Tex19基因在胆管癌诊断和治疗中的应用
Tex19基因在胆管癌诊断和治疗中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地涉及人TEX19基因在胆管癌诊断、治疗中的用 途。
【背景技术】
[0002] 人胆管癌是继肝癌之后的第二大肝胆系恶性肿瘤。目前，手术切除或肝移植是可 能治愈人胆管癌唯一有效的治疗手段，但由于人胆管癌发病隐匿，侵袭性强，大部分患者就 诊时已出现淋巴或远处转移，导致其手术根治率低，因此总生存预后结局非常差，其5年生 存率仅为20% -40%。早期预防、早期发现、早期治疗是提高人胆管癌手术根治率和5年生 存率的关键。
[0003] 目前针对人胆管癌的诊断手段仍然有限，B超、CT、MRI等影像学检查技术仍然是 人胆管癌的主要诊断方法，但当患者出现临床症状，或影像学检查发现肿瘤时，患者大多已 是进展期肿瘤，手术切除率和根治率低，目前针对人胆管癌，仍然缺乏一种特异的和敏感的 诊断方法。
【发明内容】
[0004] 为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于胆管癌早期诊断的 分子标志物。相比传统的胆管癌的诊断方法，使用基因标志物来诊断胆管癌的具有及时性、 特异性和灵敏性，从而使患者在癌症早期就能知晓癌症风险，针对风险高低，采取相应的预 防和治疗措施。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 本发明提供了一种人TEX19基因及其表达产物在制备诊断胆管癌的产品中的应 用。
[0007] 进一步，上面所提到的诊断产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位 杂交或芯片检测TEX19基因及其表达产物的表达水平以诊断胆管癌的产品。
[0008] 进一步，所述用RT-PCR诊断胆管癌的产品至少包括一对特异扩增TEX19基因的引 物；所述用实时定量PCR诊断胆管癌的产品至少包括一对特异扩增TEX19基因的引物；所 述用免疫检测诊断胆管癌的产品包括：与TEX19蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交 诊断胆管癌的产品包括：与TEX19基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断胆管癌的 产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与TEX19蛋白特异性结合的抗体，基 因芯片包括与TEX19基因的核酸序列杂交的探针。
[0009] 优选地，所述产品包括芯片、试剂盒。
[0010] 本发明还提供了人TEX19基因在高通量测序平台中的应用。随着高通量测序技术 的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常 人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知人 TEX19基因的异常与胆管癌相关也属于人TEX19基因的用途，同样在本发明的保护范围之 内。
[0011] 本发明还提供了人TEX19基因及其表达产物在制备治疗胆管癌的药物中的应用。
[0012] 一方面，本发明所述的"治疗胆管癌的药物"包括能够括抑制胆管癌细胞生长、促 进胆管癌细胞凋亡、抑制胆管癌细胞粘附、抑制胆管癌细胞迀移和侵袭。
[0013] 另一方面，本发明所述的"治疗胆管癌的药物"的主要活性成分包括抑制TEX19基 因表达的物质、抑制TEX19基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制TEX19基因表达产物活 性的物质。
[0014] 进一步，本发明所述的治疗胆管癌的药物包括：通过干扰RNA抑制TEX19基因表 达的双链核糖核酸，或基于TEX19抗原蛋白的肿瘤疫苗、或用于抑制TEX19蛋白活性的蛋白 质。
[0015] 本发明还提供了一种用于治疗胆管癌的药物组合物，所述药物组合物包含TEX19 基因和/或其表达产物抑制剂。所述抑制剂包括抑制TEX19基因表达的物质、抑制TEX19 基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制TEX19基因表达产物活性的物质。
[0016] 进一步，本发明所述抑制剂包括：通过干扰RNA抑制TEX19基因表达的双链核糖核 酸，或基于TEX19抗原蛋白的肿瘤疫苗、或用于抑制TEX19蛋白活性的蛋白质。
[0017] 本发明还提供了上述TEX19基因和/或其表达产物抑制剂在制备治疗胆管癌药物 中的应用。
[0018] 在本发明中，所述RNA干扰（RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保 守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现 象。使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于探索基因 功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。以细胞为基础的RNAi筛选在功能基因学 研宄方面具有许多优势，主要表现在大多数细胞类型都能使用RNAi方法，并且相对较容易 下调或沉默任何目的基因的表达。
[0019] 为了确保TEX19基因能够被高效剔除或沉默，根据TEX19基因的mRNA序列设计 了 siRNA特异性片段。siRNA的设计根据已发表的通用设计原则（Elbashir et.al 2001， Schwarz et.al 2003, Khvorova et.al 2003, Reynolds et.al 2004, Hsieh et.al2004, Ui-Tei et.al 2004)，通过在线工具完成设计，该在线工具为：siRNASelectionProgram of Whitehead Institute (BingbingYuan et.al 2004, http://jura.wi.mit.edu/ bioc/siRNAext/)和 BLOCK-iTTM RNAi Designer ofINVITROGEN (winner of the 2004Frost&SulIivan Excellence in Research Award, https ://rnaidesigner. invitrogen. com/sirna/)。为了进一步提高siRNA片断的有效性，综合两个在线设计工具 的优点来设计用于筛选的siRNA片断。最后，通过同源性比对（NCBI BLAST)来过滤siRNA 序列，以提高siRNA片断的特异性并减少RNAi干扰的脱靶效应。
[0020] 本发明的药物还包括药学上可接受的载体，载体，这类载体包括（但并不限于）： 稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚 乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合 物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和 镁、聚乙二醇等。
[0021] 本发明的药物还可与其他治疗胆管癌的药物联用，多种药物联合使用可以大大提 到治疗的成功率。
[0022] 本发明还提供了一种诊断胆管癌的产品，所述产品包括但不限于芯片、试剂盒。
[0023] 其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定 在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测TEX19基因转录水平的针对 TEX19基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的TEX19 蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括人TEX19基因在内的多个基因（例如，与 胆管癌相关的多个基因）的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括人TEX19蛋白在内 的多个蛋白质（例如与胆管癌相关的多个蛋白质）的表达水平。通过将多个与胆管癌的标 志物同时检测，可大大提高胆管癌诊断的准确率。
[0024] 其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试 剂盒包括用于检测TEX19基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括TEX19蛋白 的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯 片方法检测TEX19基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对TEX19基 因的引物和/或探针。根据SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测 TEX19基因表达水平的引物和探针。
[0025] 与TEX19基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其 它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结 合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述 探针的长度可长至60、80、100、150、3 00个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针 长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最 长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探 针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
[0026] 进一步，所述TEX19蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述TEX19 蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰（例如，，嵌合抗体、scFv、 Fab、F(ab'）2、Fv等。只要所述片段能够保留与TEX19蛋白的结合能力即可。用于蛋白质 水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗 体。
[0027] 在本发明的上下文中，"TEX19基因"包括人TEX19基因以及人TEX19基因的任何功 能等同物的多核苷酸。TEX19基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中TEX19 基因（NC_000017. 11)DNA序列具有70%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
[0028] 优选地，TEX19基因的编码序列包括以下任--种DNA分子：
[0029] (1)序列表中SEQ ID NO. 1所示的DNA序列；
[0030] (2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
[0031] (3)与（1)或⑵限定的DNA序列具有70%、优选地，90%以上同源性，且编码相 同功能蛋白质的DNA分子。
[0032] 在本发明的具体实施方案中，所述TEX19基因的编码序列是SEQ ID NO. 1所示的 DNA序列。
[0033] 在本发明的上下文中，TEX19基因表达产物包括人TEX19蛋白以及人TEX19蛋白 的部分肽。所述TEX19蛋白的部分肽含有与胆管癌相关的功能域。
[0034] "TEX19蛋白"包括人TEX19蛋白以及人TEX19蛋白的任何功能等同物。所述功 能等同物包括人TEX19蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异 体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人TEX19的DNA杂交的DNA所编 码的蛋白质。
[0035] 优选地，TEX19蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
[0036] (1)由序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0037] (2)将SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且与SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO. 2所示 的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地 1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
[0038] (3)与SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性（又称为序列同一 性），更优选地，与SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列至少约90%至95%的同源性，常为96%、 97%、98%、99%同源性的氨基酸序列构成的多肽。
[0039] 在本发明的具体实施方案中，所述TEX19蛋白是具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸 序列的蛋白质。
[0040] 通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。 本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、 缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相 似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
[0041] 通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是TEX19蛋白的融 合蛋白。对于与TEX19蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留TEX19 蛋白的生物学活性即可。
[0042] 本发明的TEX19蛋白也包括对SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只 要经过修饰的蛋白质仍然能够保留TEX19蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突 变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
[0043] 在本发明的上下文中，"诊断胆管癌"既包括判断受试者是否已经患有胆管癌、也 包括判断受试者是否存在患有胆管癌的风险。
[0044] 在本发明的上下文中，"治疗胆管癌"从疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓 解、疾病的完全治愈；从药物发挥的作用不同，可以包括抑制细胞生长、促进细胞凋亡、抑制 细胞粘附、抑制细胞迀移和侵袭。
[0045] 本发明的优点和有益效果：
[0046] 本发明首次发现了 TEX19基因表达与胆管癌相关，通过检测受试者胆管黏膜中 TEX19的表达，可以判断受试者是否患有胆管癌、或者判断受试者是否存在患有胆管癌的风 险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
[0047] 本发明发现了一种新的分子标记物-TEX19基因，相比传统的检测手段，基因诊断 更及时、更特异、更灵敏，能够实现胆管癌的早期诊断，从而降低胆管癌的死亡率。
【附图说明】
[0048] 图1显示利用RT-PCR检测TEX19基因在胆管癌组织中的表达情况；
[0049] 图2显示利用RT-PCR检测siRNA对TEX19基因表达的影响；
[0050] 图3显示利用MTT检测TEX19基因表达对胆管癌细胞生长的影响。
[0051] 具体的实施方式
[0052] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0053] 实施例1筛选与胆管癌相关的基因标志物
[0054] I. 1样品收集
[0055] 各收集8例正常胆管组织和胆管癌组织样本。上述样本为胆管癌患者的手术切除 标本，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。
[0056] I. 2RNA样品的制备及质量分析
[0057] I. 2. IRNA样品的制备
[0058] 使用QIAGEN公司的组织RNA提取试剂盒提前总RNA。具体步骤如下：
[0059] 1)在较少RNase干扰的清洁区，使用含适量液氮的研钵称取离体肝癌组织样本约 20mg，用件棒研磨至粉末状；
[0060] 2)将样本转移到一个不含RNA酶的2mL的离心管中；
[0061] 3)加入300 μ I Lysis solution，置于勾衆器内，充分研磨l_5min ;
[0062] 4) 12000g，4°C，离心10min，转移上清至新的I. 5mL的离心管中；
[0063] 5)加入 600 μ I RNase-Free Water，用游祸器混勾；
[0064] 6)加入20 μ 1蛋白酶K，在55°C温浴15min，不断涡旋混匀；
[0065] 7) 14000g，室温，离心lmin，使细胞碎片沉淀于离心管底部，取上清转移到另外一 个不含RNA酶I. 5mL的离心管中；
[0066] 8)加入450 μ 1的95 %乙醇，涡旋混匀；
[0067] RNA 吸附：
[0068] 9)取650 μ 1含乙醇的裂解液加到离心柱中，HOOOg离心Imin ;
[0069] 10)弃下层，重置收集管于柱上；
[0070] 11)依照裂解液的容量，重复9)~10)步；
[0071] 12)加入 400 μ I Wash solution，14000g 离心 2min ;
[0072] 13)弃下层，将柱置于一新的收集管上；
[0073] DNase 处理：
[0074] 14)加入 100 μ I Enzyme Incubation Buffer 和 15 μ I DNase I，14000g 离心 Imin ；
[0075] 15)将收集管中的溶液重新移入柱中；
[0076] 16)室温放置 15min ; [0077] RNA 洗涤：
[0078] 17)加入400 μ I Wash solution，14000g离心lmin，弃下层，重置收集管于柱上；
[0079] 18)加入 400 μ I Wash solution，14000g 离心 2min，弃收集管；
[0080] RNA 洗脱：
[0081] 19)把柱子放入 I. 7mL Elution 管中；
[0082] 20)加入 30 μ I Elution Buffer
[0083] 21) 200g离心2min，使溶液充分与柱结合，然后14000g离心Imin ;
[0084] 22)将RNA使用无 RNA去离子水溶解，待用。
[0085] I. 2. 2RNA样品的质量分析（NanoDroplOOO分光光度计）
[0086] NanoDroplOOO分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：0D260/0D280 为 1. 8-2. 2〇
[0087] I. 2. 3RNA 样品的质量分析（Agilent Technologies 2100Bioanalyzer)
[0088] 将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，Agilent Technologies 2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，观察28S rRNA和18S rRNA主带明显、无降解、RNA完 整性指数合格、浓度达到要求的符合RNA-seq测序cDNA文库构建的要求，可以用于文库构 建及测序。
[0089] 1. 3高通量转录组测序
[0090] I. 3. lRNA-seq 读段定位
[0091] 首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat vl. 3. 1将清洁片段与 UCSC H. sapiens参考基因组（hgl9)进行匹配，H. sapiens UCSC hgl9版的预先构建的索引 从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段（默 认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立 可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我 们使用TopHat方法的系统默认参数。
[0092] 1. 3. 2转录丰度评估
[0093] 匹配上的读段文件通过 Cuff links vl. 0· 3 处理，Cuff links vl. 0· 3 将 RNA-seq 片 段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定 基因 Ikb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。 Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载（Homo_sapiens. GRCh37. 63. gtf) Ο
[0094] I. 3· 3差异表达基因的检测
[0095] 将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff， Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表 达。在Cuffidff输出中只有q值<0. 01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
[0096] 1. 4 结果
[0097] RNA-seq结果显示，TEX19基因在胆管癌组织中的表达量显著高于正常的胆管组 织。
[0098] 实施例2 RT-PCR测序验证TEX19基因的差异表达
[0099] 1、根据高通量测序的检测结果选择TEX19基因进行大样本RT-PCR验证。按照实 施例1中的样本收集方式选择胆管癌组织和正常胆管组织各80例。
[0100] 2、RNA提取步骤同实施例1。
[0101] 3、逆转录：使用TAKARA公司的反转录试剂盒进行操作。具体步骤如下：
[0102] (1)取总RNA2 μ g进行逆转录，加入Oligo (dT) 2 μ 1，充分混匀。70°C水浴5分钟 后，立即冰浴2-3分钟。
[0103] (2)构建25以1反应体系，其中包括5\逆转录缓冲液5以1，（1阶13(2.51111)5 4 1， RNasin 40U/yl，M-MLV 20〇υ/μ1，补无核酶水至预期体积。
[0104] (3) 42°C水浴60分钟后，95°C水浴5分钟以灭活M-MLV。
[0105] (4)-20 ? 储存备用。
[0106] 4、PCR 扩增
[0107] (1)引物设计
[0108] 根据Genbank中TEX19基因和β-actin基因的编码序列设计RT-PCR扩增引物， 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
[0109] TEX19 基因：
[0110] TEX19 :正向引物为 5' -TCAGAGGGAAGCATTACAAAT-3'（SEQ ID NO. 3);
[0111] TEX19 :反向引物为 5' -GCCAACACATCCAGAACTA-3'（SEQ ID NO. 4)。
[0112] β-actin 基因：
[0113] β -actin :正向引物为 5' -CATCCTGCGTCTGGACCT-3'（SEQ ID NO. 5);
[0114] β -actin :反向引物为 5' -GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3'（SEQ ID NO. 6)。
[0115] (2)按照表1配制PCR反应体系：
[0116] 表1PCR反应体系
[0117] __
[0119] (3)?0?反应条件：变性95°0，111^11;退火55°0，11^11 ;延伸72°0，11^11;最后72°〇 延伸 lOmin，30 个循环；β -actin :变性 94°C，Imin ;退火 56°C，Imin ;延伸 72°C，Imin ;最后 72°C延伸10min，35个循环。
[0120] (4)各组取5 μ 1进行琼脂糖凝胶电泳。以DNA条带的亮度来衡量DNA量，条带越 亮，代表DNA量越多。以β-actin作内参对照，将ΤΕΧ19基因扩增产物的条带的亮度进行 均一化处理，比较胆管癌组织和正常的胆管组织中ΤΕΧ19基因扩增产物的亮度的比值。
[0121] 5、统计学方法
[0122] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表 示，采用SPSS13. 0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P〈0. 05 时具有统计学意义。
[0123] 6、结果
[0124] 如图1所示，与正常胆管组织相比，TEX19基因在胆管癌组织中的表达上调，同 RNA-sep结果一致。
[0125] 实施例3抑制TEX19基因表达
[0126] 1、细胞培养：人胆管癌细胞株QBC939,以含10%小牛血清的DMEM(高糖）培养基 在37°C、5% CO2、相对湿度为90%的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0. 25%胰蛋白酶 常规消化传代。
[0127] 2、siRNA 设计
[0128] 针对 TEX19 的 siRNA 序列：
[0129] siRNAl-TEX19 ：
[0130] 正义链为 5' -UUGAACUUCUGGAAAUGUCUU-3'（SEQ ID NO. 7);
[0131] 反义链为 5' -GACAUUUCCAGAAGUUCAAGC-3'（SEQ ID NO. 8)，
[0132] siRNA2-TEX19 ：
[0133] 正义链为 5' -UGUUGAAGCUGAUACAUCCAG-3'（SEQ ID NO. 9);
[0134] 反义链为 5' -GGAUGUAUCAGCUUCAACAUG-3'（SEQ ID NO. 10)，
[0135] siRNA3-TEX19 ：
[0136] 正义链为 5' -UAACGAUGUUUCUAGAAUGCU-3'（SEQ ID NO. 11);
[0137] 反义链为 5' -CAUUCUAGAAACAUCGUUAAC-3'（SEQ ID NO. 12，
[0138] 阴性对照 siRNA 序列（siRNA-NC):
[0139] 正义链为 5' -CGUACGCGGAAUACUUCGA-3'（SEQ ID NO. 13);
[0140] 反义链为 5' -UCGAAGUAUUCCGCGUACG-3'（SEQ ID NO. 14)。
[0141] 将细胞按IX 1〇4/孔接种到24孔细胞培养板中，在37°C、5% 0)2培养箱中细胞培 养24h，在无双抗、含10% FBS的DMEM培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于 Invitrogen公司）的说明书转染，实验分为阴性对照组和实验组（20nM)，其中阴性对照组 siRNA与TEX19基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔。同时分别转染。
[0142] 3、RT-PCR检测TEX19基因的转录水平
[0143] 3. 1细胞总RNA的提取
[0144] 米用 TRIzol Reagent (Invitrogen Cat. No. 15596-018)总 RNA 提取试剂，按说明 书提供方法提取QBC939细胞的总RNA。具体方法为：取细胞，用浓度为0.0 lM的PBS冲洗 3次，加入适量TRIzoI试剂，室温放置5min裂解细胞，吹打均匀后以ImL/管分装至I. 5mL Eppendorf管中。每管加入0· 2mL氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2_3min，4°C、12000r/min 离心15min，将上层水相移至干净Eppendorf管中，加入0. 5mL异丙醇，轻轻混勾，室温放置 lOmin，4°C、7500r/min 离心 lOmin。弃上清，75% 乙醇洗绦 RNA 沉淀，7500r/min 离心 5min， 室温干燥RNA沉淀，5-10min后溶于适量DEPC水。质量分数为1.0 %的琼脂糖凝胶电泳检 测RNA样本的完整性，应用Bio-Photometer对提取的RNA进行定量测定。
[0145] 3. 2逆转录步骤同实施例2。
[0146] 3. 3RT-PCR扩增步骤同实施例2。
[0147] 4、统计学方法
[0148] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表 示，采用SPSS13. 0统计软件来进行统计分析的，干扰TEX19基因表达组与对照组之间的差 异采用t检验，认为当P〈0. 05时具有统计学意义。
[0149] 5、结果
[0150] 结果如图 2 显示，与 siRNA2-TE)(19、siRNA3-TEX19 相比，siRNAl-TE)(19 能够更有 效的抑制TEX19基因的表达，差异具有统计学意义（P〈0. 05)。
[0151] 实施例4 TEX19基因对胆管癌细胞增殖的影响
[0152] 采用MTT实验检测TEX19基因对胆管癌细胞增殖能力影响。
[0153] 1、细胞培养与转染步骤同实施例3。
[0154] 2、步骤：各组细胞转染12h后胰酶消化，制成单细胞悬液，以每孔6000个细胞接种 于96孔培养板中，每组分7个时间点，每个时间点设6个复孔。细胞贴壁后，进行第1次检 测：每孔加入5g/L的MTT液20 μ 1，继续培养4h后，吸去培养基，加入DMSO 150 μ 1，细心吹 打，使紫蓝色沉淀充分溶解，用酶标仪在490nm波长测吸光度值（Α值）。然后每12h检测1 次，连续测72h，共7次。本实验重复3次。
[0155] 3、统计学方法
[0156] 实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS13. 0统计软件来进行统计分析的，两 者之间的差异采用t检验，认为当P〈0. 05时具有统计学意义。
[0157] 4、结果
[0158] 图3所示的结果显示：siRNAl_TEX19组的细胞生长速度明显低于转染SiRNA-NC 组的细胞生长速度，差异具有统计学意义（P〈〇. 05)，上述结果表明TEX19表达有利于胆管 癌细胞的生长，通过抑制TEX19基因的表达可以抑制胆管癌细胞的生长。
[0159] 实施例5 TEX19基因对胆管癌细胞对细胞凋亡的影响
[0160] 1、细胞培养步骤同实施例3。
[0161] 2、细胞转染QBC939细胞悬液3. OX IOVml接种于预置盖玻片的6孔板，之后按照 实施例3的步骤进行转染。
[0162] 3、TUNEL法原位检测细胞凋亡：转染48h后，取出盖玻片用新鲜配制的4%多聚甲 醛固定，按TUNEL试剂盒（购自武汉博士德生物工程有限公司）说明书进行操作，BLIP/NBT 显色，核固红复染，甘油封片。用PBS代替TUNEL染色液作对照组，高倍镜下计数300个细 胞。TUNEL凋亡指数计算公式为：阳性细胞数/总细胞数。
[0163] 4、统计学方法
[0164] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表 示，采用SPSS13. 0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P〈0. 05 时具有统计学意义。
[0165] 5、结果：
[0166] 转染siRNA-NC组的细胞凋亡指数为0. 016±0. 004,转染siRNAl-TEX19组的细胞 凋亡指数为0. 112±0. 006,差异具有统计学意义（P〈0. 05)，上述结果表明，TEX19表达有利 于胆管癌细胞存活，通过抑制TEX19基因的表达可以促进胆管癌细胞的凋亡。
[0167] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进 和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 人TEX19基因及其表达产物在制备诊断胆管癌的产品中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量 PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测TEX19基因及其表达产物的表达水平以诊断胆管癌的 产品。3. 人TEX19基因在高通量测序平台中的应用，其特征在于，通过高通量测序能够获知 TEX19基因的表达异常与胆管癌的发生和发展相关。4. 人TEX19基因及其表达产物在制备治疗胆管癌的药物中的应用。5. -种诊断胆管癌的产品，其特征在于，所述产品能够通过检测胆管组织中TEX19基 因的表达来诊断胆管癌。6. 根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片、或试剂盒。其中，所 述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡 核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测TEX19基因转录水平的针对TEX19基因的寡 核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的TEX19蛋白的特异性抗 体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用 于检测TEX19基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括TEX19蛋白的特异性抗 体。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括针对TEX19基因的引物和 /或探针。8. -种用于治疗胆管癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含TEX19基因 和/或其表达产物抑制剂。9. 根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述抑制剂是针对TEX19的 siRNA〇10. 权利要求8或9所述的抑制剂在制备治疗胆管癌的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了TEX19基因及其表达产物可以作为胆管癌早期诊断的分子标志物。本发明使用RNA-sep筛选并通过大样本RT-PCR证实，TEX19基因表达异常与胆管癌的发生和发展相关。根据本发明的研究成果，可以研发能够抑制胆管组织中TEX19基因表达或者能够抑制TEX19基因表达产物功能的药物，从而实现临床上对于胆管癌的预防和治疗。
【IPC分类】C12Q1/68, A61K48/00, A61K31/713, G01N33/574, A61K39/00, A61K45/00, A61P35/00, G01N33/68
【公开号】CN104894259
【申请号】CN201510292161
【发明人】杨承刚, 果春青, 宋宏涛
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月1日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地涉及人TEX19基因在胆管癌诊断、治疗中的用 途。
【背景技术】
[0002] 人胆管癌是继肝癌之后的第二大肝胆系恶性肿瘤。目前，手术切除或肝移植是可 能治愈人胆管癌唯一有效的治疗手段，但由于人胆管癌发病隐匿，侵袭性强，大部分患者就 诊时已出现淋巴或远处转移，导致其手术根治率低，因此总生存预后结局非常差，其5年生 存率仅为20% -40%。早期预防、早期发现、早期治疗是提高人胆管癌手术根治率和5年生 存率的关键。
[0003] 目前针对人胆管癌的诊断手段仍然有限，B超、CT、MRI等影像学检查技术仍然是 人胆管癌的主要诊断方法，但当患者出现临床症状，或影像学检查发现肿瘤时，患者大多已 是进展期肿瘤，手术切除率和根治率低，目前针对人胆管癌，仍然缺乏一种特异的和敏感的 诊断方法。
【发明内容】
[0004] 为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于胆管癌早期诊断的 分子标志物。相比传统的胆管癌的诊断方法，使用基因标志物来诊断胆管癌的具有及时性、 特异性和灵敏性，从而使患者在癌症早期就能知晓癌症风险，针对风险高低，采取相应的预 防和治疗措施。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 本发明提供了一种人TEX19基因及其表达产物在制备诊断胆管癌的产品中的应 用。
[0007] 进一步，上面所提到的诊断产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位 杂交或芯片检测TEX19基因及其表达产物的表达水平以诊断胆管癌的产品。
[0008] 进一步，所述用RT-PCR诊断胆管癌的产品至少包括一对特异扩增TEX19基因的引 物；所述用实时定量PCR诊断胆管癌的产品至少包括一对特异扩增TEX19基因的引物；所 述用免疫检测诊断胆管癌的产品包括：与TEX19蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交 诊断胆管癌的产品包括：与TEX19基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断胆管癌的 产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与TEX19蛋白特异性结合的抗体，基 因芯片包括与TEX19基因的核酸序列杂交的探针。
[0009] 优选地，所述产品包括芯片、试剂盒。
[0010] 本发明还提供了人TEX19基因在高通量测序平台中的应用。随着高通量测序技术 的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常 人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知人 TEX19基因的异常与胆管癌相关也属于人TEX19基因的用途，同样在本发明的保护范围之 内。
[0011] 本发明还提供了人TEX19基因及其表达产物在制备治疗胆管癌的药物中的应用。
[0012] 一方面，本发明所述的"治疗胆管癌的药物"包括能够括抑制胆管癌细胞生长、促 进胆管癌细胞凋亡、抑制胆管癌细胞粘附、抑制胆管癌细胞迀移和侵袭。
[0013] 另一方面，本发明所述的"治疗胆管癌的药物"的主要活性成分包括抑制TEX19基 因表达的物质、抑制TEX19基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制TEX19基因表达产物活 性的物质。
[0014] 进一步，本发明所述的治疗胆管癌的药物包括：通过干扰RNA抑制TEX19基因表 达的双链核糖核酸，或基于TEX19抗原蛋白的肿瘤疫苗、或用于抑制TEX19蛋白活性的蛋白 质。
[0015] 本发明还提供了一种用于治疗胆管癌的药物组合物，所述药物组合物包含TEX19 基因和/或其表达产物抑制剂。所述抑制剂包括抑制TEX19基因表达的物质、抑制TEX19 基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制TEX19基因表达产物活性的物质。
[0016] 进一步，本发明所述抑制剂包括：通过干扰RNA抑制TEX19基因表达的双链核糖核 酸，或基于TEX19抗原蛋白的肿瘤疫苗、或用于抑制TEX19蛋白活性的蛋白质。
[0017] 本发明还提供了上述TEX19基因和/或其表达产物抑制剂在制备治疗胆管癌药物 中的应用。
[0018] 在本发明中，所述RNA干扰（RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保 守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现 象。使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于探索基因 功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。以细胞为基础的RNAi筛选在功能基因学 研宄方面具有许多优势，主要表现在大多数细胞类型都能使用RNAi方法，并且相对较容易 下调或沉默任何目的基因的表达。
[0019] 为了确保TEX19基因能够被高效剔除或沉默，根据TEX19基因的mRNA序列设计 了 siRNA特异性片段。siRNA的设计根据已发表的通用设计原则（Elbashir et.al 2001， Schwarz et.al 2003, Khvorova et.al 2003, Reynolds et.al 2004, Hsieh et.al2004, Ui-Tei et.al 2004)，通过在线工具完成设计，该在线工具为：siRNASelectionProgram of Whitehead Institute (BingbingYuan et.al 2004, http://jura.wi.mit.edu/ bioc/siRNAext/)和 BLOCK-iTTM RNAi Designer ofINVITROGEN (winner of the 2004Frost&SulIivan Excellence in Research Award, https ://rnaidesigner. invitrogen. com/sirna/)。为了进一步提高siRNA片断的有效性，综合两个在线设计工具 的优点来设计用于筛选的siRNA片断。最后，通过同源性比对（NCBI BLAST)来过滤siRNA 序列，以提高siRNA片断的特异性并减少RNAi干扰的脱靶效应。
[0020] 本发明的药物还包括药学上可接受的载体，载体，这类载体包括（但并不限于）： 稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚 乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合 物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和 镁、聚乙二醇等。
[0021] 本发明的药物还可与其他治疗胆管癌的药物联用，多种药物联合使用可以大大提 到治疗的成功率。
[0022] 本发明还提供了一种诊断胆管癌的产品，所述产品包括但不限于芯片、试剂盒。
[0023] 其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定 在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测TEX19基因转录水平的针对 TEX19基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的TEX19 蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括人TEX19基因在内的多个基因（例如，与 胆管癌相关的多个基因）的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括人TEX19蛋白在内 的多个蛋白质（例如与胆管癌相关的多个蛋白质）的表达水平。通过将多个与胆管癌的标 志物同时检测，可大大提高胆管癌诊断的准确率。
[0024] 其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试 剂盒包括用于检测TEX19基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括TEX19蛋白 的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯 片方法检测TEX19基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对TEX19基 因的引物和/或探针。根据SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测 TEX19基因表达水平的引物和探针。
[0025] 与TEX19基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其 它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结 合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述 探针的长度可长至60、80、100、150、3 00个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针 长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最 长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探 针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
[0026] 进一步，所述TEX19蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述TEX19 蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰（例如，，嵌合抗体、scFv、 Fab、F(ab'）2、Fv等。只要所述片段能够保留与TEX19蛋白的结合能力即可。用于蛋白质 水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗 体。
[0027] 在本发明的上下文中，"TEX19基因"包括人TEX19基因以及人TEX19基因的任何功 能等同物的多核苷酸。TEX19基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中TEX19 基因（NC_000017. 11)DNA序列具有70%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
[0028] 优选地，TEX19基因的编码序列包括以下任--种DNA分子：
[0029] (1)序列表中SEQ ID NO. 1所示的DNA序列；
[0030] (2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
[0031] (3)与（1)或⑵限定的DNA序列具有70%、优选地，90%以上同源性，且编码相 同功能蛋白质的DNA分子。
[0032] 在本发明的具体实施方案中，所述TEX19基因的编码序列是SEQ ID NO. 1所示的 DNA序列。
[0033] 在本发明的上下文中，TEX19基因表达产物包括人TEX19蛋白以及人TEX19蛋白 的部分肽。所述TEX19蛋白的部分肽含有与胆管癌相关的功能域。
[0034] "TEX19蛋白"包括人TEX19蛋白以及人TEX19蛋白的任何功能等同物。所述功 能等同物包括人TEX19蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异 体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人TEX19的DNA杂交的DNA所编 码的蛋白质。
[0035] 优选地，TEX19蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
[0036] (1)由序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0037] (2)将SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且与SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO. 2所示 的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地 1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
[0038] (3)与SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性（又称为序列同一 性），更优选地，与SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列至少约90%至95%的同源性，常为96%、 97%、98%、99%同源性的氨基酸序列构成的多肽。
[0039] 在本发明的具体实施方案中，所述TEX19蛋白是具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸 序列的蛋白质。
[0040] 通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。 本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、 缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相 似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
[0041] 通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是TEX19蛋白的融 合蛋白。对于与TEX19蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留TEX19 蛋白的生物学活性即可。
[0042] 本发明的TEX19蛋白也包括对SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只 要经过修饰的蛋白质仍然能够保留TEX19蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突 变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
[0043] 在本发明的上下文中，"诊断胆管癌"既包括判断受试者是否已经患有胆管癌、也 包括判断受试者是否存在患有胆管癌的风险。
[0044] 在本发明的上下文中，"治疗胆管癌"从疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓 解、疾病的完全治愈；从药物发挥的作用不同，可以包括抑制细胞生长、促进细胞凋亡、抑制 细胞粘附、抑制细胞迀移和侵袭。
[0045] 本发明的优点和有益效果：
[0046] 本发明首次发现了 TEX19基因表达与胆管癌相关，通过检测受试者胆管黏膜中 TEX19的表达，可以判断受试者是否患有胆管癌、或者判断受试者是否存在患有胆管癌的风 险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
[0047] 本发明发现了一种新的分子标记物-TEX19基因，相比传统的检测手段，基因诊断 更及时、更特异、更灵敏，能够实现胆管癌的早期诊断，从而降低胆管癌的死亡率。
【附图说明】
[0048] 图1显示利用RT-PCR检测TEX19基因在胆管癌组织中的表达情况；
[0049] 图2显示利用RT-PCR检测siRNA对TEX19基因表达的影响；
[0050] 图3显示利用MTT检测TEX19基因表达对胆管癌细胞生长的影响。
[0051] 具体的实施方式
[0052] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0053] 实施例1筛选与胆管癌相关的基因标志物
[0054] I. 1样品收集
[0055] 各收集8例正常胆管组织和胆管癌组织样本。上述样本为胆管癌患者的手术切除 标本，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。
[0056] I. 2RNA样品的制备及质量分析
[0057] I. 2. IRNA样品的制备
[0058] 使用QIAGEN公司的组织RNA提取试剂盒提前总RNA。具体步骤如下：
[0059] 1)在较少RNase干扰的清洁区，使用含适量液氮的研钵称取离体肝癌组织样本约 20mg，用件棒研磨至粉末状；
[0060] 2)将样本转移到一个不含RNA酶的2mL的离心管中；
[0061] 3)加入300 μ I Lysis solution，置于勾衆器内，充分研磨l_5min ;
[0062] 4) 12000g，4°C，离心10min，转移上清至新的I. 5mL的离心管中；
[0063] 5)加入 600 μ I RNase-Free Water，用游祸器混勾；
[0064] 6)加入20 μ 1蛋白酶K，在55°C温浴15min，不断涡旋混匀；
[0065] 7) 14000g，室温，离心lmin，使细胞碎片沉淀于离心管底部，取上清转移到另外一 个不含RNA酶I. 5mL的离心管中；
[0066] 8)加入450 μ 1的95 %乙醇，涡旋混匀；
[0067] RNA 吸附：
[0068] 9)取650 μ 1含乙醇的裂解液加到离心柱中，HOOOg离心Imin ;
[0069] 10)弃下层，重置收集管于柱上；
[0070] 11)依照裂解液的容量，重复9)~10)步；
[0071] 12)加入 400 μ I Wash solution，14000g 离心 2min ;
[0072] 13)弃下层，将柱置于一新的收集管上；
[0073] DNase 处理：
[0074] 14)加入 100 μ I Enzyme Incubation Buffer 和 15 μ I DNase I，14000g 离心 Imin ；
[0075] 15)将收集管中的溶液重新移入柱中；
[0076] 16)室温放置 15min ; [0077] RNA 洗涤：
[0078] 17)加入400 μ I Wash solution，14000g离心lmin，弃下层，重置收集管于柱上；
[0079] 18)加入 400 μ I Wash solution，14000g 离心 2min，弃收集管；
[0080] RNA 洗脱：
[0081] 19)把柱子放入 I. 7mL Elution 管中；
[0082] 20)加入 30 μ I Elution Buffer
[0083] 21) 200g离心2min，使溶液充分与柱结合，然后14000g离心Imin ;
[0084] 22)将RNA使用无 RNA去离子水溶解，待用。
[0085] I. 2. 2RNA样品的质量分析（NanoDroplOOO分光光度计）
[0086] NanoDroplOOO分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：0D260/0D280 为 1. 8-2. 2〇
[0087] I. 2. 3RNA 样品的质量分析（Agilent Technologies 2100Bioanalyzer)
[0088] 将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，Agilent Technologies 2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，观察28S rRNA和18S rRNA主带明显、无降解、RNA完 整性指数合格、浓度达到要求的符合RNA-seq测序cDNA文库构建的要求，可以用于文库构 建及测序。
[0089] 1. 3高通量转录组测序
[0090] I. 3. lRNA-seq 读段定位
[0091] 首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat vl. 3. 1将清洁片段与 UCSC H. sapiens参考基因组（hgl9)进行匹配，H. sapiens UCSC hgl9版的预先构建的索引 从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段（默 认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立 可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我 们使用TopHat方法的系统默认参数。
[0092] 1. 3. 2转录丰度评估
[0093] 匹配上的读段文件通过 Cuff links vl. 0· 3 处理，Cuff links vl. 0· 3 将 RNA-seq 片 段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定 基因 Ikb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。 Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载（Homo_sapiens. GRCh37. 63. gtf) Ο
[0094] I. 3· 3差异表达基因的检测
[0095] 将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff， Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表 达。在Cuffidff输出中只有q值<0. 01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
[0096] 1. 4 结果
[0097] RNA-seq结果显示，TEX19基因在胆管癌组织中的表达量显著高于正常的胆管组 织。
[0098] 实施例2 RT-PCR测序验证TEX19基因的差异表达
[0099] 1、根据高通量测序的检测结果选择TEX19基因进行大样本RT-PCR验证。按照实 施例1中的样本收集方式选择胆管癌组织和正常胆管组织各80例。
[0100] 2、RNA提取步骤同实施例1。
[0101] 3、逆转录：使用TAKARA公司的反转录试剂盒进行操作。具体步骤如下：
[0102] (1)取总RNA2 μ g进行逆转录，加入Oligo (dT) 2 μ 1，充分混匀。70°C水浴5分钟 后，立即冰浴2-3分钟。
[0103] (2)构建25以1反应体系，其中包括5\逆转录缓冲液5以1，（1阶13(2.51111)5 4 1， RNasin 40U/yl，M-MLV 20〇υ/μ1，补无核酶水至预期体积。
[0104] (3) 42°C水浴60分钟后，95°C水浴5分钟以灭活M-MLV。
[0105] (4)-20 ? 储存备用。
[0106] 4、PCR 扩增
[0107] (1)引物设计
[0108] 根据Genbank中TEX19基因和β-actin基因的编码序列设计RT-PCR扩增引物， 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
[0109] TEX19 基因：
[0110] TEX19 :正向引物为 5' -TCAGAGGGAAGCATTACAAAT-3'（SEQ ID NO. 3);
[0111] TEX19 :反向引物为 5' -GCCAACACATCCAGAACTA-3'（SEQ ID NO. 4)。
[0112] β-actin 基因：
[0113] β -actin :正向引物为 5' -CATCCTGCGTCTGGACCT-3'（SEQ ID NO. 5);
[0114] β -actin :反向引物为 5' -GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3'（SEQ ID NO. 6)。
[0115] (2)按照表1配制PCR反应体系：
[0116] 表1PCR反应体系
[0117] __
[0119] (3)?0?反应条件：变性95°0，111^11;退火55°0，11^11 ;延伸72°0，11^11;最后72°〇 延伸 lOmin，30 个循环；β -actin :变性 94°C，Imin ;退火 56°C，Imin ;延伸 72°C，Imin ;最后 72°C延伸10min，35个循环。
[0120] (4)各组取5 μ 1进行琼脂糖凝胶电泳。以DNA条带的亮度来衡量DNA量，条带越 亮，代表DNA量越多。以β-actin作内参对照，将ΤΕΧ19基因扩增产物的条带的亮度进行 均一化处理，比较胆管癌组织和正常的胆管组织中ΤΕΧ19基因扩增产物的亮度的比值。
[0121] 5、统计学方法
[0122] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表 示，采用SPSS13. 0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P〈0. 05 时具有统计学意义。
[0123] 6、结果
[0124] 如图1所示，与正常胆管组织相比，TEX19基因在胆管癌组织中的表达上调，同 RNA-sep结果一致。
[0125] 实施例3抑制TEX19基因表达
[0126] 1、细胞培养：人胆管癌细胞株QBC939,以含10%小牛血清的DMEM(高糖）培养基 在37°C、5% CO2、相对湿度为90%的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0. 25%胰蛋白酶 常规消化传代。
[0127] 2、siRNA 设计
[0128] 针对 TEX19 的 siRNA 序列：
[0129] siRNAl-TEX19 ：
[0130] 正义链为 5' -UUGAACUUCUGGAAAUGUCUU-3'（SEQ ID NO. 7);
[0131] 反义链为 5' -GACAUUUCCAGAAGUUCAAGC-3'（SEQ ID NO. 8)，
[0132] siRNA2-TEX19 ：
[0133] 正义链为 5' -UGUUGAAGCUGAUACAUCCAG-3'（SEQ ID NO. 9);
[0134] 反义链为 5' -GGAUGUAUCAGCUUCAACAUG-3'（SEQ ID NO. 10)，
[0135] siRNA3-TEX19 ：
[0136] 正义链为 5' -UAACGAUGUUUCUAGAAUGCU-3'（SEQ ID NO. 11);
[0137] 反义链为 5' -CAUUCUAGAAACAUCGUUAAC-3'（SEQ ID NO. 12，
[0138] 阴性对照 siRNA 序列（siRNA-NC):
[0139] 正义链为 5' -CGUACGCGGAAUACUUCGA-3'（SEQ ID NO. 13);
[0140] 反义链为 5' -UCGAAGUAUUCCGCGUACG-3'（SEQ ID NO. 14)。
[0141] 将细胞按IX 1〇4/孔接种到24孔细胞培养板中，在37°C、5% 0)2培养箱中细胞培 养24h，在无双抗、含10% FBS的DMEM培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于 Invitrogen公司）的说明书转染，实验分为阴性对照组和实验组（20nM)，其中阴性对照组 siRNA与TEX19基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔。同时分别转染。
[0142] 3、RT-PCR检测TEX19基因的转录水平
[0143] 3. 1细胞总RNA的提取
[0144] 米用 TRIzol Reagent (Invitrogen Cat. No. 15596-018)总 RNA 提取试剂，按说明 书提供方法提取QBC939细胞的总RNA。具体方法为：取细胞，用浓度为0.0 lM的PBS冲洗 3次，加入适量TRIzoI试剂，室温放置5min裂解细胞，吹打均匀后以ImL/管分装至I. 5mL Eppendorf管中。每管加入0· 2mL氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2_3min，4°C、12000r/min 离心15min，将上层水相移至干净Eppendorf管中，加入0. 5mL异丙醇，轻轻混勾，室温放置 lOmin，4°C、7500r/min 离心 lOmin。弃上清，75% 乙醇洗绦 RNA 沉淀，7500r/min 离心 5min， 室温干燥RNA沉淀，5-10min后溶于适量DEPC水。质量分数为1.0 %的琼脂糖凝胶电泳检 测RNA样本的完整性，应用Bio-Photometer对提取的RNA进行定量测定。
[0145] 3. 2逆转录步骤同实施例2。
[0146] 3. 3RT-PCR扩增步骤同实施例2。
[0147] 4、统计学方法
[0148] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表 示，采用SPSS13. 0统计软件来进行统计分析的，干扰TEX19基因表达组与对照组之间的差 异采用t检验，认为当P〈0. 05时具有统计学意义。
[0149] 5、结果
[0150] 结果如图 2 显示，与 siRNA2-TE)(19、siRNA3-TEX19 相比，siRNAl-TE)(19 能够更有 效的抑制TEX19基因的表达，差异具有统计学意义（P〈0. 05)。
[0151] 实施例4 TEX19基因对胆管癌细胞增殖的影响
[0152] 采用MTT实验检测TEX19基因对胆管癌细胞增殖能力影响。
[0153] 1、细胞培养与转染步骤同实施例3。
[0154] 2、步骤：各组细胞转染12h后胰酶消化，制成单细胞悬液，以每孔6000个细胞接种 于96孔培养板中，每组分7个时间点，每个时间点设6个复孔。细胞贴壁后，进行第1次检 测：每孔加入5g/L的MTT液20 μ 1，继续培养4h后，吸去培养基，加入DMSO 150 μ 1，细心吹 打，使紫蓝色沉淀充分溶解，用酶标仪在490nm波长测吸光度值（Α值）。然后每12h检测1 次，连续测72h，共7次。本实验重复3次。
[0155] 3、统计学方法
[0156] 实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS13. 0统计软件来进行统计分析的，两 者之间的差异采用t检验，认为当P〈0. 05时具有统计学意义。
[0157] 4、结果
[0158] 图3所示的结果显示：siRNAl_TEX19组的细胞生长速度明显低于转染SiRNA-NC 组的细胞生长速度，差异具有统计学意义（P〈〇. 05)，上述结果表明TEX19表达有利于胆管 癌细胞的生长，通过抑制TEX19基因的表达可以抑制胆管癌细胞的生长。
[0159] 实施例5 TEX19基因对胆管癌细胞对细胞凋亡的影响
[0160] 1、细胞培养步骤同实施例3。
[0161] 2、细胞转染QBC939细胞悬液3. OX IOVml接种于预置盖玻片的6孔板，之后按照 实施例3的步骤进行转染。
[0162] 3、TUNEL法原位检测细胞凋亡：转染48h后，取出盖玻片用新鲜配制的4%多聚甲 醛固定，按TUNEL试剂盒（购自武汉博士德生物工程有限公司）说明书进行操作，BLIP/NBT 显色，核固红复染，甘油封片。用PBS代替TUNEL染色液作对照组，高倍镜下计数300个细 胞。TUNEL凋亡指数计算公式为：阳性细胞数/总细胞数。
[0163] 4、统计学方法
[0164] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表 示，采用SPSS13. 0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P〈0. 05 时具有统计学意义。
[0165] 5、结果：
[0166] 转染siRNA-NC组的细胞凋亡指数为0. 016±0. 004,转染siRNAl-TEX19组的细胞 凋亡指数为0. 112±0. 006,差异具有统计学意义（P〈0. 05)，上述结果表明，TEX19表达有利 于胆管癌细胞存活，通过抑制TEX19基因的表达可以促进胆管癌细胞的凋亡。
[0167] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进 和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 人TEX19基因及其表达产物在制备诊断胆管癌的产品中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量 PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测TEX19基因及其表达产物的表达水平以诊断胆管癌的 产品。3. 人TEX19基因在高通量测序平台中的应用，其特征在于，通过高通量测序能够获知 TEX19基因的表达异常与胆管癌的发生和发展相关。4. 人TEX19基因及其表达产物在制备治疗胆管癌的药物中的应用。5. -种诊断胆管癌的产品，其特征在于，所述产品能够通过检测胆管组织中TEX19基 因的表达来诊断胆管癌。6. 根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片、或试剂盒。其中，所 述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡 核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测TEX19基因转录水平的针对TEX19基因的寡 核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的TEX19蛋白的特异性抗 体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用 于检测TEX19基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括TEX19蛋白的特异性抗 体。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括针对TEX19基因的引物和 /或探针。8. -种用于治疗胆管癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含TEX19基因 和/或其表达产物抑制剂。9. 根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述抑制剂是针对TEX19的 siRNA〇10. 权利要求8或9所述的抑制剂在制备治疗胆管癌的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了TEX19基因及其表达产物可以作为胆管癌早期诊断的分子标志物。本发明使用RNA-sep筛选并通过大样本RT-PCR证实，TEX19基因表达异常与胆管癌的发生和发展相关。根据本发明的研究成果，可以研发能够抑制胆管组织中TEX19基因表达或者能够抑制TEX19基因表达产物功能的药物，从而实现临床上对于胆管癌的预防和治疗。
【IPC分类】C12Q1/68, A61K48/00, A61K31/713, G01N33/574, A61K39/00, A61K45/00, A61P35/00, G01N33/68
【公开号】CN104894259
【申请号】CN201510292161
【发明人】杨承刚, 果春青, 宋宏涛
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月1日
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