一种避免miRNA定量检测中因荧光探针标记不彻底而引起背景扩增的方法
一种避免miRNA定量检测中因荧光探针标记不彻底而引起背景扩增的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于miRNA荧光定量PCR检测领域，涉及一种避免miRNA定量检测中因荧 光探针标记不彻底而引起背景扩增的方法。
【背景技术】
[0002] MicroRNA(miRNA)是一组具有基因表达调控功能的长度约20~25个核苷酸的非 编码RNA。因 miRNA的序列过短，针对miRNA的荧光定量设计难度很高。目前，对miRNA定 量PCR检测技术分为荧光染料法与荧光探针法，后者因特异性好而优于前者，代表性技术 为茎环引物 RT-PCR 技术（Stem-loop RT-PCR)。
[0003] 在基于荧光探针技术的检测方法中，因序列过短荧光探针的设计位置不可避免地 会与逆转录引物甚至是上、下游引物之间有部分重叠。该重叠使得荧光探针有可能被作为 模板或者因标记不彻底而作为引物并最后形成背景扩增，从而会影响检测敏感性与线性范 围。
[0004] 荧光探针的合成过程一般为先合成基本的核酸序列，然后再进行两端的标记。本 发明人之前的研宄中发现，标记过程中因反应效率问题可能会有少量的核酸未被标记，同 时其后续的纯化过程也难以做到对其绝对去除。如此，这部分未被标记的探针将会在与模 板结合的部位充当引物角色而启发链延伸并增加背景扩增，最终会影响定量检测的线性范 围与灵敏度。
[0005] 因此，还需要进行进一步的研宄，来找到消除探针与模板结合并延伸导致的背景 扩增的增加。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种避免miRNA定量检测中因荧光探针标记不彻底而引 起背景扩增的方法。
[0007] 在本发明的第一方面，提供一种消除探针法miRNA荧光定量检测背景的方法，所 述方法包括：在荧光探针的3'末端设置阻止探针与模板结合后发生延伸的修饰。
[0008] 在一个优选例中，所述的修饰包括：在荧光探针的3'末端增加1~5个碱基，该 1~5个碱基不能与模板结合（即不能与模板上相应位置的碱基匹配）。
[0009] 在另一优选例中，在荧光探针的3'末端增加2~3个（最佳地为2个）碱基，该 2~3个（最佳地为2个）碱基不能与模板结合。
[0010] 在另一优选例中，所述的修饰包括：在荧光探针的3'末端引入双脱氧核苷酸。
[0011] 在另一优选例中，所述的荧光定量PCR法为茎环引物RT-PCR法（stem-loop RT-PCR)。
[0012] 在另一优选例中，所述的茎环引物RT-PCR法包括：
[0013] (1)根据待测miRNA的序列，设计逆转录茎环引物以及相应的PCR上、下游引物及 荧光探针，在荧光探针的3'末端设置阻止探针与模板结合后发生延伸的修饰；
[0014] (2)利用⑴的逆转录茎环引物扩增待测体系，获得逆转录产物；
[0015] (3)利用⑴的PCR上、下游引物以及荧光探针扩增⑵的逆转录产物；和
[0016] (4)通过测定荧光获得待测miRNA在待测体系中的存在情况以及存在量。
[0017] 在另一优选例中，所述的miRNA为miR-16,所述的逆转录莖环引物的核苷酸序列 如 SEQ ID NO:2 所示；
[0018] 所述的PCR上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示；
[0019] 所述的荧光探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0:7所示，其两端带有荧光基团。
[0020] 在另一优选例中，所述的方法为非诊断性或治疗性的方法。
[0021] 在本发明的另一方面，提供一种用于以荧光定量PCR法检测miR-16的试剂盒，所 述的试剂盒中包括：
[0022] 逆转录茎环引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0023] PCR上、下游引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示；
[0024] 荧光探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，其3'端带有荧光基团。
[0025] 在一个优选例中，所述的试剂盒中还包括：
[0026] 逆转录酶（如M-MLV逆转录酶）；
[0027] RNA酶抑制剂；
[0028] MgCl2;
[0029] dNTPs ;和 / 或
[0030] 使用说明书。
[0031 ] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0032] 图1、荧光定量PCR法测定时，利用探针ml6Pb的检测结果。
[0033] 图2、荧光定量PCR法测定时，利用探针ml6Pb'的检测结果。
【具体实施方式】
[0034] 本发明人经过深入的研宄，首次揭示了一种避免miRNA定量检测中因荧光探针标 记不彻底而引起背景扩增的方法，该方法在不增加检测复杂性的情况下，能够极其显著地 提高检测的灵敏度。
[0035] 本发明的核心在于阻断少量未标记探针的可延伸性。因此，本发明提供了一种测 定miRNA的方法，该方法包括：以荧光定量PCR法测定，在荧光探针的3'末端设置阻止探针 与模板结合后发生延伸的修饰。
[0036] 如本文所用，如非另外说明，所述的"模板"是指DNA模板，较佳地以待测miRNA逆 转录获得的DNA作为模板。
[0037] 在荧光探针的3'末端，多种可有效地阻止探针与模板结合的修饰方式均可应用于 本发明中，本领域技术人员可基于本发明的提示、结合现有技术来选择修饰。
[0038] 作为本发明的优选方式，所述的修饰是在荧光探针的3'末端增加1~5个、较佳 地2~3个、最佳地2个碱基；该1~5个、较佳地2~3个、最佳地2个碱基不能与模板结 合。不匹配碱基使得该探针序列的3'末端不能与模板结合。当未被标记的探针与模板结 合后因末端不匹配不能引发延伸。增加的不匹配碱基不会影响探针与模板的结合性，也不 会影响DNA聚合酶对探针的降解作用，从而可避免该原因引起的背景扩增。
[0039] 作为本发明的其它选择方式，所述的修饰也可以是在荧光探针的3'末端引入双脱 氧核苷酸，这种修饰也可以阻止探针与模板结合后发生延伸。双脱氧核苷酸修饰后使得序 列延伸终止是本领域已知的。
[0040] 本发明中，所述的荧光定量PCR法为茎环引物RT-PCR法（Stem-loop RT-PCR)。包 括利用针对miRNA设计的逆转录茎环引物扩增待测体系，获得逆转录产物；利用的PCR上、 下游引物以及荧光探针扩增逆转录产物；之后，通过测定荧光获得待测miRNA在待测体系 中的存在情况以及存在量。
[0041] 如本文所用，"茎环"结构也被称作"发夹（Hairpin) "结构、"发卡"结构，是指一种 寡核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域（茎部）的二级结构，所述的双链区域由该寡核 苷酸分子的两个区域（位于同一分子上）形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至 少一个"环"结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。茎环结构是本领域技术人员所 熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的寡核苷酸序列后，本领域技术人员能够确定该 核酸是否能形成发夹结构。
[0042] 可以根据所述的逆转录产物两端的序列来设计PCR扩增反应用的PCR上、下游引 物。
[0043] 常规的荧光定量PCR法是本领域技术人员熟知的技术。该技术是指在PCR反应体 系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板 进行定量分析的方法。在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的值，即Ct值（C代表Cycle， t代表threshold)。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的 循环数。荧光域值（threshold)的设定是本领域已知的技术。每个模板的Ct值与该模板 的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的 标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获 得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
[0044] 所述的"荧光探针" 为一种寡核苷酸，其两端分别标记一个荧光发射基团（作为可 检测信号）和一个荧光淬灭基团。当探针完整时，荧光发射基团发射的荧光信号被淬灭基 团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5' -3'外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光 淬灭基团分离，从而通过荧光检测系统可接受到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个 荧光分子形成，即荧光信号的累计与PCR产物形成的完全同步，从而实现定性和定量。
[0045] 试剂盒
[0046] 基于本发明所揭示的方法，本发明还提供了可用于实施所述方法的试剂盒，其中 包括：逆转录茎环引物；PCR上、下游引物；荧光探针，其3'末端设置阻止探针与模板结合后 发生延伸的修饰。通常，所述试剂盒包括多个容器，上述试剂独立地、分别地位于不同的容 器中。
[0047] 作为本发明的优选方式，所述的试剂盒是用于以荧光定量PCR法检测miR-16的试 剂盒，包括：逆转录茎环引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示；PCR上、下游引物，其核苷 酸序列分别如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO:4所示；荧光探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 7 所示，其3'端带有荧光基团。
[0048] 此外，所述的试剂盒中还可包括：逆转录酶（如M-MLV逆转录酶）；RNA酶抑制剂； MgCl2;dNTPs等用于逆转录或用于PCR扩增的试剂。
[0049] 作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中还包括使用说明书，以指导技术人员进 行操作。
[0050] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
[0051] 实施例1、通过茎环引物法定量检测miR-16
[0052] miR-16 序列为：5'-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3'（SEQ ID NO: 1)
[0053] 首先设计逆转录茎环引物序列为：
[0054] 5' -GGCGTAGGCAGTGCAGGGTCCGAGGTCTGCCTACGCCCGCCAATA-3' （SEQ ID N0:2)。
[0055] 逆转录获得的产物序列是：
[0056] 5'-GGCGTAGGCAGTGCAGGGTCCGAGGTCTGCCTACGCCCGCCAATATTTACGTGCTGCTA-3' （SEQ ID NO:3)
[0057] 定量PCR上、下游引物序列分别为（为提高Tm值，引物5'末端还设置有外加碱 基）：
[0058] 上游引物：5' -TCGGCTAGCAGCACGT-3'（SEQ ID N0:4);和
[0059] 下游引物：5' -TGATTGCAGGGTCCGAG-3'（SEQ ID N0:5)。
[0060] 可供荧光探针设计的序列区为：5' -AATATTGGCGGGCGTAGGCAGA-3，（SEQ ID N0:6)。分别直接以该序列为荧光探针序列（ml6Pb)或者在末端增加不匹配碱基进行设计 (ml6Pb'），如：
[0061] ml6Pb：5, -(ROX)AATATTGGCGGGCGTAGGCAGA(BHQ2)-3? (SEQ ID N0:6)；
[0062] ml6Pb' ：5' -(R0X)AATATTGGCGGGCGTAGGCAGAII(BHQ2)-3' （SEQ ID N0:7)。
[0063] 采用上述设计体系对miR-16的系列稀释样（105/μ 1、IO4/μ 1、IO3/μ 1、IO2/μ 1、 10/μ 1)与空白对照进行检测。
[0064] 检测步骤如下：
[0065] (1)以茎环引物为逆转录引物采用M-MLV逆转录酶对空白样和miR-16的系列稀释 样进行逆转录。反应体系为10 μ 1，茎环引物浓度为50nM，dNTP含量为ImM，RNA酶抑制剂 为IU/ μ I，M-MLV逆转录酶为5U/ μ 1。
[0066] 反应条件为：42°C，60分钟；85°C，5分钟。
[0067] (2)分别以ml6Pb和ml6Pb'为探针建立荧光定量体系检测各逆转录产物。体系组 成为：
[0068] MgCl2: 5ιηΜ, dNTPs： 0 2mM， 上下游引物各: 0.5μΜ， 荧光探针(ml6Pb 或 ml6Pb')： 0.25μΜ， 热启动Taq酶： 1.25U。
[0069] 反应条件为：①95°C热启动5分钟；②95°C热解链15秒，60°C退火延伸1分钟，45 个循环。
[0070] 检测结果显示：以ml6Pb为探针的检测体系有背景扩增，检测灵敏度为IO2/ μ 1， 见图1 ;而采用ml6Pb'探针可将该背景扩增消除，检测灵敏度达到10/μ 1，见图2。
[0071] 因此可见，采用本发明的方法设计检测miRNA的探针，可极其显著地提高检测的 灵敏度。
[0072] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种消除探针法miRNA荧光定量检测背景的方法，其特征在于，所述方法包括：在荧 光探针的3'末端设置阻止探针与模板结合后发生延伸的修饰。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的修饰包括： 在荧光探针的3'末端增加1~5个碱基，该1~5个碱基不能与模板结合。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在荧光探针的3'末端增加2~3个碱基，该 2~3个碱基不能与模板结合。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的修饰包括：在荧光探针的3'末端引 入双脱氧核苷酸。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的荧光定量PCR法为茎环引物RT-PCR 法。6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的茎环引物RT-PCR法包括： (1) 根据待测miRNA的序列，设计逆转录茎环引物以及相应的PCR上、下游引物及荧光 探针，在荧光探针的3'末端设置阻止探针与模板结合后发生延伸的修饰； (2) 利用（1)的逆转录茎环引物扩增待测体系，获得逆转录产物； (3) 利用（1)的PCR上、下游引物以及荧光探针扩增⑵的逆转录产物；和 (4) 通过测定荧光获得待测miRNA在待测体系中的存在情况以及存在量。7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的miRNA为miR-16,所述的逆转录莖环 引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示； 所述的PCR上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDN0:3和SEQIDN0:4所示； 所述的荧光探针的核苷酸序列分别如SEQIDNO: 7所示，其两端分别带有荧光基团与 淬灭基团。8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法为非诊断性或治疗性的方法。9. 一种用于以荧光定量PCR法检测miR-16的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包 括： 逆转录茎环引物，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示； PCR上、下游引物，其核苷酸序列分别如SEQIDN0:3和SEQIDN0:4所示； 荧光探针，其核苷酸序列如SEQIDN0:7所示，其3'端带有荧光基团。10. 如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括： 逆转录酶； RNA酶抑制剂； MgCl2; dNTPs;和 / 或 使用说明书。
【专利摘要】本发明首次揭示了一种避免miRNA定量检测中因荧光探针标记不彻底而引起背景扩增的方法，该方法在不增加检测复杂性的情况下，能够显著地拓宽miRNA定量检测的线性范围，同时达到提高检测的灵敏度的目的。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894251
【申请号】CN201510281917
【发明人】梁旺, 李宾, 王东
【申请人】基因科技（上海）有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月28日
【技术领域】
[0001] 本发明属于miRNA荧光定量PCR检测领域，涉及一种避免miRNA定量检测中因荧 光探针标记不彻底而引起背景扩增的方法。
【背景技术】
[0002] MicroRNA(miRNA)是一组具有基因表达调控功能的长度约20~25个核苷酸的非 编码RNA。因 miRNA的序列过短，针对miRNA的荧光定量设计难度很高。目前，对miRNA定 量PCR检测技术分为荧光染料法与荧光探针法，后者因特异性好而优于前者，代表性技术 为茎环引物 RT-PCR 技术（Stem-loop RT-PCR)。
[0003] 在基于荧光探针技术的检测方法中，因序列过短荧光探针的设计位置不可避免地 会与逆转录引物甚至是上、下游引物之间有部分重叠。该重叠使得荧光探针有可能被作为 模板或者因标记不彻底而作为引物并最后形成背景扩增，从而会影响检测敏感性与线性范 围。
[0004] 荧光探针的合成过程一般为先合成基本的核酸序列，然后再进行两端的标记。本 发明人之前的研宄中发现，标记过程中因反应效率问题可能会有少量的核酸未被标记，同 时其后续的纯化过程也难以做到对其绝对去除。如此，这部分未被标记的探针将会在与模 板结合的部位充当引物角色而启发链延伸并增加背景扩增，最终会影响定量检测的线性范 围与灵敏度。
[0005] 因此，还需要进行进一步的研宄，来找到消除探针与模板结合并延伸导致的背景 扩增的增加。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种避免miRNA定量检测中因荧光探针标记不彻底而引 起背景扩增的方法。
[0007] 在本发明的第一方面，提供一种消除探针法miRNA荧光定量检测背景的方法，所 述方法包括：在荧光探针的3'末端设置阻止探针与模板结合后发生延伸的修饰。
[0008] 在一个优选例中，所述的修饰包括：在荧光探针的3'末端增加1~5个碱基，该 1~5个碱基不能与模板结合（即不能与模板上相应位置的碱基匹配）。
[0009] 在另一优选例中，在荧光探针的3'末端增加2~3个（最佳地为2个）碱基，该 2~3个（最佳地为2个）碱基不能与模板结合。
[0010] 在另一优选例中，所述的修饰包括：在荧光探针的3'末端引入双脱氧核苷酸。
[0011] 在另一优选例中，所述的荧光定量PCR法为茎环引物RT-PCR法（stem-loop RT-PCR)。
[0012] 在另一优选例中，所述的茎环引物RT-PCR法包括：
[0013] (1)根据待测miRNA的序列，设计逆转录茎环引物以及相应的PCR上、下游引物及 荧光探针，在荧光探针的3'末端设置阻止探针与模板结合后发生延伸的修饰；
[0014] (2)利用⑴的逆转录茎环引物扩增待测体系，获得逆转录产物；
[0015] (3)利用⑴的PCR上、下游引物以及荧光探针扩增⑵的逆转录产物；和
[0016] (4)通过测定荧光获得待测miRNA在待测体系中的存在情况以及存在量。
[0017] 在另一优选例中，所述的miRNA为miR-16,所述的逆转录莖环引物的核苷酸序列 如 SEQ ID NO:2 所示；
[0018] 所述的PCR上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示；
[0019] 所述的荧光探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0:7所示，其两端带有荧光基团。
[0020] 在另一优选例中，所述的方法为非诊断性或治疗性的方法。
[0021] 在本发明的另一方面，提供一种用于以荧光定量PCR法检测miR-16的试剂盒，所 述的试剂盒中包括：
[0022] 逆转录茎环引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0023] PCR上、下游引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示；
[0024] 荧光探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，其3'端带有荧光基团。
[0025] 在一个优选例中，所述的试剂盒中还包括：
[0026] 逆转录酶（如M-MLV逆转录酶）；
[0027] RNA酶抑制剂；
[0028] MgCl2;
[0029] dNTPs ;和 / 或
[0030] 使用说明书。
[0031 ] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0032] 图1、荧光定量PCR法测定时，利用探针ml6Pb的检测结果。
[0033] 图2、荧光定量PCR法测定时，利用探针ml6Pb'的检测结果。
【具体实施方式】
[0034] 本发明人经过深入的研宄，首次揭示了一种避免miRNA定量检测中因荧光探针标 记不彻底而引起背景扩增的方法，该方法在不增加检测复杂性的情况下，能够极其显著地 提高检测的灵敏度。
[0035] 本发明的核心在于阻断少量未标记探针的可延伸性。因此，本发明提供了一种测 定miRNA的方法，该方法包括：以荧光定量PCR法测定，在荧光探针的3'末端设置阻止探针 与模板结合后发生延伸的修饰。
[0036] 如本文所用，如非另外说明，所述的"模板"是指DNA模板，较佳地以待测miRNA逆 转录获得的DNA作为模板。
[0037] 在荧光探针的3'末端，多种可有效地阻止探针与模板结合的修饰方式均可应用于 本发明中，本领域技术人员可基于本发明的提示、结合现有技术来选择修饰。
[0038] 作为本发明的优选方式，所述的修饰是在荧光探针的3'末端增加1~5个、较佳 地2~3个、最佳地2个碱基；该1~5个、较佳地2~3个、最佳地2个碱基不能与模板结 合。不匹配碱基使得该探针序列的3'末端不能与模板结合。当未被标记的探针与模板结 合后因末端不匹配不能引发延伸。增加的不匹配碱基不会影响探针与模板的结合性，也不 会影响DNA聚合酶对探针的降解作用，从而可避免该原因引起的背景扩增。
[0039] 作为本发明的其它选择方式，所述的修饰也可以是在荧光探针的3'末端引入双脱 氧核苷酸，这种修饰也可以阻止探针与模板结合后发生延伸。双脱氧核苷酸修饰后使得序 列延伸终止是本领域已知的。
[0040] 本发明中，所述的荧光定量PCR法为茎环引物RT-PCR法（Stem-loop RT-PCR)。包 括利用针对miRNA设计的逆转录茎环引物扩增待测体系，获得逆转录产物；利用的PCR上、 下游引物以及荧光探针扩增逆转录产物；之后，通过测定荧光获得待测miRNA在待测体系 中的存在情况以及存在量。
[0041] 如本文所用，"茎环"结构也被称作"发夹（Hairpin) "结构、"发卡"结构，是指一种 寡核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域（茎部）的二级结构，所述的双链区域由该寡核 苷酸分子的两个区域（位于同一分子上）形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至 少一个"环"结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。茎环结构是本领域技术人员所 熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的寡核苷酸序列后，本领域技术人员能够确定该 核酸是否能形成发夹结构。
[0042] 可以根据所述的逆转录产物两端的序列来设计PCR扩增反应用的PCR上、下游引 物。
[0043] 常规的荧光定量PCR法是本领域技术人员熟知的技术。该技术是指在PCR反应体 系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板 进行定量分析的方法。在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的值，即Ct值（C代表Cycle， t代表threshold)。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的 循环数。荧光域值（threshold)的设定是本领域已知的技术。每个模板的Ct值与该模板 的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的 标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获 得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
[0044] 所述的"荧光探针" 为一种寡核苷酸，其两端分别标记一个荧光发射基团（作为可 检测信号）和一个荧光淬灭基团。当探针完整时，荧光发射基团发射的荧光信号被淬灭基 团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5' -3'外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光 淬灭基团分离，从而通过荧光检测系统可接受到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个 荧光分子形成，即荧光信号的累计与PCR产物形成的完全同步，从而实现定性和定量。
[0045] 试剂盒
[0046] 基于本发明所揭示的方法，本发明还提供了可用于实施所述方法的试剂盒，其中 包括：逆转录茎环引物；PCR上、下游引物；荧光探针，其3'末端设置阻止探针与模板结合后 发生延伸的修饰。通常，所述试剂盒包括多个容器，上述试剂独立地、分别地位于不同的容 器中。
[0047] 作为本发明的优选方式，所述的试剂盒是用于以荧光定量PCR法检测miR-16的试 剂盒，包括：逆转录茎环引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示；PCR上、下游引物，其核苷 酸序列分别如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO:4所示；荧光探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 7 所示，其3'端带有荧光基团。
[0048] 此外，所述的试剂盒中还可包括：逆转录酶（如M-MLV逆转录酶）；RNA酶抑制剂； MgCl2;dNTPs等用于逆转录或用于PCR扩增的试剂。
[0049] 作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中还包括使用说明书，以指导技术人员进 行操作。
[0050] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
[0051] 实施例1、通过茎环引物法定量检测miR-16
[0052] miR-16 序列为：5'-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3'（SEQ ID NO: 1)
[0053] 首先设计逆转录茎环引物序列为：
[0054] 5' -GGCGTAGGCAGTGCAGGGTCCGAGGTCTGCCTACGCCCGCCAATA-3' （SEQ ID N0:2)。
[0055] 逆转录获得的产物序列是：
[0056] 5'-GGCGTAGGCAGTGCAGGGTCCGAGGTCTGCCTACGCCCGCCAATATTTACGTGCTGCTA-3' （SEQ ID NO:3)
[0057] 定量PCR上、下游引物序列分别为（为提高Tm值，引物5'末端还设置有外加碱 基）：
[0058] 上游引物：5' -TCGGCTAGCAGCACGT-3'（SEQ ID N0:4);和
[0059] 下游引物：5' -TGATTGCAGGGTCCGAG-3'（SEQ ID N0:5)。
[0060] 可供荧光探针设计的序列区为：5' -AATATTGGCGGGCGTAGGCAGA-3，（SEQ ID N0:6)。分别直接以该序列为荧光探针序列（ml6Pb)或者在末端增加不匹配碱基进行设计 (ml6Pb'），如：
[0061] ml6Pb：5, -(ROX)AATATTGGCGGGCGTAGGCAGA(BHQ2)-3? (SEQ ID N0:6)；
[0062] ml6Pb' ：5' -(R0X)AATATTGGCGGGCGTAGGCAGAII(BHQ2)-3' （SEQ ID N0:7)。
[0063] 采用上述设计体系对miR-16的系列稀释样（105/μ 1、IO4/μ 1、IO3/μ 1、IO2/μ 1、 10/μ 1)与空白对照进行检测。
[0064] 检测步骤如下：
[0065] (1)以茎环引物为逆转录引物采用M-MLV逆转录酶对空白样和miR-16的系列稀释 样进行逆转录。反应体系为10 μ 1，茎环引物浓度为50nM，dNTP含量为ImM，RNA酶抑制剂 为IU/ μ I，M-MLV逆转录酶为5U/ μ 1。
[0066] 反应条件为：42°C，60分钟；85°C，5分钟。
[0067] (2)分别以ml6Pb和ml6Pb'为探针建立荧光定量体系检测各逆转录产物。体系组 成为：
[0068] MgCl2: 5ιηΜ, dNTPs： 0 2mM， 上下游引物各: 0.5μΜ， 荧光探针(ml6Pb 或 ml6Pb')： 0.25μΜ， 热启动Taq酶： 1.25U。
[0069] 反应条件为：①95°C热启动5分钟；②95°C热解链15秒，60°C退火延伸1分钟，45 个循环。
[0070] 检测结果显示：以ml6Pb为探针的检测体系有背景扩增，检测灵敏度为IO2/ μ 1， 见图1 ;而采用ml6Pb'探针可将该背景扩增消除，检测灵敏度达到10/μ 1，见图2。
[0071] 因此可见，采用本发明的方法设计检测miRNA的探针，可极其显著地提高检测的 灵敏度。
[0072] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种消除探针法miRNA荧光定量检测背景的方法，其特征在于，所述方法包括：在荧 光探针的3'末端设置阻止探针与模板结合后发生延伸的修饰。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的修饰包括： 在荧光探针的3'末端增加1~5个碱基，该1~5个碱基不能与模板结合。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在荧光探针的3'末端增加2~3个碱基，该 2~3个碱基不能与模板结合。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的修饰包括：在荧光探针的3'末端引 入双脱氧核苷酸。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的荧光定量PCR法为茎环引物RT-PCR 法。6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的茎环引物RT-PCR法包括： (1) 根据待测miRNA的序列，设计逆转录茎环引物以及相应的PCR上、下游引物及荧光 探针，在荧光探针的3'末端设置阻止探针与模板结合后发生延伸的修饰； (2) 利用（1)的逆转录茎环引物扩增待测体系，获得逆转录产物； (3) 利用（1)的PCR上、下游引物以及荧光探针扩增⑵的逆转录产物；和 (4) 通过测定荧光获得待测miRNA在待测体系中的存在情况以及存在量。7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的miRNA为miR-16,所述的逆转录莖环 引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示； 所述的PCR上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDN0:3和SEQIDN0:4所示； 所述的荧光探针的核苷酸序列分别如SEQIDNO: 7所示，其两端分别带有荧光基团与 淬灭基团。8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法为非诊断性或治疗性的方法。9. 一种用于以荧光定量PCR法检测miR-16的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包 括： 逆转录茎环引物，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示； PCR上、下游引物，其核苷酸序列分别如SEQIDN0:3和SEQIDN0:4所示； 荧光探针，其核苷酸序列如SEQIDN0:7所示，其3'端带有荧光基团。10. 如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括： 逆转录酶； RNA酶抑制剂； MgCl2; dNTPs;和 / 或 使用说明书。
【专利摘要】本发明首次揭示了一种避免miRNA定量检测中因荧光探针标记不彻底而引起背景扩增的方法，该方法在不增加检测复杂性的情况下，能够显著地拓宽miRNA定量检测的线性范围，同时达到提高检测的灵敏度的目的。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894251
【申请号】CN201510281917
【发明人】梁旺, 李宾, 王东
【申请人】基因科技（上海）有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月28日
最新回复(0)