一种基于聚丙烯酰胺凝胶电泳检测低效率基因组编辑的方法及其应用
一种基于聚丙烯酰胺凝胶电泳检测低效率基因组编辑的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明具体涉及一种基于聚丙烯酰胺凝胶电泳检测低效率基因组编辑的方法及 其应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 基因组定点编辑技术无论是在生物学基础研宄，还是诸如基因治疗、生物反应器 等生物相关产业中都具有巨大的应用前景。近年来，随着大量物种基因组测序工作的完成， 以及人工核酸内切酶（Engineered endonuclease，EEN)的出现，基因组编辑技术飞速发展， 逐渐成为科研工作者选择性编辑基因组和研宄基因功能的必备工具。
[0003] 锌指核酸内切酶（zinc finger endonuclease，ZFN)是第一代人工核酸内切酶， ZFN是将锌指蛋白与核酸内切酶Fok I融合形成的核酸内切酶。到目前为止，ZFN已相 对比较成熟并成功应用于大鼠、小鼠、猪、牛等动物。但是，要设计并构建出一个切割活性 高、特异性好的ZFNs工作量很大，而且很多基因序列中可能难以找到合适的ZFN靶点，其 技术专利被少数几家商业公司控制，使用成本很高，效率相对较低，这些因素大大限制了 ZFNs的推广。随之，第二代人工核酸酶--类转录激活因子效应物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease, TALENs)出现，由于 TALEN 与 ZFN 相比构建相对 较为简单，编辑效率高，成本低，特异性更高而受到科研工作者的青睐，并迅速应用于小 鼠、斑马鱼、猪和牛等动物。2013年，一种全新的人工核酸内切酶，即第三代人工核酸内 切酶一(clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) / CRISPR-associated (Cas) 9, CRISPR/Cas9)出现，与前两代人工核酸内切酶相比，CRISPR/ Cas9制作更为简单，成本更低，作用效率更高。
[0004] 上述三种人工核酸内切酶各有优缺点，但是其作用机制基本一致，即通过特异识 别目的DNA序列，对靶标位置的DNA链进行精确切割，从而形成双链断裂（double-strand breaks, DSB)，诱发细胞内源性的修复机制，通过非同源末端连接修复（non-homologous end joining, NHEJ)或者同源重组修复（homologous recombination, HR)对切 口进行修复。 在修复过程中，有可能出现片段的删除或者插入、碱基替换、点突变等定点修饰，所以修复 的结果可能呈多态性。
[0005] 人工核酸内切酶的种类、设计、转染方式、载体形式以及其他实验条件均会对其工 作效率产生很大影响。目前，人工核酸内切酶编辑效率的检测主要有以下几种方法：（1)限 制性内切酶酶切检测法，即如果在靶位点之间的Spacer存在某个限制性内切酶的酶切位 点，那么该位点在被人工核酸内切酶切割修复后就会遭到破坏，而无法被原有的限制性内 切酶切开。这种方法的优点是廉价、简单、快捷，但其缺点也显而易见，即如果Spacer处没 有合适的限制性内切酶位点，该方法将无法使用。另外，如果人工核酸酶发挥了作用，但是 突变位点不在限制性内切酶所识别的序列，该方法也无法检测，从而造成检测到的突变率 比实际值偏低。（2)将包括靶位点的片段PCR扩增后TA克隆测序，根据测序结果计算编辑 效率和类型，该方法不受序列的限制，但是人工核酸酶的效率很低时，要准确评价其活性并 筛选阳性单克隆细胞需要进行大量的克隆、测序工作，工作量太大、成本太高。（3)基于可识 别错配双链的错配内切酶（主要采用Cel I内切酶和T7E1两种酶）检测法，即在靶位点两 侧设计引物进行PCR反应，产物回收纯化后先高温变性，再缓慢降温复性，然后用Cel I或 者T7E1酶消化，如果靶位点处由于序列插入或者删除而形成泡状结构即可被Cel I或者 ?7Ε1识别切割，该方法操作相对比较简单，但是Cel I和T7E1酶均比较昂贵，如进行大规 模检测成本较高，另外该方法酶切后一般用琼脂糖凝胶电泳检测，灵敏度不高，如果人工核 酸酶的效率很低的时候，使用该方法无法检测。除上述方法之外，还有体内或者体外引入报 告基因法以及体外的SSA(single strand annealing)分析法等。
[0006] 在使用人工核酸内切酶进行基因组编辑过程中，筛选靶基因被正确编辑的单克隆 细胞是一项庞大的工作，尤其是在人工核酸内切酶效率很低的时候，就更加困难。像ZFN这 样的低效率人工核酸内切酶，尽管Sigma公司描述其编辑效率可以达到1-20%，但是很多 实验室在实际应用过程中所获得的数据却远低于这一标准，例如刘杰等（2014)使用ZFN敲 除猪卵母细胞孤雌胚胎中MSTN基因，打靶效率为0.54%;任广彩等（2014)利用ZFN对转基 因猪成纤维细胞中的增强型绿色焚光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP) 基因进行敲除，敲除效率最低为0.97%，最高的一组也仅为1.76% ;Watanabe等（2013)用 ZFN敲除猪胎儿成纤维细胞IL2RG基因的研宄中，打靶效率也只有0. 5%。即使TALEN或者 CRISPR/Cas9这类高效率的人工核酸内切酶，也会由于靶基因序列的特殊性而出现效率很 低的情况，例如吴金青等（2015)利用CRISPR/Cas9对猪IGF2基因进行敲除，由于该基因结 构复杂、GC含量和甲基化程度高，编辑效率始终无法提高，最高也仅为9. 2%。在如此低的 编辑效率下，上述第一种和第三种方法由于灵敏度低而无法检测，若采用上述第二种方法 需要进行大量的克隆、测序才有可能筛到正确的单克隆细胞，工作量太大，实验成本也将非 常尚。
[0007] 在人工核酸内切酶技术快速发展，基因定点修饰技术已逐渐成为分子生物学实验 室必备的实验技术的形势下，最大限度地提高人工核酸内切酶编辑效率检测技术的灵敏 度，并以此指导后续的单克隆筛选工作，提高实验效率，降低实验成本就显得尤为重要。
【发明内容】
[0008] 本发明要解决的技术问题是如何快速、简单的检测低效率基因编辑。
[0009] 为解决上述问题，本发明首先提供了一种基因编辑后的DNA产物的检测方法。
[0010] 本发明提供的基因编辑后DNA的检测方法包括如下步骤：
[0011] 1)将待测基因编辑后DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，并将所述PCR扩增产 物变性、复性，得到杂交产物；
[0012] 所述待测基因编辑后DNA为将野生型DNA用人工核酸内切酶编辑，得到由突变DNA 和未突变野生型DNA组成的待测基因编辑后DNA ;
[0013] 2)用聚丙烯酰胺凝胶电泳所述杂交产物，检测电泳结果，根据分子量大小及构象 差异，确定所述待测基因编辑后DNA中突变DNA和未突变野生型DNA，实现基因编辑后DNA 的检测。
[0014] 上述方法中，所述待测基因编辑后DNA中，所述未突变野生型DNA的质量百分含量 大于所述突变DNA的质量百分含量。
[0015] 上述方法中，所述突变DNA为将野生型DNA缺失或突变多个寡核苷酸，其余寡核苷 酸不变得到的DNA。
[0016] 上述方法中，所述突变DNA的质量百分含量是指【突变DNAA野生型DNA (或者突 变DNA和未突变的野生型DNA))】*100%。
[0017] 上述方法中，所述突变DNA的质量百分含量具体为0. 1% -0. 45%。
[0018] 上述方法中，所述杂交产物中已经被编辑后发生突变的DNA会产生泡状结构，未 被编辑的DNA则不产生泡状结构。
[0019] 上述方法中，所述人工核酸内切酶为锌指核酸内切酶、类转录激活因子效应物核 酸酶或 CRISPR/Cas9。
[0020] 上述方法中，所述人工核酸内切酶为锌指核酸内切酶。
[0021] 上述方法中，所述野生型DNA为MSTN基因。
[0022] 上述方法中，将所述PCR扩增产物变性、复性的方法为现有技术，具体可根据文 献"Sanjana N E, Cong L, Zhou Y, et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. NATURE PROTOCOLS, 2012, 7(1): 171-193." 中的方法进 行。
[0023] 为解决上述技术问题，本发明还提供了上述方法的用途。
[0024] 本发明提供了上述方法在从基因编辑后的DNA产物中筛选突变DNA中的应用。
[0025] 本发明还提供了上述方法在从基因编辑后的克隆产物中筛选含有突变DNA克隆 中的应用。
[0026] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种筛选基因编辑成功的单克隆的方法。
[0027] 本发明提供的筛选基因编辑成功的单克隆的方法包括如下步骤：
[0028] 1)将待测基因编辑后的克隆产物中的克隆分别提取DNA，并分别进行PCR扩增，得 到PCR扩增产物，并将所述PCR扩增产物变性、复性，得到杂交产物；
[0029] 2)用聚丙烯酰胺凝胶电泳所述杂交产物，检测电泳结果，选取分子量大小及构象 不同于野生型克隆的克隆，即为基因编辑成功的单克隆。
[0030] 上述方法中，所述待测基因编辑后的克隆产物是按照包括如下步骤的方法制备得 到的：将表达靶向目标基因的人工核酸内切酶转入离体细胞中，进行基因编辑，得到转染后 细胞；将所述转染后细胞进行培养，得到待测基因编辑后的克隆产物。
[0031] 上述方法中，采用有限稀释法将所述转染后细胞进行培养，得到待测基因编辑后 的克隆产物。
[0032] 上述方法中，所述转染后细胞进行培养包括如下步骤：
[0033] 1)将所述转染后的细胞继续培养72h，得到培 养后的转染后的细胞；
[0034] 2)用胰酶消化所述培养后的转染后的细胞并进行计数，每个IOcm培养皿中加入 500个细胞和IOmL含20 %胎牛血清和1 %双抗的DMEM培养液，使细胞均匀分布，然后置于 37°C，5% CO2培养箱中培养7-10d，得到待测基因编辑后的克隆产物。
[0035] 上述方法中，所述目标基因为绵羊MSTN基因；所述人工核酸内切酶为锌指核酸内 切酶。
[0036] 上述方法中，所述细胞为绵羊胎儿成纤维细胞。
[0037] 本发明利用聚丙稀酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE) 高分辨率的特点，设计了一种可以简单、快捷、灵敏、高效检测人工核酸内切酶活性的方法， 并成功应用于ZFN敲除绵羊胎儿成纤维细胞MSTN基因效率的检测中，充分证明了该方法的 可行性。通过实验证明：本发明的方法在保证人工核酸内切酶编辑效率检测准确性、灵敏性 的同时，大大简化了实验操作且大大降低了检测成本，将对人工核酸内切酶在基因定点修 饰、基因功能研宄以及疾病动物模型的建立等方面的应用产生积极地推动作用。
[0038] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【附图说明】
[0039] 图1为PAGE法检测基因组编辑效率模型的建立及操作流程示意图。
[0040] 图2为PAGE法与Cel I内切酶法检测基因组编辑效率灵敏度比较。图2 (a)为 绵羊pri-miR-99a基因16bp缺失片段及其野生型片段PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测 结果，其中，M为IOObp Marker，1-3泳道为野生型PCR产物，4-6泳道为16bp缺失型PCR产 物；图2(b)为野生型片段和16bp缺失型片段杂交双链Cel I内切酶酶切后的琼脂糖凝胶 电泳图，其中，M为IOObp Marker，1泳道为野生型对照，2-5泳道为为野生型片段和16bp缺 失型片段杂交双链Cel I内切酶酶切产物；图2 (c)为PAGE法与Cel I内切酶酶切后再用 PAGE胶检测基因组编辑效率灵敏度比较，其中，M为IOObp Marker，1-5泳道为杂交双链用 Cel I内切酶酶切后再用PAGE胶检测的结果，6-10泳道为杂交双链直接用PAGE检测结果。
[0041] 图3为电转染后绵羊胎儿成纤维细胞（放大400倍）。图3(a)为电转染MSTN-ZFNs 质粒后培养48h的绵羊胎儿成纤维细胞；图3 (b)为电转染pmax-GFP质粒后培养24h的绵 羊胎儿成纤维细胞。
[0042] 图4为PAGE法检测ZFN编辑绵羊胎儿成纤维细胞MSTN基因效率。图4 (a)为PAGE 法检测部分电转染MSTN-ZFNs质粒的绵羊胎儿成纤维细胞MSTN基因 PCR产物，其中，M为 IOObp Marker，1-6泳道为部分电转染MSTN-ZFNs质粒的绵羊胎儿成纤维细胞MSTN基因 PCR 产物；图4(b)为PAGE法检测用巢式PCR扩增图4(c)图中1，2,5,6,7,8,9泳道黑色箭头所 指条带的琼脂糖凝胶电泳结果，其中，M为IOObp Marker，l泳道为绵羊基因组对照，2-8泳 道为用巢式PCR扩增图4(c)图中1，2,5,6,7,8,9泳道黑色箭头所指条带的琼脂糖凝胶电 泳结果；图4 (c)为PAGE法检测电转染MSTN-ZFNs质粒的绵羊胎儿成纤维细胞MSTN基因 PCR产物，其中，M为IOObp Marker，1-9泳道为电转染MSTN-ZFNs质粒的绵羊胎儿成纤维细 胞MSTN基因 PCR产物，10泳道为野生型对照。
[0043] 图5为Zm-63, Zm-85号MSTN基因敲除细胞及野生型细胞MSTN基因测序结果比 较。图5(a)为Zm-63号细胞与野生型细胞MSTN基因序列测序结果比较，可见Zm-63号细 胞MSTN基因261bp序列被敲除；图5 (b)为Zm-85号细胞与野生型细胞MSTN基因序列测序 结果比较，可见Zm-85号细胞MSTN基因174bp序列被敲除。
【具体实施方式】
[0044] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0045] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0046] 靶向MSTN基因的ZFN质粒是Sigma公司的产品；
[0047] DMEM(Dulbecco' s modified eagle medium)是 Thermo 公司的产品；
[0048] 胎牛血清（Fetal Bovine Serum)是浙江天杭生物科技有限公司的产品；
[0049] pmax-GFP质粒是Lonza公司的产品；
[0050] 电转染液是Lonza公司的产品；
[0051] DNA 快速提取试剂（QuickExtract DNA Extraction Solution)是 Epicentre 公司 的广品；
[0052] 感受态DH5 a、dNTP是根生化科技（北京）有限公司的产品；
[0053] Cel I内切酶是NEB公司的产品；
[0054] Pfu酶、IOObp Maker是宝生物工程（大连）有限公司的产品；
[0055] T载体、PCR产物凝胶回收试剂盒是Promega公司的产品；
[0056] 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺和过硫酸铵是生工生物工程（上海）股份有限公司的 广品；
[0057] 电转染仪是德国Lonza公司的产品；
[0058] ND2000超微量分光光度计是Thermo公司的产品；
[0059] 凝胶成像系统是BioRad公司的产品；
[0060] 阿勒泰羊20号和阿勒泰羊95号在文献"Zhang W, Wang L, Zhou P, et al.Identification and Analysis of Genetic Variations in Pri-MiRNAs Expressed Specifically or at a High Level in Sheep Skeletal Muscle. PLOS ONE, 2015, 10(2) :e0117327. doi :10. 1371/journal. pone. 0117327" 中公开过，公众可从新 疆农垦科学院获得。
[0061] 实施例UPAGE法和Cel I内切酶法检测基因组编辑效率的灵敏度
[0062] 本实施例旨在通过自然存在的纯合野生型片段和小片段纯合缺失型片段来模拟 人工核酸内切酶敲除基因的结果，并通过对纯合野生型片段和小片段纯合缺失型片段的 PCR产物的定量检测和对小片段纯合缺失型片段PCR产物的定量梯度稀释，建立了人工核 酸内切酶不同敲除效率的模型（图1)，以定量比较PAGE法与目前通用的Cel I内切酶法 检测基因组编辑效率的灵敏度。具体步骤如下：
[0063] 一、模拟基因编辑获得基因编辑后DNA
[0064] 本实施例以纯合野生型片段和小片段纯合缺失型片段为试验材料，若要重复以下 试验内容，可通过SSCP及测序获取纯合野生型片段和小片段纯合缺失型片段或者直接合 成相应片段的序列。
[0065] 1、引物的设计
[0066] 检索 miRBase (http://www. mirbase. org)获得绵羊（Ovis aries)miR_99a 的 前体序列（登录号：MI0025285)，与UCSC收录的绵羊基因组数据（ISGC 0ar_v3. 1/ oviAri3, August 2012)比对，分别向上游和下游延伸1000 bp得到pri-miR_99a的序列并以 此设计引物P-miR_99a(见表1)用于PCR扩增绵羊pri-miR-99a基因16bp缺失型片段和 野生型片段。
[0067] 表1、引物及其信息
[0068]
[0069] 2、PCR 扩增
[0070] 以阿勒泰羊20号（阿勒泰羊20号的基因组DNA仅pri-miR-99a基因缺失16bp) 的基因组DNA为模板，采用P-miR-99a引物进行PCR扩增，得到大小为580bp (序列1)的 PCR扩增产物（含有绵羊pri-miR-99a基因16bp缺失型片段）；
[0071] 以阿勒泰羊95号的基因组DNA为模板，采用P-miR-99a引物进行PCR扩增，得到 大小为596bp (序列2)的PCR扩增产物（含有绵羊pri-miR-99a基因野生型片段）。
[0072] 含有绵羊pri-miR-99a基因16bp缺失型片段为将含有绵羊pri-miR-99a基因野 生型片段缺失16bp得到的片段，具体缺失位置可见序列。
[0073] PCR 反应体系（25 μ I) : 10XBuffer 2. 5 μ 1，dNTP (2. 5mM each) 2 μ 1，上下游引物 (10 μ Μ)各 0· 5 μ 1，TaqDNA 聚合酶 0· 5 μ 1，模板 1 μ 1，ddH20 18 μ I ;
[0074] ?〇?扩增反应程序：95°0预变性5!1^11;95°0 308,55°0退火308,72°0 308,40个循 环；72°C延伸10min，4°C保存。
[0075] PCR扩增产物用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2a所示：其中，M为IOObp Marker，1-3泳道为野生型PCR产物，4-6泳道为16bp缺失型PCR产物，且均为单一条带，可 以用于后续试验。
[0076] 将上述得到的PCR扩增产物分别经琼脂糖凝胶电泳进行检测、回收纯化后，用 ND2000超微量分光光度计测定浓度，并调整至IOOng/ μ 1。将含有绵羊pri-miR-99a基因 16bp缺失型片段的PCR扩增产物分别进行10倍、100倍和1000倍梯度稀释，以模拟人工核 酸内切酶不同的编辑效率；然后吸取1 μ 1含有野生型片段的PCR扩增产物分别与1 μ 1没 有稀释和经10倍、100倍和1000倍梯度稀释的含有绵羊pri-miR-99a基因16bp缺失型片 段的PCR扩增产物混合，得到含有绵羊pri-miR-99a基因16bp缺失型片段与野生型片段质 量为1 :1的混合样品、含有绵羊pri-miR-99a基因16bp缺失型片段与野生型片段质量为 1 :1〇的混合样品、含有绵羊pri-miR-99a基因16bp缺失型片段与野生型片段质量为I :100 的混合样品和含有绵羊pri-miR-99a基因16bp缺失型片段与野生型片段质量为I :1000的 混合样品，即为模拟基因编辑后DNA。
[0077] 二、杂交双链的形成
[0078] 参照文献 " Sanjana N E，Cong L，Zhou Y，et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. NATURE PROTOCOLS, 2012, 7 (I) : 171-193. "中的方法分别将上述含有绵羊pri-miR-99a基因16bp缺 失型片段与野生型片段质量为1 :1的混合样品、含有绵羊pri-miR-99a基因16bp缺失型片 段与野生型片段质量为1 :1〇的混合样品、含有绵羊pri-miR-99a基因16bp缺失型片段与 野生型片段质量为I :100的混合样品和含有绵羊pri-miR-99a基因16bp缺失型片段与野 生型片段质量为1 :1〇〇〇的混合样品进行变性和复性以形成含有"泡状"结构的杂交双链， 分别得到待检测DNA样品1、待检测DNA样品2、待检测DNA样品3、待检测DNA样品4,变性、 复性条件见表2。
[0079] 上述各个待检测DNA样品均含有"泡状"结构的杂交双链和未杂交的野生型片段。
[0080] 表2、通过变性和复性形成杂交双链条件
[0081]
[0082] 三、基因编辑效率的检测
[0083] 1、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)检测（本发明的方法）
[0084] 由于野生型片段和含有"泡状"结构的杂交双链的分子量、构象均不同，在凝胶中 的迀移速率也不同，直接用聚丙烯酰胺凝胶电泳即可检测。具体步骤如下：分别取待检测 DNA样品1、待检测DNA样品2、待检测DNA样品3和待检测DNA样品4各2 μ 1，分别混合 1 μ 1上样缓冲液后上样，IlOV电压，15% (V/V)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，待溴酚蓝迀移至 凝胶底部时停止电泳。凝胶经固定、银染、显色和终止后置于凝胶成像仪（BioRad，美国）拍 照。
[0085] 基因组编辑为将野生型DNA通过人工内切酶作用，得到基因编辑后DNA，其由突变 DNA和未突变的野生型DNA组成。
[0086] 基因组编辑效率为【突变DNAA野生型DNA (或者突变DNA和未突变的野生型 DNA))】*100 %。
[0087] 本实施例的设定基因编辑模型中，突变DNA为含有绵羊pri-miR-99a基因16bp缺 失型片段，野生型DNA为野生型片段+含有绵羊pri-miR-99a基因16bp缺失型片段。
[0088] 待检测DNA样品1的基因组编辑效率为1八1+1) *100% = 50% ;
[0089] 待检测DNA样品2的基因组编辑效率为1八1+10) *100% ~ 10% ;
[0090] 待检测DNA样品3的基因组编辑效率为1八1+100)*100%~ 1% ;
[0091] 待检测DNA样品4的基因组编辑效率为1八1+1000)*100%~ 0. 1% ;
[0092] 结果如图2c所示：第6泳道为野生型对照，第7-10泳道分别为待检测DNA1-4号 样品，可见待检测DNA样品4 (即16bp缺失型片段被稀释至1000倍），即编辑效率为0. 1 % 时仍可被PAGE法检测（图2c第10泳道）。通过对该条带切胶回收、克隆测序后，证明该条 带是杂交双链对应的条带。
[0093] 2、Cel I酶切后琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
[0094] 分别取待检测DNA样品1、待检测DNA样品2、待检测DNA样品3和待检测DNA样 品4各2 μ 1，分别用Cel I酶进行酶切检测，得到酶切后的DNA样品。
[0095]酶切反应体系（10 μ I):待酶切 DNA 样品 2 μ 1，Cel I 酶 0.5 μ 1，IOXbuffer 1 μ 1，CldH2O 6. 5 μ 1，45°C水浴lh，然后分别用2% (V/V)的琼脂糖凝胶电泳和15% (V/V) 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切后的DNA样品。
[0096] (1)琼脂糖凝胶电泳
[0097] Cel I内切酶识别杂交双链的"泡状"结构后将待检测DNA样品中的杂交双链切 割为两个片段363bp和232bp，琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰氨凝胶电泳后可见三条带，分别 为595bp、363bp和232bp。由于16bp缺失片段经梯度稀释，所以待检测DNA样品中杂交双链 的量也在逐渐减少，反映在凝胶电泳图上便是杂交双链对应的条带或者经切割后的363bp 和232bp条带亮度逐渐降低，直至电泳无法检测。
[0098] 结果如图2b所示：第1泳道为野生型对照，第2-5泳道分别为待检测DNA1-4号样 品，可见当16bp缺失型片段被稀释至10倍即编辑效率为10%的时候酶切后的片段条带已 经很淡（图2 (b)第3泳道）；当稀释至100倍和1000倍，即编辑效率为1 %和0. 1 %时就 已经无法检测。说明内切酶法用琼脂糖凝胶电泳检测编辑效率的阈值为10%，低于10%的 编辑效率该方法无法检测。说明琼脂糖凝胶电泳的灵敏度无法满足对低编辑效率的检测。
[0099] (2)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
[0100] 酶切后的DNA样品的聚丙烯酰氨凝胶电泳检测结果图2c所示：第1泳道为野生型 对照，第2-5泳道分别为待检测DNA1-4号样品，可见当16bp缺失型片段被稀释至100倍即 编辑效率为1 %时仍可被检测（图2c第4泳道），当编辑效率低于1 %时，该方法也无法检 测（图2c第5泳道）。
[0101] 通过以上试验说明：PAGE法检测基因组编辑效率的灵敏度是Cel I内切酶法的 10倍（酶切后用PAGE检测）或者100倍（酶切后用琼脂糖凝胶电泳检测），且省去了酶切 步骤，既降低了实验成本又简化了实验步骤，完全可以替代Cel I内切酶法用于人工核酸 内切酶编辑效率的检测。
[0102] 实施例2、聚丙烯酰胺凝胶电泳法在检测ZFN的编辑效率中的应用
[0103] 由于ZFN发展时间较长，技术比较成熟，且编辑效率较低，用ZFN来验证上述实施 例1中的方法更有说服力，下面以其为本实施例中的基因编辑的工具来验证本发明的方 法。另外，MSTN基因突变的动物会表现出"双肌"性状，本实施例用ZFN对绵羊成纤维细胞 的MSTN基因进行编辑，以获得的MSTN基因敲除的绵羊成纤维细胞，对后续通过体细胞核移 植及胚胎移植培育具有"双肌"性状绵羊品种的良好材料也有重要意义。具体步骤如下：
[0104] 一、基因编辑后DNA的获得
[0105] UZFN 的制备
[0106] 根据绵羊（Ovis aries)肌生成抑制素（myostatin, MSTN)基因序列（GenBank登 录号：DQ530260. 1，提交日为2008. 4. 25)，由Sigma公司设计合成3对锌指核酸酶载体，经 生物信息学分析和酵母DNA切割实验，选择1对效率最高（75%)的MSTN-ZFNs质粒用于后 续实验，其结合位点和切割位点序列为：AACAGCTCCTAACATCagcaaaGATGCTATAAGAC(大写字 母为MSTN-ZFNs识别序列碱基，小写字母为MSTN-ZFNs切割序列碱基）。
[0107] 2、绵羊胎儿成纤维细胞的分离培养
[0108] 妊娠母羊为2岁萨福克羊（新疆农垦科学院实验羊场提供），至妊娠期第40天进 行无菌手术取出体内胎儿，去除头、四肢及内脏后用Hanks溶液清洗2-3次，洗去组织表面 的血污，然后按照文献"刘玉琴.细胞培养实验手册.北京：人民军医出版社，2009, 34-35. " 的组织块培养法，分离培养得到原代绵羊胎儿成纤维细胞，并冻存于液氮中备用。
[0109] 3、MSTN-ZFNs质粒电转染绵羊胎儿成纤维细胞实现基因编辑
[0110] 从液氮中取出冻存的原代细胞，解冻后用含15%胎牛血清和1 %双抗的DMEM培养 液于37°C，5% CO2培养至细胞覆盖约80%培养皿底时实施电转染。具体步骤如下：电转染 采用100 μ 1体系，用胰酶消化细胞并进行计数，每个转染体系中加入2 X IO6个绵羊胎儿成 纤维细胞和3. 5 μ g MSTN-ZFNs质粒，电转染液（Lonza)补足至100 μ 1后立即置于电转染 仪中，采用仪器预设的小鼠成纤维细胞转染程序（pulse code:CZ167)进行电转染，得到电 转染后的成纤维细胞。转染结束后将电转染后的成纤维细胞用含20%胎牛血清和1%双抗 的DMEM培养液于24孔板中继续培养，待细胞贴壁后更换培养液以去除死亡的细胞。
[0111] 转染效率将直接影响ZFN的编辑效率，但是由于MSTN-ZFNs质粒没有绿色荧光蛋 白（Green Fluorescent Protein, GFP)等标记，无法直接评估电转染的效率，所以本实验在 MSTN-ZFNs质粒电转染绵羊胎儿成纤维细胞的同时，用pmax-GFP质粒按照相同条件电转染 另一份细胞作为对照，根据表达绿色荧光蛋白的细胞数间接评估MSTN-ZFNs电转染绵羊胎 儿成纤维细胞的效率。
[0112] 结果如图3所示：85-90%以上的pmax-GFP质粒对照组成纤维细胞表达GFP，所以 可以确定本实验电转染的效率较高，可以满足后续实验的要求。
[0113] 将电转染后的成纤维细胞培养72h后，用胰酶消 化收集细胞，并将细胞分为两份： 一份用于检测ZFN诱变效率；另一份用于下述实施例中筛选MSTN基因敲除的阳性单克隆细 胞。
[0114] 4、基因编辑后DNA获得
[0115] (1)将上述步骤3得到的电转染后的成纤维细胞转入PCR管中，加入100 μ 1的DNA 快速提取试剂，68°C水浴15min，95°C水浴8min，得到电转染后细胞基因组DNA，4°C保存备 用。
[0116] (2)参照GenBank公布的绵羊（Ovis aries)MSTN基因序列（登录号：DQ530260. 1) 在靶位点上下游分别设计引物MSTN-Z (见表1)，以电转染后细胞基因组DNA为模板，采用引 物MSTN-Z (表1)，使用高保真Taq酶扩增进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即为基因编辑 后DNA (突变的MSTN和未突变的MSTN)。
[0117] 并将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测特异性后4°C保存备用。
[0118] 琼脂糖凝胶电泳结果如图4a所示：其中M为IOObp Marker，1-6泳道为部分电转 染MSTN-ZFNs质粒的绵羊胎儿成纤维细胞MSTN基因 PCR产物，从图中可以看出，PCR反应 特异性好，扩增效率较高，可以用于聚丙烯酰氨凝胶电泳检测。
[0119] 二、杂交双链的形成
[0120] 分别对9份转染细胞的MSTN基因进行检测，取3 μ 1的上述步骤一的4的⑵扩 增得到的PCR扩增产物，按照上述实施例1中所述的方法进行变性和复性以形成杂交双链， 得到9份ZFN处理的DNA样本。
[0121] 三、聚丙烯酰氨凝胶电泳检测ZFN敲除的效率（基因编辑效率）
[0122] 1、聚丙烯酰氨凝胶电泳检测
[0123] 将上述步骤二得到的9份ZFN处理的DNA样本分别混合1 μ 1上样缓冲液上样， IOOV电压，15% (V/V)聚丙烯酰胺凝胶电泳，待溴酚蓝迀移至凝胶底部时停止电泳，凝胶经 固定、银染、显色和终止后置于凝胶成像仪拍照。
[0124] 聚丙烯酰胺凝胶结果如图4c所示：M为IOObp Marker，1-9泳道为9份电转染 MSTN-ZFNs质粒的绵羊胎儿成纤维细胞MSTN基因 PCR产物，10泳道为野生型对照，部分ZFN 处理的细胞样品（第1、2、5、6、7、8、9泳道）在约700bp处有一条带（如箭头所示），而对照 组（第10泳道，模板为绵羊基因组）相应位置没有特异性条带。
[0125] 2、验证
[0126] 为了验证9份ZFN处理的DNA样本是否为基因编辑后DNA，在上述PCR扩增产物 的内部再设计一对巢式引物MSTN-nZ (表1)，进行巢式PCR，具体步骤如下；上述步骤1的聚 丙烯酰胺凝胶电泳结束后，分别切取1、2、5、6、7、8、9泳道中约700bp处条带，分别将其置于 I. 5mL离心管中，加入100 μ I ddH20,用玻璃棒将胶块捣碎，静置2h后吸取1 μ 1上清液作 为模板，用上述巢式PCR引物对目的片段进行巢式PCR扩增，得到巢式PCR扩增产物，并将 巢式PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。
[0127] 琼脂糖凝胶电泳结果如图4b所示：M为IOObp Marker，1泳道为绵羊基因组对照， 2-8泳道为用巢式PCR扩增图4(c)中1，2,5,6,7,8,9泳道黑色箭头所指条带的琼脂糖凝 胶电泳结果，PCR扩增产物可见2条带（2, 3,4,6, 7,8泳道）或者4条带（5泳道），而对照 组（模板为绵羊基因组）只有1条带，可进一步推断（c)图中黑色箭头所指条带为杂交双 链对应的条带。然后将其回收纯化连接T载体，转化感受态，提取阳性质粒送北京六合华大 基因科技股份有限公司测序，根据测序结果进一步确认上述700bp处的条带是MSTN基因敲 除片段与野生型片段形成的杂交双链。
[0128] 3、ZFN的编辑效率的计算
[0129] 根据聚丙烯酰氨凝胶电泳结果，选择第9泳道对应的PCR扩增产物进行TA克隆， 转化感受态，并挑取400个阳性克隆，摇菌、提取质粒后送北京六合华大基因科技股份有限 公司测序，根据测序结果计算ZFN的编辑效率。测序结果见表3。
[0130] 表3、400份第9泳道对应细胞MSTN基因 ZFN作用位点上下游序列PCR产物测序 结果
[0131]
[0132] 注意：" + "代表插入，代表缺失
[0133] 根据表3的测序结果计算得出：第9泳道所对应的细胞中ZFN的编辑效率约为 4. 75%。ZFN在基因编辑过程中会引入碱基的插入，也会出现碱基删除，而且插入或者删除 碱基的数量也呈多态性。
[0134] 以上结果表明：本发明的方法可以检测低编辑效率4. 75%的基因编辑结果。
[0135] 实施例3、聚丙烯酰氨凝胶电泳在筛选目标基因编辑克隆中的应用
[0136] 1、单克隆细胞的制备
[0137] 采用有限稀释法制备单克隆细胞，具体步骤如下：将实施例2的步骤一的3获得的 电转染后的成纤维细胞继续培养72h，用胰酶消化细胞并进行计数，每个IOcm培养皿中加 入500个细胞和IOmL含20 %胎牛血清和I %双抗的DMEM培养液，轻轻晃动培养皿使细胞 均匀分布，然后置于37°C，5% CO2培养箱中培养7-10d ;待细胞单克隆长成后用克隆环和预 热的胰酶消化细胞，分别转入96孔板中扩大培养后再传入48孔板中继续培养；待细胞覆盖 48孔板底80%时，胰酶消化细胞，每孔细胞分成两份，一份冷冻保存，另一份进行鉴定。
[0138] 2、MSTN基因敲除单克隆细胞的鉴定
[0139] 选取10份细胞进行鉴定，具体步骤如下：将待鉴定细胞转入PCR管中，按照快速提 取方法提取细胞的基因组备用，使用高保真Taq酶扩增包含ZFNs作用位点上下游共780bp 片段，用实施例2中的方法检测ZFNs敲除效率，筛选MSTN基因敲除的单克隆细胞。筛选方 法如下：挑选780bp条带以下所出现的特异性条带较浓的单克隆细胞（MSTN基因敲除的单 克隆细胞），并进一步通过测序鉴定，以确定MSTN基因敲除的序列；而没有特异性条带的细 胞则淘汰，以提高筛选的效率，降低测序的成本。
[0140] 结果表明：10份细胞全部鉴定为阳性细胞，其中编号为Zm-63和Zm-85的单克隆 细胞MSTN基因分别被双敲除261bp (第1外显子166bp和第1内含子95bp)和174bp (第 1外显子174bp)(图5)。说明本发明的方法可以有效的筛选出基因敲除阳性单克隆细胞， 且大大降低了筛选的工作量及测序的成本，提高了筛选的效率。
【主权项】
1. 一种基因编辑后的DNA产物的检测方法，包括如下步骤： 1) 将待测基因编辑后DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，并将所述PCR扩增产物变 性、复性，得到杂交产物； 所述待测基因编辑后DNA为将野生型DNA用人工核酸内切酶编辑，得到由突变DNA和 未突变野生型DNA组成的待测基因编辑后DNA; 2) 用聚丙烯酰胺凝胶电泳所述杂交产物，检测电泳结果，根据分子量大小及构象差异， 确定所述待测基因编辑后DNA中突变DNA和未突变野生型DNA，实现基因编辑后DNA的检 测。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述待测基因编辑后DNA中，所述未突变 野生型DNA的质量百分含量大于所述突变DNA的质量百分含量。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述突变DNA的质量百分含量为 0? 1-0. 45 % 〇4. 根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述人工核酸内切酶为锌指核 酸内切酶、类转录激活因子效应物核酸酶或CRISPR/Cas9。5. 权利要求1-4中任一所述的方法在从基因编辑后的DNA产物中筛选突变DNA中的应 用。6. 权利要求1-4中任一所述的方法在从基因编辑后的克隆产物中筛选含有突变DNA克 隆中的应用。7. -种筛选基因编辑成功的单克隆的方法，包括如下步骤： 1) 将待测基因编辑后的克隆产物中的克隆分别提取DNA，并分别进行PCR扩增，得到 PCR扩增产物，并将所述PCR扩增产物变性、复性，得到杂交产物； 2) 用聚丙烯酰胺凝胶电泳所述杂交产物，检测电泳结果，选取分子量大小及构象不同 于野生型克隆的克隆，即为基因编辑成功的单克隆。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述待测基因编辑后的克隆产物是按照 包括如下步骤的方法制备得到的：将表达靶向目标基因的人工核酸内切酶转入离体细胞 中，进行基因编辑，得到转染后细胞；将所述转染后细胞进行培养，得到待测基因编辑后的 克隆产物。9. 根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述目标基因为绵羊MSTN基因；所 述人工核酸内切酶为锌指核酸内切酶。10. 根据权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于：所述细胞为绵羊胎儿成纤维细 胞。
【专利摘要】本发明公开了一种基于聚丙烯酰胺凝胶电泳检测低效率基因组编辑的方法及其应用。该方法包括如下步骤：1)将野生型DNA用人工核酸内切酶编辑，得到由突变DNA和未突变野生型DNA组成的待测基因编辑后DNA；2)将待测基因编辑后DNA进行PCR扩增，并将所述PCR扩增产物变性、复性，得到杂交产物；3)用聚丙烯酰胺凝胶电泳杂交产物，确定待测基因编辑后DNA中突变DNA和未突变野生型DNA，实现基因编辑后DNA的检测。该方法在保证人工核酸内切酶编辑效率检测准确性、灵敏性的同时，简化了实验操作且降低了检测成本，将对人工核酸内切酶在基因定点修饰、基因功能研究以及疾病动物模型的建立等方面的应用产生积极地推动作用。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894255
【申请号】CN201510289009
【发明人】高蕊, 张伟, 王世银, 甘尚权, 周平, 王立民, 陈永林, 皮文辉, 黄瑾, 李冬妹, 宋广超
【申请人】石河子大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月29日
【技术领域】
[0001] 本发明具体涉及一种基于聚丙烯酰胺凝胶电泳检测低效率基因组编辑的方法及 其应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 基因组定点编辑技术无论是在生物学基础研宄，还是诸如基因治疗、生物反应器 等生物相关产业中都具有巨大的应用前景。近年来，随着大量物种基因组测序工作的完成， 以及人工核酸内切酶（Engineered endonuclease，EEN)的出现，基因组编辑技术飞速发展， 逐渐成为科研工作者选择性编辑基因组和研宄基因功能的必备工具。
[0003] 锌指核酸内切酶（zinc finger endonuclease，ZFN)是第一代人工核酸内切酶， ZFN是将锌指蛋白与核酸内切酶Fok I融合形成的核酸内切酶。到目前为止，ZFN已相 对比较成熟并成功应用于大鼠、小鼠、猪、牛等动物。但是，要设计并构建出一个切割活性 高、特异性好的ZFNs工作量很大，而且很多基因序列中可能难以找到合适的ZFN靶点，其 技术专利被少数几家商业公司控制，使用成本很高，效率相对较低，这些因素大大限制了 ZFNs的推广。随之，第二代人工核酸酶--类转录激活因子效应物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease, TALENs)出现，由于 TALEN 与 ZFN 相比构建相对 较为简单，编辑效率高，成本低，特异性更高而受到科研工作者的青睐，并迅速应用于小 鼠、斑马鱼、猪和牛等动物。2013年，一种全新的人工核酸内切酶，即第三代人工核酸内 切酶一(clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) / CRISPR-associated (Cas) 9, CRISPR/Cas9)出现，与前两代人工核酸内切酶相比，CRISPR/ Cas9制作更为简单，成本更低，作用效率更高。
[0004] 上述三种人工核酸内切酶各有优缺点，但是其作用机制基本一致，即通过特异识 别目的DNA序列，对靶标位置的DNA链进行精确切割，从而形成双链断裂（double-strand breaks, DSB)，诱发细胞内源性的修复机制，通过非同源末端连接修复（non-homologous end joining, NHEJ)或者同源重组修复（homologous recombination, HR)对切 口进行修复。 在修复过程中，有可能出现片段的删除或者插入、碱基替换、点突变等定点修饰，所以修复 的结果可能呈多态性。
[0005] 人工核酸内切酶的种类、设计、转染方式、载体形式以及其他实验条件均会对其工 作效率产生很大影响。目前，人工核酸内切酶编辑效率的检测主要有以下几种方法：（1)限 制性内切酶酶切检测法，即如果在靶位点之间的Spacer存在某个限制性内切酶的酶切位 点，那么该位点在被人工核酸内切酶切割修复后就会遭到破坏，而无法被原有的限制性内 切酶切开。这种方法的优点是廉价、简单、快捷，但其缺点也显而易见，即如果Spacer处没 有合适的限制性内切酶位点，该方法将无法使用。另外，如果人工核酸酶发挥了作用，但是 突变位点不在限制性内切酶所识别的序列，该方法也无法检测，从而造成检测到的突变率 比实际值偏低。（2)将包括靶位点的片段PCR扩增后TA克隆测序，根据测序结果计算编辑 效率和类型，该方法不受序列的限制，但是人工核酸酶的效率很低时，要准确评价其活性并 筛选阳性单克隆细胞需要进行大量的克隆、测序工作，工作量太大、成本太高。（3)基于可识 别错配双链的错配内切酶（主要采用Cel I内切酶和T7E1两种酶）检测法，即在靶位点两 侧设计引物进行PCR反应，产物回收纯化后先高温变性，再缓慢降温复性，然后用Cel I或 者T7E1酶消化，如果靶位点处由于序列插入或者删除而形成泡状结构即可被Cel I或者 ?7Ε1识别切割，该方法操作相对比较简单，但是Cel I和T7E1酶均比较昂贵，如进行大规 模检测成本较高，另外该方法酶切后一般用琼脂糖凝胶电泳检测，灵敏度不高，如果人工核 酸酶的效率很低的时候，使用该方法无法检测。除上述方法之外，还有体内或者体外引入报 告基因法以及体外的SSA(single strand annealing)分析法等。
[0006] 在使用人工核酸内切酶进行基因组编辑过程中，筛选靶基因被正确编辑的单克隆 细胞是一项庞大的工作，尤其是在人工核酸内切酶效率很低的时候，就更加困难。像ZFN这 样的低效率人工核酸内切酶，尽管Sigma公司描述其编辑效率可以达到1-20%，但是很多 实验室在实际应用过程中所获得的数据却远低于这一标准，例如刘杰等（2014)使用ZFN敲 除猪卵母细胞孤雌胚胎中MSTN基因，打靶效率为0.54%;任广彩等（2014)利用ZFN对转基 因猪成纤维细胞中的增强型绿色焚光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP) 基因进行敲除，敲除效率最低为0.97%，最高的一组也仅为1.76% ;Watanabe等（2013)用 ZFN敲除猪胎儿成纤维细胞IL2RG基因的研宄中，打靶效率也只有0. 5%。即使TALEN或者 CRISPR/Cas9这类高效率的人工核酸内切酶，也会由于靶基因序列的特殊性而出现效率很 低的情况，例如吴金青等（2015)利用CRISPR/Cas9对猪IGF2基因进行敲除，由于该基因结 构复杂、GC含量和甲基化程度高，编辑效率始终无法提高，最高也仅为9. 2%。在如此低的 编辑效率下，上述第一种和第三种方法由于灵敏度低而无法检测，若采用上述第二种方法 需要进行大量的克隆、测序才有可能筛到正确的单克隆细胞，工作量太大，实验成本也将非 常尚。
[0007] 在人工核酸内切酶技术快速发展，基因定点修饰技术已逐渐成为分子生物学实验 室必备的实验技术的形势下，最大限度地提高人工核酸内切酶编辑效率检测技术的灵敏 度，并以此指导后续的单克隆筛选工作，提高实验效率，降低实验成本就显得尤为重要。
【发明内容】
[0008] 本发明要解决的技术问题是如何快速、简单的检测低效率基因编辑。
[0009] 为解决上述问题，本发明首先提供了一种基因编辑后的DNA产物的检测方法。
[0010] 本发明提供的基因编辑后DNA的检测方法包括如下步骤：
[0011] 1)将待测基因编辑后DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，并将所述PCR扩增产 物变性、复性，得到杂交产物；
[0012] 所述待测基因编辑后DNA为将野生型DNA用人工核酸内切酶编辑，得到由突变DNA 和未突变野生型DNA组成的待测基因编辑后DNA ;
[0013] 2)用聚丙烯酰胺凝胶电泳所述杂交产物，检测电泳结果，根据分子量大小及构象 差异，确定所述待测基因编辑后DNA中突变DNA和未突变野生型DNA，实现基因编辑后DNA 的检测。
[0014] 上述方法中，所述待测基因编辑后DNA中，所述未突变野生型DNA的质量百分含量 大于所述突变DNA的质量百分含量。
[0015] 上述方法中，所述突变DNA为将野生型DNA缺失或突变多个寡核苷酸，其余寡核苷 酸不变得到的DNA。
[0016] 上述方法中，所述突变DNA的质量百分含量是指【突变DNAA野生型DNA (或者突 变DNA和未突变的野生型DNA))】*100%。
[0017] 上述方法中，所述突变DNA的质量百分含量具体为0. 1% -0. 45%。
[0018] 上述方法中，所述杂交产物中已经被编辑后发生突变的DNA会产生泡状结构，未 被编辑的DNA则不产生泡状结构。
[0019] 上述方法中，所述人工核酸内切酶为锌指核酸内切酶、类转录激活因子效应物核 酸酶或 CRISPR/Cas9。
[0020] 上述方法中，所述人工核酸内切酶为锌指核酸内切酶。
[0021] 上述方法中，所述野生型DNA为MSTN基因。
[0022] 上述方法中，将所述PCR扩增产物变性、复性的方法为现有技术，具体可根据文 献"Sanjana N E, Cong L, Zhou Y, et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. NATURE PROTOCOLS, 2012, 7(1): 171-193." 中的方法进 行。
[0023] 为解决上述技术问题，本发明还提供了上述方法的用途。
[0024] 本发明提供了上述方法在从基因编辑后的DNA产物中筛选突变DNA中的应用。
[0025] 本发明还提供了上述方法在从基因编辑后的克隆产物中筛选含有突变DNA克隆 中的应用。
[0026] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种筛选基因编辑成功的单克隆的方法。
[0027] 本发明提供的筛选基因编辑成功的单克隆的方法包括如下步骤：
[0028] 1)将待测基因编辑后的克隆产物中的克隆分别提取DNA，并分别进行PCR扩增，得 到PCR扩增产物，并将所述PCR扩增产物变性、复性，得到杂交产物；
[0029] 2)用聚丙烯酰胺凝胶电泳所述杂交产物，检测电泳结果，选取分子量大小及构象 不同于野生型克隆的克隆，即为基因编辑成功的单克隆。
[0030] 上述方法中，所述待测基因编辑后的克隆产物是按照包括如下步骤的方法制备得 到的：将表达靶向目标基因的人工核酸内切酶转入离体细胞中，进行基因编辑，得到转染后 细胞；将所述转染后细胞进行培养，得到待测基因编辑后的克隆产物。
[0031] 上述方法中，采用有限稀释法将所述转染后细胞进行培养，得到待测基因编辑后 的克隆产物。
[0032] 上述方法中，所述转染后细胞进行培养包括如下步骤：
[0033] 1)将所述转染后的细胞继续培养72h，得到培 养后的转染后的细胞；
[0034] 2)用胰酶消化所述培养后的转染后的细胞并进行计数，每个IOcm培养皿中加入 500个细胞和IOmL含20 %胎牛血清和1 %双抗的DMEM培养液，使细胞均匀分布，然后置于 37°C，5% CO2培养箱中培养7-10d，得到待测基因编辑后的克隆产物。
[0035] 上述方法中，所述目标基因为绵羊MSTN基因；所述人工核酸内切酶为锌指核酸内 切酶。
[0036] 上述方法中，所述细胞为绵羊胎儿成纤维细胞。
[0037] 本发明利用聚丙稀酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE) 高分辨率的特点，设计了一种可以简单、快捷、灵敏、高效检测人工核酸内切酶活性的方法， 并成功应用于ZFN敲除绵羊胎儿成纤维细胞MSTN基因效率的检测中，充分证明了该方法的 可行性。通过实验证明：本发明的方法在保证人工核酸内切酶编辑效率检测准确性、灵敏性 的同时，大大简化了实验操作且大大降低了检测成本，将对人工核酸内切酶在基因定点修 饰、基因功能研宄以及疾病动物模型的建立等方面的应用产生积极地推动作用。
[0038] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【附图说明】
[0039] 图1为PAGE法检测基因组编辑效率模型的建立及操作流程示意图。
[0040] 图2为PAGE法与Cel I内切酶法检测基因组编辑效率灵敏度比较。图2 (a)为 绵羊pri-miR-99a基因16bp缺失片段及其野生型片段PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测 结果，其中，M为IOObp Marker，1-3泳道为野生型PCR产物，4-6泳道为16bp缺失型PCR产 物；图2(b)为野生型片段和16bp缺失型片段杂交双链Cel I内切酶酶切后的琼脂糖凝胶 电泳图，其中，M为IOObp Marker，1泳道为野生型对照，2-5泳道为为野生型片段和16bp缺 失型片段杂交双链Cel I内切酶酶切产物；图2 (c)为PAGE法与Cel I内切酶酶切后再用 PAGE胶检测基因组编辑效率灵敏度比较，其中，M为IOObp Marker，1-5泳道为杂交双链用 Cel I内切酶酶切后再用PAGE胶检测的结果，6-10泳道为杂交双链直接用PAGE检测结果。
[0041] 图3为电转染后绵羊胎儿成纤维细胞（放大400倍）。图3(a)为电转染MSTN-ZFNs 质粒后培养48h的绵羊胎儿成纤维细胞；图3 (b)为电转染pmax-GFP质粒后培养24h的绵 羊胎儿成纤维细胞。
[0042] 图4为PAGE法检测ZFN编辑绵羊胎儿成纤维细胞MSTN基因效率。图4 (a)为PAGE 法检测部分电转染MSTN-ZFNs质粒的绵羊胎儿成纤维细胞MSTN基因 PCR产物，其中，M为 IOObp Marker，1-6泳道为部分电转染MSTN-ZFNs质粒的绵羊胎儿成纤维细胞MSTN基因 PCR 产物；图4(b)为PAGE法检测用巢式PCR扩增图4(c)图中1，2,5,6,7,8,9泳道黑色箭头所 指条带的琼脂糖凝胶电泳结果，其中，M为IOObp Marker，l泳道为绵羊基因组对照，2-8泳 道为用巢式PCR扩增图4(c)图中1，2,5,6,7,8,9泳道黑色箭头所指条带的琼脂糖凝胶电 泳结果；图4 (c)为PAGE法检测电转染MSTN-ZFNs质粒的绵羊胎儿成纤维细胞MSTN基因 PCR产物，其中，M为IOObp Marker，1-9泳道为电转染MSTN-ZFNs质粒的绵羊胎儿成纤维细 胞MSTN基因 PCR产物，10泳道为野生型对照。
[0043] 图5为Zm-63, Zm-85号MSTN基因敲除细胞及野生型细胞MSTN基因测序结果比 较。图5(a)为Zm-63号细胞与野生型细胞MSTN基因序列测序结果比较，可见Zm-63号细 胞MSTN基因261bp序列被敲除；图5 (b)为Zm-85号细胞与野生型细胞MSTN基因序列测序 结果比较，可见Zm-85号细胞MSTN基因174bp序列被敲除。
【具体实施方式】
[0044] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0045] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0046] 靶向MSTN基因的ZFN质粒是Sigma公司的产品；
[0047] DMEM(Dulbecco' s modified eagle medium)是 Thermo 公司的产品；
[0048] 胎牛血清（Fetal Bovine Serum)是浙江天杭生物科技有限公司的产品；
[0049] pmax-GFP质粒是Lonza公司的产品；
[0050] 电转染液是Lonza公司的产品；
[0051] DNA 快速提取试剂（QuickExtract DNA Extraction Solution)是 Epicentre 公司 的广品；
[0052] 感受态DH5 a、dNTP是根生化科技（北京）有限公司的产品；
[0053] Cel I内切酶是NEB公司的产品；
[0054] Pfu酶、IOObp Maker是宝生物工程（大连）有限公司的产品；
[0055] T载体、PCR产物凝胶回收试剂盒是Promega公司的产品；
[0056] 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺和过硫酸铵是生工生物工程（上海）股份有限公司的 广品；
[0057] 电转染仪是德国Lonza公司的产品；
[0058] ND2000超微量分光光度计是Thermo公司的产品；
[0059] 凝胶成像系统是BioRad公司的产品；
[0060] 阿勒泰羊20号和阿勒泰羊95号在文献"Zhang W, Wang L, Zhou P, et al.Identification and Analysis of Genetic Variations in Pri-MiRNAs Expressed Specifically or at a High Level in Sheep Skeletal Muscle. PLOS ONE, 2015, 10(2) :e0117327. doi :10. 1371/journal. pone. 0117327" 中公开过，公众可从新 疆农垦科学院获得。
[0061] 实施例UPAGE法和Cel I内切酶法检测基因组编辑效率的灵敏度
[0062] 本实施例旨在通过自然存在的纯合野生型片段和小片段纯合缺失型片段来模拟 人工核酸内切酶敲除基因的结果，并通过对纯合野生型片段和小片段纯合缺失型片段的 PCR产物的定量检测和对小片段纯合缺失型片段PCR产物的定量梯度稀释，建立了人工核 酸内切酶不同敲除效率的模型（图1)，以定量比较PAGE法与目前通用的Cel I内切酶法 检测基因组编辑效率的灵敏度。具体步骤如下：
[0063] 一、模拟基因编辑获得基因编辑后DNA
[0064] 本实施例以纯合野生型片段和小片段纯合缺失型片段为试验材料，若要重复以下 试验内容，可通过SSCP及测序获取纯合野生型片段和小片段纯合缺失型片段或者直接合 成相应片段的序列。
[0065] 1、引物的设计
[0066] 检索 miRBase (http://www. mirbase. org)获得绵羊（Ovis aries)miR_99a 的 前体序列（登录号：MI0025285)，与UCSC收录的绵羊基因组数据（ISGC 0ar_v3. 1/ oviAri3, August 2012)比对，分别向上游和下游延伸1000 bp得到pri-miR_99a的序列并以 此设计引物P-miR_99a(见表1)用于PCR扩增绵羊pri-miR-99a基因16bp缺失型片段和 野生型片段。
[0067] 表1、引物及其信息
[0068]
[0069] 2、PCR 扩增
[0070] 以阿勒泰羊20号（阿勒泰羊20号的基因组DNA仅pri-miR-99a基因缺失16bp) 的基因组DNA为模板，采用P-miR-99a引物进行PCR扩增，得到大小为580bp (序列1)的 PCR扩增产物（含有绵羊pri-miR-99a基因16bp缺失型片段）；
[0071] 以阿勒泰羊95号的基因组DNA为模板，采用P-miR-99a引物进行PCR扩增，得到 大小为596bp (序列2)的PCR扩增产物（含有绵羊pri-miR-99a基因野生型片段）。
[0072] 含有绵羊pri-miR-99a基因16bp缺失型片段为将含有绵羊pri-miR-99a基因野 生型片段缺失16bp得到的片段，具体缺失位置可见序列。
[0073] PCR 反应体系（25 μ I) : 10XBuffer 2. 5 μ 1，dNTP (2. 5mM each) 2 μ 1，上下游引物 (10 μ Μ)各 0· 5 μ 1，TaqDNA 聚合酶 0· 5 μ 1，模板 1 μ 1，ddH20 18 μ I ;
[0074] ?〇?扩增反应程序：95°0预变性5!1^11;95°0 308,55°0退火308,72°0 308,40个循 环；72°C延伸10min，4°C保存。
[0075] PCR扩增产物用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2a所示：其中，M为IOObp Marker，1-3泳道为野生型PCR产物，4-6泳道为16bp缺失型PCR产物，且均为单一条带，可 以用于后续试验。
[0076] 将上述得到的PCR扩增产物分别经琼脂糖凝胶电泳进行检测、回收纯化后，用 ND2000超微量分光光度计测定浓度，并调整至IOOng/ μ 1。将含有绵羊pri-miR-99a基因 16bp缺失型片段的PCR扩增产物分别进行10倍、100倍和1000倍梯度稀释，以模拟人工核 酸内切酶不同的编辑效率；然后吸取1 μ 1含有野生型片段的PCR扩增产物分别与1 μ 1没 有稀释和经10倍、100倍和1000倍梯度稀释的含有绵羊pri-miR-99a基因16bp缺失型片 段的PCR扩增产物混合，得到含有绵羊pri-miR-99a基因16bp缺失型片段与野生型片段质 量为1 :1的混合样品、含有绵羊pri-miR-99a基因16bp缺失型片段与野生型片段质量为 1 :1〇的混合样品、含有绵羊pri-miR-99a基因16bp缺失型片段与野生型片段质量为I :100 的混合样品和含有绵羊pri-miR-99a基因16bp缺失型片段与野生型片段质量为I :1000的 混合样品，即为模拟基因编辑后DNA。
[0077] 二、杂交双链的形成
[0078] 参照文献 " Sanjana N E，Cong L，Zhou Y，et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. NATURE PROTOCOLS, 2012, 7 (I) : 171-193. "中的方法分别将上述含有绵羊pri-miR-99a基因16bp缺 失型片段与野生型片段质量为1 :1的混合样品、含有绵羊pri-miR-99a基因16bp缺失型片 段与野生型片段质量为1 :1〇的混合样品、含有绵羊pri-miR-99a基因16bp缺失型片段与 野生型片段质量为I :100的混合样品和含有绵羊pri-miR-99a基因16bp缺失型片段与野 生型片段质量为1 :1〇〇〇的混合样品进行变性和复性以形成含有"泡状"结构的杂交双链， 分别得到待检测DNA样品1、待检测DNA样品2、待检测DNA样品3、待检测DNA样品4,变性、 复性条件见表2。
[0079] 上述各个待检测DNA样品均含有"泡状"结构的杂交双链和未杂交的野生型片段。
[0080] 表2、通过变性和复性形成杂交双链条件
[0081]
[0082] 三、基因编辑效率的检测
[0083] 1、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)检测（本发明的方法）
[0084] 由于野生型片段和含有"泡状"结构的杂交双链的分子量、构象均不同，在凝胶中 的迀移速率也不同，直接用聚丙烯酰胺凝胶电泳即可检测。具体步骤如下：分别取待检测 DNA样品1、待检测DNA样品2、待检测DNA样品3和待检测DNA样品4各2 μ 1，分别混合 1 μ 1上样缓冲液后上样，IlOV电压，15% (V/V)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，待溴酚蓝迀移至 凝胶底部时停止电泳。凝胶经固定、银染、显色和终止后置于凝胶成像仪（BioRad，美国）拍 照。
[0085] 基因组编辑为将野生型DNA通过人工内切酶作用，得到基因编辑后DNA，其由突变 DNA和未突变的野生型DNA组成。
[0086] 基因组编辑效率为【突变DNAA野生型DNA (或者突变DNA和未突变的野生型 DNA))】*100 %。
[0087] 本实施例的设定基因编辑模型中，突变DNA为含有绵羊pri-miR-99a基因16bp缺 失型片段，野生型DNA为野生型片段+含有绵羊pri-miR-99a基因16bp缺失型片段。
[0088] 待检测DNA样品1的基因组编辑效率为1八1+1) *100% = 50% ;
[0089] 待检测DNA样品2的基因组编辑效率为1八1+10) *100% ~ 10% ;
[0090] 待检测DNA样品3的基因组编辑效率为1八1+100)*100%~ 1% ;
[0091] 待检测DNA样品4的基因组编辑效率为1八1+1000)*100%~ 0. 1% ;
[0092] 结果如图2c所示：第6泳道为野生型对照，第7-10泳道分别为待检测DNA1-4号 样品，可见待检测DNA样品4 (即16bp缺失型片段被稀释至1000倍），即编辑效率为0. 1 % 时仍可被PAGE法检测（图2c第10泳道）。通过对该条带切胶回收、克隆测序后，证明该条 带是杂交双链对应的条带。
[0093] 2、Cel I酶切后琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
[0094] 分别取待检测DNA样品1、待检测DNA样品2、待检测DNA样品3和待检测DNA样 品4各2 μ 1，分别用Cel I酶进行酶切检测，得到酶切后的DNA样品。
[0095]酶切反应体系（10 μ I):待酶切 DNA 样品 2 μ 1，Cel I 酶 0.5 μ 1，IOXbuffer 1 μ 1，CldH2O 6. 5 μ 1，45°C水浴lh，然后分别用2% (V/V)的琼脂糖凝胶电泳和15% (V/V) 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切后的DNA样品。
[0096] (1)琼脂糖凝胶电泳
[0097] Cel I内切酶识别杂交双链的"泡状"结构后将待检测DNA样品中的杂交双链切 割为两个片段363bp和232bp，琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰氨凝胶电泳后可见三条带，分别 为595bp、363bp和232bp。由于16bp缺失片段经梯度稀释，所以待检测DNA样品中杂交双链 的量也在逐渐减少，反映在凝胶电泳图上便是杂交双链对应的条带或者经切割后的363bp 和232bp条带亮度逐渐降低，直至电泳无法检测。
[0098] 结果如图2b所示：第1泳道为野生型对照，第2-5泳道分别为待检测DNA1-4号样 品，可见当16bp缺失型片段被稀释至10倍即编辑效率为10%的时候酶切后的片段条带已 经很淡（图2 (b)第3泳道）；当稀释至100倍和1000倍，即编辑效率为1 %和0. 1 %时就 已经无法检测。说明内切酶法用琼脂糖凝胶电泳检测编辑效率的阈值为10%，低于10%的 编辑效率该方法无法检测。说明琼脂糖凝胶电泳的灵敏度无法满足对低编辑效率的检测。
[0099] (2)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
[0100] 酶切后的DNA样品的聚丙烯酰氨凝胶电泳检测结果图2c所示：第1泳道为野生型 对照，第2-5泳道分别为待检测DNA1-4号样品，可见当16bp缺失型片段被稀释至100倍即 编辑效率为1 %时仍可被检测（图2c第4泳道），当编辑效率低于1 %时，该方法也无法检 测（图2c第5泳道）。
[0101] 通过以上试验说明：PAGE法检测基因组编辑效率的灵敏度是Cel I内切酶法的 10倍（酶切后用PAGE检测）或者100倍（酶切后用琼脂糖凝胶电泳检测），且省去了酶切 步骤，既降低了实验成本又简化了实验步骤，完全可以替代Cel I内切酶法用于人工核酸 内切酶编辑效率的检测。
[0102] 实施例2、聚丙烯酰胺凝胶电泳法在检测ZFN的编辑效率中的应用
[0103] 由于ZFN发展时间较长，技术比较成熟，且编辑效率较低，用ZFN来验证上述实施 例1中的方法更有说服力，下面以其为本实施例中的基因编辑的工具来验证本发明的方 法。另外，MSTN基因突变的动物会表现出"双肌"性状，本实施例用ZFN对绵羊成纤维细胞 的MSTN基因进行编辑，以获得的MSTN基因敲除的绵羊成纤维细胞，对后续通过体细胞核移 植及胚胎移植培育具有"双肌"性状绵羊品种的良好材料也有重要意义。具体步骤如下：
[0104] 一、基因编辑后DNA的获得
[0105] UZFN 的制备
[0106] 根据绵羊（Ovis aries)肌生成抑制素（myostatin, MSTN)基因序列（GenBank登 录号：DQ530260. 1，提交日为2008. 4. 25)，由Sigma公司设计合成3对锌指核酸酶载体，经 生物信息学分析和酵母DNA切割实验，选择1对效率最高（75%)的MSTN-ZFNs质粒用于后 续实验，其结合位点和切割位点序列为：AACAGCTCCTAACATCagcaaaGATGCTATAAGAC(大写字 母为MSTN-ZFNs识别序列碱基，小写字母为MSTN-ZFNs切割序列碱基）。
[0107] 2、绵羊胎儿成纤维细胞的分离培养
[0108] 妊娠母羊为2岁萨福克羊（新疆农垦科学院实验羊场提供），至妊娠期第40天进 行无菌手术取出体内胎儿，去除头、四肢及内脏后用Hanks溶液清洗2-3次，洗去组织表面 的血污，然后按照文献"刘玉琴.细胞培养实验手册.北京：人民军医出版社，2009, 34-35. " 的组织块培养法，分离培养得到原代绵羊胎儿成纤维细胞，并冻存于液氮中备用。
[0109] 3、MSTN-ZFNs质粒电转染绵羊胎儿成纤维细胞实现基因编辑
[0110] 从液氮中取出冻存的原代细胞，解冻后用含15%胎牛血清和1 %双抗的DMEM培养 液于37°C，5% CO2培养至细胞覆盖约80%培养皿底时实施电转染。具体步骤如下：电转染 采用100 μ 1体系，用胰酶消化细胞并进行计数，每个转染体系中加入2 X IO6个绵羊胎儿成 纤维细胞和3. 5 μ g MSTN-ZFNs质粒，电转染液（Lonza)补足至100 μ 1后立即置于电转染 仪中，采用仪器预设的小鼠成纤维细胞转染程序（pulse code:CZ167)进行电转染，得到电 转染后的成纤维细胞。转染结束后将电转染后的成纤维细胞用含20%胎牛血清和1%双抗 的DMEM培养液于24孔板中继续培养，待细胞贴壁后更换培养液以去除死亡的细胞。
[0111] 转染效率将直接影响ZFN的编辑效率，但是由于MSTN-ZFNs质粒没有绿色荧光蛋 白（Green Fluorescent Protein, GFP)等标记，无法直接评估电转染的效率，所以本实验在 MSTN-ZFNs质粒电转染绵羊胎儿成纤维细胞的同时，用pmax-GFP质粒按照相同条件电转染 另一份细胞作为对照，根据表达绿色荧光蛋白的细胞数间接评估MSTN-ZFNs电转染绵羊胎 儿成纤维细胞的效率。
[0112] 结果如图3所示：85-90%以上的pmax-GFP质粒对照组成纤维细胞表达GFP，所以 可以确定本实验电转染的效率较高，可以满足后续实验的要求。
[0113] 将电转染后的成纤维细胞培养72h后，用胰酶消 化收集细胞，并将细胞分为两份： 一份用于检测ZFN诱变效率；另一份用于下述实施例中筛选MSTN基因敲除的阳性单克隆细 胞。
[0114] 4、基因编辑后DNA获得
[0115] (1)将上述步骤3得到的电转染后的成纤维细胞转入PCR管中，加入100 μ 1的DNA 快速提取试剂，68°C水浴15min，95°C水浴8min，得到电转染后细胞基因组DNA，4°C保存备 用。
[0116] (2)参照GenBank公布的绵羊（Ovis aries)MSTN基因序列（登录号：DQ530260. 1) 在靶位点上下游分别设计引物MSTN-Z (见表1)，以电转染后细胞基因组DNA为模板，采用引 物MSTN-Z (表1)，使用高保真Taq酶扩增进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即为基因编辑 后DNA (突变的MSTN和未突变的MSTN)。
[0117] 并将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测特异性后4°C保存备用。
[0118] 琼脂糖凝胶电泳结果如图4a所示：其中M为IOObp Marker，1-6泳道为部分电转 染MSTN-ZFNs质粒的绵羊胎儿成纤维细胞MSTN基因 PCR产物，从图中可以看出，PCR反应 特异性好，扩增效率较高，可以用于聚丙烯酰氨凝胶电泳检测。
[0119] 二、杂交双链的形成
[0120] 分别对9份转染细胞的MSTN基因进行检测，取3 μ 1的上述步骤一的4的⑵扩 增得到的PCR扩增产物，按照上述实施例1中所述的方法进行变性和复性以形成杂交双链， 得到9份ZFN处理的DNA样本。
[0121] 三、聚丙烯酰氨凝胶电泳检测ZFN敲除的效率（基因编辑效率）
[0122] 1、聚丙烯酰氨凝胶电泳检测
[0123] 将上述步骤二得到的9份ZFN处理的DNA样本分别混合1 μ 1上样缓冲液上样， IOOV电压，15% (V/V)聚丙烯酰胺凝胶电泳，待溴酚蓝迀移至凝胶底部时停止电泳，凝胶经 固定、银染、显色和终止后置于凝胶成像仪拍照。
[0124] 聚丙烯酰胺凝胶结果如图4c所示：M为IOObp Marker，1-9泳道为9份电转染 MSTN-ZFNs质粒的绵羊胎儿成纤维细胞MSTN基因 PCR产物，10泳道为野生型对照，部分ZFN 处理的细胞样品（第1、2、5、6、7、8、9泳道）在约700bp处有一条带（如箭头所示），而对照 组（第10泳道，模板为绵羊基因组）相应位置没有特异性条带。
[0125] 2、验证
[0126] 为了验证9份ZFN处理的DNA样本是否为基因编辑后DNA，在上述PCR扩增产物 的内部再设计一对巢式引物MSTN-nZ (表1)，进行巢式PCR，具体步骤如下；上述步骤1的聚 丙烯酰胺凝胶电泳结束后，分别切取1、2、5、6、7、8、9泳道中约700bp处条带，分别将其置于 I. 5mL离心管中，加入100 μ I ddH20,用玻璃棒将胶块捣碎，静置2h后吸取1 μ 1上清液作 为模板，用上述巢式PCR引物对目的片段进行巢式PCR扩增，得到巢式PCR扩增产物，并将 巢式PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。
[0127] 琼脂糖凝胶电泳结果如图4b所示：M为IOObp Marker，1泳道为绵羊基因组对照， 2-8泳道为用巢式PCR扩增图4(c)中1，2,5,6,7,8,9泳道黑色箭头所指条带的琼脂糖凝 胶电泳结果，PCR扩增产物可见2条带（2, 3,4,6, 7,8泳道）或者4条带（5泳道），而对照 组（模板为绵羊基因组）只有1条带，可进一步推断（c)图中黑色箭头所指条带为杂交双 链对应的条带。然后将其回收纯化连接T载体，转化感受态，提取阳性质粒送北京六合华大 基因科技股份有限公司测序，根据测序结果进一步确认上述700bp处的条带是MSTN基因敲 除片段与野生型片段形成的杂交双链。
[0128] 3、ZFN的编辑效率的计算
[0129] 根据聚丙烯酰氨凝胶电泳结果，选择第9泳道对应的PCR扩增产物进行TA克隆， 转化感受态，并挑取400个阳性克隆，摇菌、提取质粒后送北京六合华大基因科技股份有限 公司测序，根据测序结果计算ZFN的编辑效率。测序结果见表3。
[0130] 表3、400份第9泳道对应细胞MSTN基因 ZFN作用位点上下游序列PCR产物测序 结果
[0131]
[0132] 注意：" + "代表插入，代表缺失
[0133] 根据表3的测序结果计算得出：第9泳道所对应的细胞中ZFN的编辑效率约为 4. 75%。ZFN在基因编辑过程中会引入碱基的插入，也会出现碱基删除，而且插入或者删除 碱基的数量也呈多态性。
[0134] 以上结果表明：本发明的方法可以检测低编辑效率4. 75%的基因编辑结果。
[0135] 实施例3、聚丙烯酰氨凝胶电泳在筛选目标基因编辑克隆中的应用
[0136] 1、单克隆细胞的制备
[0137] 采用有限稀释法制备单克隆细胞，具体步骤如下：将实施例2的步骤一的3获得的 电转染后的成纤维细胞继续培养72h，用胰酶消化细胞并进行计数，每个IOcm培养皿中加 入500个细胞和IOmL含20 %胎牛血清和I %双抗的DMEM培养液，轻轻晃动培养皿使细胞 均匀分布，然后置于37°C，5% CO2培养箱中培养7-10d ;待细胞单克隆长成后用克隆环和预 热的胰酶消化细胞，分别转入96孔板中扩大培养后再传入48孔板中继续培养；待细胞覆盖 48孔板底80%时，胰酶消化细胞，每孔细胞分成两份，一份冷冻保存，另一份进行鉴定。
[0138] 2、MSTN基因敲除单克隆细胞的鉴定
[0139] 选取10份细胞进行鉴定，具体步骤如下：将待鉴定细胞转入PCR管中，按照快速提 取方法提取细胞的基因组备用，使用高保真Taq酶扩增包含ZFNs作用位点上下游共780bp 片段，用实施例2中的方法检测ZFNs敲除效率，筛选MSTN基因敲除的单克隆细胞。筛选方 法如下：挑选780bp条带以下所出现的特异性条带较浓的单克隆细胞（MSTN基因敲除的单 克隆细胞），并进一步通过测序鉴定，以确定MSTN基因敲除的序列；而没有特异性条带的细 胞则淘汰，以提高筛选的效率，降低测序的成本。
[0140] 结果表明：10份细胞全部鉴定为阳性细胞，其中编号为Zm-63和Zm-85的单克隆 细胞MSTN基因分别被双敲除261bp (第1外显子166bp和第1内含子95bp)和174bp (第 1外显子174bp)(图5)。说明本发明的方法可以有效的筛选出基因敲除阳性单克隆细胞， 且大大降低了筛选的工作量及测序的成本，提高了筛选的效率。
【主权项】
1. 一种基因编辑后的DNA产物的检测方法，包括如下步骤： 1) 将待测基因编辑后DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，并将所述PCR扩增产物变 性、复性，得到杂交产物； 所述待测基因编辑后DNA为将野生型DNA用人工核酸内切酶编辑，得到由突变DNA和 未突变野生型DNA组成的待测基因编辑后DNA; 2) 用聚丙烯酰胺凝胶电泳所述杂交产物，检测电泳结果，根据分子量大小及构象差异， 确定所述待测基因编辑后DNA中突变DNA和未突变野生型DNA，实现基因编辑后DNA的检 测。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述待测基因编辑后DNA中，所述未突变 野生型DNA的质量百分含量大于所述突变DNA的质量百分含量。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述突变DNA的质量百分含量为 0? 1-0. 45 % 〇4. 根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述人工核酸内切酶为锌指核 酸内切酶、类转录激活因子效应物核酸酶或CRISPR/Cas9。5. 权利要求1-4中任一所述的方法在从基因编辑后的DNA产物中筛选突变DNA中的应 用。6. 权利要求1-4中任一所述的方法在从基因编辑后的克隆产物中筛选含有突变DNA克 隆中的应用。7. -种筛选基因编辑成功的单克隆的方法，包括如下步骤： 1) 将待测基因编辑后的克隆产物中的克隆分别提取DNA，并分别进行PCR扩增，得到 PCR扩增产物，并将所述PCR扩增产物变性、复性，得到杂交产物； 2) 用聚丙烯酰胺凝胶电泳所述杂交产物，检测电泳结果，选取分子量大小及构象不同 于野生型克隆的克隆，即为基因编辑成功的单克隆。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述待测基因编辑后的克隆产物是按照 包括如下步骤的方法制备得到的：将表达靶向目标基因的人工核酸内切酶转入离体细胞 中，进行基因编辑，得到转染后细胞；将所述转染后细胞进行培养，得到待测基因编辑后的 克隆产物。9. 根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述目标基因为绵羊MSTN基因；所 述人工核酸内切酶为锌指核酸内切酶。10. 根据权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于：所述细胞为绵羊胎儿成纤维细 胞。
【专利摘要】本发明公开了一种基于聚丙烯酰胺凝胶电泳检测低效率基因组编辑的方法及其应用。该方法包括如下步骤：1)将野生型DNA用人工核酸内切酶编辑，得到由突变DNA和未突变野生型DNA组成的待测基因编辑后DNA；2)将待测基因编辑后DNA进行PCR扩增，并将所述PCR扩增产物变性、复性，得到杂交产物；3)用聚丙烯酰胺凝胶电泳杂交产物，确定待测基因编辑后DNA中突变DNA和未突变野生型DNA，实现基因编辑后DNA的检测。该方法在保证人工核酸内切酶编辑效率检测准确性、灵敏性的同时，简化了实验操作且降低了检测成本，将对人工核酸内切酶在基因定点修饰、基因功能研究以及疾病动物模型的建立等方面的应用产生积极地推动作用。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894255
【申请号】CN201510289009
【发明人】高蕊, 张伟, 王世银, 甘尚权, 周平, 王立民, 陈永林, 皮文辉, 黄瑾, 李冬妹, 宋广超
【申请人】石河子大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月29日
最新回复(0)