检测乙醛脱氢酶2基因rs671多态性位点的引物、试剂盒及其PCR方法
检测乙醛脱氢酶2基因rs671多态性位点的引物、试剂盒及其PCR方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学基因检测领域，特别提供了一种检测乙醛脱氢酶2基因多 态性的引物、试剂盒及其PCR方法，用于乙醛脱氢酶2基因 rs671多态位点的快速检测。
【背景技术】
[0002] 有机硝酸酯类药物用于治疗心绞痛是通过释放一氧化氮（NO)介导的，乙醛脱氢 酶2 (ALDH2)具有硝酸酯酶活性，可以将有机硝酸酯脱硝形成一氧化氮，是有机硝酸酯药物 发挥疗效的关键。如果病人ALDH2基因中携带有Glu504Lys (rs671)突变，变异基因编码 的蛋白质结构具有差异，ALDH2的硝酸酯酶活性会降低10倍以上，突变型ALDH2 *2/2是 野生型ALDH2*1/1活性的6 - 7%，突变型ALDH2*l/2是野生型ALDH2*1/1活性的8 - 15%， 因此ALDH2突变型酶Lys504不能迅速将有机硝酸酯转化为N0,导致心肌缺血情况加重，难 以发挥药效。资料显示，亚洲人群约5%-30%的个体都携带有ALDH2*2/2或ALDH2*l/2突 变。对于携带突变基因型(风险基因型）的患者，则不能完全把有机硝酸酯类药物当作心绞 痛发作时的唯一药品，因此，本试剂盒的适用人群为预期使用有机硝酸酯类药物的患者，检 测ALDH2基因型可预知含服有机硝酸酯类药物的风险，为医生合理使用有机硝酸酯类药物 提供参考。
[0003] 此外，ALDH2基因的rs671 G > A型突变，直接导致ALDH2在乙醇代谢途径中乙醛 脱氢成乙酸时活性的大幅度下降，使饮酒者体内乙醛大量储积，乙醛的毒性会使饮者头痛， 全身发红，加重肝脏负担。科学研宄发现这种突变还会增加人体患多种肿瘤尤其是食道癌 的风险，因此，本试剂盒还可适用于了解酒精代谢能力及酒精对身体危害程度的人群。
[0004] 目前对基因突变和基因多态性的检测，常见有直接测序法；基因芯片杂交法； PCR-RFLP方法；PCR扩增产物毛细管电泳分析法；PCR-SSCP ;PCR高分辨熔解曲线分析技 术；PCR-Taqman MGB (Minor Groove Binder)探针法；AS-PCR 法；Cast-PCR 法等。这些方 法或多或少还存在仪器价格高，操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床 普及程度低，不能同时大规模检测临床标本等缺点。
[0005] 如：1)直接测序法是突变分析的金标准，能发现已知和未知突变位点，但该法检测 基因突变的灵敏度为20%(即目的基因的突变基因 DNA模板数占野生型DNA模板数的20%)。 同时还存在操作复杂，周期长，分析速度慢，常需要2天的时间，而且该法是开管操作，大大 增加污染的可能性，不适合对大规模标本的检测，同时还需要昂贵的仪器，存在在基层不易 实施等缺点。
[0006] 2)普通PCR-RFLP方法技术简便，价格便宜，适宜少量样本的实验室检测，但RFLP 仅能检测有酶切位点的突变，无酶切位点不能检测，费时费力，还存在PCR产物污染导致 假阳性的风险，见[Mol Diagn Ther. 2010 Jun 1; 14(3) :163-9, United States Patent 20120135406]。
[0007] 3)芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化等特点，适用 于全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵。
[0008] 4) PCR高分辨熔解曲线分析技术，能高通量检测基因的突变情况，试剂成本较低， 但因其荧光信号来自染料，特异性受到影响，而且检测仪器是升级版的荧光PCR仪，价格高 昂，普及受限，见[Clin Chim ACqa. 2012 Nov 12;413(21-22):1781-5; United States Patent 20110045479]〇
[0009] 5 ) PCR-Taqman MGB探针法适合已知突变位点，常常需要两条探针，而Taqman MGB探针的合成价格是普通Taqman探针的几倍，见[J Clin Microbiol. 2010 Aug;48(8) :2909-15 ;United States Patent 20090311679]，并且不能检测样本中的含量 较少（彡1，〇〇〇个中的1个）的等位基因或突变位点。
[0010] 6)PCR-SSCP法虽然简单，但该法是开放性的检测系统，容易造成PCR产物的污染， 而且操作步骤多，费时费力。
[0011] 7)等位基因特异性引物PCR扩增法（AS-PCR)，这一方法是目前检测基因突变或 SNP最简单快速的方法（Wu D Y, Ugozzoli L, Pal B K, Wallace R B·，Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86:2757-2760)，其原理是引物3'末端碱基与模板的碱基错配，其PCR的 效率将会下降 IO3-IO6.6倍（Chen, X·，and Sullivan, P F, The Pharmacogeonomics Journal 2003，3，77-96)。尽管该方法的原理简单，但错配的引物，依然会发生非特异 性扩增，扩增情况视突变的类型和检测位点周围的碱基序列相关（Ayyadevara S, Thaden J J, Shmookler Reis R J·, Anal Biochem 2000; 284:11-18)，还与样本中存在的等位 基因变量的影响。为了增加 AS-PCR的特异性，许多科学家做了很多努力。大量的实验证 明，该方法最关键的是设计与3'末端突变位点碱基互补或错配的两条特异引物，引物设 计不好，将导致高背景的交叉扩增，会导致较高的假阳性。尽管不少人努力将这一弊端克 月艮，如报道的TaqMAMA方法，在3'倒数第二位或第三位上引入突变碱基，的确可以增加 反应的特异性，但仍然无法完全消除假阳性，而且在纯合子与杂合子的判断上，缺乏标准， 会出现混乱的情况，见[J Virol Methods. 2008 Nov;153(2):156-62;Genomics. 2004 Feb; 83 (2) :311-20]。简单的AS-PCR，通常采用PCR反应结束后再进行电泳，从有无反应 条带来判断结果，这种方法虽然不需要昂贵的仪器，但电泳操作，增加了 PCR的污染机会， 而且耗时费力。尽管有人对该方法作了改进，采用荧光定量PCR技术，但得到的不是"全或 无"式的结果，总会有非特异性反应的发生，即同样的引物对野生型和突变型位点都会扩 增，只是其得到的Ct (Cycle threshold)不同而已，因此就引入了 ACt的概念，即ACt= 野生Ct-突变Ct，但计算复杂，如要Λ Ct值大于纯合子Ct值判为突变型纯合子，Λ Ct值 小于杂合子Ct值，判为杂合子，ACt值的引入不仅增加了操作步骤，还会引起混乱，因为 ACt值的设定标准无法准确定位，不同人员的操作、不同的标本和不同的检测仪器都会有 不同的数字，给临床应用带来很大的困难，实际应用依然受限，见[中国专利CN101235415， CN101565742A]〇
[0012] 8)美国LIFE公司采用一种MGB封闭探针的方法，称作Cast-PCR ( Competitive allele specific Taqman PCR)，用MGB探针将不检测的位点封闭，然后用等位基因特异 引物荧光定量PCR的方法检测目的位点，这虽然提高了检测的特异性，但由于多加入一 条MGB封闭探针，势必增加成本，对反应效率多少会带来干扰，见[Exp Mol Pathol. 2012 Jun; 92 (3) :275-80; United States Patent 20100221717 ;CN102428190A]。有人采用锁 核酸（LNA) ( Plant Method 2007, 3 :2)或修饰的碱基（Anal Biochem. 2005, 340 :287-294) 的PCR引物，可以使得AS-PCR检测灵敏度提高。然而，这些方法增加了分析的总体成本，并 需对反应进行深度优化。
[0013] 目前，国内已上市有注册证的ALDH2基因检测试剂盒有如下一种：上海百傲科技 有限公司的"ALDH2(Glu504Lys)基因检测试剂盒（DNA微阵列芯片法）"，国食药监械（准） 字 2013 第 3400244 号。
[0014] 国内广州达健生物科技有限公司申请的一种ALDH2基因的rs671基因突变荧光 定量PCR分型检测试剂盒及其检测方法(专利号CN 102851368 A)，采用的是突变位点双 Taqman-MGB探针的荧光定量PCR方法；中国专利CN 102533958 A公开的检测试剂盒，采用 常规PCR扩增结合Cold-PCR富集扩增产物的技术和高分辨熔解曲线分析技术，完成对样 本ALDH2基因的rs671基因分型的判断；厦门艾德生物医药科技有限公司则采用利用双环 探针与特异性引物的杂交，检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，根据FAM和HEX荧光强 度判定结果(专利号CN 102453765 A);广州益善生物技术有限公司申请的名为一种ALDH2 基因的rs671基因突变检测液相芯片的专利(专利号CN 102234685 A)，即采用了液相芯片 技术对ALDH2基因的rs671突变情况进行检测。
[0015] 芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化等特点，适用于 全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵。而普通的荧光 定量PCR技术对最为关键的位点特异性引物设计，也仅按照引物设计的一般原则进行，没 有一个好特异引物的筛选客观指标，最为关键的是他们的结果判断，依然模糊，没有"全或 无"的概念，这样非特异性的缺点还是无法克服。双探针的荧光定量PCR方法，由于需要两 条探针，而且常常是Taqman-MGB探针，大大增加了试剂成本，并且探针的设计和优化，条件 很高。高分辨熔解曲线分析技术虽然试剂成本低，但荧光染料是非特异性的显示，先期的反 应条件优化、不同的更加昂贵的仪器和操作者的经验往往决定结果的成败。
[0016] 因此，如何对ALDH2基因 rs671多态性位点进行简单准确的检测，成为人们亟待解 决的问题。
【发明内容】
[0017] 鉴于此，本发明提供了一种检测乙醛脱氢酶2基因 rs671多态性位点的引物、试剂 盒及其PCR方法，以至少解决以往试剂盒存在的结果判读复杂、检测仪器价格高，操作难度 大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床普及程度低，不能同时大规模检测临床标 本等一个或多个问题。
[0018] 本发明提供的方案具体为：一种检测乙醛脱氢酶2基因 rs671多态性位点的引物， 其特征在于，所述引物包括：野生型特异性上游引物、突变型特异性上游引物和野生型特异 性上游引物与突变型特异性上游引物共用的下游引物； 且所述野生型特异性上游引物具有SEQ No. 17序列，所述突变型特异性上游引物具有 SEQ No. 14序列，所述共用的下游引物具有SEQ No. 16序列。
[0019] 本发明一方面还提供了一种检测乙醛脱氢酶2基因 rs671多态性位点的试剂，其 特征在于：所述试剂含有上述的引物。
[0020] 本发明另一方面还提供了一种检测乙醛脱氢酶2基因 rs671多态性位点的试剂 盒，其特征在于：所述试剂盒也含有上述的引物。
[0021 ] 优选，所述试剂盒中还包括与所述引物配合使用的探针，其中，所述探针为Taqman 探针，具有SEQ No. 15序列。
[0022] 进一步优选，所述试剂盒还包括PCR反应管、dNTPs和Taq酶混合液、PCR缓冲液、 检测管家基因 GAPDH的上游引物、检测管家基因 GAPDH的下游引物和检测管家基因 GAPDH 的探针、阳性质控品和空白对照； 所述检测管家基因 GAPDH的上游引物具有SEQ No. 19序列；所述检测管家基因 GAPDH 的下游引物具有SEQ No. 20序列；所述检测管家基因 GAPDH的探针具有SEQ No. 21序列。
[0023] 进一步优选，所述突变型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述 检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基 因 GAPDH的探针被预先包被于A型PCR反应管内；以及与所述野生型特异性上游引物、所 述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物 、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针被预先包被于G型PCR反应管内。
[0024] 进一步优选，所述A型PCR反应管内突变型特异性上游引物、所述共用的下游 引物、所述探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游 引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针浓度分别为50nM-2um、50nM-2uM、50nM-400nM、 lpm_20pm、lpm_20pm、0. 05pm_5pm ;以及所述G型PCR反应管内野生型特异性上游引物、 所述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基 因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针浓度分别为50nM-2um、50nM-2uM、 50nM_400nM、lpm_20pm、lpm_20pm、0· 05pm_5pm。
[0025] 更进一步优选，所述A型PCR反应管内突变型特异性上游引物、所述共用的下游 引物、所述探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引 物和所述检测管家基因 GAPDH的探针浓度分别为500nM、500nM、100nM、5pm、5pm、2. 5pm ;以 及所述G型PCR反应管内野生型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检 测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH 的探针浓度分别为 500nM、500nM、100nM、5pm、5pm、2. 5pm。
[0026] 本发明还提供了上述引物及试剂盒的PCR方法，其特征在于：PCR反应按两步扩增 循环程序进行，且第一步扩增的循环数小于第二步扩增的循环数，所述第一步扩增的退火 温度高于所述第二步扩增的退火温度。
[0027] 优选，所述PCR反应的条件为：37°C 2min，95°C 2min预变性；第一步扩增，95°C 变性 5s，55°C~68°C 退火 32s，循环 10~15 次；第二步，95°C 变性 5s，50°C~65°C 退火、 延伸32s，循环30~50次，收集荧光信号；进一步优选，所述PCR反应的条件为：37°C 2min， 95°C 2min预变性；第一步扩增，95°C变性5s，63°C退火32s，循环15次；第二步，95°C 变性5s，60°C退火、延伸32s，循环40次，收集荧光信号。
[0028] 本发明提供的检测乙醛脱氢酶2基因 rs671多态性位点的引物及其试剂盒，能够 大大增加等位基因特异性引物PCR区分不同等位基因位点的能力，使不同位点间的非特异 性交叉扩增的可能性降到最低，能够做到真正"全或无"式的扩增，不仅有很好的特异性，也 具有非常好的灵敏度，能检出Ing基因组DNA中的基因型分布情况。
[0029] 本发明提供的检测乙醛脱氢酶2基因 rs671多态性位点的引物及其试剂盒，具有 以下优点： 1)通过对引物序列上的人为改变使检测结果真正做到对结果"全或无"判断，大大简化 了结果判读的难度，降低了出错的可能，为科研和临床应用提供了便利。
[0030] 2) T aq酶与dNTPs的混合，保障了 dNTPs的稳定性，使其可经受多次反复冻融的 考验。
[0031] 3)提前预配好可直接使用的缓冲液，使用者更加方便。
[0032] 4)引物和探针提前包被在PCR反应管内，避免了操作者出现位点配错的可能，而 且也节约了大量操作时间。
[0033] 5)本发明中引物和试剂盒具有特异性好，检测的灵敏度高，检测速度快，整个过程 能在1小时20分钟内完成。
[0034] 6)试剂盒内仅用一条常规Taqman探针，别无其他诸如封闭探针，降低成本。
[0035] 7)该试剂盒具有检测简单、快速、准确、价廉等优点。
【附图说明】
[0036] 图1为设计野生型和突变型引物时的PCR扩增曲线图； 图2为A位点的PCR扩增曲线图； 图3为G位点的PCR扩增曲线图； 图4为AG位点的PCR扩增曲线图； 图5为管家基因 GAPDH的PCR扩增曲线图。
【具体实施方式】
[0037] 下面以具体的案例对本发明进行进一步解释，但并不用于限制本发明的保护范 围。
[0038] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段， 所用产品均为市购。
[0039] 以下定义是本发明中相关术语的解释： "等位基因"一般是指DNA区段，同源染色体上的相同物理位置上，控制相对性状的一 对基因。在一些情况下，等位基因可以对应于特定物理基因座上的单核苷酸的替换。在其 它情况中，等位基因可以对应于核苷酸（单个或多个）插入或缺失。
[0040] "等位基因特异性引物"是指与目标等位基因的序列互补，在PCR时能够延伸完成 特异的PCR反应。等位基因特异性引物可以设计成能检测出靶序列中少至1个核苷酸差异 十分特异的引物，该引物可以包含等位基因特异性核苷酸部分、3'端靶标特异性部分和尾 巴。
[0041] "MGB基团"是指小沟结合剂。当与寡核苷酸的3'末端缀合时，MGB基团能够作为 不可延伸的封闭部分发挥作用。MGB是能结合于双链DNA的小沟内的分子，通常采用DPI3 (其合成方法参见美国专利号6, 084, 102 ;和6, 727, 356)。
[0042] "检测探针"是指：指示扩增的多种信号传导分子中的任意一种。例如，SYBR Green 和其它DNA结合染料都是检测探针。一些检测探针可以是序列特异性的，例如Taqman探 针（美国专利号5, 538, 848)，多种茎环分子信标（美国专利号6, 103, 476和5, 925, 517 以及 Tyagi and Kramer，Nature Biotechnology，1996,14:303-308)，无莖的或线性信标 (W099/21881)，PM Molecular Beacons TM(美国专利号 6, 355, 421 和 6, 593, 091)，线性 PNA 信标（Kubista 等人，2001，SPIE4264 :53-58)，非-FRET 探针（美国专利号 6, 150,097)， Sunrise/Amplifluor探针（美国专利号6, 548, 250)，莖环和双链Scorpion TM探针 (Solinas 等人，2001，NucleicAcidsResearch29 :E96 和美国专利号 6, 589, 743)，鼓起的 环探针（美国专利号6, 590, 091)，假结探针（美国专利号6, 589, 250)，cycliC〇n(美国专 利号 6,383, 752)，MGB Eclipse TM 探针（Epoch Biosciences)，发夹探针（美国专利号 6, 596, 490)，肽核酸（PNA)探针。检测探针可以包含焚光报告分子，例如，6-羧基焚光素 (6-FAM)或四氯荧光素（TET)，和淬灭分子部分，例如四甲基若丹明（TAMRA)，Black Hole QuencheRS (Biosearch)，Iowa Black (IDT)，QSY 猝灭剂（Molecular Probes)和 Dabsyl 和 Dabcel磺酸盐/羧酸盐猝灭剂（Epoch)。
[0043] "共用特异性引物"是指在PCR反应中与等位基因特异性引物配对的引物，它能同 不同位点的等位基因特异性引物配对使用。
[0044] "热稳定性的聚合酶"是指对热稳定性的或热抗性的酶，主要指DNA聚合酶，该酶在 PCR扩增时，在升高的温度条件下不会发生失活。
[0045] 寡核苷酸的"Tm"或"熔解温度"是指一段DNA中50%的分子与互补序列杂交时 的温度。Tm值可以使用熟知的公式来计算（见，Maniatis，T.等人：Molecular cloning， Cold Spring Harbor, N.Y. :1982)〇
[0046] "灵敏度"是指能够被检出模板的最小量（拷贝数）。
[0047] "特异性"是指区分匹配模板和错配模板的能力。特异性经常表示为Λ Ct = Ct错 配-Ct匹配。
[0048] "选择性"是指AS-PCR测定可用于测定混合物中的少数（通常是突变）等位基因 而无来自多数（经常是野生型）等位基因的干扰的程度。选择性经常表示为比例或百分率。 例如，能够在存在100个野生型模板的情况下检出1个突变模板的测定被称作具有1 : 100 或1%的选择性。
[0049] "Ct"值是指循环阈值，代表PCR扩增曲线由基线变为指数增长拐点时的循环数。
[0050] "德尔塔Ct"或"Act"是指信号通过固定阈值时，两个不同样品或反应之间的循 环数差异。ACt是达到指数扩增时，两个不同样品或反应之间的循环数差异。ACt可用于 鉴定匹配引物与错配引物之间的特异性。
[0051] 本发明涉及快速检测ALDH2基因 rs671多态性位点的引物和试剂盒。具体地讲， 本发明是基于Past-PCR (Perfect allele-specific Taqman PCR)方法的基础上，成功应 用于ALDH2基因 rs671的多态性位点检测。所谓Past-PCR是由检测基因多态性位点或突 变的高特异性AS-PCR方法和Taqman探针的荧光PCR技术结合而成，其仅用一条Taqman探 针，在多数的情况下，这条探针为常规的Taqman探针，仅在部分基因中因富含AT碱基的特 殊序列，采用Taqman-MGB或LNA等探针，除此之外无需任何额外的封闭探针或报告探针， Past-PCR方法将AS-PCR和Taqman荧光PCR两种方法完美结合，并使两者的优点得到了极 度的发挥，具体表现在AS-PCR方法中，在不增加任何成本的情况下，靠引物设计和独特的 验证方法成功消除了非特异性扩增，使得结果判断呈现出"全和无"方式，即有就有，没有就 没有，使得结果的判断简单而准确，这是对过去的AS-PCR方法最大的改进，也是对AS-PCR 方法为人所诟病的有效弥补，从而将AS-PCR方法的优点发挥到了极致，是该方法所能达到 的最高境界。众所周知，Taqman焚光PCR具有密闭性检测无需反应完结后的处理，不仅节 省了时间，而且减少了 PCR产物污染的风险，探针的第二次识别靶序列保障了检测的特异 性和可靠性，还可用于对基因的定量检测，达到了临床使用标准等优点。Past-PCR方法具有 AS-PCR方法和Taqman荧光PCR方法的双重优点，并且是这两种方法结合在一起时，检测组 份所能达到的最简化构成，因此，我们将其称作为完美的等位基因特异性Taqman PCR。
[0052] 基于Past-PCR方法，发明了用于检测基因 ALDH2基因 rs671多态性位点的试剂 盒，其基本组成为：(a)高度特异的等位基因特异性引物；(b)荧光检测探针；（c)与等位基 因特异性引物配对的另一条特异性引物。
[0053] 其中，本发明提供的检测乙醛脱氢酶2基因 rs671多态性位点的引物，包括：野生 型特异性上游引物、突变型特异性上游引物和野生型特异性上游引物与突变型特异性上游 引物共用的下游引物； 且所述野生型特异性上游引物具有SEQ No. 17序列，所述突变型特异性上游引物具有 SEQ No. 14序列，所述共用的下游引物具有SEQ No. 16序列。
[0054] 同时还提供了含有上述引物的检测试剂和试剂盒，以解决以往检测乙醛脱氢酶2 基因 rs671多态性位点存在操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床普及 程度低，不能同时大规模检测临床标本等问题，实现了检测简单、快速、准确、廉价的理想要 求，为科研和临床基因型和基因突变分析提供了强有力的工具。
[0055] 优选，所述试剂盒中还包括与所述引物配合使用的探针，其中，所述探针为Taqman 探针，具有SEQ No. 15序列，整个试剂盒中仅使用一条探针，别无其他诸如封闭探针等，降低 试剂盒的成本。
[0056] 进一步优选，所述试剂盒还包括PCR反应管、dNTPs和Taq酶混合液、PCR缓冲液、 检测管家基因 GAPDH的上游引物、检测管家基因 GAPDH的下游引物和检测管家基因 GAPDH 的探针、阳性质控品和空白对照； 所述检测管家基因 GAPDH的上游引物具有SEQ No. 19序列；所述检测管家基因 GAPDH 的下游引物具有SEQ No. 20序列；所述检测管家基因 GAP DH的探针具有SEQ No. 21序列；其 中，将dNTPs和Taq酶混合，能够保障dNTPs的稳定性，使其可经受多次反复冻融的考验；检 测管家基因 GAPDH的上游引物、下游引物和探针是用于作为内参照，为防止检测时出现假 阴性；阳性质控品为AG型人基因组DNA ;空白对照为灭菌超纯水。
[0057] 进一步优选，所述突变型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述 检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基 因 GAPDH的探针被预先包被于A型PCR反应管内；以及与所述野生型特异性上游引物、所 述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针被预先包被于G型PCR反应管内，按最 佳的反应用量预先包被在PCR反应管中，每一个反应管中实际包被六条寡核甘酸，即一条 针对等位基因的一种特异性上游引物、一条探针(通常为Taqman探针)、一条共用特异性下 游引物、一条检测管家基因 GAPDH的上游引物、一条检测管家基因 GAPDH的下游引物和一条 检测管家基因 GAPDH的探针。这样为了检测一个位点不同的基因多态性，常需要分别包被 两管或两管以上的PCR反应管，它们中探针、共用特异性下游引物、检测管家基因 GAPDH的 上游引物、检测管家基因 GAPDH的下游引物和检测管家基因 GAPDH的探针是一样的，不同的 仅是鉴定等位基因不同型别的特异性上游引物，这样预先包被避免了操作者出现位点配错 的可能，而且节约了大量操作时间。
[0058] 进一步优选，所述A型PCR反应管内突变型特异性上游引物、所述共用的下游 引物、所述探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游 引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针浓度分别为50nM-2um、50nM-2uM和50nM-400nM、 lpm-20pm、lpm-20pm、0. 05pm_5pm ;以及所述G型PCR反应管内野生型特异性上游引物、所 述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针浓度分别为50nM-2um、50nM-2uM和 50nM-400nM、lpm-20pm、lpm-20pm、0· 05pm-5pm。最优为，所述 A 型 PCR 反应管内突变型特 异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所 述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针浓度分别为500nM、 500nM和100nM、5pm、5pm、2. 5pm ;以及所述G型PCR反应管内野生型特异性上游引物、所 述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针浓度分别为500nM、500nM和ΙΟΟηΜ、 5pm、5pm、2. 5pm〇
[0059] 由于在等位基因特异性引物内引入了错配的碱基，使其在反应时的效率下降，不 同的引物下降程度不同，通常要增加10至20个循环才能达到没有错配时的效果，保证检 测的灵敏度，优选PCR反应按两步扩增循环程序进行，且第一步扩增的循环数小于第二步 扩增的循环数，所述第一步扩增的退火温度高于第二步扩增的退火温度，第一步扩增使用 较高退火温度，第二步扩增使用较低退火温度，目的是增加第一步扩增时引物退火时的特 异性，从而保证Past-PCR检测高度特异性的目的；具体而言优选所述PCR反应的条件为： 37°C 2min，95°C 2min 预变性；第一步扩增，95°C 变性 5s，55°C~68°C 退火 32s，循环 10~15次；第二步，95°C变性5s，50°C~65°C退火、延伸32s，循环30~50次，收集荧光信 号；更为优选PCR反应的条件为：37°C 2min，95°C 2min预变性；第一步扩增，95°C变性 5s，63°C退火32s，循环15次；第二步，95°C变性5s，60°C退火、延伸32s，循环40次，收 集荧光信号。
[0060] 具体的检测过程为： 1) 将待检测样品分别放入预先分别包被有野生型特异引物、共用的下游引物、探针、检 测管家基因 GAPDH的上游引物、检测管家基因 GAPDH的下游引物和检测管家基因 GAPDH的 探针以及突变型特异引物、共用的下游引物、探针、检测管家基因 GAPDH的上游引物、检测 管家基因 GAPDH的下游引物和检测管家基因 GAPDH的探针两组PCR反应管内，并加入PCR 缓冲液、dNTPs和Taq酶混合液、灭菌超纯水和基因组DNA，盖紧管盖，在荧光定量PCR仪上 进行反应，并收集荧光信号； 2) 如果检测样本仅有突变型反应管在FAM通道有对数增长的扩增曲线，同时VIC通道 有对数增长的扩增曲线，可判定样本为A型，即突变型纯合子； 如果检测样本仅有野生型反应管在FAM通道有对数增长的扩增曲线，同时VIC通道有 对数增长的扩增曲线，可判定样本为G型，即野生型纯合子； 如果检测样本突变型和野生型反应管在FAM通道均有对数增长的扩增曲线，同时VIC 通道有对数增长的扩增曲线，可判定样本为AG型，即杂合子； 如果检测样本突变型和野生型反应管在FAM通道均无对数增长的扩增曲线，可能样本 或操作存在问题，或者样本DNA浓度过低，应重新提取样本DNA进行试验。
[0061] 下面详述检测过程中各组份介绍： (一）等位基因特异性引物： 等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分互补于基因的一个等位基因位点， 但不互补于该基因的另一个等位基因位点。通常而言，等位基因特异性引物的等位基因特 异性核苷酸部分位于等位基因特异性引物的3'端的末位碱基。在某些情况下，等位基因特 异性核苷酸部分也可位于等位基因特异性引物3'末端的其他碱基位置。
[0062] 在一些情况下，等位基因特异性引物除3'末端互补于等位基因位点有所变化外， 我们常常要在引物的其他位置引入错配的碱基，如在引物3'端倒数第二位或第三位引入碱 基错配，或第二和第三位的连续错配；针对不同的SNP或突变位点，在引物3'端倒数第二位 或第三位引入碱基错配的基础上，还可在引物的其它位点增加碱基错配来满足反应特异性 的要求，越远离3'端，增加错配的碱基数越多，在5'端可达最多。等位基因特异性引物的 长度主要依据其T m值来决定，通常而言其T m值比PCR循环的退火温度低大约5-20°C。
[0063] 两条检测对应基因多态性的等位基因特异性上游引物，除3'端检测的位点其碱基 不同外，其余序列尽可能相同，二条引物的Tm值也尽可能一致。
[0064] 低Tm的等位基因特异性引物（ASP)有更高的特异性。一般情况下，等位基因特异 性引物为短寡核苷酸，其长度是大约15-30,其Tm是大约40 °C至60 °C，比扩增过程中使用的 PCR循环条件的退火/延伸温度低大约5°C至20°C。
[0065]由于等位基因特异性引物的设计和筛选十分重要，好的引物需要从众多待选的 引物中选出，因此我们建立了一个筛选的方法，其等位基因特异性引物的具体筛选过程如 下： ⑴设计外围引物及PCR扩增：首先在待检基因突变点或SNP位点的上下游，设计一对 PCR扩增引物，然后用该对引物，对目的基因进行常规的PCR反应，其中扩增片段长度可在 几十至数千碱基对，优选长度为200至500碱基对； ⑵克隆PCR产物：将扩增出的PCR产物，利用AT克隆的方法，重组到普通的T载体质粒 中，得到重组质粒，其中得到的重组质粒可以进行测序验证，从而确保PCR产物的正确性； ⑶构建重组突变体：根据生物信息学所提供的信息，采用分子克隆技术，将突变体的序 列，构建至上述得到的重组质粒中，将构建的重组突变体进行测序验证序列，从而确保其正 确性； ⑷设计及筛选突变位点特异性引物：设计两条等位基因特异性引物，一条引物的3'端 同突变序列互补，另一条引物的3'端同正常序列互补；然后分别用等位基因特异性引物和 对应的常规PCR共同下游引物配对，以上述构建好的重组突变体作为反应模板，利用荧光 定量PCR仪，对反应体系，进行筛选；其中，反应可采用荧光染料，如SYBR GREEN，也可采用 特异性的Taqman荧光探针，按照所加样品量为0. 1微克全基因组DNA的标准进行筛选，其 具体的筛选内容如下： (a)设定PCR反应条件：首先设定PCR反应的退火温度完全一致，具体温度为55°C~ 68°C，PCR循环次数为40次，PCR反应的酶和缓冲体系均优化后固定不变，此反应条件的设 定是为了方便同时检测多种基因突变； (b)特异性筛选：采用突变型的引物以野生型的重组质粒为模板，筛选出的引物其Ct 大于40 ; 其中循环阈值的确定原因如下，突变型引物在野生型模板发生非特异性扩增比野生型 引物在野生型模板发生特异性扩增多19个循环，按照临床实际检测时，所加样品量为0. 1 微克全基因组DNA的标准，我们通过下列公式，拷贝数=(DNA量ngX6. 022X IO23V(长度 bp X IO9X 660)，其中全基因组DNA的长度为30亿对碱基，因此0. 1微克全基因组DNA的拷 贝数为：3. 09 X 104,反映在荧光定量PCR的Ct (定量循环阈值）大概为21，这样我们得到 第二个筛选指标，即用突变型的引物，在野生型的重组质粒为模板时，所得的Ct应该大于 40,方能保证检测不会出现假阳性，两者的扩增效率相差为40-21=19个循环，即扩增效率 相差19个循环以上，将成为我们判断等位基因特异性引物特异性好坏的客观指标。我们知 道当引物3'端与模板错配时，延伸效率将下降IO 3-IO6 6倍，换算成反应循环数则下降约13 至27个循环，这就是我们能筛选出理想引物的理论依据，因为不进行引物筛选，19-13=6个 循环，势必产生假阳性，该引物的特异性就不好，而19-27=-8,不可能产生假阳性，有8个循 环数的范围供我们对引物进行筛选。按照这一要求，我们设计一系列等位基因特异性引物， 从长短上、从靠近3'端人为引入碱基错配上着手，加上其配对的下游引物，利用构建好的野 生型和突变型重组质粒，分别进行荧光定量PCR反应的交叉筛选，即当用突变引物与野生 型的模板进行扩增时，与用野生型引物同野生型模板的反应要多用19个循环数以上，反之 亦然，那么这样的引物就具备高度的特异性。
[0066] (C)敏感性筛选：将筛选出的特异性引物用与重组突变型质粒作敏感性试验，将检 测灵敏度小于10-1000个拷贝的特异性引物筛选出来，即为所需的突变特异性引物。
[0067] 通过以上几方面的筛选，所得到的等位基因特异性引物将具备高度特异性和高度 敏感的理想引物。
[0068](二）检测探针： 在一些情况下，检测探针的！^直大约为60°C至70°C，最佳为65°C，探针长度根据其T m 值决定。尽管有多种不同形式的探针可供选择，Taqman探针（Applied Biosystems，Foster City)常常是首选。在一些特殊的情况下，如检测序列中AT含量过高，可以采用提高^值 的Taqman-MGB等类型的探针。
[0069] 共用的特异性引物，在一些情况下，共用的特异性引物的Tm值大约为50°C至 70 °C，最佳为60 °C，其长度由其Tm值决定，一般在15-25碱基之间。
[0070] (三）其他成分： 本发明使用的DNA聚合酶是Taq酶，及其突变体、衍生物或片段，也可是其他的耐热DNA 聚合酶，在一些情况下，也可采用Hotstart Taq酶，以增加反应的特异和高效性。
[0071] 本发明中所提供的针对ALDH2基因所提供的引物和试剂盒，主要是针对等位基因 特异性引物PCR扩增法的缺点，利用分子克隆技术，事先分别构建含待检基因野生型和突 变型的重组质粒，以此重组质粒为阳性模板，筛选确定特异地分别与3'末端突变位点或野 生位点碱基互补的两条特异引物，一旦筛选出的特异引物序列，将是我们检测体系的关键 元素。本发明的上述产品，可用于任何型号的荧光定量PCR仪，试剂成本同如今市面上的荧 光定量PCR试剂相当，因此较好地克服了其他采用等位基因特异性引物PCR扩增法的不足。
[0072] 本发明的优点在于：所述的试剂盒具有操作简单，成本低，结果判断简单容易，灵 敏度高，本试剂盒检测基因突变灵敏度可以达到1% (即目的基因的突变基因 DNA模板数占 野生型DNA模板数的1%);而直接测序中检测基因突变的灵敏度为20% (即目的 基因的突变 基因 DNA模板数占野生型DNA模板数的20%) Jaqman探针技术保障了试剂盒的检测为闭 管反应，有效的避免了假阳性的产生，其检测特异性也充分得到保证，而且检测快速方便， 整个检测过程只有80分钟，而直接测序则需要2天的时间，而且是开管操作，PCR产物污 染的可能性大增。
[0073] 本发明中PCR (Past-PCR)的实施步骤： 1.阳性质粒的构建 在待检测的ALDH2基因 rs671多态性位点的上下游设计一对PCR引物，其扩增片段 的长度可在500bp的范围内，用gDNA为模板，采用常规PCR方法，扩增出这一片段，通过 AT克隆的方式，将该片段克隆至测序的质粒中，通常用Invitrogen的pCR2.1 Topo T载 体试剂盒，操作按说明书进行，也可用其他厂家的T载体试剂盒，甚至可用自己制备的T载 体质粒。得到的阳性克隆，经测序验证，证明序列的正确性，然后采用Stratagene公司的 Quickchange试剂盒，设计对应位点的另一个基因型引物，通过Quickchange的方法，得到 该突变型别的阳性克隆，操作按说明书进行，所得到的阳性质粒都必须经测序验证为正确 方可进入下一步的使用。Taqman定量质粒，并用作模板以验证给定的测定法的灵敏性、线性 动态范围、特异性。
[0074] 2.等位基因特异性引物（ASP)的设计和筛选 在引物3'末端互补于对应的基因突变碱基位点，而在引物3'末端倒数第二位或第三 位引入碱基错配，或第二和第三位的连续错配；针对不同的SNP或突变位点，在引物3'端倒 数第二位或第三位引入碱基错配的基础上，还可在引物的其它位点增加碱基错配来满足反 应特异性的要求，越远离3'端，增加错配的碱基数越多，在5'端可达最多的等位基因1特 异性引物。
[0075] ASP的筛选是利用构建好的野生型和突变型重组质粒，分别进行荧光定量PCR反 应的交叉筛选，即当用突变引物与野生型的模板进行扩增时，与用野生型引物同野生型模 板的反应要多用19个循环数以上，反之亦然，那么这样的引物就具备高度的特异性。将筛 选出的特异性引物用与对应的重组质粒作敏感性试验，检测灵敏度小于10-1000个拷贝的 引物即达到检测的灵敏度要求，满足上述两个条件的引物就是我们选出的ASP引物，可进 行下一步的检测。
[0076] 3.扩增试剂准备及加入被检测样品 (1)从试剂盒中取出各组成成分，室温缓慢融化PCR缓冲液、dNTPs和Taq酶混合液、阳 性质控品、空白对照，颠倒摇匀。每个反应管需加入PCR缓冲液、Taq酶（dNTPs )、灭菌超纯 水和DNA样本。盖紧管盖，瞬时离心后转移到PCR扩增区。
[0077] (2)建议每次PCR反应均同时进行样本、阳性质控品、空白对照的分析，阳性质控 品和空白对照的加样方法同样本加入方法。
[0078] 4.反应条件 每个反应管中（反应终体积的范围可在10-50 μ 1，最佳在20-25 μ 1反应体积）包含 PCR缓冲液（IOmM Tris-HCl ρΗ8· 3, 50mM KC1, 0· l%Triton X-100,2. OmM MgCl2)，IO-IOOng DNA或1，000, OOO个拷贝的质粒DNA，50nM-400nM -个共同的通用特异性Taqman探针，一 个50nM-2uM共同的通用反向特异性下游引物，50nM-2uM不同等位基因特异性上游引物， lpm-20pm检测管家基因 GAPDH的上游引物，Ipm-20pm检测管家基因 GAPDH的下游引物， 0· 05pm-5pm检测管家基因 GAPDH的探针，再加上L 5单位Taq聚合酶，200 μ M dNTPs。
[0079] I )、循环条件设置
为使荧光曲线更加美观，建议从第二步开始收集荧光信号。
[0080] 2)、仪器检测通道选择
荧光信号采集温度设为60°C，具体设置方法请参照相应仪器使用说明书。
[0081] 3 )、检测类型设定：空白对照设为" NTC "，阳性质控品和待检样本设为 "Unknown"。
[0082] 5.结果分析 如果检测样本仅有突变型反应管在FAM通道有对数增长的扩增曲线，同时VIC通道有 对数增长的扩增曲线，可判定样本为A型，即突变型纯合子；如果检测样本仅有野生型反应 管在FAM通道有对数增长的扩增曲线，同时VIC通道有对数增长的扩增曲线，可判定样本为 G型，即野生型纯合子；如果检测样本突变型和野生型反应管在FAM通道均有对数增长的扩 增曲线，同时VIC通道有对数增长的扩增曲线，可判定样本为AG型，即杂合子；由于本方法 结果是"全或无"，结果极易判断，哪一个管有反应，哪一个管就是阳性。 具体实施例
[0083] 下面以对ALDH2 (乙醛脱氢酶2)基因 rs671多态性位点突变检测的情形为例，具 体对本发明作进一步详细的说明。
[0084] 实施例1 :针对ALDH2 (乙醛脱氢酶2)基因 rs671多态性检测的野生型和突变型 阳性质粒的制备 首先我们从基因库中调出ALDH2基因 rs671多态性位点前后的基因序列，并将多态性 位点用双下划线标记，在ALDH2基因 rs671多态性位点的上下游适当位置(用黑体字和下 划线标示)，设计一对克隆引物，扩增片段为274bp，突变位点包含其内，基因序列显示如下， SEQ No. 1 ： gggcaacagagaaagattctatctcaaaaaaaaaaatttttttttaagttaaaaataaaataaagactttggg gcaatacagggggtcctgggagtgtaacccataacccccaagagtgatttctgcaatctcgtttcaaattacagggt caactgctatgatgtgtttggagcccagtcaccctttggtggctacaagatgtcggggagtggccgggagttgggcg agtacgggctgcaggcatacactgaagtgaaaactgtgagtgtgggacctgctgggggctcagggcctgttggggct tgagggtctgctggtggctcggagcctgctgggggattggggtctgttgggggctcggggcctgccagaggttcagg acctgccggggactcagggcctgctggaagttcaggacctgctggggatcagggcctgccagggatttagggtct 实验步骤如下： 1)提取基因组DNA 用国内天根公司或Qiagen公司的基因组DNA提取试剂盒，提取基因组DNA，具体操作步 骤按说明书进行。制备好的DNA标本，经紫外分光光度计测定浓度，将其浓度调整到50ng/ μ 1，保存于_20°C，或直接进行下面的反应。
[0085] 2) AT克隆获得阳性质粒 首先在突变点上下游设计克隆引物，见表1 : 表1. ALDH2基因 rs671多态性位点野生型克隆引物
在 12·5μ1 的 2XPCR Master Mix (Fermentas)的 PCR 扩增体系，加入 ΙΟμΜ 上游引 物和10 μ M下游引物，以及基因组DNA50ng，加水至总体积25 μ 1，PCR反应条件设定为95°C 预变性3min，95°C变性10s，60°C退火及延伸30s，总共35个循环，反应结束后取15 μ 1反 应产物，进行浓度2. 5%的凝胶电泳，电泳结束后观察，条带与预测的大小相符，表明扩增成 功。采用美国Life公司的pCR2.0 TOPO T载体，按其操作说明，通过TA克隆的方式，获得 ALDH2基因的rs671位点野生型阳性质粒，具体的基因序列如下，其中多态性位点显示为G 型，说明为野生型，测序证明所获质粒正确。
[0086] SEQNo. 4 ：gggggtcctgggagtgtaacccataacccccaagagtgatttctgcaatctcgtttcaaat tacagggtcaactgctatgatgtgtttggagcccagtcaccctttggtggctacaagatgtcggggagtggccggga gttgggcgagtacgggctgcaggcatacact_gaagtgaaaactgtgagtgtgggacctgctgggggctcagggcctg ttggggcttgagggtctgctggtggctcggagcctgctgggggattggggtctgttggg 3)快速突变法获得突变质粒 然后，采用产生快速突变的方法（Quickchange，QC)，设计突变引物，引物序列见表2. 表2.获得ALDH2基因的rs671多态性位点突变型克隆引物
按照（Stratagene公司）Quickchange试剂盒的反应条件和步骤，完成突变体的构建， 所得到的重组质粒，具体的基因序列如下，经测序验证其中多态性位点显示为A型，为突变 型，然后将突变型与野生型质粒分别置_20°C保存备用。
[0087] SEQ No. 7 ：gggggtcctgggagtgtaacccataacccccaagagtgatttctgcaatctcgtttcaaa ttacagggtcaactgctatgatgtgtttggagcccagtcaccctttggtggctacaagatgtcggggagtggccggg agttgggcgagtacgggctgcaggcatacactaaagtgaaaactgtgagtgtgggacctgctgggggctcagggcct gttggggcttgagggtctgctggtggctcggagcctgctgggggattggggtctgttggg 实施例2 :等位基因特异性引物（ASP)的设计和特异性筛选 针对ALDH2基因 rs671多态性位点，设计野生型和一系列突变特异型引物如下： ALDH2 基因的 rs671_WT_F: gggctgcaggcatacagtg (SEQ Νο·8) ALDH2 基因的 rs671-mut_F: gggctgcaggcatacagta (SEQ Νο·9) ALDH2 基因的 rs671-mut_Fl: ggctgcaggcatacagta (SEQ Νο.10) ALDH2 基因的 rs671-mut_F2: gctgcaggcatacagta (SEQ No.ll) ALDH2 基因的 rs671-mut_F3: gctgcaggcatacacaa (SEQ No.12) ALDH2 基因的 rs671-mut_F4: ggctgcaggcatacacaa (SEQ No.13) ALDH2 基因的 rs671-mut_F5: gggctgcaggcatacacaa (SEQ No.14) 同时设计合成Taqman特异性探针： SEQ No. 15 ：FAM-cctgttggggcttgagggtc-BHQl〇
[0088] 相关引物和探针在生工生物工程(上海）有限公司进行合成。
[0089] 然后分别用上述7条引物与ALDH2基因的共同下游引物rs671-R: 5'-cccaacagaccccaatc-3'（SEQNo·16)引物配对，加上Taqman特异性探针，加入前述构 建所得到的野生型重组质粒约3万个拷贝为模板，在荧光定量PCR仪上进行引物特异性筛 选，反应条件设定为第一步95°C 2min预变性，95°C 5s，63°C 30s共15个循环，不收集荧 光信号，第二步95°C 5s，60°C 30s共40个循环，收集荧光信号，结果见图1。
[0090] 其中，图 1 中 1~7 曲线分别代表 rs671-WT-F、rs671-mut-F、rs671-mut-Fl、 rs671-mut-F2、rs671-mut-F3、rs671-mut-F4、rs671-mut-F5 的 PCR扩增曲线，从图 2 中我们 看出1号野生型引物在15. 5个循环产生扩增信号，2-6号引物的特异性较差，分别在17-19 个循环左右产生非特异性扩增，同野生型引物（1号）扩增效率相差小于19个循环，第7号 引物满足我们的要求，在40个循环时，仍然没有扩增，同野生型引物扩增效率相差大于19 个循环。为了与突变引物有更好的可比性，我们参照第7号引物重新设计野生型的引物为： gggctgcaggcatacacag (SEQ No. 17)〇
[0091] 即最终设计筛选的引物： 野生型上游引物：gggctgcaggcatacacag (SEQ No. 17) 突变型上游引物：gggctgcaggcatacacaa (SEQ No . 14) 实施例3 :ASP灵敏度筛选 再用突变型引物分别同ALDH2基因 rs671多态性位点的共同下游引物SEQ No. 16配 对，用突变型重组质粒，按照1〇6,1〇5,1〇4,1〇3,1〇 2,10, 〇作梯度稀释，加上Taqman特异性探 针，在荧光定量PCR仪上进行灵敏度验证。突变特异型引物能检测出100个拷贝的突变体， 因此这一引物就是按我们的方法筛选出检测ALDH2基因 rs671多态性位点的最佳引物，见 表3所示。
[0092] 实施例4 :预制的本发明PCR (Past-PCR)反应管 按照每个突变位点两个反应管的要求，即一管检测野生型位点，另一管检测突变位点， 将适宜浓度的引物探针预先包被于0. 2ML乳白色的PCR反应管中。
[0093] 为了防止检测时出现假阴性，在每个反应管中均预先包被有检测管家基因 GAPDH 的上游引物、下游引物和探针，其中，GAPDH基因序列如下： cctccgggaaactgtggcgtgatggccgcggggctctccagaacatcatccctgcctctactggcgctgcc aaggctgtgggcaaggtcatccctgagetgaacgggaagctcactggcatggccttccgtgtccccactgccaacg tgtcagtggtggacctgacctgccgtctagaaaaacctgccaaatatgatgacatcaagaaggtggtgaagcaggcg tcggagggccccctcaagggcatcctgggctacactgagcaccaggtggtctcctctgacttcaacagcgacaccca ctcctccacctttgacgctggggctggcattgccctcaacg (SEQ No. 18) 检测管家基因 GAPDH的上游引物序列为：ggctgtgggcaaggtcatc (SEQ No. 19) 检测管家基因 GAPDH的下游引物序列为：ctccgacgcctgcttcaccac(SEQ Νο·20) 检测管家基因 GAPDH 的探针序列为：ccttccgtgtccccactgccaacgt(SEQ No. 21) 其中，检测管家基因 GAPDH的探针5 '端用HEX荧光标记，3 '端用BHQ标记，由于HEX和 VIC属于同一通道检测，而许多仪器往往采用VIC标示，因此文中用VIC叙述。
[0094] PCR反应管中具体的细节见表3。
[0095] 表3.预制ALDH2基因 rs671多态性位点Past-PCR反应管的组分和浓度
由于我们预先把突变型和野生型上游引物、探针、共同下游引物、检测管家基因 GAPDH 的上、下游引物和检测管家基因 GATOH的探针包被在编好号的不同反应管中，有效避免了 使用者的操作误差，同时大大提高了操作效率，极大方便了在临床上的实际使用。
[0096] 实施例5 :标本的验证 采集正常人群的外周血或口腔脱落细胞标本，并用Qiagen公司的基因组DNA提取试剂 盒，提取基因组DNA，具体操作步骤按说明书进行。制备好的DNA标本，经紫外分光光度计测 定浓度，将其浓度调整到IOOng/ μ 1备用。
[0097] 我们用筛选出的这个突变特异性引物，同时用野生型引物作对照，在同一个PCR 反应板上，每两个反应管检测一个基因位点，其中一个是突变位点，另一个是野生型位点。 每个反应管 20μ1 反应体积中包含 IOmM Tris-HCl pH8.3,50mM KCl，(Xl%Triton Χ-100， 2. OmM MgCl2, IOOng人基因组DNA，IOOnM特异性Taqman探针，500nM共用特异性下游引物， 500nM野生型特异性上游引物或突变型特异性上游引物，5pm检测管家基因 GAPDH的上游引 物，5pm检测管家基因 GAPDH的下游引物，2. 5pm检测管家基因 GAPDH的探针，再加上1. 5单 位Taq DNA聚合酶，200 μ M dNTPs，其余为去离子水。
[0098] 第一步PCR反应条件是：37°C 2min，95°C2min预变性，然后 95°C5s，63°C30s，15 个循环，此步不收集荧光；第二步PCR反应条件是：95°C 5s，60°C 30s，共40个循环，此步收 集荧光。为了方便起见，我们将ALDH2基因 rs671多态性正常位点认定为野生型（G位点)， 而容易引起ALDH2酶活性下降的位点则为突变型（A位点)，如果对应的反应管在FAM通道有 对数增长的扩增曲线，同时VIC通道有对数增长的扩增曲线，就判断为对应的纯合基因型； 如两管均在FAM通道有对数增长的扩增曲线，同时VIC通道有对数增长的扩增曲线，则为杂 合型。
[0099] 1、按照上述方法进行突变等位基因纯合子（A位点）检测，其具体基因序列为： SEQ No. 22 ：ggcatacactaaagtgaaaac 收集到的FAM通道PCR扩增曲线图，如图2所示，其中，a曲线代表检测突变型PCR反 应管中的扩增曲线，b曲线代表检测野生型PCR反应管中的扩增曲线。
[0100] 2、按照上述方法进行野生等位基因纯合子（G位点）检测，其具体基因序列为： SEQ No. 23 ：ggcatacactgaagtgaaaac 收集到的FAM通道PCR扩增曲线图，如图3所示，其中，c曲线代表检测野生型PCR反 应管中的扩增曲线，d曲线代表检测突变型PCR反应管中的扩增曲线。
[0101] 3、按照上述方法进行杂合（AG型）检测，其具体基因序列为： SEQ No. 24 ：ggcatacacta/gaagtgaaaac 收集到的FAM通道PCR扩增曲线图，如图4所示，其中，e曲线代表检测野生型PCR反 应管中的扩增曲线，f曲线代表检测突变型PCR反应管中的扩增曲线。
[0102] 同时，上述3个检测案例中，当VIC通道管家基因 GAPDH有对数增长的扩增曲线， 如图5所示，同时FAM通道有对数增长的扩增曲线，则此次实验结果有效。
[0103] 因此，从上述的检测试验可见，本试剂盒的检测结果为"全或无"的结果，即若被检 测样品为突变等位基因纯合子，两个PCR反应管中，仅有突变型PCR反应管在FAM通道和 VIC通道均有对数增长的扩增曲线，而野生型PCR反应管在FAM通道毫无扩增曲线；若被检 测样品为野生等位基因纯合子，两个PCR反应管中，仅有野生型PCR反应管在FAM通道和 VIC通道均有对数增长的扩增曲线，而突变型PCR反应管在FAM通道毫无扩增曲线；若被检 测样品为杂合子，两个PCR反应管在FAM通道和VIC通道均有对数增长的荧光信号。该试 剂盒的检测结果判读简单，减少了以往试剂盒的检测结果需要进行ACt等一系列复杂计 算的过程，降低错判率，同时还有效避免了以往试剂盒检测结果中存在假阴性假阳性现象 的发生。此外本发明提供的试剂盒可用于任何型号的荧光定量PCR仪，检测仪器简单，成本 低，为科研和临床乙醛脱氢酶2基因 rs671多态性位点分型和基因突变分析提供了强有力 的工具。
【主权项】
1. 一种检测乙醛脱氢酶2基因rs671多态性位点的引物，其特征在于，所述引物包括： 野生型特异性上游引物、突变型特异性上游引物和野生型特异性上游引物与突变型特异性 上游引物共用的下游引物； 且所述野生型特异性上游引物具有SEQNo. 17序列，所述突变型特异性上游引物具有SEQNo. 14序列，所述共用的下游引物具有SEQNo. 16序列。2. -种检测乙醛脱氢酶2基因rs671多态性位点的试剂，其特征在于：所述试剂含有 权利要求1所述的引物。3. -种检测乙醛脱氢酶2基因rs671多态性位点的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒 含有权利要求1所述的引物。4. 按照权利要求3所述检测乙醛脱氢酶2基因rs671多态性位点的试剂盒，其特征在 于：所述试剂盒还包括与权利要求1所述引物配合使用的探针，其中，所述探针为Taqman探 针，具有SEQNo. 15序列。5. 按照权利要求4所述检测乙醛脱氢酶2基因rs671多态性位点的试剂盒，其特征在 于：所述试剂盒还包括PCR反应管、dNTPs和Taq酶混合液、PCR缓冲液、检测管家基因GAPDH 的上游引物、检测管家基因GAPDH的下游引物和检测管家基因GAPDH的探针、阳性质控品和 空白对照； 所述检测管家基因GAPDH的上游引物具有SEQNo. 19序列；所述检测管家基因GAPDH的下游引物具有SEQNo. 20序列；所述检测管家基因GAPDH的探针具有SEQNo. 21序列。6. 按照权利要求5所述检测乙醛脱氢酶2基因rs671多态性位点的试剂盒，其特征 在于：所述突变型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探 针被预先包被于A型PCR反应管内；以及与所述野生型特异性上游引物、所述共用的下游引 物、所述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物 和所述检测管家基因GAPDH的探针被预先包被于G型PCR反应管内。7. 按照权利要求6所述检测乙醛脱氢酶2基因rs671多态性位点的试剂盒，其特征 在于：所述A型PCR反应管内突变型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所 述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管 家基因GAPDH的探针浓度分别为 50nM-2um、50nM-2uM、50nM-400nM、lpm-20pm、lpm-20pm、 0. 05pm-5pm;以及所述G型PCR反应管内野生型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所 述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所 述检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为50nM-2um、50nM-2uM、50nM-400nM、lpm-20pm、 lpm_20pm、0. 05pm_5pm〇8. 按照权利要求7所述检测乙醛脱氢酶2基因rs671多态性位点的试剂盒，其特征在 于：所述A型PCR反应管内突变型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检 测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针浓度分别为500nM、500nM、100nM、5pm、5pm、2. 5pm;以及所述G型PCR反应管内 野生型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游 引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为 500nM、500nM、100nM、5pm、5pm、2. 5pm。9. 一种权利要求1所述引物或权利要求3~8任一试剂盒的PCR方法，其特征在于：PCR 反应按两步扩增循环程序进行，且第一步扩增的循环数小于第二步扩增的循环数，所述第 一步扩增的退火温度高于所述第二步扩增的退火温度。10.按照权利要求9所述的PCR方法，其特征在于，所述PCR反应的条件为：37°C 2min， 95°C 2min预变性；第一步扩增，95°C变性5s，55°C~68°C退火32s，循环10~15次；第二 步，95°C变性5s，50°C~65°C退火、延伸32s，循环30~50次，收集荧光信号；或所述PCR反 应的条件为：37°C 2min，95°C 2min预变性；第一步扩增，95°C变性5s，63°C退火32s， 循环15次；第二步，95°C变性5s，60°C退火、延伸32s，循环40次，收集荧光信号。
【专利摘要】本发明公开了一种检测乙醛脱氢酶2基因rs671多态性位点的引物、试剂盒及其PCR方法，其中包括：野生型特异性上游引物、突变型特异性上游引物和野生型特异性上游引物与突变型特异性上游引物共用的下游引物；且所述野生型特异性上游引物具有SEQ No.17序列，所述突变型特异性上游引物具有SEQ No.14序列，所述共用的下游引物具有SEQ No.16序列；试剂盒具有检测简单、快速、准确、廉价等优点，为科研和临床乙醛脱氢酶2基因型和基因突变分析提供了强有力的工具。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894256
【申请号】CN201510290613
【发明人】高劲松, 张英杰, 李星颐, 樊志美, 于农, 魏潇, 魏奇
【申请人】沈阳优吉诺生物科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月29日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学基因检测领域，特别提供了一种检测乙醛脱氢酶2基因多 态性的引物、试剂盒及其PCR方法，用于乙醛脱氢酶2基因 rs671多态位点的快速检测。
【背景技术】
[0002] 有机硝酸酯类药物用于治疗心绞痛是通过释放一氧化氮（NO)介导的，乙醛脱氢 酶2 (ALDH2)具有硝酸酯酶活性，可以将有机硝酸酯脱硝形成一氧化氮，是有机硝酸酯药物 发挥疗效的关键。如果病人ALDH2基因中携带有Glu504Lys (rs671)突变，变异基因编码 的蛋白质结构具有差异，ALDH2的硝酸酯酶活性会降低10倍以上，突变型ALDH2 *2/2是 野生型ALDH2*1/1活性的6 - 7%，突变型ALDH2*l/2是野生型ALDH2*1/1活性的8 - 15%， 因此ALDH2突变型酶Lys504不能迅速将有机硝酸酯转化为N0,导致心肌缺血情况加重，难 以发挥药效。资料显示，亚洲人群约5%-30%的个体都携带有ALDH2*2/2或ALDH2*l/2突 变。对于携带突变基因型(风险基因型）的患者，则不能完全把有机硝酸酯类药物当作心绞 痛发作时的唯一药品，因此，本试剂盒的适用人群为预期使用有机硝酸酯类药物的患者，检 测ALDH2基因型可预知含服有机硝酸酯类药物的风险，为医生合理使用有机硝酸酯类药物 提供参考。
[0003] 此外，ALDH2基因的rs671 G > A型突变，直接导致ALDH2在乙醇代谢途径中乙醛 脱氢成乙酸时活性的大幅度下降，使饮酒者体内乙醛大量储积，乙醛的毒性会使饮者头痛， 全身发红，加重肝脏负担。科学研宄发现这种突变还会增加人体患多种肿瘤尤其是食道癌 的风险，因此，本试剂盒还可适用于了解酒精代谢能力及酒精对身体危害程度的人群。
[0004] 目前对基因突变和基因多态性的检测，常见有直接测序法；基因芯片杂交法； PCR-RFLP方法；PCR扩增产物毛细管电泳分析法；PCR-SSCP ;PCR高分辨熔解曲线分析技 术；PCR-Taqman MGB (Minor Groove Binder)探针法；AS-PCR 法；Cast-PCR 法等。这些方 法或多或少还存在仪器价格高，操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床 普及程度低，不能同时大规模检测临床标本等缺点。
[0005] 如：1)直接测序法是突变分析的金标准，能发现已知和未知突变位点，但该法检测 基因突变的灵敏度为20%(即目的基因的突变基因 DNA模板数占野生型DNA模板数的20%)。 同时还存在操作复杂，周期长，分析速度慢，常需要2天的时间，而且该法是开管操作，大大 增加污染的可能性，不适合对大规模标本的检测，同时还需要昂贵的仪器，存在在基层不易 实施等缺点。
[0006] 2)普通PCR-RFLP方法技术简便，价格便宜，适宜少量样本的实验室检测，但RFLP 仅能检测有酶切位点的突变，无酶切位点不能检测，费时费力，还存在PCR产物污染导致 假阳性的风险，见[Mol Diagn Ther. 2010 Jun 1; 14(3) :163-9, United States Patent 20120135406]。
[0007] 3)芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化等特点，适用 于全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵。
[0008] 4) PCR高分辨熔解曲线分析技术，能高通量检测基因的突变情况，试剂成本较低， 但因其荧光信号来自染料，特异性受到影响，而且检测仪器是升级版的荧光PCR仪，价格高 昂，普及受限，见[Clin Chim ACqa. 2012 Nov 12;413(21-22):1781-5; United States Patent 20110045479]〇
[0009] 5 ) PCR-Taqman MGB探针法适合已知突变位点，常常需要两条探针，而Taqman MGB探针的合成价格是普通Taqman探针的几倍，见[J Clin Microbiol. 2010 Aug;48(8) :2909-15 ;United States Patent 20090311679]，并且不能检测样本中的含量 较少（彡1，〇〇〇个中的1个）的等位基因或突变位点。
[0010] 6)PCR-SSCP法虽然简单，但该法是开放性的检测系统，容易造成PCR产物的污染， 而且操作步骤多，费时费力。
[0011] 7)等位基因特异性引物PCR扩增法（AS-PCR)，这一方法是目前检测基因突变或 SNP最简单快速的方法（Wu D Y, Ugozzoli L, Pal B K, Wallace R B·，Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86:2757-2760)，其原理是引物3'末端碱基与模板的碱基错配，其PCR的 效率将会下降 IO3-IO6.6倍（Chen, X·，and Sullivan, P F, The Pharmacogeonomics Journal 2003，3，77-96)。尽管该方法的原理简单，但错配的引物，依然会发生非特异 性扩增，扩增情况视突变的类型和检测位点周围的碱基序列相关（Ayyadevara S, Thaden J J, Shmookler Reis R J·, Anal Biochem 2000; 284:11-18)，还与样本中存在的等位 基因变量的影响。为了增加 AS-PCR的特异性，许多科学家做了很多努力。大量的实验证 明，该方法最关键的是设计与3'末端突变位点碱基互补或错配的两条特异引物，引物设 计不好，将导致高背景的交叉扩增，会导致较高的假阳性。尽管不少人努力将这一弊端克 月艮，如报道的TaqMAMA方法，在3'倒数第二位或第三位上引入突变碱基，的确可以增加 反应的特异性，但仍然无法完全消除假阳性，而且在纯合子与杂合子的判断上，缺乏标准， 会出现混乱的情况，见[J Virol Methods. 2008 Nov;153(2):156-62;Genomics. 2004 Feb; 83 (2) :311-20]。简单的AS-PCR，通常采用PCR反应结束后再进行电泳，从有无反应 条带来判断结果，这种方法虽然不需要昂贵的仪器，但电泳操作，增加了 PCR的污染机会， 而且耗时费力。尽管有人对该方法作了改进，采用荧光定量PCR技术，但得到的不是"全或 无"式的结果，总会有非特异性反应的发生，即同样的引物对野生型和突变型位点都会扩 增，只是其得到的Ct (Cycle threshold)不同而已，因此就引入了 ACt的概念，即ACt= 野生Ct-突变Ct，但计算复杂，如要Λ Ct值大于纯合子Ct值判为突变型纯合子，Λ Ct值 小于杂合子Ct值，判为杂合子，ACt值的引入不仅增加了操作步骤，还会引起混乱，因为 ACt值的设定标准无法准确定位，不同人员的操作、不同的标本和不同的检测仪器都会有 不同的数字，给临床应用带来很大的困难，实际应用依然受限，见[中国专利CN101235415， CN101565742A]〇
[0012] 8)美国LIFE公司采用一种MGB封闭探针的方法，称作Cast-PCR ( Competitive allele specific Taqman PCR)，用MGB探针将不检测的位点封闭，然后用等位基因特异 引物荧光定量PCR的方法检测目的位点，这虽然提高了检测的特异性，但由于多加入一 条MGB封闭探针，势必增加成本，对反应效率多少会带来干扰，见[Exp Mol Pathol. 2012 Jun; 92 (3) :275-80; United States Patent 20100221717 ;CN102428190A]。有人采用锁 核酸（LNA) ( Plant Method 2007, 3 :2)或修饰的碱基（Anal Biochem. 2005, 340 :287-294) 的PCR引物，可以使得AS-PCR检测灵敏度提高。然而，这些方法增加了分析的总体成本，并 需对反应进行深度优化。
[0013] 目前，国内已上市有注册证的ALDH2基因检测试剂盒有如下一种：上海百傲科技 有限公司的"ALDH2(Glu504Lys)基因检测试剂盒（DNA微阵列芯片法）"，国食药监械（准） 字 2013 第 3400244 号。
[0014] 国内广州达健生物科技有限公司申请的一种ALDH2基因的rs671基因突变荧光 定量PCR分型检测试剂盒及其检测方法(专利号CN 102851368 A)，采用的是突变位点双 Taqman-MGB探针的荧光定量PCR方法；中国专利CN 102533958 A公开的检测试剂盒，采用 常规PCR扩增结合Cold-PCR富集扩增产物的技术和高分辨熔解曲线分析技术，完成对样 本ALDH2基因的rs671基因分型的判断；厦门艾德生物医药科技有限公司则采用利用双环 探针与特异性引物的杂交，检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，根据FAM和HEX荧光强 度判定结果(专利号CN 102453765 A);广州益善生物技术有限公司申请的名为一种ALDH2 基因的rs671基因突变检测液相芯片的专利(专利号CN 102234685 A)，即采用了液相芯片 技术对ALDH2基因的rs671突变情况进行检测。
[0015] 芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化等特点，适用于 全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵。而普通的荧光 定量PCR技术对最为关键的位点特异性引物设计，也仅按照引物设计的一般原则进行，没 有一个好特异引物的筛选客观指标，最为关键的是他们的结果判断，依然模糊，没有"全或 无"的概念，这样非特异性的缺点还是无法克服。双探针的荧光定量PCR方法，由于需要两 条探针，而且常常是Taqman-MGB探针，大大增加了试剂成本，并且探针的设计和优化，条件 很高。高分辨熔解曲线分析技术虽然试剂成本低，但荧光染料是非特异性的显示，先期的反 应条件优化、不同的更加昂贵的仪器和操作者的经验往往决定结果的成败。
[0016] 因此，如何对ALDH2基因 rs671多态性位点进行简单准确的检测，成为人们亟待解 决的问题。
【发明内容】
[0017] 鉴于此，本发明提供了一种检测乙醛脱氢酶2基因 rs671多态性位点的引物、试剂 盒及其PCR方法，以至少解决以往试剂盒存在的结果判读复杂、检测仪器价格高，操作难度 大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床普及程度低，不能同时大规模检测临床标 本等一个或多个问题。
[0018] 本发明提供的方案具体为：一种检测乙醛脱氢酶2基因 rs671多态性位点的引物， 其特征在于，所述引物包括：野生型特异性上游引物、突变型特异性上游引物和野生型特异 性上游引物与突变型特异性上游引物共用的下游引物； 且所述野生型特异性上游引物具有SEQ No. 17序列，所述突变型特异性上游引物具有 SEQ No. 14序列，所述共用的下游引物具有SEQ No. 16序列。
[0019] 本发明一方面还提供了一种检测乙醛脱氢酶2基因 rs671多态性位点的试剂，其 特征在于：所述试剂含有上述的引物。
[0020] 本发明另一方面还提供了一种检测乙醛脱氢酶2基因 rs671多态性位点的试剂 盒，其特征在于：所述试剂盒也含有上述的引物。
[0021 ] 优选，所述试剂盒中还包括与所述引物配合使用的探针，其中，所述探针为Taqman 探针，具有SEQ No. 15序列。
[0022] 进一步优选，所述试剂盒还包括PCR反应管、dNTPs和Taq酶混合液、PCR缓冲液、 检测管家基因 GAPDH的上游引物、检测管家基因 GAPDH的下游引物和检测管家基因 GAPDH 的探针、阳性质控品和空白对照； 所述检测管家基因 GAPDH的上游引物具有SEQ No. 19序列；所述检测管家基因 GAPDH 的下游引物具有SEQ No. 20序列；所述检测管家基因 GAPDH的探针具有SEQ No. 21序列。
[0023] 进一步优选，所述突变型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述 检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基 因 GAPDH的探针被预先包被于A型PCR反应管内；以及与所述野生型特异性上游引物、所 述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物 、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针被预先包被于G型PCR反应管内。
[0024] 进一步优选，所述A型PCR反应管内突变型特异性上游引物、所述共用的下游 引物、所述探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游 引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针浓度分别为50nM-2um、50nM-2uM、50nM-400nM、 lpm_20pm、lpm_20pm、0. 05pm_5pm ;以及所述G型PCR反应管内野生型特异性上游引物、 所述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基 因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针浓度分别为50nM-2um、50nM-2uM、 50nM_400nM、lpm_20pm、lpm_20pm、0· 05pm_5pm。
[0025] 更进一步优选，所述A型PCR反应管内突变型特异性上游引物、所述共用的下游 引物、所述探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引 物和所述检测管家基因 GAPDH的探针浓度分别为500nM、500nM、100nM、5pm、5pm、2. 5pm ;以 及所述G型PCR反应管内野生型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检 测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH 的探针浓度分别为 500nM、500nM、100nM、5pm、5pm、2. 5pm。
[0026] 本发明还提供了上述引物及试剂盒的PCR方法，其特征在于：PCR反应按两步扩增 循环程序进行，且第一步扩增的循环数小于第二步扩增的循环数，所述第一步扩增的退火 温度高于所述第二步扩增的退火温度。
[0027] 优选，所述PCR反应的条件为：37°C 2min，95°C 2min预变性；第一步扩增，95°C 变性 5s，55°C~68°C 退火 32s，循环 10~15 次；第二步，95°C 变性 5s，50°C~65°C 退火、 延伸32s，循环30~50次，收集荧光信号；进一步优选，所述PCR反应的条件为：37°C 2min， 95°C 2min预变性；第一步扩增，95°C变性5s，63°C退火32s，循环15次；第二步，95°C 变性5s，60°C退火、延伸32s，循环40次，收集荧光信号。
[0028] 本发明提供的检测乙醛脱氢酶2基因 rs671多态性位点的引物及其试剂盒，能够 大大增加等位基因特异性引物PCR区分不同等位基因位点的能力，使不同位点间的非特异 性交叉扩增的可能性降到最低，能够做到真正"全或无"式的扩增，不仅有很好的特异性，也 具有非常好的灵敏度，能检出Ing基因组DNA中的基因型分布情况。
[0029] 本发明提供的检测乙醛脱氢酶2基因 rs671多态性位点的引物及其试剂盒，具有 以下优点： 1)通过对引物序列上的人为改变使检测结果真正做到对结果"全或无"判断，大大简化 了结果判读的难度，降低了出错的可能，为科研和临床应用提供了便利。
[0030] 2) T aq酶与dNTPs的混合，保障了 dNTPs的稳定性，使其可经受多次反复冻融的 考验。
[0031] 3)提前预配好可直接使用的缓冲液，使用者更加方便。
[0032] 4)引物和探针提前包被在PCR反应管内，避免了操作者出现位点配错的可能，而 且也节约了大量操作时间。
[0033] 5)本发明中引物和试剂盒具有特异性好，检测的灵敏度高，检测速度快，整个过程 能在1小时20分钟内完成。
[0034] 6)试剂盒内仅用一条常规Taqman探针，别无其他诸如封闭探针，降低成本。
[0035] 7)该试剂盒具有检测简单、快速、准确、价廉等优点。
【附图说明】
[0036] 图1为设计野生型和突变型引物时的PCR扩增曲线图； 图2为A位点的PCR扩增曲线图； 图3为G位点的PCR扩增曲线图； 图4为AG位点的PCR扩增曲线图； 图5为管家基因 GAPDH的PCR扩增曲线图。
【具体实施方式】
[0037] 下面以具体的案例对本发明进行进一步解释，但并不用于限制本发明的保护范 围。
[0038] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段， 所用产品均为市购。
[0039] 以下定义是本发明中相关术语的解释： "等位基因"一般是指DNA区段，同源染色体上的相同物理位置上，控制相对性状的一 对基因。在一些情况下，等位基因可以对应于特定物理基因座上的单核苷酸的替换。在其 它情况中，等位基因可以对应于核苷酸（单个或多个）插入或缺失。
[0040] "等位基因特异性引物"是指与目标等位基因的序列互补，在PCR时能够延伸完成 特异的PCR反应。等位基因特异性引物可以设计成能检测出靶序列中少至1个核苷酸差异 十分特异的引物，该引物可以包含等位基因特异性核苷酸部分、3'端靶标特异性部分和尾 巴。
[0041] "MGB基团"是指小沟结合剂。当与寡核苷酸的3'末端缀合时，MGB基团能够作为 不可延伸的封闭部分发挥作用。MGB是能结合于双链DNA的小沟内的分子，通常采用DPI3 (其合成方法参见美国专利号6, 084, 102 ;和6, 727, 356)。
[0042] "检测探针"是指：指示扩增的多种信号传导分子中的任意一种。例如，SYBR Green 和其它DNA结合染料都是检测探针。一些检测探针可以是序列特异性的，例如Taqman探 针（美国专利号5, 538, 848)，多种茎环分子信标（美国专利号6, 103, 476和5, 925, 517 以及 Tyagi and Kramer，Nature Biotechnology，1996,14:303-308)，无莖的或线性信标 (W099/21881)，PM Molecular Beacons TM(美国专利号 6, 355, 421 和 6, 593, 091)，线性 PNA 信标（Kubista 等人，2001，SPIE4264 :53-58)，非-FRET 探针（美国专利号 6, 150,097)， Sunrise/Amplifluor探针（美国专利号6, 548, 250)，莖环和双链Scorpion TM探针 (Solinas 等人，2001，NucleicAcidsResearch29 :E96 和美国专利号 6, 589, 743)，鼓起的 环探针（美国专利号6, 590, 091)，假结探针（美国专利号6, 589, 250)，cycliC〇n(美国专 利号 6,383, 752)，MGB Eclipse TM 探针（Epoch Biosciences)，发夹探针（美国专利号 6, 596, 490)，肽核酸（PNA)探针。检测探针可以包含焚光报告分子，例如，6-羧基焚光素 (6-FAM)或四氯荧光素（TET)，和淬灭分子部分，例如四甲基若丹明（TAMRA)，Black Hole QuencheRS (Biosearch)，Iowa Black (IDT)，QSY 猝灭剂（Molecular Probes)和 Dabsyl 和 Dabcel磺酸盐/羧酸盐猝灭剂（Epoch)。
[0043] "共用特异性引物"是指在PCR反应中与等位基因特异性引物配对的引物，它能同 不同位点的等位基因特异性引物配对使用。
[0044] "热稳定性的聚合酶"是指对热稳定性的或热抗性的酶，主要指DNA聚合酶，该酶在 PCR扩增时，在升高的温度条件下不会发生失活。
[0045] 寡核苷酸的"Tm"或"熔解温度"是指一段DNA中50%的分子与互补序列杂交时 的温度。Tm值可以使用熟知的公式来计算（见，Maniatis，T.等人：Molecular cloning， Cold Spring Harbor, N.Y. :1982)〇
[0046] "灵敏度"是指能够被检出模板的最小量（拷贝数）。
[0047] "特异性"是指区分匹配模板和错配模板的能力。特异性经常表示为Λ Ct = Ct错 配-Ct匹配。
[0048] "选择性"是指AS-PCR测定可用于测定混合物中的少数（通常是突变）等位基因 而无来自多数（经常是野生型）等位基因的干扰的程度。选择性经常表示为比例或百分率。 例如，能够在存在100个野生型模板的情况下检出1个突变模板的测定被称作具有1 : 100 或1%的选择性。
[0049] "Ct"值是指循环阈值，代表PCR扩增曲线由基线变为指数增长拐点时的循环数。
[0050] "德尔塔Ct"或"Act"是指信号通过固定阈值时，两个不同样品或反应之间的循 环数差异。ACt是达到指数扩增时，两个不同样品或反应之间的循环数差异。ACt可用于 鉴定匹配引物与错配引物之间的特异性。
[0051] 本发明涉及快速检测ALDH2基因 rs671多态性位点的引物和试剂盒。具体地讲， 本发明是基于Past-PCR (Perfect allele-specific Taqman PCR)方法的基础上，成功应 用于ALDH2基因 rs671的多态性位点检测。所谓Past-PCR是由检测基因多态性位点或突 变的高特异性AS-PCR方法和Taqman探针的荧光PCR技术结合而成，其仅用一条Taqman探 针，在多数的情况下，这条探针为常规的Taqman探针，仅在部分基因中因富含AT碱基的特 殊序列，采用Taqman-MGB或LNA等探针，除此之外无需任何额外的封闭探针或报告探针， Past-PCR方法将AS-PCR和Taqman荧光PCR两种方法完美结合，并使两者的优点得到了极 度的发挥，具体表现在AS-PCR方法中，在不增加任何成本的情况下，靠引物设计和独特的 验证方法成功消除了非特异性扩增，使得结果判断呈现出"全和无"方式，即有就有，没有就 没有，使得结果的判断简单而准确，这是对过去的AS-PCR方法最大的改进，也是对AS-PCR 方法为人所诟病的有效弥补，从而将AS-PCR方法的优点发挥到了极致，是该方法所能达到 的最高境界。众所周知，Taqman焚光PCR具有密闭性检测无需反应完结后的处理，不仅节 省了时间，而且减少了 PCR产物污染的风险，探针的第二次识别靶序列保障了检测的特异 性和可靠性，还可用于对基因的定量检测，达到了临床使用标准等优点。Past-PCR方法具有 AS-PCR方法和Taqman荧光PCR方法的双重优点，并且是这两种方法结合在一起时，检测组 份所能达到的最简化构成，因此，我们将其称作为完美的等位基因特异性Taqman PCR。
[0052] 基于Past-PCR方法，发明了用于检测基因 ALDH2基因 rs671多态性位点的试剂 盒，其基本组成为：(a)高度特异的等位基因特异性引物；(b)荧光检测探针；（c)与等位基 因特异性引物配对的另一条特异性引物。
[0053] 其中，本发明提供的检测乙醛脱氢酶2基因 rs671多态性位点的引物，包括：野生 型特异性上游引物、突变型特异性上游引物和野生型特异性上游引物与突变型特异性上游 引物共用的下游引物； 且所述野生型特异性上游引物具有SEQ No. 17序列，所述突变型特异性上游引物具有 SEQ No. 14序列，所述共用的下游引物具有SEQ No. 16序列。
[0054] 同时还提供了含有上述引物的检测试剂和试剂盒，以解决以往检测乙醛脱氢酶2 基因 rs671多态性位点存在操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床普及 程度低，不能同时大规模检测临床标本等问题，实现了检测简单、快速、准确、廉价的理想要 求，为科研和临床基因型和基因突变分析提供了强有力的工具。
[0055] 优选，所述试剂盒中还包括与所述引物配合使用的探针，其中，所述探针为Taqman 探针，具有SEQ No. 15序列，整个试剂盒中仅使用一条探针，别无其他诸如封闭探针等，降低 试剂盒的成本。
[0056] 进一步优选，所述试剂盒还包括PCR反应管、dNTPs和Taq酶混合液、PCR缓冲液、 检测管家基因 GAPDH的上游引物、检测管家基因 GAPDH的下游引物和检测管家基因 GAPDH 的探针、阳性质控品和空白对照； 所述检测管家基因 GAPDH的上游引物具有SEQ No. 19序列；所述检测管家基因 GAPDH 的下游引物具有SEQ No. 20序列；所述检测管家基因 GAP DH的探针具有SEQ No. 21序列；其 中，将dNTPs和Taq酶混合，能够保障dNTPs的稳定性，使其可经受多次反复冻融的考验；检 测管家基因 GAPDH的上游引物、下游引物和探针是用于作为内参照，为防止检测时出现假 阴性；阳性质控品为AG型人基因组DNA ;空白对照为灭菌超纯水。
[0057] 进一步优选，所述突变型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述 检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基 因 GAPDH的探针被预先包被于A型PCR反应管内；以及与所述野生型特异性上游引物、所 述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针被预先包被于G型PCR反应管内，按最 佳的反应用量预先包被在PCR反应管中，每一个反应管中实际包被六条寡核甘酸，即一条 针对等位基因的一种特异性上游引物、一条探针(通常为Taqman探针)、一条共用特异性下 游引物、一条检测管家基因 GAPDH的上游引物、一条检测管家基因 GAPDH的下游引物和一条 检测管家基因 GAPDH的探针。这样为了检测一个位点不同的基因多态性，常需要分别包被 两管或两管以上的PCR反应管，它们中探针、共用特异性下游引物、检测管家基因 GAPDH的 上游引物、检测管家基因 GAPDH的下游引物和检测管家基因 GAPDH的探针是一样的，不同的 仅是鉴定等位基因不同型别的特异性上游引物，这样预先包被避免了操作者出现位点配错 的可能，而且节约了大量操作时间。
[0058] 进一步优选，所述A型PCR反应管内突变型特异性上游引物、所述共用的下游 引物、所述探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游 引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针浓度分别为50nM-2um、50nM-2uM和50nM-400nM、 lpm-20pm、lpm-20pm、0. 05pm_5pm ;以及所述G型PCR反应管内野生型特异性上游引物、所 述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针浓度分别为50nM-2um、50nM-2uM和 50nM-400nM、lpm-20pm、lpm-20pm、0· 05pm-5pm。最优为，所述 A 型 PCR 反应管内突变型特 异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所 述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针浓度分别为500nM、 500nM和100nM、5pm、5pm、2. 5pm ;以及所述G型PCR反应管内野生型特异性上游引物、所 述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针浓度分别为500nM、500nM和ΙΟΟηΜ、 5pm、5pm、2. 5pm〇
[0059] 由于在等位基因特异性引物内引入了错配的碱基，使其在反应时的效率下降，不 同的引物下降程度不同，通常要增加10至20个循环才能达到没有错配时的效果，保证检 测的灵敏度，优选PCR反应按两步扩增循环程序进行，且第一步扩增的循环数小于第二步 扩增的循环数，所述第一步扩增的退火温度高于第二步扩增的退火温度，第一步扩增使用 较高退火温度，第二步扩增使用较低退火温度，目的是增加第一步扩增时引物退火时的特 异性，从而保证Past-PCR检测高度特异性的目的；具体而言优选所述PCR反应的条件为： 37°C 2min，95°C 2min 预变性；第一步扩增，95°C 变性 5s，55°C~68°C 退火 32s，循环 10~15次；第二步，95°C变性5s，50°C~65°C退火、延伸32s，循环30~50次，收集荧光信 号；更为优选PCR反应的条件为：37°C 2min，95°C 2min预变性；第一步扩增，95°C变性 5s，63°C退火32s，循环15次；第二步，95°C变性5s，60°C退火、延伸32s，循环40次，收 集荧光信号。
[0060] 具体的检测过程为： 1) 将待检测样品分别放入预先分别包被有野生型特异引物、共用的下游引物、探针、检 测管家基因 GAPDH的上游引物、检测管家基因 GAPDH的下游引物和检测管家基因 GAPDH的 探针以及突变型特异引物、共用的下游引物、探针、检测管家基因 GAPDH的上游引物、检测 管家基因 GAPDH的下游引物和检测管家基因 GAPDH的探针两组PCR反应管内，并加入PCR 缓冲液、dNTPs和Taq酶混合液、灭菌超纯水和基因组DNA，盖紧管盖，在荧光定量PCR仪上 进行反应，并收集荧光信号； 2) 如果检测样本仅有突变型反应管在FAM通道有对数增长的扩增曲线，同时VIC通道 有对数增长的扩增曲线，可判定样本为A型，即突变型纯合子； 如果检测样本仅有野生型反应管在FAM通道有对数增长的扩增曲线，同时VIC通道有 对数增长的扩增曲线，可判定样本为G型，即野生型纯合子； 如果检测样本突变型和野生型反应管在FAM通道均有对数增长的扩增曲线，同时VIC 通道有对数增长的扩增曲线，可判定样本为AG型，即杂合子； 如果检测样本突变型和野生型反应管在FAM通道均无对数增长的扩增曲线，可能样本 或操作存在问题，或者样本DNA浓度过低，应重新提取样本DNA进行试验。
[0061] 下面详述检测过程中各组份介绍： (一）等位基因特异性引物： 等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分互补于基因的一个等位基因位点， 但不互补于该基因的另一个等位基因位点。通常而言，等位基因特异性引物的等位基因特 异性核苷酸部分位于等位基因特异性引物的3'端的末位碱基。在某些情况下，等位基因特 异性核苷酸部分也可位于等位基因特异性引物3'末端的其他碱基位置。
[0062] 在一些情况下，等位基因特异性引物除3'末端互补于等位基因位点有所变化外， 我们常常要在引物的其他位置引入错配的碱基，如在引物3'端倒数第二位或第三位引入碱 基错配，或第二和第三位的连续错配；针对不同的SNP或突变位点，在引物3'端倒数第二位 或第三位引入碱基错配的基础上，还可在引物的其它位点增加碱基错配来满足反应特异性 的要求，越远离3'端，增加错配的碱基数越多，在5'端可达最多。等位基因特异性引物的 长度主要依据其T m值来决定，通常而言其T m值比PCR循环的退火温度低大约5-20°C。
[0063] 两条检测对应基因多态性的等位基因特异性上游引物，除3'端检测的位点其碱基 不同外，其余序列尽可能相同，二条引物的Tm值也尽可能一致。
[0064] 低Tm的等位基因特异性引物（ASP)有更高的特异性。一般情况下，等位基因特异 性引物为短寡核苷酸，其长度是大约15-30,其Tm是大约40 °C至60 °C，比扩增过程中使用的 PCR循环条件的退火/延伸温度低大约5°C至20°C。
[0065]由于等位基因特异性引物的设计和筛选十分重要，好的引物需要从众多待选的 引物中选出，因此我们建立了一个筛选的方法，其等位基因特异性引物的具体筛选过程如 下： ⑴设计外围引物及PCR扩增：首先在待检基因突变点或SNP位点的上下游，设计一对 PCR扩增引物，然后用该对引物，对目的基因进行常规的PCR反应，其中扩增片段长度可在 几十至数千碱基对，优选长度为200至500碱基对； ⑵克隆PCR产物：将扩增出的PCR产物，利用AT克隆的方法，重组到普通的T载体质粒 中，得到重组质粒，其中得到的重组质粒可以进行测序验证，从而确保PCR产物的正确性； ⑶构建重组突变体：根据生物信息学所提供的信息，采用分子克隆技术，将突变体的序 列，构建至上述得到的重组质粒中，将构建的重组突变体进行测序验证序列，从而确保其正 确性； ⑷设计及筛选突变位点特异性引物：设计两条等位基因特异性引物，一条引物的3'端 同突变序列互补，另一条引物的3'端同正常序列互补；然后分别用等位基因特异性引物和 对应的常规PCR共同下游引物配对，以上述构建好的重组突变体作为反应模板，利用荧光 定量PCR仪，对反应体系，进行筛选；其中，反应可采用荧光染料，如SYBR GREEN，也可采用 特异性的Taqman荧光探针，按照所加样品量为0. 1微克全基因组DNA的标准进行筛选，其 具体的筛选内容如下： (a)设定PCR反应条件：首先设定PCR反应的退火温度完全一致，具体温度为55°C~ 68°C，PCR循环次数为40次，PCR反应的酶和缓冲体系均优化后固定不变，此反应条件的设 定是为了方便同时检测多种基因突变； (b)特异性筛选：采用突变型的引物以野生型的重组质粒为模板，筛选出的引物其Ct 大于40 ; 其中循环阈值的确定原因如下，突变型引物在野生型模板发生非特异性扩增比野生型 引物在野生型模板发生特异性扩增多19个循环，按照临床实际检测时，所加样品量为0. 1 微克全基因组DNA的标准，我们通过下列公式，拷贝数=(DNA量ngX6. 022X IO23V(长度 bp X IO9X 660)，其中全基因组DNA的长度为30亿对碱基，因此0. 1微克全基因组DNA的拷 贝数为：3. 09 X 104,反映在荧光定量PCR的Ct (定量循环阈值）大概为21，这样我们得到 第二个筛选指标，即用突变型的引物，在野生型的重组质粒为模板时，所得的Ct应该大于 40,方能保证检测不会出现假阳性，两者的扩增效率相差为40-21=19个循环，即扩增效率 相差19个循环以上，将成为我们判断等位基因特异性引物特异性好坏的客观指标。我们知 道当引物3'端与模板错配时，延伸效率将下降IO 3-IO6 6倍，换算成反应循环数则下降约13 至27个循环，这就是我们能筛选出理想引物的理论依据，因为不进行引物筛选，19-13=6个 循环，势必产生假阳性，该引物的特异性就不好，而19-27=-8,不可能产生假阳性，有8个循 环数的范围供我们对引物进行筛选。按照这一要求，我们设计一系列等位基因特异性引物， 从长短上、从靠近3'端人为引入碱基错配上着手，加上其配对的下游引物，利用构建好的野 生型和突变型重组质粒，分别进行荧光定量PCR反应的交叉筛选，即当用突变引物与野生 型的模板进行扩增时，与用野生型引物同野生型模板的反应要多用19个循环数以上，反之 亦然，那么这样的引物就具备高度的特异性。
[0066] (C)敏感性筛选：将筛选出的特异性引物用与重组突变型质粒作敏感性试验，将检 测灵敏度小于10-1000个拷贝的特异性引物筛选出来，即为所需的突变特异性引物。
[0067] 通过以上几方面的筛选，所得到的等位基因特异性引物将具备高度特异性和高度 敏感的理想引物。
[0068](二）检测探针： 在一些情况下，检测探针的！^直大约为60°C至70°C，最佳为65°C，探针长度根据其T m 值决定。尽管有多种不同形式的探针可供选择，Taqman探针（Applied Biosystems，Foster City)常常是首选。在一些特殊的情况下，如检测序列中AT含量过高，可以采用提高^值 的Taqman-MGB等类型的探针。
[0069] 共用的特异性引物，在一些情况下，共用的特异性引物的Tm值大约为50°C至 70 °C，最佳为60 °C，其长度由其Tm值决定，一般在15-25碱基之间。
[0070] (三）其他成分： 本发明使用的DNA聚合酶是Taq酶，及其突变体、衍生物或片段，也可是其他的耐热DNA 聚合酶，在一些情况下，也可采用Hotstart Taq酶，以增加反应的特异和高效性。
[0071] 本发明中所提供的针对ALDH2基因所提供的引物和试剂盒，主要是针对等位基因 特异性引物PCR扩增法的缺点，利用分子克隆技术，事先分别构建含待检基因野生型和突 变型的重组质粒，以此重组质粒为阳性模板，筛选确定特异地分别与3'末端突变位点或野 生位点碱基互补的两条特异引物，一旦筛选出的特异引物序列，将是我们检测体系的关键 元素。本发明的上述产品，可用于任何型号的荧光定量PCR仪，试剂成本同如今市面上的荧 光定量PCR试剂相当，因此较好地克服了其他采用等位基因特异性引物PCR扩增法的不足。
[0072] 本发明的优点在于：所述的试剂盒具有操作简单，成本低，结果判断简单容易，灵 敏度高，本试剂盒检测基因突变灵敏度可以达到1% (即目的基因的突变基因 DNA模板数占 野生型DNA模板数的1%);而直接测序中检测基因突变的灵敏度为20% (即目的 基因的突变 基因 DNA模板数占野生型DNA模板数的20%) Jaqman探针技术保障了试剂盒的检测为闭 管反应，有效的避免了假阳性的产生，其检测特异性也充分得到保证，而且检测快速方便， 整个检测过程只有80分钟，而直接测序则需要2天的时间，而且是开管操作，PCR产物污 染的可能性大增。
[0073] 本发明中PCR (Past-PCR)的实施步骤： 1.阳性质粒的构建 在待检测的ALDH2基因 rs671多态性位点的上下游设计一对PCR引物，其扩增片段 的长度可在500bp的范围内，用gDNA为模板，采用常规PCR方法，扩增出这一片段，通过 AT克隆的方式，将该片段克隆至测序的质粒中，通常用Invitrogen的pCR2.1 Topo T载 体试剂盒，操作按说明书进行，也可用其他厂家的T载体试剂盒，甚至可用自己制备的T载 体质粒。得到的阳性克隆，经测序验证，证明序列的正确性，然后采用Stratagene公司的 Quickchange试剂盒，设计对应位点的另一个基因型引物，通过Quickchange的方法，得到 该突变型别的阳性克隆，操作按说明书进行，所得到的阳性质粒都必须经测序验证为正确 方可进入下一步的使用。Taqman定量质粒，并用作模板以验证给定的测定法的灵敏性、线性 动态范围、特异性。
[0074] 2.等位基因特异性引物（ASP)的设计和筛选 在引物3'末端互补于对应的基因突变碱基位点，而在引物3'末端倒数第二位或第三 位引入碱基错配，或第二和第三位的连续错配；针对不同的SNP或突变位点，在引物3'端倒 数第二位或第三位引入碱基错配的基础上，还可在引物的其它位点增加碱基错配来满足反 应特异性的要求，越远离3'端，增加错配的碱基数越多，在5'端可达最多的等位基因1特 异性引物。
[0075] ASP的筛选是利用构建好的野生型和突变型重组质粒，分别进行荧光定量PCR反 应的交叉筛选，即当用突变引物与野生型的模板进行扩增时，与用野生型引物同野生型模 板的反应要多用19个循环数以上，反之亦然，那么这样的引物就具备高度的特异性。将筛 选出的特异性引物用与对应的重组质粒作敏感性试验，检测灵敏度小于10-1000个拷贝的 引物即达到检测的灵敏度要求，满足上述两个条件的引物就是我们选出的ASP引物，可进 行下一步的检测。
[0076] 3.扩增试剂准备及加入被检测样品 (1)从试剂盒中取出各组成成分，室温缓慢融化PCR缓冲液、dNTPs和Taq酶混合液、阳 性质控品、空白对照，颠倒摇匀。每个反应管需加入PCR缓冲液、Taq酶（dNTPs )、灭菌超纯 水和DNA样本。盖紧管盖，瞬时离心后转移到PCR扩增区。
[0077] (2)建议每次PCR反应均同时进行样本、阳性质控品、空白对照的分析，阳性质控 品和空白对照的加样方法同样本加入方法。
[0078] 4.反应条件 每个反应管中（反应终体积的范围可在10-50 μ 1，最佳在20-25 μ 1反应体积）包含 PCR缓冲液（IOmM Tris-HCl ρΗ8· 3, 50mM KC1, 0· l%Triton X-100,2. OmM MgCl2)，IO-IOOng DNA或1，000, OOO个拷贝的质粒DNA，50nM-400nM -个共同的通用特异性Taqman探针，一 个50nM-2uM共同的通用反向特异性下游引物，50nM-2uM不同等位基因特异性上游引物， lpm-20pm检测管家基因 GAPDH的上游引物，Ipm-20pm检测管家基因 GAPDH的下游引物， 0· 05pm-5pm检测管家基因 GAPDH的探针，再加上L 5单位Taq聚合酶，200 μ M dNTPs。
[0079] I )、循环条件设置
为使荧光曲线更加美观，建议从第二步开始收集荧光信号。
[0080] 2)、仪器检测通道选择
荧光信号采集温度设为60°C，具体设置方法请参照相应仪器使用说明书。
[0081] 3 )、检测类型设定：空白对照设为" NTC "，阳性质控品和待检样本设为 "Unknown"。
[0082] 5.结果分析 如果检测样本仅有突变型反应管在FAM通道有对数增长的扩增曲线，同时VIC通道有 对数增长的扩增曲线，可判定样本为A型，即突变型纯合子；如果检测样本仅有野生型反应 管在FAM通道有对数增长的扩增曲线，同时VIC通道有对数增长的扩增曲线，可判定样本为 G型，即野生型纯合子；如果检测样本突变型和野生型反应管在FAM通道均有对数增长的扩 增曲线，同时VIC通道有对数增长的扩增曲线，可判定样本为AG型，即杂合子；由于本方法 结果是"全或无"，结果极易判断，哪一个管有反应，哪一个管就是阳性。 具体实施例
[0083] 下面以对ALDH2 (乙醛脱氢酶2)基因 rs671多态性位点突变检测的情形为例，具 体对本发明作进一步详细的说明。
[0084] 实施例1 :针对ALDH2 (乙醛脱氢酶2)基因 rs671多态性检测的野生型和突变型 阳性质粒的制备 首先我们从基因库中调出ALDH2基因 rs671多态性位点前后的基因序列，并将多态性 位点用双下划线标记，在ALDH2基因 rs671多态性位点的上下游适当位置(用黑体字和下 划线标示)，设计一对克隆引物，扩增片段为274bp，突变位点包含其内，基因序列显示如下， SEQ No. 1 ： gggcaacagagaaagattctatctcaaaaaaaaaaatttttttttaagttaaaaataaaataaagactttggg gcaatacagggggtcctgggagtgtaacccataacccccaagagtgatttctgcaatctcgtttcaaattacagggt caactgctatgatgtgtttggagcccagtcaccctttggtggctacaagatgtcggggagtggccgggagttgggcg agtacgggctgcaggcatacactgaagtgaaaactgtgagtgtgggacctgctgggggctcagggcctgttggggct tgagggtctgctggtggctcggagcctgctgggggattggggtctgttgggggctcggggcctgccagaggttcagg acctgccggggactcagggcctgctggaagttcaggacctgctggggatcagggcctgccagggatttagggtct 实验步骤如下： 1)提取基因组DNA 用国内天根公司或Qiagen公司的基因组DNA提取试剂盒，提取基因组DNA，具体操作步 骤按说明书进行。制备好的DNA标本，经紫外分光光度计测定浓度，将其浓度调整到50ng/ μ 1，保存于_20°C，或直接进行下面的反应。
[0085] 2) AT克隆获得阳性质粒 首先在突变点上下游设计克隆引物，见表1 : 表1. ALDH2基因 rs671多态性位点野生型克隆引物
在 12·5μ1 的 2XPCR Master Mix (Fermentas)的 PCR 扩增体系，加入 ΙΟμΜ 上游引 物和10 μ M下游引物，以及基因组DNA50ng，加水至总体积25 μ 1，PCR反应条件设定为95°C 预变性3min，95°C变性10s，60°C退火及延伸30s，总共35个循环，反应结束后取15 μ 1反 应产物，进行浓度2. 5%的凝胶电泳，电泳结束后观察，条带与预测的大小相符，表明扩增成 功。采用美国Life公司的pCR2.0 TOPO T载体，按其操作说明，通过TA克隆的方式，获得 ALDH2基因的rs671位点野生型阳性质粒，具体的基因序列如下，其中多态性位点显示为G 型，说明为野生型，测序证明所获质粒正确。
[0086] SEQNo. 4 ：gggggtcctgggagtgtaacccataacccccaagagtgatttctgcaatctcgtttcaaat tacagggtcaactgctatgatgtgtttggagcccagtcaccctttggtggctacaagatgtcggggagtggccggga gttgggcgagtacgggctgcaggcatacact_gaagtgaaaactgtgagtgtgggacctgctgggggctcagggcctg ttggggcttgagggtctgctggtggctcggagcctgctgggggattggggtctgttggg 3)快速突变法获得突变质粒 然后，采用产生快速突变的方法（Quickchange，QC)，设计突变引物，引物序列见表2. 表2.获得ALDH2基因的rs671多态性位点突变型克隆引物
按照（Stratagene公司）Quickchange试剂盒的反应条件和步骤，完成突变体的构建， 所得到的重组质粒，具体的基因序列如下，经测序验证其中多态性位点显示为A型，为突变 型，然后将突变型与野生型质粒分别置_20°C保存备用。
[0087] SEQ No. 7 ：gggggtcctgggagtgtaacccataacccccaagagtgatttctgcaatctcgtttcaaa ttacagggtcaactgctatgatgtgtttggagcccagtcaccctttggtggctacaagatgtcggggagtggccggg agttgggcgagtacgggctgcaggcatacactaaagtgaaaactgtgagtgtgggacctgctgggggctcagggcct gttggggcttgagggtctgctggtggctcggagcctgctgggggattggggtctgttggg 实施例2 :等位基因特异性引物（ASP)的设计和特异性筛选 针对ALDH2基因 rs671多态性位点，设计野生型和一系列突变特异型引物如下： ALDH2 基因的 rs671_WT_F: gggctgcaggcatacagtg (SEQ Νο·8) ALDH2 基因的 rs671-mut_F: gggctgcaggcatacagta (SEQ Νο·9) ALDH2 基因的 rs671-mut_Fl: ggctgcaggcatacagta (SEQ Νο.10) ALDH2 基因的 rs671-mut_F2: gctgcaggcatacagta (SEQ No.ll) ALDH2 基因的 rs671-mut_F3: gctgcaggcatacacaa (SEQ No.12) ALDH2 基因的 rs671-mut_F4: ggctgcaggcatacacaa (SEQ No.13) ALDH2 基因的 rs671-mut_F5: gggctgcaggcatacacaa (SEQ No.14) 同时设计合成Taqman特异性探针： SEQ No. 15 ：FAM-cctgttggggcttgagggtc-BHQl〇
[0088] 相关引物和探针在生工生物工程(上海）有限公司进行合成。
[0089] 然后分别用上述7条引物与ALDH2基因的共同下游引物rs671-R: 5'-cccaacagaccccaatc-3'（SEQNo·16)引物配对，加上Taqman特异性探针，加入前述构 建所得到的野生型重组质粒约3万个拷贝为模板，在荧光定量PCR仪上进行引物特异性筛 选，反应条件设定为第一步95°C 2min预变性，95°C 5s，63°C 30s共15个循环，不收集荧 光信号，第二步95°C 5s，60°C 30s共40个循环，收集荧光信号，结果见图1。
[0090] 其中，图 1 中 1~7 曲线分别代表 rs671-WT-F、rs671-mut-F、rs671-mut-Fl、 rs671-mut-F2、rs671-mut-F3、rs671-mut-F4、rs671-mut-F5 的 PCR扩增曲线，从图 2 中我们 看出1号野生型引物在15. 5个循环产生扩增信号，2-6号引物的特异性较差，分别在17-19 个循环左右产生非特异性扩增，同野生型引物（1号）扩增效率相差小于19个循环，第7号 引物满足我们的要求，在40个循环时，仍然没有扩增，同野生型引物扩增效率相差大于19 个循环。为了与突变引物有更好的可比性，我们参照第7号引物重新设计野生型的引物为： gggctgcaggcatacacag (SEQ No. 17)〇
[0091] 即最终设计筛选的引物： 野生型上游引物：gggctgcaggcatacacag (SEQ No. 17) 突变型上游引物：gggctgcaggcatacacaa (SEQ No . 14) 实施例3 :ASP灵敏度筛选 再用突变型引物分别同ALDH2基因 rs671多态性位点的共同下游引物SEQ No. 16配 对，用突变型重组质粒，按照1〇6,1〇5,1〇4,1〇3,1〇 2,10, 〇作梯度稀释，加上Taqman特异性探 针，在荧光定量PCR仪上进行灵敏度验证。突变特异型引物能检测出100个拷贝的突变体， 因此这一引物就是按我们的方法筛选出检测ALDH2基因 rs671多态性位点的最佳引物，见 表3所示。
[0092] 实施例4 :预制的本发明PCR (Past-PCR)反应管 按照每个突变位点两个反应管的要求，即一管检测野生型位点，另一管检测突变位点， 将适宜浓度的引物探针预先包被于0. 2ML乳白色的PCR反应管中。
[0093] 为了防止检测时出现假阴性，在每个反应管中均预先包被有检测管家基因 GAPDH 的上游引物、下游引物和探针，其中，GAPDH基因序列如下： cctccgggaaactgtggcgtgatggccgcggggctctccagaacatcatccctgcctctactggcgctgcc aaggctgtgggcaaggtcatccctgagetgaacgggaagctcactggcatggccttccgtgtccccactgccaacg tgtcagtggtggacctgacctgccgtctagaaaaacctgccaaatatgatgacatcaagaaggtggtgaagcaggcg tcggagggccccctcaagggcatcctgggctacactgagcaccaggtggtctcctctgacttcaacagcgacaccca ctcctccacctttgacgctggggctggcattgccctcaacg (SEQ No. 18) 检测管家基因 GAPDH的上游引物序列为：ggctgtgggcaaggtcatc (SEQ No. 19) 检测管家基因 GAPDH的下游引物序列为：ctccgacgcctgcttcaccac(SEQ Νο·20) 检测管家基因 GAPDH 的探针序列为：ccttccgtgtccccactgccaacgt(SEQ No. 21) 其中，检测管家基因 GAPDH的探针5 '端用HEX荧光标记，3 '端用BHQ标记，由于HEX和 VIC属于同一通道检测，而许多仪器往往采用VIC标示，因此文中用VIC叙述。
[0094] PCR反应管中具体的细节见表3。
[0095] 表3.预制ALDH2基因 rs671多态性位点Past-PCR反应管的组分和浓度
由于我们预先把突变型和野生型上游引物、探针、共同下游引物、检测管家基因 GAPDH 的上、下游引物和检测管家基因 GATOH的探针包被在编好号的不同反应管中，有效避免了 使用者的操作误差，同时大大提高了操作效率，极大方便了在临床上的实际使用。
[0096] 实施例5 :标本的验证 采集正常人群的外周血或口腔脱落细胞标本，并用Qiagen公司的基因组DNA提取试剂 盒，提取基因组DNA，具体操作步骤按说明书进行。制备好的DNA标本，经紫外分光光度计测 定浓度，将其浓度调整到IOOng/ μ 1备用。
[0097] 我们用筛选出的这个突变特异性引物，同时用野生型引物作对照，在同一个PCR 反应板上，每两个反应管检测一个基因位点，其中一个是突变位点，另一个是野生型位点。 每个反应管 20μ1 反应体积中包含 IOmM Tris-HCl pH8.3,50mM KCl，(Xl%Triton Χ-100， 2. OmM MgCl2, IOOng人基因组DNA，IOOnM特异性Taqman探针，500nM共用特异性下游引物， 500nM野生型特异性上游引物或突变型特异性上游引物，5pm检测管家基因 GAPDH的上游引 物，5pm检测管家基因 GAPDH的下游引物，2. 5pm检测管家基因 GAPDH的探针，再加上1. 5单 位Taq DNA聚合酶，200 μ M dNTPs，其余为去离子水。
[0098] 第一步PCR反应条件是：37°C 2min，95°C2min预变性，然后 95°C5s，63°C30s，15 个循环，此步不收集荧光；第二步PCR反应条件是：95°C 5s，60°C 30s，共40个循环，此步收 集荧光。为了方便起见，我们将ALDH2基因 rs671多态性正常位点认定为野生型（G位点)， 而容易引起ALDH2酶活性下降的位点则为突变型（A位点)，如果对应的反应管在FAM通道有 对数增长的扩增曲线，同时VIC通道有对数增长的扩增曲线，就判断为对应的纯合基因型； 如两管均在FAM通道有对数增长的扩增曲线，同时VIC通道有对数增长的扩增曲线，则为杂 合型。
[0099] 1、按照上述方法进行突变等位基因纯合子（A位点）检测，其具体基因序列为： SEQ No. 22 ：ggcatacactaaagtgaaaac 收集到的FAM通道PCR扩增曲线图，如图2所示，其中，a曲线代表检测突变型PCR反 应管中的扩增曲线，b曲线代表检测野生型PCR反应管中的扩增曲线。
[0100] 2、按照上述方法进行野生等位基因纯合子（G位点）检测，其具体基因序列为： SEQ No. 23 ：ggcatacactgaagtgaaaac 收集到的FAM通道PCR扩增曲线图，如图3所示，其中，c曲线代表检测野生型PCR反 应管中的扩增曲线，d曲线代表检测突变型PCR反应管中的扩增曲线。
[0101] 3、按照上述方法进行杂合（AG型）检测，其具体基因序列为： SEQ No. 24 ：ggcatacacta/gaagtgaaaac 收集到的FAM通道PCR扩增曲线图，如图4所示，其中，e曲线代表检测野生型PCR反 应管中的扩增曲线，f曲线代表检测突变型PCR反应管中的扩增曲线。
[0102] 同时，上述3个检测案例中，当VIC通道管家基因 GAPDH有对数增长的扩增曲线， 如图5所示，同时FAM通道有对数增长的扩增曲线，则此次实验结果有效。
[0103] 因此，从上述的检测试验可见，本试剂盒的检测结果为"全或无"的结果，即若被检 测样品为突变等位基因纯合子，两个PCR反应管中，仅有突变型PCR反应管在FAM通道和 VIC通道均有对数增长的扩增曲线，而野生型PCR反应管在FAM通道毫无扩增曲线；若被检 测样品为野生等位基因纯合子，两个PCR反应管中，仅有野生型PCR反应管在FAM通道和 VIC通道均有对数增长的扩增曲线，而突变型PCR反应管在FAM通道毫无扩增曲线；若被检 测样品为杂合子，两个PCR反应管在FAM通道和VIC通道均有对数增长的荧光信号。该试 剂盒的检测结果判读简单，减少了以往试剂盒的检测结果需要进行ACt等一系列复杂计 算的过程，降低错判率，同时还有效避免了以往试剂盒检测结果中存在假阴性假阳性现象 的发生。此外本发明提供的试剂盒可用于任何型号的荧光定量PCR仪，检测仪器简单，成本 低，为科研和临床乙醛脱氢酶2基因 rs671多态性位点分型和基因突变分析提供了强有力 的工具。
【主权项】
1. 一种检测乙醛脱氢酶2基因rs671多态性位点的引物，其特征在于，所述引物包括： 野生型特异性上游引物、突变型特异性上游引物和野生型特异性上游引物与突变型特异性 上游引物共用的下游引物； 且所述野生型特异性上游引物具有SEQNo. 17序列，所述突变型特异性上游引物具有SEQNo. 14序列，所述共用的下游引物具有SEQNo. 16序列。2. -种检测乙醛脱氢酶2基因rs671多态性位点的试剂，其特征在于：所述试剂含有 权利要求1所述的引物。3. -种检测乙醛脱氢酶2基因rs671多态性位点的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒 含有权利要求1所述的引物。4. 按照权利要求3所述检测乙醛脱氢酶2基因rs671多态性位点的试剂盒，其特征在 于：所述试剂盒还包括与权利要求1所述引物配合使用的探针，其中，所述探针为Taqman探 针，具有SEQNo. 15序列。5. 按照权利要求4所述检测乙醛脱氢酶2基因rs671多态性位点的试剂盒，其特征在 于：所述试剂盒还包括PCR反应管、dNTPs和Taq酶混合液、PCR缓冲液、检测管家基因GAPDH 的上游引物、检测管家基因GAPDH的下游引物和检测管家基因GAPDH的探针、阳性质控品和 空白对照； 所述检测管家基因GAPDH的上游引物具有SEQNo. 19序列；所述检测管家基因GAPDH的下游引物具有SEQNo. 20序列；所述检测管家基因GAPDH的探针具有SEQNo. 21序列。6. 按照权利要求5所述检测乙醛脱氢酶2基因rs671多态性位点的试剂盒，其特征 在于：所述突变型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探 针被预先包被于A型PCR反应管内；以及与所述野生型特异性上游引物、所述共用的下游引 物、所述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物 和所述检测管家基因GAPDH的探针被预先包被于G型PCR反应管内。7. 按照权利要求6所述检测乙醛脱氢酶2基因rs671多态性位点的试剂盒，其特征 在于：所述A型PCR反应管内突变型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所 述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管 家基因GAPDH的探针浓度分别为 50nM-2um、50nM-2uM、50nM-400nM、lpm-20pm、lpm-20pm、 0. 05pm-5pm;以及所述G型PCR反应管内野生型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所 述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所 述检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为50nM-2um、50nM-2uM、50nM-400nM、lpm-20pm、 lpm_20pm、0. 05pm_5pm〇8. 按照权利要求7所述检测乙醛脱氢酶2基因rs671多态性位点的试剂盒，其特征在 于：所述A型PCR反应管内突变型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检 测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针浓度分别为500nM、500nM、100nM、5pm、5pm、2. 5pm;以及所述G型PCR反应管内 野生型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游 引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为 500nM、500nM、100nM、5pm、5pm、2. 5pm。9. 一种权利要求1所述引物或权利要求3~8任一试剂盒的PCR方法，其特征在于：PCR 反应按两步扩增循环程序进行，且第一步扩增的循环数小于第二步扩增的循环数，所述第 一步扩增的退火温度高于所述第二步扩增的退火温度。10.按照权利要求9所述的PCR方法，其特征在于，所述PCR反应的条件为：37°C 2min， 95°C 2min预变性；第一步扩增，95°C变性5s，55°C~68°C退火32s，循环10~15次；第二 步，95°C变性5s，50°C~65°C退火、延伸32s，循环30~50次，收集荧光信号；或所述PCR反 应的条件为：37°C 2min，95°C 2min预变性；第一步扩增，95°C变性5s，63°C退火32s， 循环15次；第二步，95°C变性5s，60°C退火、延伸32s，循环40次，收集荧光信号。
【专利摘要】本发明公开了一种检测乙醛脱氢酶2基因rs671多态性位点的引物、试剂盒及其PCR方法，其中包括：野生型特异性上游引物、突变型特异性上游引物和野生型特异性上游引物与突变型特异性上游引物共用的下游引物；且所述野生型特异性上游引物具有SEQ No.17序列，所述突变型特异性上游引物具有SEQ No.14序列，所述共用的下游引物具有SEQ No.16序列；试剂盒具有检测简单、快速、准确、廉价等优点，为科研和临床乙醛脱氢酶2基因型和基因突变分析提供了强有力的工具。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894256
【申请号】CN201510290613
【发明人】高劲松, 张英杰, 李星颐, 樊志美, 于农, 魏潇, 魏奇
【申请人】沈阳优吉诺生物科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月29日
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