了检测人基因组中rs492594位点的基因型 和/或检测人基因组中rs570876位点的基因型的产品，其包含扩增包含rs570876位点及 紧邻该位点的3'下游5个核苷酸的人基因组DNA片段的PCR引物；
[0050] 所述PCR引物具体为序列1所示的DNA分子和序列2所示的DNA分子组成的引物 对。
[0051 ] 上述的应用、方法或产品中，所述人为糖尿病患者。
[0052] 所述糖尿病患者具体为糖尿病前期患者。
[0053] 所述rs570876和所述rs492594存在连锁不平衡（r2= I)，rs570876位点A等位 基因（rs570876-A)和rs492594位点G等位基因（rs492594-C)构成单倍型。
[0054] 上述任一所述的应用或产品中，所述产品可为试剂或试剂盒，还可为试剂或试剂 盒和仪器的组合产品，如由引物和DNA测序仪组成的组合产品，由PCR试剂和DNA测序试剂 和DNA测序仪组成的组合产品；
[0055] 所述rs492594是人染色体2上的一个二等位多态性的SNP位点，该变异是转换G/ C(在其互补链上则为C/G) ;rs492594位点的基因型为CC、CG或GG ;所述CC是rs492594 位点为C的纯合型，所述GG是rs492594位点为G的纯合型，所述CG是rs492594位点为G 和C的杂合型，所述检测人基因组中rs492594位点的基因型具体可为检测rs492594位点 的核苷酸种类；
[0056] 所述rs570876是人染色体2上的一个二等位多态性的SNP位点，该变异是转换A/ T(在其互补链上则为T/A) ;rs570876位点的基因型为AA、TT或AT ;所述AA是rs570876 位点为A的纯合型，所述TT是rs570876位点为T的纯合型，所述AT是rs570876位点为A 和T的杂合型，检测人基因组中rs570876位点的基因型具体可为检测rs570876位点的核 苷酸种类；
[0057] 本发明证明，rs492594处的基因型为GG的糖尿病前期患者使用吡格列酮后血糖 及HbAlc(糖化血红蛋白）降低的程度显著大于rs492594处的基因型为CG或CC的糖尿 病前期患者，糖尿病前期患者rs492594处的基因型与吡格列酮的降糖效果相关，rs492594 基因型的检测可用于筛选对吡格列酮相对敏感的糖尿病前期患者，可根据糖尿病前期患 者rs492594处的基因型选择适合的降血糖药物，提高个体化治疗水平。本发明进一步 提供了 rs492594处的基因型的限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析方法，该方法可以可靠、简便、经济、快速的鉴定rs492594位点的 基因型。
【附图说明】
[0058] 图1为吡格列酮的药物遗传学研宄流程图。
[0059] 图2为芯片分型结果与本发明的RFLP分型结果比较。
【具体实施方式】
[0060] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0061] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0062] 下述实施例中的患者均为糖尿病前期患者。
[0063] 实施例1、吡格列酮对不同基因型糖尿病患者治愈效果的研宄
[0064] 伦理声明
[0065] 本研宄通过了北京大学医学部伦理委员会（IRB)批准，所有糖尿病前期患者均签 署了知情同意书。
[0066] 一、临床数据和生物样本的收集
[0067] 开展吡格列酮药物临床试验，建立研宄队列，收集各个阶段的临床数据和生物样 本。
[0068] 该研宄是一项随机、药物双盲、平行、安慰剂对照的前瞻性多中心临床试验。按照 WH01999诊断标准，纳入糖尿病前期患者1903人，其中使用吡格列酮953人（吡格列酮服用 剂量为30mg/d，全部受试者完成一年的随访。收集受试者的基线及随访数据，包括患者的身 高、体重、腰围、臀围，空腹血糖、HbAlc (糖化血红蛋白），空腹C肽，空腹胰岛素，餐后2小时 血糖，血脂、尿微量白蛋白等。在去除第1年随访时脱落以及基线资料不全的样本，最后入 选例数为761例使用吡格列酮糖尿病前期患者。
[0069] 二、芯片设计和基因分型
[0070] 本研宄分别运用Illumina公司的Infinium HD iSelect定制芯片（货号为 WG-401-1004)及MassARRAY飞行质谱进行SNP位点分型。iSelect定制芯片包括药代动力 学及糖尿病候选基因相关位点，覆盖了几乎所有与药物代谢有关的基因位点，又兼顾了中 国汉族人群的遗传背景的特征。在第1阶段iSelect芯片研宄中，选择步骤一得到的761例 糖尿病前期患者中的477例进行基因分型实验。得到12个有统计学差异的相关位点。第 二阶段在步骤一剩余285例糖尿病前期患者中验证，用飞行质谱方法重复对这12个位点分 型，最后合并两次分型结果进行分析，得出与降糖疗效相关性最高的位点。
[0071] 吡格列酮干预有效的判定标准为：患者随访1年时逆转为糖耐量正常状态，采用 WHO 1999标准，在口服糖耐量实验中FPG < 6. lmmol/L且2hPG < 7. 8mmol/L为糖耐量正 常。
[0072] 实验流程如图1所示。
[0073] 三、研宄结果
[0074] 第一阶段使用iSelect定制芯片对3089个SNP位点进行分型，纳入分析检出率 彡90%同时次要等位基因频率（MF)彡1%的位点，共计782个SNP位点。全部结果采用 遗传学统计软件PLINK versionl. 07进行统计。
[0075] 以随访1年时，糖尿病前期状态逆转为糖耐量正常状态作为吡格列酮干预有效， 在校正性别、年龄、基线体质指数（BMI)和生活方式干预等混杂因素，进行logistic回归分 析，结果提示共有39个位点P〈0. 05,按照p值升序排列，选择前19个相关性最高的SNP位 点进行第二阶段MassARRAY飞行质谱分型验证。验证位点包括：rs2236135、rsl0849577、 rs683369、rs492594、rs8133052、rsl7036104、rs3788007、rs2276707、rsll807、rs4715332、 rsl800822、rs7294。在验证研宄中证实rs492594仍与糖尿病前期逆转存在相关性，且与第 一阶段研宄的结果一致（0R(95% Cl) = 1.634(1. 126-2. 357)，p = 9. 7XKT3)。
[0076] 合并第一阶段及第二阶段的数据后，分别在相加、隐性、显性遗传模式下，调整 性别、年龄和基线BMI后，对rs492594的次要等位基因 G和吡格列酮干预的疗效进行 logistic回归分析。发现rs492594的次要的等位基因 G对吡格列酮干预后逆转为糖耐量 正常是有利的（加性模式下(《(95%〇1)=1.499(1.214-1.852)，？=1.6\1〇- 4)，且？值 进一步下降。研宄结果如表1所示。
[0077] 表1 rs492594位点和吡格列酮干预有效相关性研宄结果#
[0078]
[0079] * :相加模式下，合并第一阶段及第二阶段数据后
[0080] 761例糖尿病前期患者中分型成功749例，145例样本为rs492594位点GG基因型， 366例样本为rs492594位点CC基因型，238例样本为rs492594位点GC基因型。
[0081] 比较携带rs492594不同基因型患者的血糖变化，结果如表2所示。可以发现，从 CC基因型、CG基因型到GG基因型，吡格列酮干预前后口服葡萄糖耐量试验（0GTT)2小时血 糖和糖化血红蛋白（HbAlc)下降的程度是逐渐增加的，GG基因型的糖尿病前期患者吡格列 酮干预前后0GTT2小时血糖和HbAlc下降的程度最为显著，其余依次是CG基因型、CC基因 型，吡格列酮干预前后0GTT2小时血糖和HbAlc下降的程度在不同基因型之间有显著性差 异。而基线临床特征在三个基因型之间没有差异，表明吡格列酮干预前后0GTT2小时血糖 和HbAlc下降与基线时的血糖水平无关。以上结果证明，携带G基因的糖尿病前期患者使 用吡格列酮后，血糖及HbAlc降低更明显，疗效更好。同时发现，GG基因型的糖尿病前期患 者使用吡格列酮干预后胰岛素抵抗（HOM-IR)改善最明显。
[0082] 表2 rs492594不同基因型间临床特征的相关指标的比车父
[0083]
[0085] *:H0MA-IR呈非正态分布，用中位数（四分位数间距）表示。P值为上述参数对数 转换后，经ANOVA分析得出。
[0086] 从上述结果可以看出，可以检测待测糖尿病患者rs492594基因型辅助检测吡格 列酮干预前后待测糖尿病患者血糖和/或HbAlc性状的方法，具体如下：
[0087] 检测吡格列酮干预前后待测糖尿病患者rs492594 SNP位点基因型，根据所述待 测糖尿病患者的基因型确定吡格列酮干预前后血糖和/或HbAlc性状：rs492594 SNP位点 GG基因型的待测糖尿病患者在吡格列酮干预后血糖和/或HbAlc下降程度高于或候选高于 rs492594 SNP位点CC基因型或rs492594 SNP位点GC基因型的待测糖尿病患者在吡格列 酮干预后血糖和/或HbAlc下降程度；所述GG基因型为rs492594SNP位点为G的纯合体， 所述GC基因型为rs492594SNP位点为G和C的杂合体，所述CC基因型为rs492594SNP位 点为C的纯合体；
[0088] 上述rS492594SNP位点的核苷酸为序列7的第501位核苷酸或G6PC2基因的 GenBank Accession Number NCBI Reference Sequence:NG_011682. 1(2014 年 5 月 4 日） 的第11427位脱氧核糖核苷酸。
[0089] 上述吡格列酮干预后血糖下降程度为【（吡格列酮干预前血糖与吡格列酮干预后 血糖的差值）/吡格列酮干预前血糖】*100% ;
[0090] 上述吡格列酮干预后HbAlc下降程度为【（吡格列酮干预前HbAlc与吡格列酮干 预后HbAlc的差值）/吡格列酮干预前HbAlc】*100%。
[0091] 上述血糖为0GTT2小时血糖。
[0092] 吡格列酮干预是指服用一年，每天剂量为30mg。
[0093] 因此，rs492594基因型的检测可用于筛选对吡格列酮相对敏感的糖尿病前期患 者，提高个体化治疗水平。
[0094] rs492594是人2号染色体上的一个单核苷酸多态性位点，该位点变异是转换G/ C(在其互补链上则为C/G)。rs492594位点的基因型是CC、CG或GG。所述CC是rs492594 位点为C的纯合型，所述GG是rs492594位点为G的纯合型，所述CG是rs492594位点为G 和C的杂合型。检测人基因组中rs492594的多态性（即等位基因）或基因型具体可为检 测rs492594的核苷酸种类。
[0095] 实施例2、rs492594位点的基因型检测
[0096] -、rs492594位点的基因型检测的引物设计
[0097] 1、检测原理
[0098] rs492594位点通常是用芯片检测及飞行质谱的方法进行分型的，该方法复杂适 用于多位点及高通量的研宄，但对于分型位点及例数均较少的研宄来说实验条件及成本较 高，不利于临床检测的开展。在此研宄结果的基础上，设计一种方便实用的试剂盒十分必 要。
[0099] 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP)作 为第一代分子生物学标记广泛应用于生物学研宄，成本较低，操作简单，一般实验室均可进 行操作。实验原理为：DNA限制性核酸内切酶具有识别特定的DNA序列并在特定的部位切 断DNA双链的活性，DNA分子由于突变（核苷酸的置换、插入或缺失）改变（或形成）了限 制性核酸内切酶的识别序列，使DNA限制性核酸内切酶能或不能将靶DNA片段切断，可通过 电泳检测DNA片段长短判断特定位置的核苷酸类型。
[0100] 2、rs492594不具备限制性核酸内切酶的识别位点
[0101] 检索发现rs570876和rs492594存在连锁不平衡（r2= I)，rs570876位点A等位 基因（rs570876-A)和rs492594位点G等位基因（rs492594-C)构成单倍型，即rs570876-A 和rs492594-G可以相互替代。
[0102] rs570876是人2号染色体上的一个单核苷酸多态性位点，该变异是转换A/T(在 其互补链上则为T/A)。rs570876位点的基因型是AA、TT或AT。所述AA是rs570876位点 为A的纯合型，所述TT是rs570876位点为T的纯合型，所述AT是rs570876位点为A和 T的杂合型。检测人基因组中rs570876的多态性（即等位基因）或基因型具体可为检测 rs570876的核苷酸种类。
[0103] 由此得出，rs570876位点的基因型AA对应于rs492594位点的基因型GG， rs570876位点的基因型TT对应于rs492594位点的基因型CC，rs570876位点的基因型AT对 应于rs492594位点的基因型GC，所以可以通过检测rs570876位点的基因型确定rs492594 位点的基因型。
[0104] rs570876位点位于限制性核酸内切酶ApoI的识别序列内，故针对rs570876位点 设计PCR引物及限制性核酸内切酶类型。
[0105] 3、针对rs570876位点的PCR引物
[0106] 正向引物：5 ' -CCTGCATGTATGTGTGGGGT-3 ' ；（序列 1)
[0107] 反向引物：5' -TCTTCTTAAGGCCAGGCTGC-3'。（序列 2)
[0108] 二、rs570876位点基因型检测确定rs492594位点的基因型
[0109] 1、PCR 扩增
[0110] 分别以检测对象的基因组DNA为模板，步骤一的正向引物和反向引物为引物进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物，PCR扩增产物由序列3和序列4所示的DNA分子中的至少一 种组成，共有如下三种情况：
[0111] A、PCR扩增产物均为序列3所示的DNA分子；
[0112] B、PCR扩增产物均为序列4所示的DNA分子；
[0113] C、PCR扩增产物为序列3所示的DNA分子和序列4所示的DNA分子。
[0114] PCR扩增产物自5'末端起第308位为SNP位点，具备A或T两种核苷酸类型。若 该SNP位点处为A时，ApoI可将PCR扩增产物中含有该位点的序列（即序列3所示的序列） 切开，若该SNP位点处为T时，ApoI则不能将PCR扩增产物中含有该位点的序列（即序列4 所示的序列）切开。
[0115] 2、ApoI 酶切
[0116] 将各PCR扩增产物用ApoI酶切，得到各酶切产物，将各酶切产物进行2%的琼脂糖 凝胶（琼脂糖与电泳缓冲液的比例为2g :100ml)电泳，出现如下（1)-(3)种情况：
[0117] (1)酶切产物为两条条带且条带位于307bp及396bp左右；
[0118] (2)酶切产物为一条条带且条带位于700bp左右；
[0119] (3)酶切产物为三条条带，条带位置分别约在307bp、350bp及700bp。
[0120] 将各酶切产物的条带进行测序，结果如下：
[0121] 糖尿病前期患者中rs492594位点GG基因型患者离体血液样本对应的酶切产物为 307bp及396bp条带两种不同的DNA分子，分别为序列5(307bp)和序列6(396bp)所示的 DNA分子，酶切对应的PCR扩增产物为步骤1中A所示的情形，即PCR扩增产物均为序列3 所示的DNA分子，表明该糖尿病前期患者rs570876位点基因型为AA ;
[0122] 糖尿病前期患者中rs492594位点CC基因型患者离体血液样本对应的酶切产物为 700bp左右的条带，为序列4所示的DNA分子，酶切对应的PCR扩增产物为步骤1中B所示 的情形，即PCR扩增产物均为序列4所示的DNA分子，表明该糖尿病前期患者中rs570876 位点基因型为TT ;
[0123] 糖尿病前期患者中rs492594位点GC基因型患者离体血液样本对应的酶切产物 为307bp、396bp和700bp的条带，为3种不同的DNA分子，分别为序列5(307bp)和序列 6 (396bp)所示的DNA分子、序列4所示（700bp)的DNA分子，对应的PCR扩增产物为步骤1 中C所示的情形，即PCR扩增产物为序列3所示的DNA分子和序列4所示的DNA分子，表明 该糖尿病前期患者中rs570876位点基因型为AT。
[0124] 因此，可以通过检测待测糖尿病前期患者基因组DNA中rs570876SNP位点基因型 确定该待测糖尿病前期患者rs492594SNP位点基因型，若待测糖尿病前期患者基因组DNA 中rs570876SNP位点基因型为AA，则该待测糖尿病前期患者rs492594SNP位点基因型为 GG，若待测糖尿病前期患者基因组DNA中rs570876SNP位点基因型为TT，则该待测糖尿病前 期患者rs492594SNP位点基因型为CC，若待测糖尿病前期患者基因组DNA中rs570876SNP 位点基因型为AT，则该待测糖尿病前期患者rs492594SNP位点基因型为GC。
[0125] 上述该待测糖尿病前期患者rs492594SNP位点基因型方法具体如下：以待测糖尿 病前期患者基因组DNA为模板，以序列1和序列2所示的DNA分子为引物进行PCR扩增，得 到PCR扩增产物，再将PCR扩增产物用ApoI酶切，得到酶切产物；
[0126] 检测酶切产物大小，
[0127] 如果酶切产物为序列5 (307bp)和序列6 (396bp)所示的两种DNA分子，则PCR扩增 产物均为序列3所示的DNA分子，则所检测患者的rs570897基因型为AA，rs492594基因型 为GG ;如果酶切产物为序列4 (703bp)所示的DNA分子，则PCR扩增产物均为序列4所示的 DNA分子，所检测患者的rs570897基因型为TT，rs492594基因型为CC ;如果酶切产物为序 列5 (307bp)、序列6 (396bp)、序列4 (703bp)所示的三种DNA分子，则PCR扩增产物为序列3 所示的DNA分子和序列4所示的DNA分子，所检测患者的rs570897基因型为AT，rs492594 基因型为CG。将该种检测方法命名为rs492594的基因型的RFLP检测方法。
[0128] 三、rs492594的基因型的RFLP检测方法验证
[0129] (一）对步骤一中761例糖尿病前期患者的基因组DNA随机选取已有芯片结果的 96例患者DNA样本。在rs492594位点进行检测分型，得到各患者的rs492594位点的基因 型检测结果。
[0130] (二）分别以所检测的96例基因组DNA为模板，以序列1和序列2所示的DNA分 子为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，将PCR扩增产物用ApoI酶切，得到酶切产物； 并对酶切产物进行测序分析，按照如下判断标准对所检测的患者在rs492594处进行基因 型的判断：
[0131] 如果酶切产物为序列5(307bp)和序列6(396bp)所示的DNA分子，则对应的PCR 扩增产物均为序列3所示的DNA分子，所检测患者的rs570897基因型为AA，rs492594基因 型为GG ;
[0132] 如果酶切产物为序列4 (703bp)所示的DNA分子，则对应的PCR扩增产物均为序列 4所示的DNA分子，所检测患者的rs570897基因型为TT，rs492594基因型为CC ;
[0133] 如果酶切产物为序列5(307bp)、序列6(396bp)、序列4(703bp)所示，对应的PCR 扩增产物为序列3所示的DNA分子和序列4所示的DNA分子，所检测患者的rs570897基因 型为AT，rs492594基因型为CG。
[0134] 结果如图2所示：
[0135] 图2A为iSelect芯片检测rs492594基因型为CC患者的rs570897基因型测序结 果；
[0136] 图2B为iSelect芯片检测rs492594基因型为CC患者的rs570897基因型酶切电 泳结果；
[0137] 图2C为iSelect芯片检测rs492594基因型为GG患者的rs570897基因型测序结 果；
[0138] 图2D为iSelect芯片检测rs492594基因型为GG患者的rs570897基因型酶切电 泳结果；
[0139] 图2E为iSelect芯片检测rs492594基因型为GC患者的rs570897基因型测序结 果；
[0140] 图2F为iSelect芯片检测rs492594基因型为GC患者的rs570897基因型酶切电 泳结果；
[0141] 图2G为酶切电泳示意图；
[0142] 统计，所检测的96例患者中11例在rs570897处的基因型为AA，则其在rs492594 处的基因型为GG，与iSelect芯片检测rs492594处的基因型100%-致；
[0143] 所检测的96例患者中45例在rs570897处的基因型为AT，则其在rs492594处的 基因型为GC，与iSelect芯片检测rs492594处的基因型100%-致；
[0144] 所检测的96例患者中40例在rs570897处的基因型为TT，则其在rs492594处的 基因型为CC，与iSelect芯片检测rs492594处的基因型100%-致。
[0145] 实验证明，上述rs492594的基因型的RFLP检测方法可以可靠、简便、经济、快速的 进行rs492594位点的基因型检测。
【主权项】
1. 检测人基因组中rs492594SNP位点的基因型的产品或检测人基因组中rs570876SNP 位点的基因型的产品在制备预测吡格列酮干预后对人的降血糖效果的产品中的应用。2. 检测人基因组中rs492594SNP位点的基因型的产品或检测人基因组中rs570876SNP 位点的基因型的产品在制备筛查对吡格列酮敏感的糖尿病前期患者的产品中的应用。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述产品为序列1和序列2所示的 DNA分子。4. 检测人基因组中rs570876SNP位点的基因型的产品在制备检测人基因组中 rs492594SNP位点的基因型的产品中的应用。5. -种检测人基因组中rs492594SNP位点的基因型的方法，为如下1)或2): 1) 直接测序； 2)检测待测人基因组中rs570876SNP位点的基因型，根据所述待测人基因组中 rs570876SNP位点的基因型确定所述待测人基因组中rs492594SNP位点的基因型。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于： 2)所示的方法包括如下步骤： 1) 用扩增含有rs570876SNP位点DNA片段的引物对所述待测人基因组DNA进行PCR扩 增，得到PCR扩增产物； 2) 用ApoI酶切所述PCR产物，得到酶切产物，根据所述酶切产物大小判断所述待测 人基因组中rs570876SNP位点的基因型，再根据所述rs570876SNP位点的基因型确定所述 rs492594SNP位点的基因型。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于： 所述扩增含有rs492594SNP位点DNA片段的引物对由序列1所示的DNA分子和序列2 所示的DNA分子组成； 所述根据所述酶切产物大小判断所述待测人基因组中rs570876SNP位点的基因型，再 根据所述rs570876SNP位点的基因型确定所述rs492594SNP位点的基因型为如下：若所 述酶切产物仅含有307bp和396bp大小的目的片段，则所述人基因组中rs570876SNP位点 的基因型为AA，所述人基因组中rs492594SNP位点的基因型为GG;若所述酶切产物含有 307bp、396bp和703bp3条DNA片段，则所述人基因组中rs570876SNP位点的基因型为AT， 所述人基因组中rs492594SNP位点的基因型为GC;若所述酶切产物仅含有703bpDNA片段， 则所述人基因组中rs570876SNP位点的基因型为TT，所述人基因组中rs492594SNP位点的 基因型为CC。8.人基因组中rs570876位点的基因型和/或rs492594位点的基因型在制备预测吡格 列酮对人的降血糖效果的产品中的应用； 或， 人基因组中rs570876位点的基因型和/或rs492594位点的基因型在制备筛查对吡格 列酮敏感的糖尿病患者的产品中的应用。9.检测人基因组中rs492594位点的基因型和/或检测人基因组中rs570876位点的基 因型的产品，其包含扩增包含rs570876位点及紧邻该位点的3'下游5个核苷酸的人基因 组DNA片段的PCR引物； 所述PCR引物具体为序列1所示的DNA分子和序列2所示的DNA分子组成的引物对。
【专利摘要】本发明公开了一种rs492594的基因型的检测方法及其应用。本发明提供了检测人基因组中rs492594SNP位点的基因型的产品或检测人基因组中rs570876SNP位点的基因型的产品在制备预测吡格列酮干预后对人的降血糖效果的产品中的应用。本发明证明，糖尿病患者rs492594处的基因型与吡格列酮的降血糖效果相关，rs492594的检测可用于筛选对吡格列酮相对敏感的2型糖尿病患者，可根据糖尿病患者rs492594处的基因型选择适合的降血糖药物，提高个体化治疗水平。本发明进一步公开了rs492594处的基因型的限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)方法，该方法可以可靠、简便、经济、快速的鉴定rs492594位点的基因型。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104894250
【申请号】CN201510275993
【发明人】纪立农, 刘昭前
【申请人】北京大学人民医院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月26日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种rs492594的基因型的检测方法及其应用，属于生物医药领域，
【背景技术】
[0002] 噻唑烷二酮类药物又称为胰岛素增敏剂，是临床上常用的口服降糖药物。噻唑 烷二酮类药物包括吡格列酮、曲格列酮、罗格列酮等，这些药物具有相似的化学结构，即2， 4-噻唑烷二酮结构，不同的药物区别在于具有不同的侧链取代基。但是这些化合药物的安 全性不尽相同，目前仍在临床上广泛使用的只有吡格列酮。噻唑烷二酮类药物是过氧化物 酶体增殖物激活受体γ (PPARy)激动剂。PPARy激活后发生结构上的变化，可招募多种共 激活物与之结合，发挥不同的生物学作用，包括增加外周组织的胰岛素敏感性，减轻骨骼肌 和肝脏的脂肪沉积，促进骨骼肌对循环中葡萄糖的利用，抑制肝糖输出。也有研宄提示噻唑 烷二酮类药物可保护胰腺β细胞功能。
[0003] 目前临床上虽然有多种口服降糖药物，但是一方面难以做到个体化治疗使药物发 挥最大疗效，另一方面由于副作用的发生限制了某些降糖药物的使用。药物作用差异主要 是个体在药物效应和代谢相关的遗传背景差异所决定的。通过研宄口服降糖药物的药物遗 传学，可以采用遗传信息为个体化用药提供理论依据。吡格列酮是目前市场上仍在使用的 噻唑烷二酮类药物。研宄显示，它除了降低血糖、延缓糖尿病前期进展为糖尿病，还有抗炎 和抗动脉粥样硬化，具有潜在的心血管保护作用。同时也有导致水肿、体重增加、骨折风险 增加和心力衰竭的不良反应。吡格列酮的适应症是所有2型糖尿病，但由于2型糖尿病病 因和发病机制的异质性，如果不加细分，必然有少部分病人出现不良反应或疗效不佳，导致 患者医疗费用增加和因不良反应导致的身心危害。因此，找出对该药敏感的2型糖尿病特 殊群体，使用个体化的药物剂量，可能对病人带来更多收益。
[0004] G6PC2基因位于2q24. 3,编码葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基2。该蛋白在胰腺β细 胞特异性表达，细胞研宄中并没有发现该蛋白有磷酸水解酶的活性，而是细胞免疫介导的 自身免疫性糖尿病的主要靶蛋白。在动物实验中敲除G6PC2基因后导致葡萄糖激酶的相 对活化，改变了葡萄糖刺激的胰岛素分泌状态。国内外多项2型糖尿病人群中的研宄曾发 现G6PC2基因和空腹血糖或2型糖尿病发病风险相关。其中一个SNP位点rs492594位于 G6PC2基因的第5号外显子上，是一个错义突变（c. 655G > C，Val219Leu)，根据PubMed中 国人分型数据，rs492594的次要等位基因 G频率为0. 463。
【发明内容】
[0005] 本发明一个所要解决的技术问题是预测吡格列酮的降血糖效果。
[0006] 为了解决以上技术问题，本发明提供检测人基因组中rs492594SNP位点的基因型 的产品或检测人基因组中rs570876SNP位点的基因型的产品在制备预测吡格列酮干预后 对人的降血糖效果的产品中的应用。
[0007] 上述应用具体体现在如下：
[0008] rs492594 SNP位点GG基因型的待测糖尿病患者在吡格列酮干预后血糖下降程 度、HbAlc下降程度和/或胰岛素抵抗水平下降程度高于或候选高于rs492594 SNP位点 CC基因型或rs492594 SNP位点GC基因型的待测糖尿病患者在吡格列酮干预后血糖下降 程度、HbAlc (糖化血红蛋白）下降程度和/或胰岛素抵抗水平下降程度；所述GG基因型为 rs492594SNP位点为G的纯合体，所述GC基因型为rs492594SNP位点为G和C的杂合体，所 述CC基因型为rs492594SNP位点为C的纯合体；
[0009] rs570876 SNP位点AA基因型的待测糖尿病患者在吡格列酮干预后血糖下降程 度、HbAlc下降程度和/或胰岛素抵抗水平下降程度高于或候选高于rs570876 SNP位点 TT基因型或rs570876 SNP位点AT基因型的待测糖尿病患者在吡格列酮干预后血糖下降 程度、HbAlc (糖化血红蛋白）下降程度和/或胰岛素抵抗水平下降程度；所述AA基因型为 rs570876SNP位点为A的纯合体，所述AT基因型为rs570876SNP位点为A和T的杂合体，所 述TT基因型为rs570876SNP位点为T的纯合体；
[0010] 上述吡格列酮干预后血糖下降程度为【（吡格列酮干预前血糖与吡格列酮干预后 血糖的差值）/吡格列酮干预前血糖】*100% ;
[0011] 上述吡格列酮干预后HbAlc下降程度为【（吡格列酮干预前HbAlc与吡格列酮干 预后HbAlc的差值）/吡格列酮干预前HbAlc】*100%。
[0012] 上述血糖为0GTT2小时血糖。
[0013] 啦格列酮干预是指服用一年，每天剂量为30mg。
[0014] 上述降血糖效果体现在如下（1)-(3)其中至少任一所示：
[0015] (1)吡格列酮干预后人的血糖浓度下降程度；
[0016] ⑵吡格列酮干预后人的糖化血红蛋白浓度下降程度；
[0017] (3)吡格列酮干预后人的胰岛素抵抗水平下降程度；
[0018] 降血糖效果好体现在如下A' -C'其中至少任一所示：
[0019] A'、吡格列酮干预后人的血糖浓度下降程度高；
[0020] B'、吡格列酮干预后人的糖化血红蛋白浓度下降程度高；
[0021] C'、吡格列酮干预后人的胰岛素抵抗水平下降程度高。
[0022] 吡格列酮对rs492594位点的基因型为GG的人的降血糖效果好于吡格列酮对 rs492594位点的基因型为CG或CC的人的降血糖效果。
[0023] 吡格列酮对rs570876位点的基因型为AA的人的降血糖效果好于吡格列酮对 rs492594位点的基因型为AT或TT的人的降血糖效果。
[0024] 本发明另一个所要解决的技术问题是筛查对吡格列酮敏感的糖尿病前期患者。
[0025] 为了解决以上技术问题，本发明提供检测人基因组中rs492594SNP位点的基因型 的产品或检测人基因组中rs570876SNP位点的基因型的产品在制备筛查对吡格列酮敏感 的糖尿病前期患者的产品中的应用。
[0026] 对吡格列酮相对敏感的糖尿病前期患者体现在吡格列酮干预后血糖下降程度高、 HbAlc下降程度高和/或胰岛素抵抗水平下降程度高。
[0027] 上述应用中，所述产品为序列1和序列2所示的DNA分子。
[0028] 本发明第三个所要解决的技术问题是检测人基因组中rs492594SNP位点的基因 型。
[0029] 为了解决以上技术问题，本发明提供检测人基因组中rs570876SNP位点的基因型 的产品在制备检测人基因组中rs492594SNP位点的基因型的产品中的应用。
[0030] 本发明第四个所要解决的技术问题是检测人基因组中rs492594SNP位点的基因 型。
[0031] 为了解决以上技术问题，本发明提供一种检测人基因组中rs492594SNP位点的基 因型的方法，1)直接测序；
[0032] 2)检测待测人基因组中rs570876SNP位点的基因型，根据所述待测人基因组中 rs570876SNP位点的基因型确定所述待测人基因组中rs492594SNP位点的基因型。
[0033] 上述2)所示的方法，包括如下步骤：
[0034] 1)用扩增含有rs570876SNP位点DNA片段的引物对所述待测人基因组DNA进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物；
[0035] 2)用ApoI酶切所述PCR产物，得到酶切产物，根据所述酶切产物大小判断所述待 测人基因组中rs570876SNP位点的基因型，再根据所述rs570876SNP位点的基因型确定所 述rs492594SNP位点的基因型。
[0036] 上述方法中，所述扩增含有rs492594SNP位点DNA片段的引物对由序列1所示的 DNA分子和序列2所不的DNA分子组成；
[0037] 所述根据所述酶切产物大小判断所述待测人基因组中rs570876SNP位点的基因 型，再根据所述rs570876SNP位点的基因型确定所述rs492594SNP位点的基因型为如下：若 所述酶切产物仅含有307bp和396bp大小的目的片段，则所述人基因组中rs570876SNP位 点的基因型为AA，所述人基因组中rs492594SNP位点的基因型为GG ;若所述酶切产物含有 307bp、396bp和703bp 3条DNA片段，则所述人基因组中rs570876SNP位点的基因型为AT， 所述人基因组中rs492594SNP位点的基因型为GC ;若所述酶切产物仅含有703bp DNA片段， 则所述人基因组中rs570876SNP位点的基因型为TT，所述人基因组中rs492594SNP位点的 基因型为CC。
[0038] 所述rs570876SNP位点的核苷酸为序列3或序列4的第308位核苷酸；
[0039] 所述rS492594SNP位点的核苷酸为序列7的第501位核苷酸或G6PC2基因的 GenBank Accession Number NCBI Reference Sequence:NG_011682. 1(2014 年 5 月 4 日） 的第11427位脱氧核糖核苷酸。
[0040] 所述方法为非诊断目的和非治疗目的的方法。
[0041] 所述307bp大小的目的片段的核苷酸序列为序列5 ;
[0042] 所述396bp大小的目的片段的核苷酸序列为序列6 ;
[0043] 所述703bp大小的目的片段的核苷酸序列为序列4所示的DNA分子。
[0044] 本发明第五个所要解决的技术问题是制备预测吡格列酮对人的降血糖效果的产 品或制备筛查对吡格列酮敏感的糖尿病患者产品。
[0045] 为了解决以上技术问题，本发明提供了人基因组中rs570876位点的基因型和/或 rs492594位点的基因型在制备预测吡格列酮对人的降血糖效果的产品中的应用；
[0046] 或，
[0047] 人基因组中rs570876位点的基因型和/或rs492594位点的基因型在制备筛查对 吡格列酮敏感的糖尿病患者的产品中的应用。
[0048] 本发明第六个所要解决的技术问题是检测人基因组中rs492594位点的基因型和 /或检测人基因组中rs570876位点的基因型的产品。
[0049] 为了解决以上技术问题，本发明提供了检测人基因组中rs492594位点的基因型 和/或检测人基因组中rs570876位点的基因型的产品，其包含扩增包含rs570876位点及 紧邻该位点的3'下游5个核苷酸的人基因组DNA片段的PCR引物；
[0050] 所述PCR引物具体为序列1所示的DNA分子和序列2所示的DNA分子组成的引物 对。
[0051 ] 上述的应用、方法或产品中，所述人为糖尿病患者。
[0052] 所述糖尿病患者具体为糖尿病前期患者。
[0053] 所述rs570876和所述rs492594存在连锁不平衡（r2= I)，rs570876位点A等位 基因（rs570876-A)和rs492594位点G等位基因（rs492594-C)构成单倍型。
[0054] 上述任一所述的应用或产品中，所述产品可为试剂或试剂盒，还可为试剂或试剂 盒和仪器的组合产品，如由引物和DNA测序仪组成的组合产品，由PCR试剂和DNA测序试剂 和DNA测序仪组成的组合产品；
[0055] 所述rs492594是人染色体2上的一个二等位多态性的SNP位点，该变异是转换G/ C(在其互补链上则为C/G) ;rs492594位点的基因型为CC、CG或GG ;所述CC是rs492594 位点为C的纯合型，所述GG是rs492594位点为G的纯合型，所述CG是rs492594位点为G 和C的杂合型，所述检测人基因组中rs492594位点的基因型具体可为检测rs492594位点 的核苷酸种类；
[0056] 所述rs570876是人染色体2上的一个二等位多态性的SNP位点，该变异是转换A/ T(在其互补链上则为T/A) ;rs570876位点的基因型为AA、TT或AT ;所述AA是rs570876 位点为A的纯合型，所述TT是rs570876位点为T的纯合型，所述AT是rs570876位点为A 和T的杂合型，检测人基因组中rs570876位点的基因型具体可为检测rs570876位点的核 苷酸种类；
[0057] 本发明证明，rs492594处的基因型为GG的糖尿病前期患者使用吡格列酮后血糖 及HbAlc(糖化血红蛋白）降低的程度显著大于rs492594处的基因型为CG或CC的糖尿 病前期患者，糖尿病前期患者rs492594处的基因型与吡格列酮的降糖效果相关，rs492594 基因型的检测可用于筛选对吡格列酮相对敏感的糖尿病前期患者，可根据糖尿病前期患 者rs492594处的基因型选择适合的降血糖药物，提高个体化治疗水平。本发明进一步 提供了 rs492594处的基因型的限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析方法，该方法可以可靠、简便、经济、快速的鉴定rs492594位点的 基因型。
【附图说明】
[0058] 图1为吡格列酮的药物遗传学研宄流程图。
[0059] 图2为芯片分型结果与本发明的RFLP分型结果比较。
【具体实施方式】
[0060] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0061] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0062] 下述实施例中的患者均为糖尿病前期患者。
[0063] 实施例1、吡格列酮对不同基因型糖尿病患者治愈效果的研宄
[0064] 伦理声明
[0065] 本研宄通过了北京大学医学部伦理委员会（IRB)批准，所有糖尿病前期患者均签 署了知情同意书。
[0066] 一、临床数据和生物样本的收集
[0067] 开展吡格列酮药物临床试验，建立研宄队列，收集各个阶段的临床数据和生物样 本。
[0068] 该研宄是一项随机、药物双盲、平行、安慰剂对照的前瞻性多中心临床试验。按照 WH01999诊断标准，纳入糖尿病前期患者1903人，其中使用吡格列酮953人（吡格列酮服用 剂量为30mg/d，全部受试者完成一年的随访。收集受试者的基线及随访数据，包括患者的身 高、体重、腰围、臀围，空腹血糖、HbAlc (糖化血红蛋白），空腹C肽，空腹胰岛素，餐后2小时 血糖，血脂、尿微量白蛋白等。在去除第1年随访时脱落以及基线资料不全的样本，最后入 选例数为761例使用吡格列酮糖尿病前期患者。
[0069] 二、芯片设计和基因分型
[0070] 本研宄分别运用Illumina公司的Infinium HD iSelect定制芯片（货号为 WG-401-1004)及MassARRAY飞行质谱进行SNP位点分型。iSelect定制芯片包括药代动力 学及糖尿病候选基因相关位点，覆盖了几乎所有与药物代谢有关的基因位点，又兼顾了中 国汉族人群的遗传背景的特征。在第1阶段iSelect芯片研宄中，选择步骤一得到的761例 糖尿病前期患者中的477例进行基因分型实验。得到12个有统计学差异的相关位点。第 二阶段在步骤一剩余285例糖尿病前期患者中验证，用飞行质谱方法重复对这12个位点分 型，最后合并两次分型结果进行分析，得出与降糖疗效相关性最高的位点。
[0071] 吡格列酮干预有效的判定标准为：患者随访1年时逆转为糖耐量正常状态，采用 WHO 1999标准，在口服糖耐量实验中FPG < 6. lmmol/L且2hPG < 7. 8mmol/L为糖耐量正 常。
[0072] 实验流程如图1所示。
[0073] 三、研宄结果
[0074] 第一阶段使用iSelect定制芯片对3089个SNP位点进行分型，纳入分析检出率 彡90%同时次要等位基因频率（MF)彡1%的位点，共计782个SNP位点。全部结果采用 遗传学统计软件PLINK versionl. 07进行统计。
[0075] 以随访1年时，糖尿病前期状态逆转为糖耐量正常状态作为吡格列酮干预有效， 在校正性别、年龄、基线体质指数（BMI)和生活方式干预等混杂因素，进行logistic回归分 析，结果提示共有39个位点P〈0. 05,按照p值升序排列，选择前19个相关性最高的SNP位 点进行第二阶段MassARRAY飞行质谱分型验证。验证位点包括：rs2236135、rsl0849577、 rs683369、rs492594、rs8133052、rsl7036104、rs3788007、rs2276707、rsll807、rs4715332、 rsl800822、rs7294。在验证研宄中证实rs492594仍与糖尿病前期逆转存在相关性，且与第 一阶段研宄的结果一致（0R(95% Cl) = 1.634(1. 126-2. 357)，p = 9. 7XKT3)。
[0076] 合并第一阶段及第二阶段的数据后，分别在相加、隐性、显性遗传模式下，调整 性别、年龄和基线BMI后，对rs492594的次要等位基因 G和吡格列酮干预的疗效进行 logistic回归分析。发现rs492594的次要的等位基因 G对吡格列酮干预后逆转为糖耐量 正常是有利的（加性模式下(《(95%〇1)=1.499(1.214-1.852)，？=1.6\1〇- 4)，且？值 进一步下降。研宄结果如表1所示。
[0077] 表1 rs492594位点和吡格列酮干预有效相关性研宄结果#
[0078]
[0079] * :相加模式下，合并第一阶段及第二阶段数据后
[0080] 761例糖尿病前期患者中分型成功749例，145例样本为rs492594位点GG基因型， 366例样本为rs492594位点CC基因型，238例样本为rs492594位点GC基因型。
[0081] 比较携带rs492594不同基因型患者的血糖变化，结果如表2所示。可以发现，从 CC基因型、CG基因型到GG基因型，吡格列酮干预前后口服葡萄糖耐量试验（0GTT)2小时血 糖和糖化血红蛋白（HbAlc)下降的程度是逐渐增加的，GG基因型的糖尿病前期患者吡格列 酮干预前后0GTT2小时血糖和HbAlc下降的程度最为显著，其余依次是CG基因型、CC基因 型，吡格列酮干预前后0GTT2小时血糖和HbAlc下降的程度在不同基因型之间有显著性差 异。而基线临床特征在三个基因型之间没有差异，表明吡格列酮干预前后0GTT2小时血糖 和HbAlc下降与基线时的血糖水平无关。以上结果证明，携带G基因的糖尿病前期患者使 用吡格列酮后，血糖及HbAlc降低更明显，疗效更好。同时发现，GG基因型的糖尿病前期患 者使用吡格列酮干预后胰岛素抵抗（HOM-IR)改善最明显。
[0082] 表2 rs492594不同基因型间临床特征的相关指标的比车父
[0083]
[0085] *:H0MA-IR呈非正态分布，用中位数（四分位数间距）表示。P值为上述参数对数 转换后，经ANOVA分析得出。
[0086] 从上述结果可以看出，可以检测待测糖尿病患者rs492594基因型辅助检测吡格 列酮干预前后待测糖尿病患者血糖和/或HbAlc性状的方法，具体如下：
[0087] 检测吡格列酮干预前后待测糖尿病患者rs492594 SNP位点基因型，根据所述待 测糖尿病患者的基因型确定吡格列酮干预前后血糖和/或HbAlc性状：rs492594 SNP位点 GG基因型的待测糖尿病患者在吡格列酮干预后血糖和/或HbAlc下降程度高于或候选高于 rs492594 SNP位点CC基因型或rs492594 SNP位点GC基因型的待测糖尿病患者在吡格列 酮干预后血糖和/或HbAlc下降程度；所述GG基因型为rs492594SNP位点为G的纯合体， 所述GC基因型为rs492594SNP位点为G和C的杂合体，所述CC基因型为rs492594SNP位 点为C的纯合体；
[0088] 上述rS492594SNP位点的核苷酸为序列7的第501位核苷酸或G6PC2基因的 GenBank Accession Number NCBI Reference Sequence:NG_011682. 1(2014 年 5 月 4 日） 的第11427位脱氧核糖核苷酸。
[0089] 上述吡格列酮干预后血糖下降程度为【（吡格列酮干预前血糖与吡格列酮干预后 血糖的差值）/吡格列酮干预前血糖】*100% ;
[0090] 上述吡格列酮干预后HbAlc下降程度为【（吡格列酮干预前HbAlc与吡格列酮干 预后HbAlc的差值）/吡格列酮干预前HbAlc】*100%。
[0091] 上述血糖为0GTT2小时血糖。
[0092] 吡格列酮干预是指服用一年，每天剂量为30mg。
[0093] 因此，rs492594基因型的检测可用于筛选对吡格列酮相对敏感的糖尿病前期患 者，提高个体化治疗水平。
[0094] rs492594是人2号染色体上的一个单核苷酸多态性位点，该位点变异是转换G/ C(在其互补链上则为C/G)。rs492594位点的基因型是CC、CG或GG。所述CC是rs492594 位点为C的纯合型，所述GG是rs492594位点为G的纯合型，所述CG是rs492594位点为G 和C的杂合型。检测人基因组中rs492594的多态性（即等位基因）或基因型具体可为检 测rs492594的核苷酸种类。
[0095] 实施例2、rs492594位点的基因型检测
[0096] -、rs492594位点的基因型检测的引物设计
[0097] 1、检测原理
[0098] rs492594位点通常是用芯片检测及飞行质谱的方法进行分型的，该方法复杂适 用于多位点及高通量的研宄，但对于分型位点及例数均较少的研宄来说实验条件及成本较 高，不利于临床检测的开展。在此研宄结果的基础上，设计一种方便实用的试剂盒十分必 要。
[0099] 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP)作 为第一代分子生物学标记广泛应用于生物学研宄，成本较低，操作简单，一般实验室均可进 行操作。实验原理为：DNA限制性核酸内切酶具有识别特定的DNA序列并在特定的部位切 断DNA双链的活性，DNA分子由于突变（核苷酸的置换、插入或缺失）改变（或形成）了限 制性核酸内切酶的识别序列，使DNA限制性核酸内切酶能或不能将靶DNA片段切断，可通过 电泳检测DNA片段长短判断特定位置的核苷酸类型。
[0100] 2、rs492594不具备限制性核酸内切酶的识别位点
[0101] 检索发现rs570876和rs492594存在连锁不平衡（r2= I)，rs570876位点A等位 基因（rs570876-A)和rs492594位点G等位基因（rs492594-C)构成单倍型，即rs570876-A 和rs492594-G可以相互替代。
[0102] rs570876是人2号染色体上的一个单核苷酸多态性位点，该变异是转换A/T(在 其互补链上则为T/A)。rs570876位点的基因型是AA、TT或AT。所述AA是rs570876位点 为A的纯合型，所述TT是rs570876位点为T的纯合型，所述AT是rs570876位点为A和 T的杂合型。检测人基因组中rs570876的多态性（即等位基因）或基因型具体可为检测 rs570876的核苷酸种类。
[0103] 由此得出，rs570876位点的基因型AA对应于rs492594位点的基因型GG， rs570876位点的基因型TT对应于rs492594位点的基因型CC，rs570876位点的基因型AT对 应于rs492594位点的基因型GC，所以可以通过检测rs570876位点的基因型确定rs492594 位点的基因型。
[0104] rs570876位点位于限制性核酸内切酶ApoI的识别序列内，故针对rs570876位点 设计PCR引物及限制性核酸内切酶类型。
[0105] 3、针对rs570876位点的PCR引物
[0106] 正向引物：5 ' -CCTGCATGTATGTGTGGGGT-3 ' ；（序列 1)
[0107] 反向引物：5' -TCTTCTTAAGGCCAGGCTGC-3'。（序列 2)
[0108] 二、rs570876位点基因型检测确定rs492594位点的基因型
[0109] 1、PCR 扩增
[0110] 分别以检测对象的基因组DNA为模板，步骤一的正向引物和反向引物为引物进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物，PCR扩增产物由序列3和序列4所示的DNA分子中的至少一 种组成，共有如下三种情况：
[0111] A、PCR扩增产物均为序列3所示的DNA分子；
[0112] B、PCR扩增产物均为序列4所示的DNA分子；
[0113] C、PCR扩增产物为序列3所示的DNA分子和序列4所示的DNA分子。
[0114] PCR扩增产物自5'末端起第308位为SNP位点，具备A或T两种核苷酸类型。若 该SNP位点处为A时，ApoI可将PCR扩增产物中含有该位点的序列（即序列3所示的序列） 切开，若该SNP位点处为T时，ApoI则不能将PCR扩增产物中含有该位点的序列（即序列4 所示的序列）切开。
[0115] 2、ApoI 酶切
[0116] 将各PCR扩增产物用ApoI酶切，得到各酶切产物，将各酶切产物进行2%的琼脂糖 凝胶（琼脂糖与电泳缓冲液的比例为2g :100ml)电泳，出现如下（1)-(3)种情况：
[0117] (1)酶切产物为两条条带且条带位于307bp及396bp左右；
[0118] (2)酶切产物为一条条带且条带位于700bp左右；
[0119] (3)酶切产物为三条条带，条带位置分别约在307bp、350bp及700bp。
[0120] 将各酶切产物的条带进行测序，结果如下：
[0121] 糖尿病前期患者中rs492594位点GG基因型患者离体血液样本对应的酶切产物为 307bp及396bp条带两种不同的DNA分子，分别为序列5(307bp)和序列6(396bp)所示的 DNA分子，酶切对应的PCR扩增产物为步骤1中A所示的情形，即PCR扩增产物均为序列3 所示的DNA分子，表明该糖尿病前期患者rs570876位点基因型为AA ;
[0122] 糖尿病前期患者中rs492594位点CC基因型患者离体血液样本对应的酶切产物为 700bp左右的条带，为序列4所示的DNA分子，酶切对应的PCR扩增产物为步骤1中B所示 的情形，即PCR扩增产物均为序列4所示的DNA分子，表明该糖尿病前期患者中rs570876 位点基因型为TT ;
[0123] 糖尿病前期患者中rs492594位点GC基因型患者离体血液样本对应的酶切产物 为307bp、396bp和700bp的条带，为3种不同的DNA分子，分别为序列5(307bp)和序列 6 (396bp)所示的DNA分子、序列4所示（700bp)的DNA分子，对应的PCR扩增产物为步骤1 中C所示的情形，即PCR扩增产物为序列3所示的DNA分子和序列4所示的DNA分子，表明 该糖尿病前期患者中rs570876位点基因型为AT。
[0124] 因此，可以通过检测待测糖尿病前期患者基因组DNA中rs570876SNP位点基因型 确定该待测糖尿病前期患者rs492594SNP位点基因型，若待测糖尿病前期患者基因组DNA 中rs570876SNP位点基因型为AA，则该待测糖尿病前期患者rs492594SNP位点基因型为 GG，若待测糖尿病前期患者基因组DNA中rs570876SNP位点基因型为TT，则该待测糖尿病前 期患者rs492594SNP位点基因型为CC，若待测糖尿病前期患者基因组DNA中rs570876SNP 位点基因型为AT，则该待测糖尿病前期患者rs492594SNP位点基因型为GC。
[0125] 上述该待测糖尿病前期患者rs492594SNP位点基因型方法具体如下：以待测糖尿 病前期患者基因组DNA为模板，以序列1和序列2所示的DNA分子为引物进行PCR扩增，得 到PCR扩增产物，再将PCR扩增产物用ApoI酶切，得到酶切产物；
[0126] 检测酶切产物大小，
[0127] 如果酶切产物为序列5 (307bp)和序列6 (396bp)所示的两种DNA分子，则PCR扩增 产物均为序列3所示的DNA分子，则所检测患者的rs570897基因型为AA，rs492594基因型 为GG ;如果酶切产物为序列4 (703bp)所示的DNA分子，则PCR扩增产物均为序列4所示的 DNA分子，所检测患者的rs570897基因型为TT，rs492594基因型为CC ;如果酶切产物为序 列5 (307bp)、序列6 (396bp)、序列4 (703bp)所示的三种DNA分子，则PCR扩增产物为序列3 所示的DNA分子和序列4所示的DNA分子，所检测患者的rs570897基因型为AT，rs492594 基因型为CG。将该种检测方法命名为rs492594的基因型的RFLP检测方法。
[0128] 三、rs492594的基因型的RFLP检测方法验证
[0129] (一）对步骤一中761例糖尿病前期患者的基因组DNA随机选取已有芯片结果的 96例患者DNA样本。在rs492594位点进行检测分型，得到各患者的rs492594位点的基因 型检测结果。
[0130] (二）分别以所检测的96例基因组DNA为模板，以序列1和序列2所示的DNA分 子为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，将PCR扩增产物用ApoI酶切，得到酶切产物； 并对酶切产物进行测序分析，按照如下判断标准对所检测的患者在rs492594处进行基因 型的判断：
[0131] 如果酶切产物为序列5(307bp)和序列6(396bp)所示的DNA分子，则对应的PCR 扩增产物均为序列3所示的DNA分子，所检测患者的rs570897基因型为AA，rs492594基因 型为GG ;
[0132] 如果酶切产物为序列4 (703bp)所示的DNA分子，则对应的PCR扩增产物均为序列 4所示的DNA分子，所检测患者的rs570897基因型为TT，rs492594基因型为CC ;
[0133] 如果酶切产物为序列5(307bp)、序列6(396bp)、序列4(703bp)所示，对应的PCR 扩增产物为序列3所示的DNA分子和序列4所示的DNA分子，所检测患者的rs570897基因 型为AT，rs492594基因型为CG。
[0134] 结果如图2所示：
[0135] 图2A为iSelect芯片检测rs492594基因型为CC患者的rs570897基因型测序结 果；
[0136] 图2B为iSelect芯片检测rs492594基因型为CC患者的rs570897基因型酶切电 泳结果；
[0137] 图2C为iSelect芯片检测rs492594基因型为GG患者的rs570897基因型测序结 果；
[0138] 图2D为iSelect芯片检测rs492594基因型为GG患者的rs570897基因型酶切电 泳结果；
[0139] 图2E为iSelect芯片检测rs492594基因型为GC患者的rs570897基因型测序结 果；
[0140] 图2F为iSelect芯片检测rs492594基因型为GC患者的rs570897基因型酶切电 泳结果；
[0141] 图2G为酶切电泳示意图；
[0142] 统计，所检测的96例患者中11例在rs570897处的基因型为AA，则其在rs492594 处的基因型为GG，与iSelect芯片检测rs492594处的基因型100%-致；
[0143] 所检测的96例患者中45例在rs570897处的基因型为AT，则其在rs492594处的 基因型为GC，与iSelect芯片检测rs492594处的基因型100%-致；
[0144] 所检测的96例患者中40例在rs570897处的基因型为TT，则其在rs492594处的 基因型为CC，与iSelect芯片检测rs492594处的基因型100%-致。
[0145] 实验证明，上述rs492594的基因型的RFLP检测方法可以可靠、简便、经济、快速的 进行rs492594位点的基因型检测。
【主权项】
1. 检测人基因组中rs492594SNP位点的基因型的产品或检测人基因组中rs570876SNP 位点的基因型的产品在制备预测吡格列酮干预后对人的降血糖效果的产品中的应用。2. 检测人基因组中rs492594SNP位点的基因型的产品或检测人基因组中rs570876SNP 位点的基因型的产品在制备筛查对吡格列酮敏感的糖尿病前期患者的产品中的应用。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述产品为序列1和序列2所示的 DNA分子。4. 检测人基因组中rs570876SNP位点的基因型的产品在制备检测人基因组中 rs492594SNP位点的基因型的产品中的应用。5. -种检测人基因组中rs492594SNP位点的基因型的方法，为如下1)或2): 1) 直接测序； 2)检测待测人基因组中rs570876SNP位点的基因型，根据所述待测人基因组中 rs570876SNP位点的基因型确定所述待测人基因组中rs492594SNP位点的基因型。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于： 2)所示的方法包括如下步骤： 1) 用扩增含有rs570876SNP位点DNA片段的引物对所述待测人基因组DNA进行PCR扩 增，得到PCR扩增产物； 2) 用ApoI酶切所述PCR产物，得到酶切产物，根据所述酶切产物大小判断所述待测 人基因组中rs570876SNP位点的基因型，再根据所述rs570876SNP位点的基因型确定所述 rs492594SNP位点的基因型。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于： 所述扩增含有rs492594SNP位点DNA片段的引物对由序列1所示的DNA分子和序列2 所示的DNA分子组成； 所述根据所述酶切产物大小判断所述待测人基因组中rs570876SNP位点的基因型，再 根据所述rs570876SNP位点的基因型确定所述rs492594SNP位点的基因型为如下：若所 述酶切产物仅含有307bp和396bp大小的目的片段，则所述人基因组中rs570876SNP位点 的基因型为AA，所述人基因组中rs492594SNP位点的基因型为GG;若所述酶切产物含有 307bp、396bp和703bp3条DNA片段，则所述人基因组中rs570876SNP位点的基因型为AT， 所述人基因组中rs492594SNP位点的基因型为GC;若所述酶切产物仅含有703bpDNA片段， 则所述人基因组中rs570876SNP位点的基因型为TT，所述人基因组中rs492594SNP位点的 基因型为CC。8.人基因组中rs570876位点的基因型和/或rs492594位点的基因型在制备预测吡格 列酮对人的降血糖效果的产品中的应用； 或， 人基因组中rs570876位点的基因型和/或rs492594位点的基因型在制备筛查对吡格 列酮敏感的糖尿病患者的产品中的应用。9.检测人基因组中rs492594位点的基因型和/或检测人基因组中rs570876位点的基 因型的产品，其包含扩增包含rs570876位点及紧邻该位点的3'下游5个核苷酸的人基因 组DNA片段的PCR引物； 所述PCR引物具体为序列1所示的DNA分子和序列2所示的DNA分子组成的引物对。
【专利摘要】本发明公开了一种rs492594的基因型的检测方法及其应用。本发明提供了检测人基因组中rs492594SNP位点的基因型的产品或检测人基因组中rs570876SNP位点的基因型的产品在制备预测吡格列酮干预后对人的降血糖效果的产品中的应用。本发明证明，糖尿病患者rs492594处的基因型与吡格列酮的降血糖效果相关，rs492594的检测可用于筛选对吡格列酮相对敏感的2型糖尿病患者，可根据糖尿病患者rs492594处的基因型选择适合的降血糖药物，提高个体化治疗水平。本发明进一步公开了rs492594处的基因型的限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)方法，该方法可以可靠、简便、经济、快速的鉴定rs492594位点的基因型。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104894250
【申请号】CN201510275993
【发明人】纪立农, 刘昭前
【申请人】北京大学人民医院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月26日
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