一种河豚鱼物种鉴别方法
一种河豚鱼物种鉴别方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种应用限制性内切酶III确证PCR结果的河豚鱼物种鉴别方 法。
【背景技术】
[0002] 我国海域广阔，河豚鱼种类繁多，鱼类加工食品中因混有河豚鱼，使得消费者误食 而中毒的事件时有发生，2007年发生了由于出口美国的銨鱅鱼混有河豚鱼，导致顾客误食 而中毒的事件，这些事件对我国食品出口贸易造成负面影响。同年日本食品检验部门在我 国南方某食品有限公司出口的马面鱼干中检出河豚鱼成分。为了保证消费者的健康与权 益，保障水产加工制品的质量与安全，急需一种能够在食品中快速检测出河豚鱼成分的方 法。本研宄基于作者于2011年建立的河豚鱼成分检测PCR方法 [22]检测河豚鱼与其他样 品，发现在金枪鱼与鲈鱼中也能扩增出与河豚鱼DNA片段大小（423 bp)接近的PCR产物， 产生了假阳性结果。因此，本实验应用限制性内切酶与DNA测序方法，分析了 13种河豚鱼 样品与2种非河豚鱼(金枪鱼与鲈鱼）的PCR结果的差别，经序列分析验证，建立了有效的 排除假阳性结果的方法，提高河豚鱼物种PCR鉴别效率，并保证结果的准确性，建立河豚鱼 物种的快速鉴别方法。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种河豚鱼物种鉴别方法，建立了有效的排除假阳性结果 的方法，提高河豚鱼物种PCR鉴别效率，并保证结果的准确性，建立河豚鱼物种的快速鉴别 方法。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种用于河豚鱼物种鉴别方法的PCR引物，所述引物为HT-IF : 5'-TGCCTCAACTACAAGAACCTAATGG-3' ；HT-1R :5'-GGGAAGGACATAGCCCACGA-3'。
[0005] -种河豚鱼物种鉴别方法，所述方法包括如下：以优化后确立的DNA提取CTAB方 法与PCR引物、扩增体系和温度程序，进行DNA提取、PCR扩增、PCR产物凝胶水平电泳与凝 胶成像；在10 μL的PCR产物中，加入2.0 μL IOX Cut smart Buffer、1.0 μL限制性内 切酶他?6^111、0.05卜1^5^腺苷甲硫胺酸（5^1(1611〇87111161:11；[011；[116，3麻）溶液，再加纯净水 6. 95 PL使总体积达到20 μL，在37 °C条件下消化16~18 h，然后进行琼脂糖凝胶电泳与 成像拍照。
[0006] 所述的DNA提取CTAB方法为：称取100 mg样品各两管于2. 0 mL离心管中，加入 600 yL 2 % CTAB溶液和蛋白酶K 15 yL，经超声波处理5 min;加入600 yL三氯甲烷， 13400 r · mirT1条件下离心15 min，取上清，加入2倍体积的0. 5 % CTAB溶液，颠倒混勾， 室温静置约1.5 h;在13400 r^mirT1条件下离心25 min，取沉淀，加入约400 μ L NaCl 溶液，沉淀溶解完全后，加入15 μ L Rnase酶37 °C条件下温浴约1.5 h;加入等体积的三 氯甲烷、饱和酚、异戊醇混合液，三者的体积比为25 :24 :1，，颠倒数次充分混合后，在13400 r · mirT1条件下离心15 min，重复此操作三次；取上清，加入0. 8倍异丙醇和1/10体积的 NaAc溶液，祸旋30 s，充分混合后，在13400 r .mirT1下离心15 min ;取沉淀，加入400 μ L 70 %乙醇，上下颠倒使沉淀悬于溶液中，在13400 条件下离心洗涤沉淀10 min; 经DNA浓缩仪干燥10 min，加100 μ L TE (pH 8.0)在65 °C条件下溶解15 min，放入4 °〇冰箱保存待用。
[0007] PCR扩增反应体系为：2XTaq PCR MasterMix 10 yL，上下游引物（10 μΜ)各0· 8 4 1^，0嫩模板量250叩，！120为7.2以匕扩增程序为：94°0预变性5 1^11，94°0变性30 s，64 °C退火30 s，72 °C延伸30s，反应循环40次，最后72 °C延伸5 min。
[0008] 本发明涉及河豚鱼成分PCR检测结果的限制性内切酶肠 eA III酶切确证方法。
[0009] 应用限制性内切酶III对河豚鱼疑似阳性样品的PCR产物进行酶切与电泳分 析，电泳图谱与河豚鱼阳性对照不同的样品，判定为假阳性结果，电泳图谱与阳性对照相同 的河豚鱼加工样品，确证为阳性结果，即检出河豚鱼成分，并经序列分析验证，建立了简便 高效的河豚鱼成分PCR检测结果的确证方法。
[0010] 本发明的优点在于：可以快速、精准鉴别河豚鱼物种与非河豚鱼物种，有效排除有 毒物质河豚鱼成分检测中可能产生的假阳性结果。
【附图说明】
[0011] 图1引物HT-I对河豚鱼的PCR扩增结果；1.黑腮兔头飩；2.兔头飩；3.暗纹东 方飩；4.黄鳍东方飩；5.棕斑腹刺飩；6.红鳍东方飩；7.暗鳍腹刺飩；8.月腹刺飩；9.横纹 东方飩；10.河豚鱼加工鲜肉；11.河豚鱼干I ;12.鲈鱼；13.河豚鱼干2 ;14.河豚鱼干3 ; 15.金枪鱼；16.大黄鱼；17.鳗鱼；18.带鱼；19.空白对照（CldH2O) ;M. DNA marker I。
[0012] 图2 PCR产物及其酶切结果电泳图谱；其中M. DNA marker I ;1、2.黑腮兔头飩； 3、4.兔头飩；5、6.暗纹东方飩；7、8.黄鳍东方飩；9、10.棕斑腹刺飩；11、12.红鳍东方飩； 13、14.暗鳍腹刺飩；15、16.月腹刺飩；17、18.横纹东方飩；19、20.河豚鱼加工鲜肉；21、 22.河豚鱼干1;23、24.鲈鱼；25、26.河豚鱼干2;27、28.河豚鱼干3;29、30.金枪鱼。奇 数号泳道为酶切消化后的产物电泳图谱，偶数号泳道为未经酶切的PCR产物电泳图谱。
[0013] 图3河豚鱼（兔头飩）分?織分片段PCR产物碱基序列与限制性内切酶III 酶切位点；下划线部分与HT-I引物(表2)部分同源，框内碱基GCCGAG + (N)19 为酶切 位点。
[0014] 图4金枪鱼分?/?部分片段PCR产物碱基序列与限制性内切酶III酶切位点 NEB cutter分析图，下划线部分与HT-I引物(表2)部分同源，框内碱基GCCGAG + (N)19 Λ NNt为酶切位点。
[0015] 图5鲈鱼分?/τ部分片段PCR产物碱基序列。
【具体实施方式】
[0016] 材料与方法 1. 1材料来源 9个已知物种名称的河豚鱼样品、4个未知种类的河豚鱼样品、5个非河豚鱼样品（表 1)搜集自福建省莆田、厦门、福州等地水产养殖场、农贸市场和超市。
[0017] 表1 18个河豚鱼及其他鱼类供试样品
1. 2试剂 试剂来源：10 X buffer与T^i7HdNTPs购自上海生工有限公司，限制性内切 酶MwA 111(2000 U/mL)购自北京纽英伦生物技术有限公司，引物委托上海生工有限公司合 成。
[0018] 引物合成 由上海生工生物工程有限公司合成河豚鱼成分检测引物（HT-1)，引物碱基序列、PCR 产物片段长度与适合的退火温度（^值）见表2。
[0019] 表2河豚鱼成分的PCR检测用的引物序列与退火温度
I. 4. DNA提取、PCR扩增、限制性内切酶消化 以优化后确立的DNA提取CTAB方法与PCR引物、扩增体系和温度程序，进行DNA提取、 PCR扩增、PCR产物凝胶水平电泳与凝胶成像，每个PCR重复3次。按照产品使用说明书规 定，在10 μL的PCR产物中，加入2.0 μL IOX Cut smart Buffer、1.0 μL限制性内切酶 肠6^111、0.05卜1^5]~腺苷甲硫胺酸（5^(1611〇87111161:11；[011； [116，3敵）溶液，再加纯净水6.95 KL使总体积达到20 μL，在37 °C条件下消化16~18 h，然后进行琼脂糖凝胶电泳与成像 拍照。
[0020] 1.5 PCR产物测序、序列比对与酶切位点确定 PCR产物通过凝胶电泳后，检出阳性结果的PCR扩增产物委托上海生工生物技术有限 公司进行克隆、测序。
[0021] 应用DNAMAN 5. 2. 2版软件对各个样品PCR产物序列进行整理分析，结果以MASED Document/DNAMANl格式输出，同时在GenBank中进行BLAST分析。应用NEBcutter 2. 0软 件进行限制性内切酶III酶切位点分析。
[0022] 5.结果分析 5. 1河豚鱼成分PCR检测结果 应用河豚鱼成分PCR检测引物（HT-I)对13个河豚鱼样品与5个非河豚鱼样品提取 的DNA进行河豚鱼线粒体特异性基因（分i WPCR扩增，结果表明，18个样品中3个样品无 PCR扩增产物，判为阴性结果，15个样品初步判为疑似阳性。图1中13个河豚鱼样品与2 个非河豚鱼样品（金枪鱼与鲈鱼）共15个样品检出PCR产物，为疑似阳性结果。另外3种 非河豚鱼类的大黄鱼、鳗鱼、带鱼与空白对照（CldH 2O)均未扩增出DNA条带，判为阴性结果。
[0023] 5. 2 PCR产物酶切图谱分析 15个检出河豚鱼成分疑似阳性结果的样品PCR产物及其经酶切消化后的产物电泳图 谱见图2。其中奇数号泳道为酶切消化后的产物电泳图谱，偶数号泳道为未经酶切的PCR产 物电泳图谱。图2Α与图2Β中9个已知学名与4个未知学名的的河豚鱼样品，在奇数号泳 道均检出酶切产物，各样品图谱相同，均有2条新的片段较小的条带，分别在300 bp与200 bp的下方。图2B可知，23、24号泳道分别为鲈鱼酶切与未经酶切的PCR产物，前者无新的 条带出现，29、30号泳道为金枪鱼的酶切与未经酶切的PCR产物，酶切的电泳图谱出现4条 新的条带，图谱与河豚鱼明显不同。可见，应用限制性内切酶MwA III酶切可以区别河豚鱼 与非河豚鱼，进而排除2个非河豚鱼的假阳性结果。
[0024] 从电泳图片2A与2B来看，所有疑似阳性样品的PCR产物酶切后残留PCR产物片 段条带位置都高于未经酶切处理的原PCR产物条带，出现该现象的原因是加入的限制性内 切酶(蛋白）与DNA结合，使得分子质量比原来纯DNA片段更大。毛细管电泳结果(本文略） 表明，经内切酶消化酶切后切断的与未切断残留的DNA片段，因结合了内切酶，其大小都比 实际的DNA片段大。
[0025] 产物的DNA序列与酶切位点分析 应用NEB cutter 2.0软件对13种河豚鱼与2种非河豚鱼(J卢鱼及金枪鱼）样品 的PCR产物碱基序列进行限制性内切酶酶切位点分析，结果表明，III酶切位点为 5'... GCCGAG (N)19 & NN'..3'。河豚鱼样品的PCR产物均为423个碱基(仅出示兔头飩 序列，其他种类河豚鱼DNA序列资料略III酶切位点都只有1个（图3)，在5'端起的 第256/254碱基位置，被切成2段，即电泳图出现的2条新带（图2)，大小为256/254 bp 与167/169 bp。金枪鱼PCR产物为422个碱基，III酶切位点有2个（图4)，分别在 5'.端起的第339/337碱基与252/250碱基的位置，被切成4段，大小为339/337 bp、83/85 bp与252/250 bp、170/172 bp (图2B第29泳道)。鲈鱼PCR产物为423个碱基，其序列 无 III限制性内切酶酶切位点（图5)，NEB cutter 2. 0软件无法生成酶切分析图，电泳 结果无新条带出现（图2B)，二者结果吻合。2个非河豚鱼样品中也能扩增出与河豚鱼相似 的PCR产物，出现假阳性现象，原因是，河豚鱼成分PCR检测所用的正向引物25个碱基，反 向互补20个碱基(表2)，结果正向引物有20个连续碱基、反向互补有10个连续碱基与7 个连续碱基分别与金枪鱼分? △部分片段序列两端互补，鲈鱼中也存在类似情况。
[0026] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1. 一种用于河豚鱼物种鉴别方法的PCR引物，其特征在于：所述引物为HT-IF: 5'-TGCCTCAACTACAAGAACCTAATGG-3' ；HT-1R:5'-GGGAAGGACATAGCCCACGA-3'。2. -种河豚鱼物种鉴别方法，其特征在于：所述方法包括如下：以优化后确立的DNA提 取CTAB方法与PCR引物、扩增体系和温度程序，进行DNA提取、PCR扩增、PCR产物凝胶水平 电泳与凝胶成像。3. 根据权利要求2所述的一种河豚鱼物种鉴别方法，其特征在于：所述的PCR产物 凝胶水平电泳与凝胶成像方法为在10ML的PCR产物中，加入2.OMLIOXCutsmart Buffer、1.0ML限制性内切酶肠eAIII、0. 05ML义腺苷甲硫胺酸溶液，再加纯净水6. 95 ML使总体积达到20ML，在37 °C条件下消化16~18h，然后进行琼脂糖凝胶电泳与成像 拍照。4. 根据权利要求2所述的一种河豚鱼物种鉴别方法，其特征在于：所述的DNA提取 CTAB方法为：称取100mg样品各两管于2. 0mL离心管中，加入600yL2 %CTAB溶液和 蛋白酶K15yL，经超声波处理5min;加入600yL三氯甲烷，13400I-Inirr1条件下离心 15min，取上清，加入2倍体积的0. 5 %CTAB溶液，颠倒混匀，室温静置约I. 5h;在13400 r.miiT1条件下离心25min，取沉淀，加入约400yLNaCl溶液，沉淀溶解完全后，加入15 yLRnase酶37 °C条件下温浴约1.5h;加入等体积的三氯甲烷：饱和酚：异戊醇混合液， 三者的体积比为25 :24 :1，颠倒数次充分混合后，在13400r.HiirT1条件下离心15min，重 复此操作三次；取上清，加入0. 8倍异丙醇和1/10体积的NaAc溶液，涡旋30s，充分混合 后，在13400r.HiirT1下离心15min;取沉淀，加入400yL70 %乙醇，上下颠倒使沉淀悬 于溶液中，在13400r^mirT1条件下离心洗绦沉淀10min;经DNA浓缩仪干燥10min，加 pH8.0、100yLTE在65 °C条件下溶解15min，放入4 °C冰箱保存待用。5. 根据权利要求2所述的一种河豚鱼物种鉴别方法，其特征在于：PCR扩增反应体系 为：2父131?〇?1&18七6-1叉10 1^，上下游引物（10 11]\〇各0.8 1^，0嫩模板量250叩， H2O为7.2yL，扩增程序为：94 °C预变性5min，94 °C变性30s，64 °C退火30s，72 °C延 伸30s，反应循环40次，最后72 °C延伸5min。
【专利摘要】本发明涉及一种河豚鱼物种鉴别方法，以优化后确立的DNA提取CTAB方法与PCR引物、扩增体系和温度程序，进行DNA提取、PCR扩增、PCR产物凝胶水平电泳与凝胶成像；在10μL的PCR产物中，加入2.0μL 10× Cut smart Buffer、1.0μL限制性内切酶NmeA Ⅲ、0.05μL S-腺苷甲硫胺酸（S-adenosylmethionine，SMA）溶液，再加纯净水6.95μL使总体积达到20μL，在37℃条件下消化16～18h，然后进行琼脂糖凝胶电泳与成像拍照。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104894254
【申请号】CN201510286313
【发明人】陈文炳, 翁国柱, 邵碧英, 缪婷玉, 江树勋, 彭娟
【申请人】福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月30日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种应用限制性内切酶III确证PCR结果的河豚鱼物种鉴别方 法。
【背景技术】
[0002] 我国海域广阔，河豚鱼种类繁多，鱼类加工食品中因混有河豚鱼，使得消费者误食 而中毒的事件时有发生，2007年发生了由于出口美国的銨鱅鱼混有河豚鱼，导致顾客误食 而中毒的事件，这些事件对我国食品出口贸易造成负面影响。同年日本食品检验部门在我 国南方某食品有限公司出口的马面鱼干中检出河豚鱼成分。为了保证消费者的健康与权 益，保障水产加工制品的质量与安全，急需一种能够在食品中快速检测出河豚鱼成分的方 法。本研宄基于作者于2011年建立的河豚鱼成分检测PCR方法 [22]检测河豚鱼与其他样 品，发现在金枪鱼与鲈鱼中也能扩增出与河豚鱼DNA片段大小（423 bp)接近的PCR产物， 产生了假阳性结果。因此，本实验应用限制性内切酶与DNA测序方法，分析了 13种河豚鱼 样品与2种非河豚鱼(金枪鱼与鲈鱼）的PCR结果的差别，经序列分析验证，建立了有效的 排除假阳性结果的方法，提高河豚鱼物种PCR鉴别效率，并保证结果的准确性，建立河豚鱼 物种的快速鉴别方法。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种河豚鱼物种鉴别方法，建立了有效的排除假阳性结果 的方法，提高河豚鱼物种PCR鉴别效率，并保证结果的准确性，建立河豚鱼物种的快速鉴别 方法。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种用于河豚鱼物种鉴别方法的PCR引物，所述引物为HT-IF : 5'-TGCCTCAACTACAAGAACCTAATGG-3' ；HT-1R :5'-GGGAAGGACATAGCCCACGA-3'。
[0005] -种河豚鱼物种鉴别方法，所述方法包括如下：以优化后确立的DNA提取CTAB方 法与PCR引物、扩增体系和温度程序，进行DNA提取、PCR扩增、PCR产物凝胶水平电泳与凝 胶成像；在10 μL的PCR产物中，加入2.0 μL IOX Cut smart Buffer、1.0 μL限制性内 切酶他?6^111、0.05卜1^5^腺苷甲硫胺酸（5^1(1611〇87111161:11；[011；[116，3麻）溶液，再加纯净水 6. 95 PL使总体积达到20 μL，在37 °C条件下消化16~18 h，然后进行琼脂糖凝胶电泳与 成像拍照。
[0006] 所述的DNA提取CTAB方法为：称取100 mg样品各两管于2. 0 mL离心管中，加入 600 yL 2 % CTAB溶液和蛋白酶K 15 yL，经超声波处理5 min;加入600 yL三氯甲烷， 13400 r · mirT1条件下离心15 min，取上清，加入2倍体积的0. 5 % CTAB溶液，颠倒混勾， 室温静置约1.5 h;在13400 r^mirT1条件下离心25 min，取沉淀，加入约400 μ L NaCl 溶液，沉淀溶解完全后，加入15 μ L Rnase酶37 °C条件下温浴约1.5 h;加入等体积的三 氯甲烷、饱和酚、异戊醇混合液，三者的体积比为25 :24 :1，，颠倒数次充分混合后，在13400 r · mirT1条件下离心15 min，重复此操作三次；取上清，加入0. 8倍异丙醇和1/10体积的 NaAc溶液，祸旋30 s，充分混合后，在13400 r .mirT1下离心15 min ;取沉淀，加入400 μ L 70 %乙醇，上下颠倒使沉淀悬于溶液中，在13400 条件下离心洗涤沉淀10 min; 经DNA浓缩仪干燥10 min，加100 μ L TE (pH 8.0)在65 °C条件下溶解15 min，放入4 °〇冰箱保存待用。
[0007] PCR扩增反应体系为：2XTaq PCR MasterMix 10 yL，上下游引物（10 μΜ)各0· 8 4 1^，0嫩模板量250叩，！120为7.2以匕扩增程序为：94°0预变性5 1^11，94°0变性30 s，64 °C退火30 s，72 °C延伸30s，反应循环40次，最后72 °C延伸5 min。
[0008] 本发明涉及河豚鱼成分PCR检测结果的限制性内切酶肠 eA III酶切确证方法。
[0009] 应用限制性内切酶III对河豚鱼疑似阳性样品的PCR产物进行酶切与电泳分 析，电泳图谱与河豚鱼阳性对照不同的样品，判定为假阳性结果，电泳图谱与阳性对照相同 的河豚鱼加工样品，确证为阳性结果，即检出河豚鱼成分，并经序列分析验证，建立了简便 高效的河豚鱼成分PCR检测结果的确证方法。
[0010] 本发明的优点在于：可以快速、精准鉴别河豚鱼物种与非河豚鱼物种，有效排除有 毒物质河豚鱼成分检测中可能产生的假阳性结果。
【附图说明】
[0011] 图1引物HT-I对河豚鱼的PCR扩增结果；1.黑腮兔头飩；2.兔头飩；3.暗纹东 方飩；4.黄鳍东方飩；5.棕斑腹刺飩；6.红鳍东方飩；7.暗鳍腹刺飩；8.月腹刺飩；9.横纹 东方飩；10.河豚鱼加工鲜肉；11.河豚鱼干I ;12.鲈鱼；13.河豚鱼干2 ;14.河豚鱼干3 ; 15.金枪鱼；16.大黄鱼；17.鳗鱼；18.带鱼；19.空白对照（CldH2O) ;M. DNA marker I。
[0012] 图2 PCR产物及其酶切结果电泳图谱；其中M. DNA marker I ;1、2.黑腮兔头飩； 3、4.兔头飩；5、6.暗纹东方飩；7、8.黄鳍东方飩；9、10.棕斑腹刺飩；11、12.红鳍东方飩； 13、14.暗鳍腹刺飩；15、16.月腹刺飩；17、18.横纹东方飩；19、20.河豚鱼加工鲜肉；21、 22.河豚鱼干1;23、24.鲈鱼；25、26.河豚鱼干2;27、28.河豚鱼干3;29、30.金枪鱼。奇 数号泳道为酶切消化后的产物电泳图谱，偶数号泳道为未经酶切的PCR产物电泳图谱。
[0013] 图3河豚鱼（兔头飩）分?織分片段PCR产物碱基序列与限制性内切酶III 酶切位点；下划线部分与HT-I引物(表2)部分同源，框内碱基GCCGAG + (N)19 为酶切 位点。
[0014] 图4金枪鱼分?/?部分片段PCR产物碱基序列与限制性内切酶III酶切位点 NEB cutter分析图，下划线部分与HT-I引物(表2)部分同源，框内碱基GCCGAG + (N)19 Λ NNt为酶切位点。
[0015] 图5鲈鱼分?/τ部分片段PCR产物碱基序列。
【具体实施方式】
[0016] 材料与方法 1. 1材料来源 9个已知物种名称的河豚鱼样品、4个未知种类的河豚鱼样品、5个非河豚鱼样品（表 1)搜集自福建省莆田、厦门、福州等地水产养殖场、农贸市场和超市。
[0017] 表1 18个河豚鱼及其他鱼类供试样品
1. 2试剂 试剂来源：10 X buffer与T^i7HdNTPs购自上海生工有限公司，限制性内切 酶MwA 111(2000 U/mL)购自北京纽英伦生物技术有限公司，引物委托上海生工有限公司合 成。
[0018] 引物合成 由上海生工生物工程有限公司合成河豚鱼成分检测引物（HT-1)，引物碱基序列、PCR 产物片段长度与适合的退火温度（^值）见表2。
[0019] 表2河豚鱼成分的PCR检测用的引物序列与退火温度
I. 4. DNA提取、PCR扩增、限制性内切酶消化 以优化后确立的DNA提取CTAB方法与PCR引物、扩增体系和温度程序，进行DNA提取、 PCR扩增、PCR产物凝胶水平电泳与凝胶成像，每个PCR重复3次。按照产品使用说明书规 定，在10 μL的PCR产物中，加入2.0 μL IOX Cut smart Buffer、1.0 μL限制性内切酶 肠6^111、0.05卜1^5]~腺苷甲硫胺酸（5^(1611〇87111161:11；[011； [116，3敵）溶液，再加纯净水6.95 KL使总体积达到20 μL，在37 °C条件下消化16~18 h，然后进行琼脂糖凝胶电泳与成像 拍照。
[0020] 1.5 PCR产物测序、序列比对与酶切位点确定 PCR产物通过凝胶电泳后，检出阳性结果的PCR扩增产物委托上海生工生物技术有限 公司进行克隆、测序。
[0021] 应用DNAMAN 5. 2. 2版软件对各个样品PCR产物序列进行整理分析，结果以MASED Document/DNAMANl格式输出，同时在GenBank中进行BLAST分析。应用NEBcutter 2. 0软 件进行限制性内切酶III酶切位点分析。
[0022] 5.结果分析 5. 1河豚鱼成分PCR检测结果 应用河豚鱼成分PCR检测引物（HT-I)对13个河豚鱼样品与5个非河豚鱼样品提取 的DNA进行河豚鱼线粒体特异性基因（分i WPCR扩增，结果表明，18个样品中3个样品无 PCR扩增产物，判为阴性结果，15个样品初步判为疑似阳性。图1中13个河豚鱼样品与2 个非河豚鱼样品（金枪鱼与鲈鱼）共15个样品检出PCR产物，为疑似阳性结果。另外3种 非河豚鱼类的大黄鱼、鳗鱼、带鱼与空白对照（CldH 2O)均未扩增出DNA条带，判为阴性结果。
[0023] 5. 2 PCR产物酶切图谱分析 15个检出河豚鱼成分疑似阳性结果的样品PCR产物及其经酶切消化后的产物电泳图 谱见图2。其中奇数号泳道为酶切消化后的产物电泳图谱，偶数号泳道为未经酶切的PCR产 物电泳图谱。图2Α与图2Β中9个已知学名与4个未知学名的的河豚鱼样品，在奇数号泳 道均检出酶切产物，各样品图谱相同，均有2条新的片段较小的条带，分别在300 bp与200 bp的下方。图2B可知，23、24号泳道分别为鲈鱼酶切与未经酶切的PCR产物，前者无新的 条带出现，29、30号泳道为金枪鱼的酶切与未经酶切的PCR产物，酶切的电泳图谱出现4条 新的条带，图谱与河豚鱼明显不同。可见，应用限制性内切酶MwA III酶切可以区别河豚鱼 与非河豚鱼，进而排除2个非河豚鱼的假阳性结果。
[0024] 从电泳图片2A与2B来看，所有疑似阳性样品的PCR产物酶切后残留PCR产物片 段条带位置都高于未经酶切处理的原PCR产物条带，出现该现象的原因是加入的限制性内 切酶(蛋白）与DNA结合，使得分子质量比原来纯DNA片段更大。毛细管电泳结果(本文略） 表明，经内切酶消化酶切后切断的与未切断残留的DNA片段，因结合了内切酶，其大小都比 实际的DNA片段大。
[0025] 产物的DNA序列与酶切位点分析 应用NEB cutter 2.0软件对13种河豚鱼与2种非河豚鱼(J卢鱼及金枪鱼）样品 的PCR产物碱基序列进行限制性内切酶酶切位点分析，结果表明，III酶切位点为 5'... GCCGAG (N)19 & NN'..3'。河豚鱼样品的PCR产物均为423个碱基(仅出示兔头飩 序列，其他种类河豚鱼DNA序列资料略III酶切位点都只有1个（图3)，在5'端起的 第256/254碱基位置，被切成2段，即电泳图出现的2条新带（图2)，大小为256/254 bp 与167/169 bp。金枪鱼PCR产物为422个碱基，III酶切位点有2个（图4)，分别在 5'.端起的第339/337碱基与252/250碱基的位置，被切成4段，大小为339/337 bp、83/85 bp与252/250 bp、170/172 bp (图2B第29泳道)。鲈鱼PCR产物为423个碱基，其序列 无 III限制性内切酶酶切位点（图5)，NEB cutter 2. 0软件无法生成酶切分析图，电泳 结果无新条带出现（图2B)，二者结果吻合。2个非河豚鱼样品中也能扩增出与河豚鱼相似 的PCR产物，出现假阳性现象，原因是，河豚鱼成分PCR检测所用的正向引物25个碱基，反 向互补20个碱基(表2)，结果正向引物有20个连续碱基、反向互补有10个连续碱基与7 个连续碱基分别与金枪鱼分? △部分片段序列两端互补，鲈鱼中也存在类似情况。
[0026] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1. 一种用于河豚鱼物种鉴别方法的PCR引物，其特征在于：所述引物为HT-IF: 5'-TGCCTCAACTACAAGAACCTAATGG-3' ；HT-1R:5'-GGGAAGGACATAGCCCACGA-3'。2. -种河豚鱼物种鉴别方法，其特征在于：所述方法包括如下：以优化后确立的DNA提 取CTAB方法与PCR引物、扩增体系和温度程序，进行DNA提取、PCR扩增、PCR产物凝胶水平 电泳与凝胶成像。3. 根据权利要求2所述的一种河豚鱼物种鉴别方法，其特征在于：所述的PCR产物 凝胶水平电泳与凝胶成像方法为在10ML的PCR产物中，加入2.OMLIOXCutsmart Buffer、1.0ML限制性内切酶肠eAIII、0. 05ML义腺苷甲硫胺酸溶液，再加纯净水6. 95 ML使总体积达到20ML，在37 °C条件下消化16~18h，然后进行琼脂糖凝胶电泳与成像 拍照。4. 根据权利要求2所述的一种河豚鱼物种鉴别方法，其特征在于：所述的DNA提取 CTAB方法为：称取100mg样品各两管于2. 0mL离心管中，加入600yL2 %CTAB溶液和 蛋白酶K15yL，经超声波处理5min;加入600yL三氯甲烷，13400I-Inirr1条件下离心 15min，取上清，加入2倍体积的0. 5 %CTAB溶液，颠倒混匀，室温静置约I. 5h;在13400 r.miiT1条件下离心25min，取沉淀，加入约400yLNaCl溶液，沉淀溶解完全后，加入15 yLRnase酶37 °C条件下温浴约1.5h;加入等体积的三氯甲烷：饱和酚：异戊醇混合液， 三者的体积比为25 :24 :1，颠倒数次充分混合后，在13400r.HiirT1条件下离心15min，重 复此操作三次；取上清，加入0. 8倍异丙醇和1/10体积的NaAc溶液，涡旋30s，充分混合 后，在13400r.HiirT1下离心15min;取沉淀，加入400yL70 %乙醇，上下颠倒使沉淀悬 于溶液中，在13400r^mirT1条件下离心洗绦沉淀10min;经DNA浓缩仪干燥10min，加 pH8.0、100yLTE在65 °C条件下溶解15min，放入4 °C冰箱保存待用。5. 根据权利要求2所述的一种河豚鱼物种鉴别方法，其特征在于：PCR扩增反应体系 为：2父131?〇?1&18七6-1叉10 1^，上下游引物（10 11]\〇各0.8 1^，0嫩模板量250叩， H2O为7.2yL，扩增程序为：94 °C预变性5min，94 °C变性30s，64 °C退火30s，72 °C延 伸30s，反应循环40次，最后72 °C延伸5min。
【专利摘要】本发明涉及一种河豚鱼物种鉴别方法，以优化后确立的DNA提取CTAB方法与PCR引物、扩增体系和温度程序，进行DNA提取、PCR扩增、PCR产物凝胶水平电泳与凝胶成像；在10μL的PCR产物中，加入2.0μL 10× Cut smart Buffer、1.0μL限制性内切酶NmeA Ⅲ、0.05μL S-腺苷甲硫胺酸（S-adenosylmethionine，SMA）溶液，再加纯净水6.95μL使总体积达到20μL，在37℃条件下消化16～18h，然后进行琼脂糖凝胶电泳与成像拍照。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104894254
【申请号】CN201510286313
【发明人】陈文炳, 翁国柱, 邵碧英, 缪婷玉, 江树勋, 彭娟
【申请人】福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月30日
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