Pna钳位实时定量pcr检测hbv线性dna比例的制作方法
Pna钳位实时定量pcr检测hbv线性dna比例的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种有关HBV DNA检测。更具体的说是，涉及一种检测检测HBV线性 DNA比例的方法。另外，本发明还涉及所述检测方法用到的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 乙型肝炎病毒Ofepatitis B virus，HBV)是嗜肝DNA病毒。具有感染性的HBV Dane's颗粒包含两种基因组形式，部分双链松弛环状DNA (Relaxed-circular DNA, rcDNA) 和双链线性DNA (Duplex-linear DNA, dlDNA)。这两种基因组形式的产生基于正链合成时起 始引物结合位点的不同。如正链合成的引物停留在原位即直接重复序列UDirect repeat 1，DR1)，直接延伸合成正链，称为原位延伸，合成的基因组为dlDNA。如正链引物转位到 直接重复序列2 (Direct repeat2, DR2)上再合成正链，称为转位延伸，则合成的基因组为 rcDNA，成环的rcDNA除比dlDNA长224个碱基外，其余碱基序列二者相同[图1，参考文献 1]。既往多项研宄报道显示嗜肝病毒科中dlDNA与宿主基因组的整合与肝癌的发生有关 [参考文献2, 3]。但迄今为止尚缺乏对慢乙肝患者中血清中HBV dlDNA比例的大样本调查， 其临床意义不明。
[0003] 既往研宄显示，血清中HBV dlDNA比例约为总HBV DNA的5-15%，但既往对HBV DNA基因组形式的分析主要应用Southern杂交法和病毒基因组提取后电镜下直接观察方 法[参考文献4, 5]。这些方法存在操作复杂、检测时间长、灵敏度低、半定量等缺点，并不适 于临床样本分析。理论上，HBV dlDNA比例可以通过扩增总的HBV DNA (dlDNA和rcDNA)和 单独扩增rcDNA方法计算得出，这种方法需要设计两对引物，一对用来扩增总的HBV DNA， 一对引物扩增rcDNA。但是，不同引物序列之间和扩增长度的差异，导致他们的解链温度、结 合效率、扩增效率等不同，增加了实验的不确定性和不可比性。因此，目前亟需建立简便可 靠的检测慢乙肝感染者血清中HBV dlDNA比例的方法，以探讨其临床价值。
[0004] 基于HBV rcDNA和dlDNA基因组结构的差别，我们设计了 PNA钳位qPCR以检测血 清中HBV dlDNA比例。肽核酸（PNA)是一种寡核苷酸的模拟物，其经典的分子结构是由重 复性的N-(2-氨基乙基）甘氨酸单元通过酰胺键相连取代DNA分子中的磷酸戊糖骨架所 形成的一种DNA分子的类似物[参考文献6]。尽管PNA分子骨架与DNA分子显著不同，但 PNA与互补核酸之间的结合仍遵循碱基互补配对的原则，且由于PNA呈电中性，其比天然核 苷酸具有更高的亲和力和特异性。PNA的虽然可与DNA模板特异性结合，但并不能作为PCR 引物对模板进行延伸。因此PNA与PCR引物可以竞争性地与DNA模板结合而特异性抑制 PCR反应[参考文献7]。我们评估了 PNA钳位实时定量PCR检测HBVdlDNA比例的灵敏度、 特异性和准确性。由此产生了本发明。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种PNA钳位实时定量PCR检测HBV线性DNA比例的方法。 本发明的另一目的是提供一种用于所述检测方法的试剂盒。
[0006] 本发明采用如下技术方案来实现本发明的上述目的。
[0007] 本发明所述的PNA钳位实时定量PCR检测HBV线性DNA比例的方法，包括如下步 骤：（1)用DNA聚合酶和核酸内切酶对HBV DNA模板进行预处理，产生相差12个碱基的不 同模板；（2)利用引物对和肽核酸对dlDNA进行选择性扩增；（3)根据定量PCR检测结果中 的HBV dlDNA定量值和总HBV DNA，计算得到dlDNA比例。
[0008] 根据我们的试验结果，限制性核酸内切酶有助于DNA聚合酶的修复。因此，优选方 案是，在步骤（1)中同时使用DNA聚合酶和限制性核酸内切酶对HBV DNA模板的预处理。所 述DNA聚合酶和限制性核酸内切酶优选klenow DNA聚合酶和Hpy8 I内切酶。
[0009] 基于rcDNA和dlDNA的结构序列特点，我们设计了 PNA钳位qPCR技术，应用一对引 物和一条PNA，以检测dlDNA占总的HBV DNA比例，保证了该方法的特异性和准确性。该方 法的关键设计在于用限制性核酸内切酶Hyp8 I和Klenow DNA聚合酶对HBV DNA模板的预 处理，在正链的5'末端产生了相差12个碱基的不同模板，即240bp的rcDNA模板和228bp 的dlDNA模板。这种差异成为我们设计PNA选择性的抑制rcDNA扩增的基础。
[0010] 根据HBV序列设计引物和PNA序列，序列以及相应位置见表1-1。
[0011] 表1-1.引物序列和PNA序列
[0012]
[0013] 采用设计的引物对和PNA，可以使PNA与rcDNA完全互补配对结合，而只有部分 碱基与dlDNA互补配对。因此，在优化的退火条件下，可以使PNA只能与rcDNA结合而不 能与dlDNA结合，从而实现对rcDNA扩增的抑制，即选择性的扩增dlDNA。在优化条件下， 可以实现该方法的检测灵敏度为〇. 5 %，线性范围为0. 5 %到99 %。PNA钳位qPCR法与 Southern-Blot法的结果比较，进一步验证了该方法的准确性。
[0014] 本发明还提供一种试剂盒，用于PNA钳位实时定量PCR检测HBV线性DNA比例，包 括引物对、肽核酸以及Hpy8 I核酸内切酶和Klenow聚合酶，所述引物对、肽核酸如表1-1 所定义。
[0015] 本发明的PNA钳位qPCR法检测HBV dlDNA灵敏度和准确度较高，弥补了经典的 Southern-Blot法的半定量，操作复杂，灵敏度低等局限性，因此，该新方法的建立为进一步 检测分析慢乙肝患者血清中HBV dlDNA比例检测提供了技术支持。
【附图说明】
[0016] 图I HBV DNA的复制过程
[0017] 图2 PNA钳位qPCR检测dlDNA比例方法的设计原理。㈧对rcDNA和dlDNA进行 预处理。（B)选择性扩增dlDNA的PNA钳位qPCR原理。（C) PNA钳位PCR扩增优化条件。
[0018] 图3 PNA钳位qPCR检测dlDNA的特异性和线性范围分析。（A) rcDNA和dlDNA的 浓度以拷贝数/毫升表示，X轴表示系列稀释的模拟物。（B)用PNA钳位qPCR检测dlDNA 在混合物中的比例，白条示dlDNA比例在混合物中理论值，灰条为PNA钳位qPCR检测值。
[0019] 图4用Southern杂交法验证PNA钳位qPCR检测血清中dlDNA比例的准确性。左 图显示，HBV DNA经内源性聚合酶修补后，BmgBI和AseI内切酶对模板进行酶切产生1030bp 的rcDNA片段和817bp的dlDNA片段。右图上为southern杂交法的检测结果，右图下为 PNA钳位qPCR的检测结果。N/A表示southern杂交法未检测到信号。
[0020] 图5 PNA钳位qPCR中klenow DNA聚合酶和Hpy8 I内切酶的功能评估。（A)经或 者不经Hpy8 I预酶切的HBV DNA模板，经过不同时间的Klenow酶修复所得到的dlDNA比 例；（B)将 pUC18-HBVl. 2-wt 和（C)Hpy8 I 酶切位点突变的 pUC18-HBVl. 2-T1804A 质粒，转 染H印G2细胞后，上清分别分成4组，Klenow+Hpy8 I共处理组、Klenow酶处理组、Hpy8 I 内切酶处理组和对照组。PNA钳位qPCR检测上清中dlDNA比例的结果。
【具体实施方式】
[0021] 实施例1引物序列以及肽核酸序列的设计与合成
[0022] 引物序列和PNA序列是参照pUC18-HBVl. 2 (GenBank AY040627)的序列设计。
[0023] (1)引物设计：
[0024] 根据HBV序列（GenBank AY040627)设计引物，相应位置见表1-1，由北京赛百盛生 物技术有限公司公司合成。
[0025] ⑵肽核酸：
[0026] 根据HBV序列（GenBank AY040627)设计PNA序列，相应位置见表1-1，由韩国的 PANAgene公司合成。
[0027] 实施例2 PNA、引物和酶切位点序列的保守性分析
[0028] 根据PUC18-HBV1. 2质粒的序列，我们设计的PNA碱基序列和相应的引物序列分别 为 5'-CAGCACCATGCAACTTTTTC-3' （1806-1825nt)和 5'-CAACTTTTTCACCTCTG-3' （1816-1832 nt)，限制性核酸内切酶Hpy8 I的酶切位点在1804nt。
[0029] HBV DNA的核酸序1804nt-1832nt包括PNA、前向引物、核酸内切酶Hpy8I酶切位 点，因此这29个碱基的保守性和特异性也是实验设计成功的关键。由于该区域多态性可能 影响PNA钳位qPCR准确性，因此，针对包含PNA、引物和酶切位点的1804-1832nt序列共29 个碱基我们在pubmed上用BLAST程序对GenBank中HBV病毒株进行了该区段的保守性分 析。
[0030] 在GenBank数据库，通过Blast分析对PNA、前向引物结合位点和Hpy8 I酶切位点 的序列即1804-1832nt共29个碱基进行多态性分析，结果显示，在检测的20000条HBV DNA 病毒株中，这29个碱基存在1-5个碱基突变的序列占4. 43 % (886/20000)，在这886条序 列中，65%的病毒株为基因 A型，20%的病毒株基因为D和F型，而基因 B和C型占的比例 〈10%〇
[0031] 根据最近我国HBV DNA基因型的分布调查结果显示，A基因型约占0. 5%，B基因 型约占38. 6%，C基因型占约57%，B基因型和C基因型为绝对优势基因型，所占比例高达 95.6%。因此，本发明可以广泛的应用于检测我国慢乙肝患者血清中HBV dlDNA比例水平。 这也提示我们，通过对1804nt-1832nt序列区段进行测序，有助于对dlDNA比例的检测值进 行验证。
[0032] 实施例3 PNA钳位实时定量PCR检测HBV线性DNA
[0033] HBV DNA基因组中，rcDNA除了在正链的5'端比dlDNA多224个碱基外，其余的序 列二者完全相同[参考文献1]。基于结构和序列上的差异，我们设计了 PNA钳位qPCR选择 性的扩增dlDNA。
[0034] 首先，我们用Klenow DNA聚合酶和限制性核酸内切酶Hpy8 I对提取的HBV DNA 模板进行酶切和修补。rcDNA经限制性核酸内切酶Hpy8 I酶切后，产生一段从1804n t到 2043nt共240个碱基的片段，而这个片段负链的3'端有12bp不连续的片段。为了修补此 不连续的负链3'末端，我们首先对酶切后模板45°C变性，使与正链5'末端互补的12bp不 连续负链片段从该正链模板上游离下来，产生一个3'末端缺口，Klenow DNA聚合酶则可以 与缺口处负链的3'末端结合，以正链为模板，延伸负链补齐缺口，产生240bp完整的双链 "rcDNA"模板。同时由于dlDNA的起始位点为1816nt，因此经Hpy8 I酶酶切后，产生一段 从1816nt到2043nt共228个碱基的双链DNA片段，此片段为"dlDNA"模板。其次，我们设 计了一段与前向引物P1F(1816-I832nt)有部分重叠的PNA(1806-1825nt)序列。此设计可 以使PNA与rcDNA完全互补配对结合，而只有部分碱基与dlDNA互补配对。因此，在优化的 退火条件下，可以使PNA只能与rcDNA结合而不能与dlDNA结合，从而实现对rcDNA扩增的 抑制。为此，我们在标准PCR流程中，外加了一步PNA退火的温度，使其优先于前向引物退 火结合rcDNA，阻断PCR对rcDNA的扩增。
[0035] 下面通过病人样本分析完整过程来具体进行说明。
[0036] 1、200 μ 1血清标本中HBV DNA模板按天根生化科技有限公司的病毒DNA提取试剂 盒的说明书操作提取。溶于20 μ 1蒸馏水中。
[0037] 2、根据Hpy8I和KlenowDNA聚合酶的说明书对HBV DNA模板进行处理，操作步骤 如下：
[0038] 按下表在冰上I. 5ml的EP内配备酶切和修补的反应体系10 μ 1 :
[0039]
[0040] 配完后，简短离心，收集液体至管底，在37°C孵育15分钟，45°C孵育15分钟。
[0041] 3、PNA钳位的实时定量PCR
[0042] 取上述处理后的HBV DNA模板进行实时定量PCR，体系配置如下：
[0043] 按下表在冰上准备PCR反应液：
[0044]
[0046] 每个标准品和样本都对应的有两组，不加 PNA组和加 PNA组，最后加个空白对照 组。将上述体系配好后，加入毛细玻璃管中，放入低温高速离心机内4500rpm/分钟，离心2 分钟，然后将毛细玻璃管放入荧光定量PCR仪上。设定PCR的流程如下：95°C预变性15分 钟，95°C 10秒，64°C 15秒，52°C 15秒，72°C 30秒，共反应40个循环。
[0047] 优化条件：PNA的终浓度为500nM，PCR引物的终浓度为250nM，95°C预变性15分 钟，95°C变性10秒，64°C PNA优先退火15秒，52°C PCR引物退火15秒（图2. C)。在此条 件下，PNA可以抑制rcDNA的扩增在200倍左右，而对dlDNA的扩增没有影响（图3. A)。因 此，该方法的检测灵敏度为0. 5%，由于血清中HBV dlDNA比例远高于0. 5%，所以此方法的 灵敏度足以应用于检测临床血清样本中HBV dlDNA比例。
[0048] 将定量PCR检测结果中的HBV dlDNA定量值（加 PNA组）和总HBV DNA (无 PNA 组）相除，得到dlDNA比例。
[0049] 为了检测该方法的线性范围，我们将dlDNA和rcDNA的模拟物按不同的已知比例 混合，然后用该方法检测。结果显示，PNA钳位qPCR的检测结果与理论值一致（图3. B)。
[0050] 实施例4 PNA钳位qPCR检测dlDNA比例的准确性验证
[0051] 为了进一步验证该方法的准确性，我们挑选了 8个临床检测HBV DNA水平较高 的慢乙肝患者血清样本，按照实施例3所述的方法检测其中HBV dlDNA比例，并与经典的 Southern杂交分析结果比较。由于HBV基因组正链为长度50-90%长短不一的不完全DNA 链，因此我们对HBV DNA进行内源性修补和酶切，以获得清晰条带进行定量比较。
[0052] 如图4所示，用Quantity one软件对Southern条带灰度值进行定量分析，结果显 示，PNA钳位qPCR法与Southern杂交法的结果一致。
[0053] 实施例5 PNA钳位qPCR中Klenow聚合酶和Hpy8 I内切酶的功能评估
[0054] 为了评估Hpy8 I内切酶的功能，在存在或不存在Hpy8 I内切酶的情况下，我们分 别测定了 Klenow聚合酶修复时间。试验结果显示，在DNA模板没有用Hpy8 I内切酶进行 处理的情况下，需要用Klenow聚合酶处理30分钟，才可以完全修复HBV rcDNA ;但是，如果 在DNA模板用Hpy8 I内切酶进行处理的情况下，则用Klenow聚合酶处理1分钟，就可以完 全修复HBV rcDNA。因此，试验结果表明，Hpy8 I极大提高了修补的效率（图5A)。
[0055] 为了评估Klenow酶修补的作用，我们应用野生型的pUC18-HBVL 2-WT、和Hpy8 I 酶切位点突变的PUC18-HBV1. 2-T1804A转染H印G2细胞后培养3天，上清中HBV dlDNA比例 用PNA钳位qPCR检测。然后将二者的模板分成四组分别进行不同处理即：l)Klen 〇W+Hpy8 I处理组，2) Klenow酶修补组，3) Hpy8 I内切酶切组，4)对照组（不经二者处理）。结果如 图5B/C所示。pUC18-HBVl. 2、pUC18-HBVl. 2-T1804A转染H印G2细胞的培养上清中，对照 组HBV dlDNA比例显著高于Hpy8 I酶切和Klenow酶修补组。然而，样本经Hpy8 I酶切和 Klenow酶修补组结果与Klenow聚合酶修补组的检测结果没有统计学差异。这表明Klenow 聚合酶对HBV DNA模板的修补是必须环节。但在Klenow聚合酶充分修补情况下（30分钟 以上），Hyp8 I内切酶的酶切并非必要。
[0056] 参考文献
[0057] [1]. Seeger, C. and ff. S. Mason, Hepatitis B virus biology. Microbiol Mol Biol Rev, 2000. 64(1) :p. 51-68.
[0058] [2]. Toh, S. T. , et al. , Deep sequencing of the hepatitis B virus in hepatocellular carcinoma patients reveals enriched integration events, structural alterations and sequence variations. Carcinogenesis, 2013. 34(4 ):p. 787-98.
[0059] [3]. Sung, ff. K. , et al. , Genome-wide survey of recurrent HBV integration in hepatocellular carcinoma. Nat Genet, 2012. 44(7):p.765-9.
[0060] [4]. Yamada, M.,et al. , Three distinct Southern blot hybridization patterns of HBV-DNA in the sera of HBV carriers. Tohoku J Exp Med, 1993. 170(4) :p. 219-28.
[0061] [5]. Delius, H. , et al. , Structure of the hepatitis B virus genome. J Virol, 1983. 47(2) :p. 337-43.
[0062] [6].Egholm, M. , et al. , PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the Watson-Crick hydrogen-bonding rules. Nature, 1993. 365(6446):p. 566-8
[0063] [7]. Buchardt, 0. , et al. , Peptide nucleic acids and their potential applications in biotechnology. Trends Biotechnol,1993.11 (9):p.384-6 。
【主权项】
1. 一种PNA钳位实时定量PCR检测HBV线性DNA比例的方法，包括如下步骤：（1)用DNA 聚合酶和核酸内切酶对HBVDNA模板进行预处理，产生相差12个碱基的不同模板；（2)利 用引物对和肽核酸对dlDNA进行选择性扩增；（3)根据定量PCR检测结果中的HBVdlDNA定 量值和总HBVDNA，计算得到dlDNA比例，其中所述引物和PNA序列以及相应位置见表1-1。2. 根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（1)中同时使用DNA聚合酶和限制性核酸 内切酶对HBVDNA模板的预处理。3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述DNA聚合酶和限制性核酸内切酶是指klenow DNA聚合酶和Hpy8I内切酶。4. 根据权利要求1所述的方法，其中在步骤⑵中设定PCR的流程如下：95°C预变性 15分钟，95°C10秒，64°C15秒，52°C15秒，72°C30秒，共反应40个循环。5. 根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（2)中，优化条件是：PNA的终浓度为 500nM，PCR引物的终浓度为250nM，95°C预变性15分钟，95°C变性10秒，64°CPNA优先退火 15秒，52°CPCR引物退火15秒。6. -种试剂盒，用于PNA钳位实时定量PCR检测HBV线性DNA比例，包括引物对、肽核 酸以及Hpy8I核酸内切酶和Klenow聚合酶，所述引物对、肽核酸如表1-1所定义。
【专利摘要】本发明公开了一种PNA钳位实时定量PCR检测HBV线性DNA比例的方法，包括如下步骤：(1)用DNA聚合酶和核酸内切酶对HBV DNA模板进行预处理，产生相差12个碱基的不同模板；(2)利用引物对和肽核酸对dlDNA进行选择性扩增，(3)根据定量PCR检测结果中的HBV dlDNA定量值和总HBV DNA，计算得到dlDNA比例。灵敏度和准确度较高，弥补了经典的Southern-Blot法的半定量，操作复杂，灵敏度低等局限性。为进一步检测分析慢乙肝患者血清中HBV dlDNA比例检测提供了技术支持。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894258
【申请号】CN201510292094
【发明人】潘孝本, 魏来
【申请人】北京大学人民医院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月1日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种有关HBV DNA检测。更具体的说是，涉及一种检测检测HBV线性 DNA比例的方法。另外，本发明还涉及所述检测方法用到的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 乙型肝炎病毒Ofepatitis B virus，HBV)是嗜肝DNA病毒。具有感染性的HBV Dane's颗粒包含两种基因组形式，部分双链松弛环状DNA (Relaxed-circular DNA, rcDNA) 和双链线性DNA (Duplex-linear DNA, dlDNA)。这两种基因组形式的产生基于正链合成时起 始引物结合位点的不同。如正链合成的引物停留在原位即直接重复序列UDirect repeat 1，DR1)，直接延伸合成正链，称为原位延伸，合成的基因组为dlDNA。如正链引物转位到 直接重复序列2 (Direct repeat2, DR2)上再合成正链，称为转位延伸，则合成的基因组为 rcDNA，成环的rcDNA除比dlDNA长224个碱基外，其余碱基序列二者相同[图1，参考文献 1]。既往多项研宄报道显示嗜肝病毒科中dlDNA与宿主基因组的整合与肝癌的发生有关 [参考文献2, 3]。但迄今为止尚缺乏对慢乙肝患者中血清中HBV dlDNA比例的大样本调查， 其临床意义不明。
[0003] 既往研宄显示，血清中HBV dlDNA比例约为总HBV DNA的5-15%，但既往对HBV DNA基因组形式的分析主要应用Southern杂交法和病毒基因组提取后电镜下直接观察方 法[参考文献4, 5]。这些方法存在操作复杂、检测时间长、灵敏度低、半定量等缺点，并不适 于临床样本分析。理论上，HBV dlDNA比例可以通过扩增总的HBV DNA (dlDNA和rcDNA)和 单独扩增rcDNA方法计算得出，这种方法需要设计两对引物，一对用来扩增总的HBV DNA， 一对引物扩增rcDNA。但是，不同引物序列之间和扩增长度的差异，导致他们的解链温度、结 合效率、扩增效率等不同，增加了实验的不确定性和不可比性。因此，目前亟需建立简便可 靠的检测慢乙肝感染者血清中HBV dlDNA比例的方法，以探讨其临床价值。
[0004] 基于HBV rcDNA和dlDNA基因组结构的差别，我们设计了 PNA钳位qPCR以检测血 清中HBV dlDNA比例。肽核酸（PNA)是一种寡核苷酸的模拟物，其经典的分子结构是由重 复性的N-(2-氨基乙基）甘氨酸单元通过酰胺键相连取代DNA分子中的磷酸戊糖骨架所 形成的一种DNA分子的类似物[参考文献6]。尽管PNA分子骨架与DNA分子显著不同，但 PNA与互补核酸之间的结合仍遵循碱基互补配对的原则，且由于PNA呈电中性，其比天然核 苷酸具有更高的亲和力和特异性。PNA的虽然可与DNA模板特异性结合，但并不能作为PCR 引物对模板进行延伸。因此PNA与PCR引物可以竞争性地与DNA模板结合而特异性抑制 PCR反应[参考文献7]。我们评估了 PNA钳位实时定量PCR检测HBVdlDNA比例的灵敏度、 特异性和准确性。由此产生了本发明。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种PNA钳位实时定量PCR检测HBV线性DNA比例的方法。 本发明的另一目的是提供一种用于所述检测方法的试剂盒。
[0006] 本发明采用如下技术方案来实现本发明的上述目的。
[0007] 本发明所述的PNA钳位实时定量PCR检测HBV线性DNA比例的方法，包括如下步 骤：（1)用DNA聚合酶和核酸内切酶对HBV DNA模板进行预处理，产生相差12个碱基的不 同模板；（2)利用引物对和肽核酸对dlDNA进行选择性扩增；（3)根据定量PCR检测结果中 的HBV dlDNA定量值和总HBV DNA，计算得到dlDNA比例。
[0008] 根据我们的试验结果，限制性核酸内切酶有助于DNA聚合酶的修复。因此，优选方 案是，在步骤（1)中同时使用DNA聚合酶和限制性核酸内切酶对HBV DNA模板的预处理。所 述DNA聚合酶和限制性核酸内切酶优选klenow DNA聚合酶和Hpy8 I内切酶。
[0009] 基于rcDNA和dlDNA的结构序列特点，我们设计了 PNA钳位qPCR技术，应用一对引 物和一条PNA，以检测dlDNA占总的HBV DNA比例，保证了该方法的特异性和准确性。该方 法的关键设计在于用限制性核酸内切酶Hyp8 I和Klenow DNA聚合酶对HBV DNA模板的预 处理，在正链的5'末端产生了相差12个碱基的不同模板，即240bp的rcDNA模板和228bp 的dlDNA模板。这种差异成为我们设计PNA选择性的抑制rcDNA扩增的基础。
[0010] 根据HBV序列设计引物和PNA序列，序列以及相应位置见表1-1。
[0011] 表1-1.引物序列和PNA序列
[0012]
[0013] 采用设计的引物对和PNA，可以使PNA与rcDNA完全互补配对结合，而只有部分 碱基与dlDNA互补配对。因此，在优化的退火条件下，可以使PNA只能与rcDNA结合而不 能与dlDNA结合，从而实现对rcDNA扩增的抑制，即选择性的扩增dlDNA。在优化条件下， 可以实现该方法的检测灵敏度为〇. 5 %，线性范围为0. 5 %到99 %。PNA钳位qPCR法与 Southern-Blot法的结果比较，进一步验证了该方法的准确性。
[0014] 本发明还提供一种试剂盒，用于PNA钳位实时定量PCR检测HBV线性DNA比例，包 括引物对、肽核酸以及Hpy8 I核酸内切酶和Klenow聚合酶，所述引物对、肽核酸如表1-1 所定义。
[0015] 本发明的PNA钳位qPCR法检测HBV dlDNA灵敏度和准确度较高，弥补了经典的 Southern-Blot法的半定量，操作复杂，灵敏度低等局限性，因此，该新方法的建立为进一步 检测分析慢乙肝患者血清中HBV dlDNA比例检测提供了技术支持。
【附图说明】
[0016] 图I HBV DNA的复制过程
[0017] 图2 PNA钳位qPCR检测dlDNA比例方法的设计原理。㈧对rcDNA和dlDNA进行 预处理。（B)选择性扩增dlDNA的PNA钳位qPCR原理。（C) PNA钳位PCR扩增优化条件。
[0018] 图3 PNA钳位qPCR检测dlDNA的特异性和线性范围分析。（A) rcDNA和dlDNA的 浓度以拷贝数/毫升表示，X轴表示系列稀释的模拟物。（B)用PNA钳位qPCR检测dlDNA 在混合物中的比例，白条示dlDNA比例在混合物中理论值，灰条为PNA钳位qPCR检测值。
[0019] 图4用Southern杂交法验证PNA钳位qPCR检测血清中dlDNA比例的准确性。左 图显示，HBV DNA经内源性聚合酶修补后，BmgBI和AseI内切酶对模板进行酶切产生1030bp 的rcDNA片段和817bp的dlDNA片段。右图上为southern杂交法的检测结果，右图下为 PNA钳位qPCR的检测结果。N/A表示southern杂交法未检测到信号。
[0020] 图5 PNA钳位qPCR中klenow DNA聚合酶和Hpy8 I内切酶的功能评估。（A)经或 者不经Hpy8 I预酶切的HBV DNA模板，经过不同时间的Klenow酶修复所得到的dlDNA比 例；（B)将 pUC18-HBVl. 2-wt 和（C)Hpy8 I 酶切位点突变的 pUC18-HBVl. 2-T1804A 质粒，转 染H印G2细胞后，上清分别分成4组，Klenow+Hpy8 I共处理组、Klenow酶处理组、Hpy8 I 内切酶处理组和对照组。PNA钳位qPCR检测上清中dlDNA比例的结果。
【具体实施方式】
[0021] 实施例1引物序列以及肽核酸序列的设计与合成
[0022] 引物序列和PNA序列是参照pUC18-HBVl. 2 (GenBank AY040627)的序列设计。
[0023] (1)引物设计：
[0024] 根据HBV序列（GenBank AY040627)设计引物，相应位置见表1-1，由北京赛百盛生 物技术有限公司公司合成。
[0025] ⑵肽核酸：
[0026] 根据HBV序列（GenBank AY040627)设计PNA序列，相应位置见表1-1，由韩国的 PANAgene公司合成。
[0027] 实施例2 PNA、引物和酶切位点序列的保守性分析
[0028] 根据PUC18-HBV1. 2质粒的序列，我们设计的PNA碱基序列和相应的引物序列分别 为 5'-CAGCACCATGCAACTTTTTC-3' （1806-1825nt)和 5'-CAACTTTTTCACCTCTG-3' （1816-1832 nt)，限制性核酸内切酶Hpy8 I的酶切位点在1804nt。
[0029] HBV DNA的核酸序1804nt-1832nt包括PNA、前向引物、核酸内切酶Hpy8I酶切位 点，因此这29个碱基的保守性和特异性也是实验设计成功的关键。由于该区域多态性可能 影响PNA钳位qPCR准确性，因此，针对包含PNA、引物和酶切位点的1804-1832nt序列共29 个碱基我们在pubmed上用BLAST程序对GenBank中HBV病毒株进行了该区段的保守性分 析。
[0030] 在GenBank数据库，通过Blast分析对PNA、前向引物结合位点和Hpy8 I酶切位点 的序列即1804-1832nt共29个碱基进行多态性分析，结果显示，在检测的20000条HBV DNA 病毒株中，这29个碱基存在1-5个碱基突变的序列占4. 43 % (886/20000)，在这886条序 列中，65%的病毒株为基因 A型，20%的病毒株基因为D和F型，而基因 B和C型占的比例 〈10%〇
[0031] 根据最近我国HBV DNA基因型的分布调查结果显示，A基因型约占0. 5%，B基因 型约占38. 6%，C基因型占约57%，B基因型和C基因型为绝对优势基因型，所占比例高达 95.6%。因此，本发明可以广泛的应用于检测我国慢乙肝患者血清中HBV dlDNA比例水平。 这也提示我们，通过对1804nt-1832nt序列区段进行测序，有助于对dlDNA比例的检测值进 行验证。
[0032] 实施例3 PNA钳位实时定量PCR检测HBV线性DNA
[0033] HBV DNA基因组中，rcDNA除了在正链的5'端比dlDNA多224个碱基外，其余的序 列二者完全相同[参考文献1]。基于结构和序列上的差异，我们设计了 PNA钳位qPCR选择 性的扩增dlDNA。
[0034] 首先，我们用Klenow DNA聚合酶和限制性核酸内切酶Hpy8 I对提取的HBV DNA 模板进行酶切和修补。rcDNA经限制性核酸内切酶Hpy8 I酶切后，产生一段从1804n t到 2043nt共240个碱基的片段，而这个片段负链的3'端有12bp不连续的片段。为了修补此 不连续的负链3'末端，我们首先对酶切后模板45°C变性，使与正链5'末端互补的12bp不 连续负链片段从该正链模板上游离下来，产生一个3'末端缺口，Klenow DNA聚合酶则可以 与缺口处负链的3'末端结合，以正链为模板，延伸负链补齐缺口，产生240bp完整的双链 "rcDNA"模板。同时由于dlDNA的起始位点为1816nt，因此经Hpy8 I酶酶切后，产生一段 从1816nt到2043nt共228个碱基的双链DNA片段，此片段为"dlDNA"模板。其次，我们设 计了一段与前向引物P1F(1816-I832nt)有部分重叠的PNA(1806-1825nt)序列。此设计可 以使PNA与rcDNA完全互补配对结合，而只有部分碱基与dlDNA互补配对。因此，在优化的 退火条件下，可以使PNA只能与rcDNA结合而不能与dlDNA结合，从而实现对rcDNA扩增的 抑制。为此，我们在标准PCR流程中，外加了一步PNA退火的温度，使其优先于前向引物退 火结合rcDNA，阻断PCR对rcDNA的扩增。
[0035] 下面通过病人样本分析完整过程来具体进行说明。
[0036] 1、200 μ 1血清标本中HBV DNA模板按天根生化科技有限公司的病毒DNA提取试剂 盒的说明书操作提取。溶于20 μ 1蒸馏水中。
[0037] 2、根据Hpy8I和KlenowDNA聚合酶的说明书对HBV DNA模板进行处理，操作步骤 如下：
[0038] 按下表在冰上I. 5ml的EP内配备酶切和修补的反应体系10 μ 1 :
[0039]
[0040] 配完后，简短离心，收集液体至管底，在37°C孵育15分钟，45°C孵育15分钟。
[0041] 3、PNA钳位的实时定量PCR
[0042] 取上述处理后的HBV DNA模板进行实时定量PCR，体系配置如下：
[0043] 按下表在冰上准备PCR反应液：
[0044]
[0046] 每个标准品和样本都对应的有两组，不加 PNA组和加 PNA组，最后加个空白对照 组。将上述体系配好后，加入毛细玻璃管中，放入低温高速离心机内4500rpm/分钟，离心2 分钟，然后将毛细玻璃管放入荧光定量PCR仪上。设定PCR的流程如下：95°C预变性15分 钟，95°C 10秒，64°C 15秒，52°C 15秒，72°C 30秒，共反应40个循环。
[0047] 优化条件：PNA的终浓度为500nM，PCR引物的终浓度为250nM，95°C预变性15分 钟，95°C变性10秒，64°C PNA优先退火15秒，52°C PCR引物退火15秒（图2. C)。在此条 件下，PNA可以抑制rcDNA的扩增在200倍左右，而对dlDNA的扩增没有影响（图3. A)。因 此，该方法的检测灵敏度为0. 5%，由于血清中HBV dlDNA比例远高于0. 5%，所以此方法的 灵敏度足以应用于检测临床血清样本中HBV dlDNA比例。
[0048] 将定量PCR检测结果中的HBV dlDNA定量值（加 PNA组）和总HBV DNA (无 PNA 组）相除，得到dlDNA比例。
[0049] 为了检测该方法的线性范围，我们将dlDNA和rcDNA的模拟物按不同的已知比例 混合，然后用该方法检测。结果显示，PNA钳位qPCR的检测结果与理论值一致（图3. B)。
[0050] 实施例4 PNA钳位qPCR检测dlDNA比例的准确性验证
[0051] 为了进一步验证该方法的准确性，我们挑选了 8个临床检测HBV DNA水平较高 的慢乙肝患者血清样本，按照实施例3所述的方法检测其中HBV dlDNA比例，并与经典的 Southern杂交分析结果比较。由于HBV基因组正链为长度50-90%长短不一的不完全DNA 链，因此我们对HBV DNA进行内源性修补和酶切，以获得清晰条带进行定量比较。
[0052] 如图4所示，用Quantity one软件对Southern条带灰度值进行定量分析，结果显 示，PNA钳位qPCR法与Southern杂交法的结果一致。
[0053] 实施例5 PNA钳位qPCR中Klenow聚合酶和Hpy8 I内切酶的功能评估
[0054] 为了评估Hpy8 I内切酶的功能，在存在或不存在Hpy8 I内切酶的情况下，我们分 别测定了 Klenow聚合酶修复时间。试验结果显示，在DNA模板没有用Hpy8 I内切酶进行 处理的情况下，需要用Klenow聚合酶处理30分钟，才可以完全修复HBV rcDNA ;但是，如果 在DNA模板用Hpy8 I内切酶进行处理的情况下，则用Klenow聚合酶处理1分钟，就可以完 全修复HBV rcDNA。因此，试验结果表明，Hpy8 I极大提高了修补的效率（图5A)。
[0055] 为了评估Klenow酶修补的作用，我们应用野生型的pUC18-HBVL 2-WT、和Hpy8 I 酶切位点突变的PUC18-HBV1. 2-T1804A转染H印G2细胞后培养3天，上清中HBV dlDNA比例 用PNA钳位qPCR检测。然后将二者的模板分成四组分别进行不同处理即：l)Klen 〇W+Hpy8 I处理组，2) Klenow酶修补组，3) Hpy8 I内切酶切组，4)对照组（不经二者处理）。结果如 图5B/C所示。pUC18-HBVl. 2、pUC18-HBVl. 2-T1804A转染H印G2细胞的培养上清中，对照 组HBV dlDNA比例显著高于Hpy8 I酶切和Klenow酶修补组。然而，样本经Hpy8 I酶切和 Klenow酶修补组结果与Klenow聚合酶修补组的检测结果没有统计学差异。这表明Klenow 聚合酶对HBV DNA模板的修补是必须环节。但在Klenow聚合酶充分修补情况下（30分钟 以上），Hyp8 I内切酶的酶切并非必要。
[0056] 参考文献
[0057] [1]. Seeger, C. and ff. S. Mason, Hepatitis B virus biology. Microbiol Mol Biol Rev, 2000. 64(1) :p. 51-68.
[0058] [2]. Toh, S. T. , et al. , Deep sequencing of the hepatitis B virus in hepatocellular carcinoma patients reveals enriched integration events, structural alterations and sequence variations. Carcinogenesis, 2013. 34(4 ):p. 787-98.
[0059] [3]. Sung, ff. K. , et al. , Genome-wide survey of recurrent HBV integration in hepatocellular carcinoma. Nat Genet, 2012. 44(7):p.765-9.
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[0063] [7]. Buchardt, 0. , et al. , Peptide nucleic acids and their potential applications in biotechnology. Trends Biotechnol,1993.11 (9):p.384-6 。
【主权项】
1. 一种PNA钳位实时定量PCR检测HBV线性DNA比例的方法，包括如下步骤：（1)用DNA 聚合酶和核酸内切酶对HBVDNA模板进行预处理，产生相差12个碱基的不同模板；（2)利 用引物对和肽核酸对dlDNA进行选择性扩增；（3)根据定量PCR检测结果中的HBVdlDNA定 量值和总HBVDNA，计算得到dlDNA比例，其中所述引物和PNA序列以及相应位置见表1-1。2. 根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（1)中同时使用DNA聚合酶和限制性核酸 内切酶对HBVDNA模板的预处理。3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述DNA聚合酶和限制性核酸内切酶是指klenow DNA聚合酶和Hpy8I内切酶。4. 根据权利要求1所述的方法，其中在步骤⑵中设定PCR的流程如下：95°C预变性 15分钟，95°C10秒，64°C15秒，52°C15秒，72°C30秒，共反应40个循环。5. 根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（2)中，优化条件是：PNA的终浓度为 500nM，PCR引物的终浓度为250nM，95°C预变性15分钟，95°C变性10秒，64°CPNA优先退火 15秒，52°CPCR引物退火15秒。6. -种试剂盒，用于PNA钳位实时定量PCR检测HBV线性DNA比例，包括引物对、肽核 酸以及Hpy8I核酸内切酶和Klenow聚合酶，所述引物对、肽核酸如表1-1所定义。
【专利摘要】本发明公开了一种PNA钳位实时定量PCR检测HBV线性DNA比例的方法，包括如下步骤：(1)用DNA聚合酶和核酸内切酶对HBV DNA模板进行预处理，产生相差12个碱基的不同模板；(2)利用引物对和肽核酸对dlDNA进行选择性扩增，(3)根据定量PCR检测结果中的HBV dlDNA定量值和总HBV DNA，计算得到dlDNA比例。灵敏度和准确度较高，弥补了经典的Southern-Blot法的半定量，操作复杂，灵敏度低等局限性。为进一步检测分析慢乙肝患者血清中HBV dlDNA比例检测提供了技术支持。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894258
【申请号】CN201510292094
【发明人】潘孝本, 魏来
【申请人】北京大学人民医院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月1日
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