多物种成分实时荧光pcr联合检测方法
多物种成分实时荧光pcr联合检测方法
【专利说明】多物种成分实时荧光PCR联合检测方法 发明领域
[0001] 本发明涉及肉制品中肉类成分的实时荧光PCR检测方法，特别是涉及一种同时测 定肉制品中多种动物源成分的实时荧光PCR联合检测方法，属于食品安全检测应用技术领 域。
【背景技术】
[0002] 肉制品掺假造假是常见的现象，某些不法商贩以低价肉类代替高价肉类出售，损 害了消费者的利益，造成了不正当竞争；随着疯牛病和禽流感等疾病的流行和食品贸易的 全球化，消费者更迫切地要求知晓食品的确切成分，因此必须建立快速、准确的肉制品品 种鉴定方法。
[0003] 目前，肉制品品种鉴定方法主要有蛋白质鉴定（等电聚焦电泳、酶联免疫吸附试 验、色谱等）和分子学鉴定两类，其中以物种间基因差异为基础的分子学鉴定方法是研宄 的热点，主要原因是：① DNA比蛋白质的耐热性强，高温处理过的食品中仍能提取出小片 段的DNA，而多数蛋白质会发生变性，不能满足鉴定需要；②分子学鉴定方法不依赖于组织 和细胞的类型；③不同的基因片段进化效率不同，可以根据实验目的选择不同的目的基因 进行研宄；④DNA比蛋白质具有更尚的种间多态性，有利于品种鉴定。
[0004] 目前用于肉制品鉴定的主要分子学检测方法及其优缺点：
[0005] I. PCR-FINS :该方法是基于特定基因片段的序列差异来鉴定物种，由4个步骤组 成：①建立从广泛的生物样品中分离DNA的方法，包括处理过的食品（罐头、半加工、压制、 盐渍、熏制）；②应用通用引物扩增出特定的DNA片段；③对扩增的DNA片段进行测序；④将 这个核酸序列与被提交数据库进行序列比对，从而直接鉴定出物种或者找到数据库中与 其亲缘关系最接近的物种。优点：可以直接判断食品中未知成分的种属来源。缺点：由于使 用了通用引物，混合物中通常有多种成分被同时扩增，会造成测序结果的杂乱，因此不适 用于混合物的鉴定。
[0006] 2. PCR-RFLP :又称为切割扩增多态性序列分析，其基本步骤包括：PCR扩增特定基 因片段、限制性内切酶酶切、酶切产物的电泳、酶切图谱的比较和物种鉴定。优点：简单、快 速、便宜，更适用于常规检测。缺点：易受种内多态性的影响，如果酶切位点发生了突变，就 会改变酶切图谱，导致出现错误的鉴定结果。
[0007] 3.物种特异性PCR :物种特异性PCR是根据物种之间基因序列的差异设计特异性 引物，使该引物只能在特定的物种中扩增出特定长度的片段，在其它任何物种中都没有相 应片段的出现，根据扩增片段的有无实现物种鉴定。优点：可以通过电泳结果直接判定物 种来源，不需要后续的测序或酶切处理，更简单、快速，可用于大样本的常规检测。缺点： PCR产物容易发生气溶胶污染。
[0008] 4.荧光实时定量PCR:该技术是在常规PCR基础上运用荧光能量传递技术，加入 荧光标记探针或荧光染料，借助于荧光信号来检测PCR产物。根据荧光标记的不同，可以 分为两类：一类是对特异性序列的检测，用荧光标记的特异性杂交探针定量，如TaqMan。 另一类是对非特异性序列的检测，应用DNA结合染料，如SYBR green，它与双链DNA的小 槽结合后荧光信号增强，结合过程与序列无关。
[0009] 荧光实时定量PCR的优势在于：①可实现定量检测。②其荧光数据可以通过实时 PCR仪器或荧光检测器直接检测，不需要进行电泳，缩短了分析时间，减少产物污染。③适 用于小片段的扩增，这在检测处理过的食品尤其是DNA降解严重的食品时尤为重要。
[0010] 以上方法都可以应用于单一物种的鉴定，但单一物种的PCR检测成本高，而肉品 中可能存在其它品种，单重PCR已经满足不了现有的要求，进而出现了多重PCR技术，即在 同一反应体系中加入多对引物同时扩增多条目的DNA片段的方法。已有报道有利用多重 PCR技术对18种常见动物种类进行检测的技术，但要根据其PCR产物大小不同，用毛细管电 泳对其片段进行分离后判断物种的种类，后续处理繁琐，且多重PCR也存在一些不足，如体 系中存在多对引物而导致的扩增效率较低，不同模板之间的扩增效率不一致等，这些都限 制了此项技术的商业化应用。因此，建立一种能快速、灵敏、特异的检测未知生肉品种的检 测方法一直是有待解决的难题，而联合检测方法将有望解决这一难题。
[0011] 所谓联合检测，即使用相同的反应体系和反应条件，一次检测可以得到所有可能 的结果。此方法不同于多重PCR技术，每个反应是在不同的反应管中进行，避免了引物之间 的相互干扰。联合检测的难点在于设计的引物要物种特异性强，不能有交叉反应，且要能优 化到同一 PCR反应条件。目前报道的利用联合检测鉴定肉制品种属的有应用Taqman探针对 混合物中牛肉、猪肉、羊肉、鸡肉、火鸡肉、鸵鸟肉成分进行了测定，也有报道用SYBR Green 法成功鉴别混合肉种的马鹿、欧洲鹿、狍、岩羚羊和比利牛斯山羊。但以上检测也存在一些 问题：探针法对探针设计要求较高，且因检测灵敏度太高，对实验操作的要求较高，一些微 小的污染也可能被检测出来。染料法对引物的设计要求较高，容易有非特异性扩增，且仅以 溶解曲线判读结果不能排除假阳性。
[0012] 针对以上问题，本发明提出一种同时测定肉制品中多种动物源成分的实时荧光 PCR联合检测方法：通过对多个物种分别设计特异性引物，可以在一个PCR反应体系内同时 对多个物种的特异性片段进行扩增，特别适用于目前肉制品中混合成分的检出。通过加入 荧光染料来检测荧光信号，不用设计特异性探针，节约成本，最后通过扩增的CT值与内参 的对照来确定阴阳性，排除因沾染造成的假阳性结果。该方法的特点：1、通过对多个物种分 别设计特异性引物，可以在一个PCR反应体系内同时对多个物种的特异性片段进行扩增， 且对荧光信号无干扰，特别适用于肉类及肉制品中混合成分的鉴定。2、反应管已集成化，使 用时仅需加入模板即可进行PCR检测，操作简便。3、通过与内参对照判定阴阳性，排除因沾 染造成的假阳性结果。4、可以根据需要灵活组合鉴定的肉制品种类和检测样本的份数。
【发明内容】
[0013] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种同时测定肉制品中 多种动物源成分的实时荧光PCR联合检测方法，针对多个物种分别设计特异性引物，并在 一个PCR反应体系内同时对多个物种的特异性片段进行扩增。结合荧光染料的使用，可以 直接判读阴阳性。该方法成本低、省时、高效，可对多种成分同时鉴别。
[0014] 为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：1. 一种同时测定产品中多物种 成分的实时荧光PCR联合检测方法，根据线粒体DNA上物种间基因多态性的差异设计各物 种特异性的引物，并将反应条件优化到同一体系，即可以在一个PCR体系中同时对多种物 种成分进行鉴定，通过加入荧光染料来检测荧光信号，最后用扩增的CT值与内参的对照来 确定阴阳性；该方法同时对肉及肉制品中10种以上动物源性成分进行检测。
[0015] 所述实时荧光PCR法包含的10个以上物种的特异性引物和1个内参引物的序列。
[0016] 所述实时荧光PCR检测方法对多种动物源成分的检测是在一个PCR反应体系中、 同一个反应条件下一次完成的。
[0017] 所述实时荧光PCR法的所用荧光染料SYBR Green，但不限于SYBR Green，也可以 是Eva Green、LC Green等焚光染料，并通过对溶解曲线的判读分析扩增的特异性。
[0018] 所述实时荧光PCR法的结果的判读方法：用扩增的CT值与内参的对照来确定阴阳 性；无 CT值的直接判读为阴性；有扩增CT值的与内参引物扩增CT值进行比较，大于等于7 的判读为阴性，小于7的判读为阳性。
[0019] 所述实时荧光PCR法应用于10个以上物种中的任一物种检测。
[0020] 所述实时荧光PCR法应用于 10个以上物种中的任意混合物种的检测。
[0021] 本发明的优点和有益效果为：
[0022] 1、通过对多个物种分别设计特异性引物，可以在一个PCR反应体系内同时对多个 物种的特异性片段进行扩增，且对荧光信号无干扰，特别适用于肉类及肉制品中混合成分 的鉴定。
[0023] 2、反应管已集成化，使用时仅需加入模板即可进行PCR检测，操作简便。
[0024] 3、通过与内参对照判定阴阳性，排除因沾染造成的假阳性结果。
[0025] 4、可以根据需要灵活组合鉴定的肉制品种类和检测样本的份数。
【具体实施方式】
[0026] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施 例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通 技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范 围。
[0027] -种同时测定肉制品中多种动物源成分的实时荧光PCR联合检测方法，其鉴定方 法为：根据线粒体基因上动物种间多态性的差异设计各物种特异性的引物，并将反应条件 优化到同一体系，即可以在一个PCR体系中同时对10个以上的物种成分进行鉴定，通过加 入荧光染料SYBR来检测荧光信号，最后用扩增的CT值与内参的对照来确定阴阳性。该 RT-PCR方法可以同时对肉及肉制品中多种动物源性成分（猪、牛、羊、狗、兔、猫、鸡、鸭、鹅、 鼠等）的单一肉制品或多种动物的混合肉制品进彳丁检测鉴定。
[0028] 进一步的，所述实时荧光PCR法的物种特异性引物和1个内参引物的序列。
[0029]
[0031] 进一步的，所述实时荧光PCR法的PCR反应体系和条件。
[0032] PCR 体系：
[0037] 所述实时荧光PCR法的所用的荧光染料SYBR，并通过对溶解曲线的判读分析扩增 的特异性。所述实时荧光PCR法的结果的判读方法：用扩增的CT值与内参的对照来确定阴 阳性。无 CT值的直接判读为阴性；有扩增CT值的与内参引物扩增CT值进行比较，大于等 于7的判读为阴性，小于7的判读为阳性。CT值与起始DNA浓度的对数成反比，因此CT值 相差7以上表示模板DNA含量相差百倍以上，以此判断标准可以排除因沾染造成的假阳性 结果。所述实时荧光PCR法的应用于多个物种中的任一物种检测。所述实时荧光PCR法的 应用于多个物种中的任意混合物种的检测。
[0038] 实施例1
[0039] 单一成分检测：
[0040] 1.材料：
[0041]
[0043] 2.基因组DNA提取：用OMEGA组织DNA提取试剂盒提取以上各个材料的基因组 DNA0
[0044] 3. PCR扩增反应：
[0045] 按下列组分分别配制PCR反应液，最后加入样本DNA。
[0046]
[0047] 按下列条件进行PCR反应：
[0048]
[0049] 4.结果分析：
[0050] 检查扩增曲线和溶解曲线是否正常，是否需要手动调整基线和阈值。待调整好曲 线后读取扩增曲线的CT值。
[0051] 5.结果判定：
[0052]
[0053]
[0054] 结果判定如下：1-猪2-牛3-羊4-鸡5-鸭6-鹅7-狗8-兔9-猫 10-鼠
[0055] 实施例2
[0056] 混合成分检测：
[0057] 1.材料：
[0058]
[0059] 2.基因组DNA提取：用OMEGA组织DNA提取试剂盒提取以上各个材料的基因组 DNA0
[0060] 3. PCR扩增反应：
[0061] 按下列组分分别配制PCR反应液，最后加入样本DNA。
[0062]
[0063]
[0064] 按下列条件进行PCR反应：
[0065]
[0066] 4.结果分析：检查扩增曲线和溶解曲线是否正常，是否需要手动调整基线和阈 值。待调整好曲线后读取扩增曲线的CT值。
[0067] 5.结果判定：
[0068]
[0069] 结果判定如下：1_猪、牛混合成分2-牛、羊混合成分3-猪、羊混合成分4-猪、鸡 混合成分。
[0070] 对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在 不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论 从哪一点来看，均应将发明例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权 利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有 变化囊括在本发明内。
【主权项】
1. 一种同时测定产品中多物种成分的实时荧光PCR联合检测方法，其特征在于：根据 线粒体DNA上物种间基因多态性的差异设计各物种特异性的引物，并将反应条件优化到同 一体系，即可以在一个PCR体系中同时对多种物种成分进行鉴定，通过加入荧光染料来检 测荧光信号，最后用扩增的CT值与内参的对照来确定阴阳性；该方法同时对肉及肉制品中 10种以上动物源性成分进行检测。2. 根据权利要求1所述的一种同时测定肉制品中多种动物源成分的实时荧光PCR联合 检测方法，其特征在于：所述实时荧光PCR法包含的10个以上物种的特异性引物和1个内 参引物的序列。3. 根据权利要求1或2所述的一种同时测定肉制品中多种动物源成分的实时荧光PCR 联合检测方法，其特征在于：所述实时荧光PCR检测方法对多种动物源成分的检测是在一 个PCR反应体系中、同一个反应条件下一次完成的。4. 根据权利要求3所述的一种同时测定肉制品中多种动物源成分的实时荧光PCR联 合检测方法，其特征在于：所述实时荧光PCR法的所用荧光染料SYBRGreen，但不限于SYBR Green，也可以是EvaGreen、LCGreen等焚光染料，并通过对溶解曲线的判读分析扩增的特 异性。5. 根据权利要求1或4所述的一种同时测定肉制品中多种动物源成分的实时荧光PCR 联合检测方法，其特征在于：所述实时荧光PCR法的结果的判读方法：用扩增的CT值与内 参的对照来确定阴阳性；无CT值的直接判读为阴性；有扩增CT值的与内参引物扩增CT值 进行比较，大于等于7的判读为阴性，小于7的判读为阳性。6. 根据权利要求5所述的一种同时测定肉制品中多种动物源成分的实时荧光PCR联 合检测方法，其特征在于：所述实时荧光PCR法应用于10个以上物种中的任一物种检测。7. 根据权利要求6所述的一种同时测定肉制品中多种动物源成分的实时荧光PCR联合 检测方法，其特征在于：所述实时荧光PCR法应用于10个以上物种中的任意混合物种的检 测。
【专利摘要】本发明公开一种同时测定肉制品中多种动物源成分的实时荧光PCR联合检测方法，该方法根据线粒体基因上动物种间多态性的差异设计各物种特异性的引物，即可实现在一个PCR反应体系中同时对10个以上的物种成分进行鉴定。CT值与起始DNA浓度的对数成反比，因此其CT值相差7以上表示模板DNA含量相差百倍以上，以此判断标准可以排除因沾染造成的假阳性结果。本发明可以对鉴定范围内的任何一种未知动物源成分的肉制品，或多种动物源成分的混合肉制品一次试验完成全部动物源成分鉴定，适用于生、熟及各种加工方法制备的肉制品的检测鉴定。该方法不需要进行电泳，从而缩短了分析时间，减少了产物污染。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894263
【申请号】CN201510300666
【发明人】胡军, 孙丽君, 李元, 张海祥
【申请人】陕西瑞奇生物科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月4日
【专利说明】多物种成分实时荧光PCR联合检测方法 发明领域
[0001] 本发明涉及肉制品中肉类成分的实时荧光PCR检测方法，特别是涉及一种同时测 定肉制品中多种动物源成分的实时荧光PCR联合检测方法，属于食品安全检测应用技术领 域。
【背景技术】
[0002] 肉制品掺假造假是常见的现象，某些不法商贩以低价肉类代替高价肉类出售，损 害了消费者的利益，造成了不正当竞争；随着疯牛病和禽流感等疾病的流行和食品贸易的 全球化，消费者更迫切地要求知晓食品的确切成分，因此必须建立快速、准确的肉制品品 种鉴定方法。
[0003] 目前，肉制品品种鉴定方法主要有蛋白质鉴定（等电聚焦电泳、酶联免疫吸附试 验、色谱等）和分子学鉴定两类，其中以物种间基因差异为基础的分子学鉴定方法是研宄 的热点，主要原因是：① DNA比蛋白质的耐热性强，高温处理过的食品中仍能提取出小片 段的DNA，而多数蛋白质会发生变性，不能满足鉴定需要；②分子学鉴定方法不依赖于组织 和细胞的类型；③不同的基因片段进化效率不同，可以根据实验目的选择不同的目的基因 进行研宄；④DNA比蛋白质具有更尚的种间多态性，有利于品种鉴定。
[0004] 目前用于肉制品鉴定的主要分子学检测方法及其优缺点：
[0005] I. PCR-FINS :该方法是基于特定基因片段的序列差异来鉴定物种，由4个步骤组 成：①建立从广泛的生物样品中分离DNA的方法，包括处理过的食品（罐头、半加工、压制、 盐渍、熏制）；②应用通用引物扩增出特定的DNA片段；③对扩增的DNA片段进行测序；④将 这个核酸序列与被提交数据库进行序列比对，从而直接鉴定出物种或者找到数据库中与 其亲缘关系最接近的物种。优点：可以直接判断食品中未知成分的种属来源。缺点：由于使 用了通用引物，混合物中通常有多种成分被同时扩增，会造成测序结果的杂乱，因此不适 用于混合物的鉴定。
[0006] 2. PCR-RFLP :又称为切割扩增多态性序列分析，其基本步骤包括：PCR扩增特定基 因片段、限制性内切酶酶切、酶切产物的电泳、酶切图谱的比较和物种鉴定。优点：简单、快 速、便宜，更适用于常规检测。缺点：易受种内多态性的影响，如果酶切位点发生了突变，就 会改变酶切图谱，导致出现错误的鉴定结果。
[0007] 3.物种特异性PCR :物种特异性PCR是根据物种之间基因序列的差异设计特异性 引物，使该引物只能在特定的物种中扩增出特定长度的片段，在其它任何物种中都没有相 应片段的出现，根据扩增片段的有无实现物种鉴定。优点：可以通过电泳结果直接判定物 种来源，不需要后续的测序或酶切处理，更简单、快速，可用于大样本的常规检测。缺点： PCR产物容易发生气溶胶污染。
[0008] 4.荧光实时定量PCR:该技术是在常规PCR基础上运用荧光能量传递技术，加入 荧光标记探针或荧光染料，借助于荧光信号来检测PCR产物。根据荧光标记的不同，可以 分为两类：一类是对特异性序列的检测，用荧光标记的特异性杂交探针定量，如TaqMan。 另一类是对非特异性序列的检测，应用DNA结合染料，如SYBR green，它与双链DNA的小 槽结合后荧光信号增强，结合过程与序列无关。
[0009] 荧光实时定量PCR的优势在于：①可实现定量检测。②其荧光数据可以通过实时 PCR仪器或荧光检测器直接检测，不需要进行电泳，缩短了分析时间，减少产物污染。③适 用于小片段的扩增，这在检测处理过的食品尤其是DNA降解严重的食品时尤为重要。
[0010] 以上方法都可以应用于单一物种的鉴定，但单一物种的PCR检测成本高，而肉品 中可能存在其它品种，单重PCR已经满足不了现有的要求，进而出现了多重PCR技术，即在 同一反应体系中加入多对引物同时扩增多条目的DNA片段的方法。已有报道有利用多重 PCR技术对18种常见动物种类进行检测的技术，但要根据其PCR产物大小不同，用毛细管电 泳对其片段进行分离后判断物种的种类，后续处理繁琐，且多重PCR也存在一些不足，如体 系中存在多对引物而导致的扩增效率较低，不同模板之间的扩增效率不一致等，这些都限 制了此项技术的商业化应用。因此，建立一种能快速、灵敏、特异的检测未知生肉品种的检 测方法一直是有待解决的难题，而联合检测方法将有望解决这一难题。
[0011] 所谓联合检测，即使用相同的反应体系和反应条件，一次检测可以得到所有可能 的结果。此方法不同于多重PCR技术，每个反应是在不同的反应管中进行，避免了引物之间 的相互干扰。联合检测的难点在于设计的引物要物种特异性强，不能有交叉反应，且要能优 化到同一 PCR反应条件。目前报道的利用联合检测鉴定肉制品种属的有应用Taqman探针对 混合物中牛肉、猪肉、羊肉、鸡肉、火鸡肉、鸵鸟肉成分进行了测定，也有报道用SYBR Green 法成功鉴别混合肉种的马鹿、欧洲鹿、狍、岩羚羊和比利牛斯山羊。但以上检测也存在一些 问题：探针法对探针设计要求较高，且因检测灵敏度太高，对实验操作的要求较高，一些微 小的污染也可能被检测出来。染料法对引物的设计要求较高，容易有非特异性扩增，且仅以 溶解曲线判读结果不能排除假阳性。
[0012] 针对以上问题，本发明提出一种同时测定肉制品中多种动物源成分的实时荧光 PCR联合检测方法：通过对多个物种分别设计特异性引物，可以在一个PCR反应体系内同时 对多个物种的特异性片段进行扩增，特别适用于目前肉制品中混合成分的检出。通过加入 荧光染料来检测荧光信号，不用设计特异性探针，节约成本，最后通过扩增的CT值与内参 的对照来确定阴阳性，排除因沾染造成的假阳性结果。该方法的特点：1、通过对多个物种分 别设计特异性引物，可以在一个PCR反应体系内同时对多个物种的特异性片段进行扩增， 且对荧光信号无干扰，特别适用于肉类及肉制品中混合成分的鉴定。2、反应管已集成化，使 用时仅需加入模板即可进行PCR检测，操作简便。3、通过与内参对照判定阴阳性，排除因沾 染造成的假阳性结果。4、可以根据需要灵活组合鉴定的肉制品种类和检测样本的份数。
【发明内容】
[0013] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种同时测定肉制品中 多种动物源成分的实时荧光PCR联合检测方法，针对多个物种分别设计特异性引物，并在 一个PCR反应体系内同时对多个物种的特异性片段进行扩增。结合荧光染料的使用，可以 直接判读阴阳性。该方法成本低、省时、高效，可对多种成分同时鉴别。
[0014] 为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：1. 一种同时测定产品中多物种 成分的实时荧光PCR联合检测方法，根据线粒体DNA上物种间基因多态性的差异设计各物 种特异性的引物，并将反应条件优化到同一体系，即可以在一个PCR体系中同时对多种物 种成分进行鉴定，通过加入荧光染料来检测荧光信号，最后用扩增的CT值与内参的对照来 确定阴阳性；该方法同时对肉及肉制品中10种以上动物源性成分进行检测。
[0015] 所述实时荧光PCR法包含的10个以上物种的特异性引物和1个内参引物的序列。
[0016] 所述实时荧光PCR检测方法对多种动物源成分的检测是在一个PCR反应体系中、 同一个反应条件下一次完成的。
[0017] 所述实时荧光PCR法的所用荧光染料SYBR Green，但不限于SYBR Green，也可以 是Eva Green、LC Green等焚光染料，并通过对溶解曲线的判读分析扩增的特异性。
[0018] 所述实时荧光PCR法的结果的判读方法：用扩增的CT值与内参的对照来确定阴阳 性；无 CT值的直接判读为阴性；有扩增CT值的与内参引物扩增CT值进行比较，大于等于7 的判读为阴性，小于7的判读为阳性。
[0019] 所述实时荧光PCR法应用于10个以上物种中的任一物种检测。
[0020] 所述实时荧光PCR法应用于 10个以上物种中的任意混合物种的检测。
[0021] 本发明的优点和有益效果为：
[0022] 1、通过对多个物种分别设计特异性引物，可以在一个PCR反应体系内同时对多个 物种的特异性片段进行扩增，且对荧光信号无干扰，特别适用于肉类及肉制品中混合成分 的鉴定。
[0023] 2、反应管已集成化，使用时仅需加入模板即可进行PCR检测，操作简便。
[0024] 3、通过与内参对照判定阴阳性，排除因沾染造成的假阳性结果。
[0025] 4、可以根据需要灵活组合鉴定的肉制品种类和检测样本的份数。
【具体实施方式】
[0026] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施 例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通 技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范 围。
[0027] -种同时测定肉制品中多种动物源成分的实时荧光PCR联合检测方法，其鉴定方 法为：根据线粒体基因上动物种间多态性的差异设计各物种特异性的引物，并将反应条件 优化到同一体系，即可以在一个PCR体系中同时对10个以上的物种成分进行鉴定，通过加 入荧光染料SYBR来检测荧光信号，最后用扩增的CT值与内参的对照来确定阴阳性。该 RT-PCR方法可以同时对肉及肉制品中多种动物源性成分（猪、牛、羊、狗、兔、猫、鸡、鸭、鹅、 鼠等）的单一肉制品或多种动物的混合肉制品进彳丁检测鉴定。
[0028] 进一步的，所述实时荧光PCR法的物种特异性引物和1个内参引物的序列。
[0029]
[0031] 进一步的，所述实时荧光PCR法的PCR反应体系和条件。
[0032] PCR 体系：
[0037] 所述实时荧光PCR法的所用的荧光染料SYBR，并通过对溶解曲线的判读分析扩增 的特异性。所述实时荧光PCR法的结果的判读方法：用扩增的CT值与内参的对照来确定阴 阳性。无 CT值的直接判读为阴性；有扩增CT值的与内参引物扩增CT值进行比较，大于等 于7的判读为阴性，小于7的判读为阳性。CT值与起始DNA浓度的对数成反比，因此CT值 相差7以上表示模板DNA含量相差百倍以上，以此判断标准可以排除因沾染造成的假阳性 结果。所述实时荧光PCR法的应用于多个物种中的任一物种检测。所述实时荧光PCR法的 应用于多个物种中的任意混合物种的检测。
[0038] 实施例1
[0039] 单一成分检测：
[0040] 1.材料：
[0041]
[0043] 2.基因组DNA提取：用OMEGA组织DNA提取试剂盒提取以上各个材料的基因组 DNA0
[0044] 3. PCR扩增反应：
[0045] 按下列组分分别配制PCR反应液，最后加入样本DNA。
[0046]
[0047] 按下列条件进行PCR反应：
[0048]
[0049] 4.结果分析：
[0050] 检查扩增曲线和溶解曲线是否正常，是否需要手动调整基线和阈值。待调整好曲 线后读取扩增曲线的CT值。
[0051] 5.结果判定：
[0052]
[0053]
[0054] 结果判定如下：1-猪2-牛3-羊4-鸡5-鸭6-鹅7-狗8-兔9-猫 10-鼠
[0055] 实施例2
[0056] 混合成分检测：
[0057] 1.材料：
[0058]
[0059] 2.基因组DNA提取：用OMEGA组织DNA提取试剂盒提取以上各个材料的基因组 DNA0
[0060] 3. PCR扩增反应：
[0061] 按下列组分分别配制PCR反应液，最后加入样本DNA。
[0062]
[0063]
[0064] 按下列条件进行PCR反应：
[0065]
[0066] 4.结果分析：检查扩增曲线和溶解曲线是否正常，是否需要手动调整基线和阈 值。待调整好曲线后读取扩增曲线的CT值。
[0067] 5.结果判定：
[0068]
[0069] 结果判定如下：1_猪、牛混合成分2-牛、羊混合成分3-猪、羊混合成分4-猪、鸡 混合成分。
[0070] 对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在 不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论 从哪一点来看，均应将发明例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权 利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有 变化囊括在本发明内。
【主权项】
1. 一种同时测定产品中多物种成分的实时荧光PCR联合检测方法，其特征在于：根据 线粒体DNA上物种间基因多态性的差异设计各物种特异性的引物，并将反应条件优化到同 一体系，即可以在一个PCR体系中同时对多种物种成分进行鉴定，通过加入荧光染料来检 测荧光信号，最后用扩增的CT值与内参的对照来确定阴阳性；该方法同时对肉及肉制品中 10种以上动物源性成分进行检测。2. 根据权利要求1所述的一种同时测定肉制品中多种动物源成分的实时荧光PCR联合 检测方法，其特征在于：所述实时荧光PCR法包含的10个以上物种的特异性引物和1个内 参引物的序列。3. 根据权利要求1或2所述的一种同时测定肉制品中多种动物源成分的实时荧光PCR 联合检测方法，其特征在于：所述实时荧光PCR检测方法对多种动物源成分的检测是在一 个PCR反应体系中、同一个反应条件下一次完成的。4. 根据权利要求3所述的一种同时测定肉制品中多种动物源成分的实时荧光PCR联 合检测方法，其特征在于：所述实时荧光PCR法的所用荧光染料SYBRGreen，但不限于SYBR Green，也可以是EvaGreen、LCGreen等焚光染料，并通过对溶解曲线的判读分析扩增的特 异性。5. 根据权利要求1或4所述的一种同时测定肉制品中多种动物源成分的实时荧光PCR 联合检测方法，其特征在于：所述实时荧光PCR法的结果的判读方法：用扩增的CT值与内 参的对照来确定阴阳性；无CT值的直接判读为阴性；有扩增CT值的与内参引物扩增CT值 进行比较，大于等于7的判读为阴性，小于7的判读为阳性。6. 根据权利要求5所述的一种同时测定肉制品中多种动物源成分的实时荧光PCR联 合检测方法，其特征在于：所述实时荧光PCR法应用于10个以上物种中的任一物种检测。7. 根据权利要求6所述的一种同时测定肉制品中多种动物源成分的实时荧光PCR联合 检测方法，其特征在于：所述实时荧光PCR法应用于10个以上物种中的任意混合物种的检 测。
【专利摘要】本发明公开一种同时测定肉制品中多种动物源成分的实时荧光PCR联合检测方法，该方法根据线粒体基因上动物种间多态性的差异设计各物种特异性的引物，即可实现在一个PCR反应体系中同时对10个以上的物种成分进行鉴定。CT值与起始DNA浓度的对数成反比，因此其CT值相差7以上表示模板DNA含量相差百倍以上，以此判断标准可以排除因沾染造成的假阳性结果。本发明可以对鉴定范围内的任何一种未知动物源成分的肉制品，或多种动物源成分的混合肉制品一次试验完成全部动物源成分鉴定，适用于生、熟及各种加工方法制备的肉制品的检测鉴定。该方法不需要进行电泳，从而缩短了分析时间，减少了产物污染。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894263
【申请号】CN201510300666
【发明人】胡军, 孙丽君, 李元, 张海祥
【申请人】陕西瑞奇生物科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月4日
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