海马的鉴定方法
海马的鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及海马的鉴定方法，属于分子生物学领域。
【背景技术】
[0002] 海马是硬骨鱼纲（Osteichthyes)海龙目（Syngnathiformes)海龙科 (Syngnathidae)海马属（Hippocampus)鱼类的统称，在东亚地区主要作为传统药材被人们 加以利用。海马为我国传统名贵中药材，首载于《本草经集注》。2010版《中国药典》收载海马 为海龙科动物线纹海马 Hippocampus, kelloggi Jordan et Snyder、刺海马 Hippocampus, histris Kaup 大海马 Hippocampus kuda Bleeker、三斑海马 Hippocampus, trimaulatus Leachh或小海马Hippocampus japonicus Kaup5种（《中国鱼类系统检索》记载线纹 海马H. kelloggi为大海马，大海马H. kuda为管海马，小海马H. japonicus为日本海马 H.mohnkei,本研宄采用《中国鱼类检索》所载海马名称）均被列入CITES (the Convention on Internaitional Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora)附录 II 〇
[0003] 全世界海马约有33种，也有报道为35种。普遍认为，我国近海海驻要有6种，即 日本海马、冠海马、三斑海马、大海马，刺海马及克氏海马等。海马是珍贵的海洋药源动物， 有极高的经济价值和药用价值，全世界不少于51个国家和地区在进行海马的贸易。有报道 称：仅1995年，全球约至少有2千万只的海马被交易，用于中药材、养殖和观赏等方面，而最 大的进口地区依次为中国大陆、台湾省及香港，每年的进口量分别为20、11、7吨。海马种类 复杂，流通种类同药典差异较大，近年来掺假掺伪、以次充好、错用及混用等现象愈演愈烈， 严重影响了海马药材临床用药安全，为其质量控制和规范市场销售秩序带来较大的困扰。
[0004] 现有海马的真伪鉴别包括外观形状鉴别，显微鉴别等传统方法，扫描电镜，高效毛 细管电泳，高效液相指纹图谱，X射线衍射等化学鉴别方法。传统的形态学鉴别手段经验化 要求高，而化学鉴别操作繁琐，多需要大型仪器。与之相比，分子标记具有稳定，不受器官和 环境因素影响的特点，目前以聚合酶链式反应[PCR]为基础的的技术已逐步成为中药鉴定 的核心方法如DNA条形码，SCAR，ISSR，RAH)等多种分子标记技术已广泛应用于中药鉴定。 目前已报道用于海马的分子鉴别方法操作复杂（PCR-RFLP)、周期长（DNA barcoding)，已不 能满足对海马掺伪现象的控制和监管需要，建立科学、准确、快速、高通量的海马真伪鉴定 方法已十分必要。特异引物PCR技术以其简单、快速、准确及成本低等优点，备受检验检疫 部门青睐。该技术目前在石斛，鳖甲，金银花，紫苏中已有报道，2010版《中国药典》已收录 该方法为蕲蛇，乌梢蛇的分子鉴定方法，目前尚未见该方法用于海马鉴定。
[0005] 长期以来DNA的提取一直是DNA分析技术实验中最耗时、繁琐的步骤，严重制约了 分子鉴定方法的使用和推广。快速提取DNA -直是分子研宄者的目标和追求，煮沸碱裂解 法是一种有效的DNA快速提取方法，目前已广泛用于小麦、花生、水稻等，在分子辅助育种、 转基因植物鉴定、SSR鉴定等众起到了重要作用。碱裂解法[通过0. 2M~IM的氢氧化钠 或氢氧化钾处理材料，裂解细胞并获得DNA，方法简单，操作步骤少、步骤少、不需要酚、氯仿 等有毒试剂。蒋超等采用碱裂解法提取了 144种中药材的DNA并进行DNA条形码扩增，均 可扩增出明显条带。
[0006] PCR扩增是各种分子标记的基础，常规扩增过程一般耗时3h左右，快速PCR (rapdi PCR或fast PCR)是指在保证PCR扩增反应结果准确性的前提下，尽量缩短PCR反应时间， 实现快速扩增。目前主要在临床快速诊断、病原体快速检测、药物快速鉴别、动植物DNA快 速检测等方面有较广泛的实际应用。
[0007] 常规PCR反应每个循环包括3个温度梯度：（1)94°C变性，双链解链成单链DNA ; (2)复性，引物与模板特异结合；(3) 72°C延伸，DNA聚合酶在4种dNTP的参与下扩增模 板。常规PCR反应需要30~35个循环，时间至少需要2个h。若扩增DNA片段较小（小 于200bp)，从55°C复性到94°C左右变性过程中，引物与第五模板结合后，继而DNA聚合酶 就可以在升温过程中很快完成DNA链的催化合成。Wittwer等采用毛细血管作为PCR反应 容器，以空气作热传导介质，使用快速循环仪在15min内完成了三温度循环PCR的35个循 环。Cha RS等进一步简化了传统的PCR程序，取消了延伸这一温度梯度，采用两温度法PCR 扩增了大鼠 CHa ras基因的突变，获得了理想的扩增结果。
[0008] SYBR Green I是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料，其只有与双链结合方可发 出荧光，且信号强弱与双链DNA分子数成正比，随扩增产物增加而增加。向PCR产物中直接 加入SYBR Green I后在紫外下观察颜色，可直接判别是否有扩增产物，省去了琼脂糖凝胶 电泳时间。
[0009] 在一个反应管中使用多套引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增的 过程即为多重PCR，可满足同时分析不同DNA序列的需要。在同一反应体系中加入多对引物 的多重PCR技术可提高检测效率和检测通量。目前，该技术多用于微生物检验，也有其用于 鹿的亚种以及白术、苍术鉴定的报道。
【发明内容】
[0010] 本发明要解决的技术问题是提供一种海马的鉴定方法，该方法可以实现日本海 马、三斑海马、大海马或管海马的准确鉴定。
[0011] 本发明海马的鉴定方法，包括如下步骤：
[0012] a、提取海马DNA ;
[0013] b、PCR扩增：对海马DNA进行PCR扩增；
[0014] 反应体系为：2X Taq master mix缓冲液12.5 μ L，引物终浓度0.8 μ M，待海马DNA I UL ;引物为上述四种引物中的至少一种，CldH2O补足25 yL ;
[0015] 反应程序为：94°0预变性111^11，94°0变性3〇8,64°0退火3〇8,30个循环，反应结束 后15°C保存；PCR反应设置无模板DNA的阴性对照；
[0016] c、PCR扩增结束后，在反应体系内加入I yL 100X SYBR Green I染料，在紫外灯 下检测样品颜色；
[0017] 若样品颜色不为黄色或黄绿色，则样品中不含有相应海马，鉴定结束；
[0018] 若样品颜色为黄色或黄绿色，则样品中含有相应海马；取5yL PCR产物进行 1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，确定海马种类。
[0019] 进一步的，作为优选方案，海马DNA的提取方法可采用试剂盒法或下述快速提取 法。
[0020] 所述快速提取法为：
[0021] 取海马药材约50mg，加入60~80 μ L提取试剂A，混匀后，100°C孵育30s，加入 200 μ L中和试剂B，混勾后，9000rpm离心5min，取上清；
[0022] 其中，所述提取试剂A为0. 5M氢氧化钠、1% PVP 40、1% Triton X-100 ;中和试剂 B 为 0· IM Tris-Hcl。
[0023] 上述快速提取法通过煮沸法碱裂解快速提取，通过氢氧化钠裂解样品释放DNA，能 快速提取海马DNA，从而实现海马PCR扩增。
[0024] 进一步的，所述b步骤中PCR扩增的引物为日本海马鉴定用引物、三斑海马鉴定 用引物、大海马鉴定用引物、管海马鉴定用引物中至少一种；当加入多种引物时，若样品颜 色为黄色或黄绿色，则样品中至少含有一种引物所对应的海马；例如，加入的引物为日本海 马、大海马、管海马，当样品颜色为黄色或黄绿色时，则说明样品中至少含有上述三种海马 中的一种。
[0025] 其中，所述的日本海马鉴定用引物序列如Seq ID NO. 1和Seq ID NO. 2所示，所述 的三斑海马鉴定用引物序列如Seq ID NO. 3和Seq ID NO. 4所示，所述的大海马鉴定用引 物序列如Seq ID NO. 5和Seq ID NO. 6所示，所述的管海马鉴定用引物序列如Seq ID NO. 7 和Seq ID NO. 8所示。具体如下：
[0026] 日本海马（H. mohnkei)鉴定用引物：
[0027] Mo-F :5' -ACCCTCATTCCTTCTTCTCCGC-3'，（Seq ID NO.1)
[0028] Mo-R :5, -GGTGTTTGGTATTGCGTGATTGAC-3, ；（Seq ID NO. 2)
[0029] 三斑海马（H. trimaculate)鉴定用引物：
[0030] Tr-F :5, -TCTTTCCTTCTCCTCCTTGCCTC-3，，（Seq ID NO. 3)
[0031] Tr-R :5' -GGTGTTTGGTATTGTGAGATTGAGTGA-3' ；（Seq ID NO. 4)
[0032] 大海马（H. kelloggi)鉴定用引物：
[0033] Ke-F :5' -CGTCAGGAGTAGAAGCTGGGTCG-3'，（Seq ID NO. 5)
[0034] Ke-R :5, -GTCTGTGAGAAGTATGGTAATCCCG-3, ；（Seq ID NO. 6)
[0035] 管海马（H. kuda)鉴定用引物：
[0036] Ku-F :5, -TTTCTTCTCCTCCTTGCTTCCTCAG-3，，（Seq ID NO. 7)
[0037] Ku-R :5, -GAAATTGATGGGGGTTTTATGGTG-3，。（Seq ID NO. 8)
[0038] 本发明针对日本海马，三斑海马，大海马，管海马分别设计了一对特异引物，此外 首次利用二温度法结合多重PCR这一技术来进行海马的快速鉴定。为建立海马的二温度 PCR检测方法，首先要选择海马所特有的核苷酸序列，然后进行引物设计和合成。研宄表明 海马的COI序列能作为DNA条形码，用于海马的鉴定和检测。且为了实现二温度法扩增，所 设计的引物退火温度应尽量高，实现延伸退火在同一个阶段完成。为了满足上述需要，通过 引物设计软件Primer Primer 5.0设计得到海马的特异引物。上述引物可以特异扩增海马 的部分COI基因。
[0039] 其中，本发明中海马名称均采用《中国鱼类系统检索》所载海马名称。在药典中， 日本海马又称为小海马（H. japonicus Kaup)，大海马称为线纹海马，管海马称为大海马。
[0040] 本发明有益效果：
[0041] 1、采用本发明海马鉴定用引物以及鉴定方法对海马进行鉴定，所用时间短，仅 1~2h内即可获得检测结果，比现有的分子生物学检测方法缩短2~3h。
[0042] 2、本发明海马的鉴定方法操作简单，检测结果清晰，肉眼观察颜色即可判断。
[0043] 3、本发明海马的鉴定方法中不涉及酚、氯仿等有毒试剂，极大的保护了实验人员 的健康。
【附图说明】
[0044] 图1海马和其混淆品COI片段扩增（阴性对照）；
[0045] 样品编号：M-DL2000 DNA marker, 1-鲍氏海马，2-H. cf. fuscus，3-虎尾海马， 4一太平洋海马，5-日本海马，6-三斑海马，7-大海马，8-昆士兰海马，9一管海马，CK一 阴性对照；
[0046] 图2-a日本海马的特异引物电泳；
[0047] 图2-b三斑海马的特异引物电泳；
[0048] 图2-c大海马的特异引物电泳；
[0049] 图2-d管海马的特异引物电泳；
[0050] 样品编号：M - DL2000 DNA marker, 1-鲍氏海马，2 - H. cf. fuscus，3-虎尾海 马，4一太平洋海马，5-日本海马，6-三斑海马，7-大海马，8-昆士兰海马，9一.管海 马，CK一 阴性对照；
[0051] 图3-a日本海马的特异引物紫外检测结果；
[0052] 图3-b三斑海马的特异引物紫外检测结果；
[0053] 图3-c大海马的特异引物紫外检测结果；
[0054] 图3-d管海马的特异引物紫外检测结果；
[0055] 样品编号：1.鲍氏海马，2. H. cf. fuscus 3虎尾海马，4.太平洋海马，5.日本海马， 6.三斑海马，7.线纹海马，8.昆士兰海马，9.管海马，CK:阴性对照；
[0056] 图4多重PCR电泳；
[0057] 样品编号：M-DL2000 DNA marker, 1-鲍氏海马，2-H. cf. fuscus，3-虎尾海马， 4一太平洋海马，5-日本海马，6-三斑海马，7-大海马，8-昆士兰海马，9一管海马，CK一 阴性对照；
[0058] 图5多重PCR紫外检测结果；
[0059] 样品编号：1 一鲍氏海马，2-H. cf. fuscus, 3一虎尾海马，4一太平洋海马，5-日本 海马，6-三斑海马，7-线纹海马，8-昆士兰海马，9一管海马，CK一阴性对照。
【具体实施方式】
[0060] 本发明海马的鉴定方法，包括如下步骤：
[0061] a、提取海马DNA ;
[0062] b、PCR扩增：对海马DNA进行PCR扩增；
[0063] 反应体系为：2X Taq master mix缓冲液12.5 μ L，引物终浓度0.8 μ M，待海马DNA I UL ;引物为上述四种引物中的至少一种，CldH2O补足25 yL ;
[0064] 反应程序为：94°C预变性lmin，94°C变性30s，64°C退火30s，30个循环，反应结束 后15°C保存；PCR反应设置无模板DNA的阴性对照；
[0065] c、PCR扩增结束后，在反应体系内加入I yL IOOX SYBR Green I染料，在紫外灯 下检测样品颜色；
[0066] 若样品颜色不为黄色或黄绿色，则样品中不含有相应海马，鉴定结束；
[0067] 若样品颜色为黄色或黄绿色，则样品中含有相应海马；取5yL PCR产物进行 1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，确定海马种类。
[0068] 进一步的，作为优选方案，海马DNA的提取方法可采用试剂盒法或下述快速提取 法。
[0069] 所述快速提取法为：
[0070] 取海马药材约50mg，加入60~80 μ L提取试剂A，混匀后，100°C孵育30s，加入 200 μ L中和试剂B，混勾后，9000rpm离心5min，取上清；
[0071] 其中，所述提取试剂A为0· 5M氢氧化钠、1% PVP 40、1% Triton X-100 ;中和试剂 B 为 0· IM Tris-Hcl。
[0072] 上述快速提取法通过煮沸法碱裂解快速提取，通过氢氧化钠裂解样品释放DNA，能 快速提取海马DNA，从而实现海马PCR扩增。
[0073] 进一步的，所述b步骤中PCR扩增的引物为日本海马鉴定用引物、三斑海马鉴定 用引物、大海马鉴定用引物、管海马鉴定用引物中至少一种；当加入多种引物时，若样品颜 色为黄色或黄绿色，则样品中至少含有一种引物所对应的海马；例如，加入的引物为日本海 马、大海马、管海马，当样品颜色为黄色或黄绿色时，则说明样品中至少含有上述三种海马 中的一种。
[0074] 其中，所述的日本海马鉴定用引物序列如Seq ID NO. 1和Seq ID NO. 2所示，所述 的三斑海马鉴定用引物序列如Seq ID NO. 3和Seq ID NO. 4所示，所述的大海马鉴定用引 物序列如Seq ID NO. 5和Seq ID NO. 6所示，所述的管海马鉴定用引物序列如Seq ID NO. 7 和Seq ID NO. 8所示。具体如下：
[0075] 日本海马（H.mohnkei)鉴定用引物：
[0076] Mo-F :5, -ACCCTCATTCCTTCTTCTCCGC-3，，（Seq ID NO. 1)
[0077] Mo-R :5, -GGTGTTTGGTATTGCGTGATTGAC-3, ；（Seq ID NO. 2)
[0078] 三斑海马（H. trimaculate)鉴定用引物：
[0079] Tr-F :5' -TCTTTCCTTCTCCTCCTTGCCTC-3'，（Seq ID NO. 3)
[0080] Tr-R :5, -GGTGTTTGGTATTGTGAGATTGAGTGA-3, ；（Seq ID NO. 4)
[0081] 大海马（H. kelloggi)鉴定用引物：
[0082] Ke-F :5' -CGTCAGGAGTAGAAGCTGGGTCG-3'，（Seq ID NO. 5)
[0083] Ke-R :5, -GTCTGTGAGAAGTATGGTAATCCCG-3, ；（Seq ID NO. 6)
[0084] 管海马（H. kuda)鉴定用引物：
[0085] Ku-F :5' -TTTCTTCTCCTCCTTGCTTCCTCAG-3'，（Seq ID NO. 7)
[0086] Ku-R :5' -GAAATTGATGGGGGTTTTATGGTG-3'。（Seq ID NO. 8)
[0087] 下面结合实施例对本发明的【具体实施方式】做进一步的描述，并不因此将本发明限 制在所述的实施例范围之中。
[0088] 实施例1
[0089] 1、海马DNA提取方法
[0090] I. 1材料和方法
[0091] I. LI 材料
[0092] 实验所用材料如表1所示，包括：
[0093] 表1海马相关样品基本情况
[0094]
[0095] 注："*"为药典收载海马，本研宄采用《中国鱼类系统检索》所载名称，括号内为药 典名称。
[0096] L L 2实验仪器
[0097] Icycle per仪（美国Bio-Rad公司）；离心机，恒温金属浴，紫外灯
[0098] I. L 3 方法
[0099] 模板DNA提取：选取无霉变的干燥药材标本50mg，用剪刀剪碎至粉末后，转移至 I. 5mL微量离心管中，加入60 μ L碱裂解缓冲液（0· 5mol/L NaOH, 1 % PVP-40, 1 % Triton X-100);使用漩涡振荡器振荡20s混匀，煮沸30s，取出；分别加入0.1 M Tris-HCl (pH = 8) 200uL，轻微漩涡混匀；13000r/min离心5min，保存上清（内含DNA)，作为PCR反应模板。
[0100] PCR 扩增：
[0101] 反应总体系：25 yL，包括 2x Taq master mix 12. 5 yL,引物为 M〇-F/M〇-R、Ku-F/ Ku-R、Tr-F/Tr-R 或 Ke-F/Ke-R 0· 5 μ L (20 μ mol/L)，模板 1 μ L (约 30ng)，加 ddH20 补足至 25 μ L。反应程序：94°C预变性Imin ;94°C变性30s，64°C 30s，共30个循环。反应结束后加 入100倍稀释的SYBR Green I染料1 μ L，在紫外灯下检测被检样品反应产物的颜色，另取 5 μ L产物，1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测条带，紫外凝胶成像观察。
[0102] 1.2 结果
[0103] 紫外等下检视若颜色为绿色或黄绿色则表示检测药材中存在引物对应的海马，非 引物对应的海马，其余的海马均不显绿色或黄绿色荧光。琼脂糖凝胶电泳检测显示引物对 应的海马在约200bp处显示唯一条带，在用COI通用引物进行扩增的阳性对照，均应在约 700bp处出现唯一明亮条带，如图I.
[0104] 实施例2
[0105] 采用实施例1的方法制备模板DNA。
[0106] PCR 扩增反应总体系为 25 μ L，包括 2x Taq master mix 12.5 μ L,引物（Mo-F/ Mo-R, Ku-F/Ku-R, Tr-F/Tr-R)各 0· 5 μ L (20 μ mol/L)，模板 1 μ L (约 30ng),加 ddH20 补足 至25 μ L。94°C预变性Imin ;94°C变性30s，64°C 30s，共30个循环。反应结束后加入100 倍稀释的SYBR Green I染料1 μ L，在紫外灯下检测被检样品反应产物的颜色。另取5 μ L 产物，1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测条带，紫外凝胶成像观察，如图4。
[0107] 2.、结果
[0108] 紫外荧光检视，若颜色为绿色或黄绿色则表示检测药材中至少存在日本海马，管 海马，三斑海马三者其中之一，其余的海马均不显绿色或黄绿色荧光。琼脂糖凝胶电泳检测 结果显示日本海马，管海马，三斑海马均在约200bp处有唯一条带，其余海马均无条带，如 图5,也即，样品中同时含有日本海马、管海马和三斑海马。
【主权项】
1. 海马的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤： a、 提取海马DNA; b、PCR扩增：对海马DNA进行PCR扩增； 反应体系为：2XTaqmastermix缓冲液12.5yL，引物终浓度0.8yM，待海马DNA IUL;引物为上述四种引物中的至少一种，CldH2O补足25yL; 反应程序为：94°C预变性lmin，94°C变性30s，64°C退火30s，30个循环，反应结束后 15°C保存；PCR反应设置无模板DNA的阴性对照； c、PCR扩增结束后，在反应体系内加入IyL100XSYBRGreenI染料，在紫外灯下检 测样品颜色； 若样品颜色不为黄色或黄绿色，则样品中不含有相应海马，鉴定结束； 若样品颜色为黄色或黄绿色，则样品中含有相应海马；取5yLPCR产物进行1. 5%琼 脂糖凝胶电泳检测，确定海马种类。2. 根据权利要求1所述的海马的鉴定方法，其特征在于：a步骤中提取海马DNA的方法 采用下述快速提取法： 取海马药材约50mg，加入60~80yL提取试剂A，混匀后，100°C孵育30s，加入200yL中和试剂B，混勾后，9000rpm离心5min，取上清； 其中，所述提取试剂A为0.5M氢氧化钠、1 %PVP40、1 %TritonX-100 ;中和试剂B为 0.IMTris-Hcl。3. 根据权利要求2所述的海马的鉴定方法，其特征在于：所述快速提取法通过煮沸法 碱裂解快速提取。4. 根据权利要求1~3任一项所述的海马的鉴定方法，其特征在于：所述b步骤中PCR 扩增的引物为日本海马鉴定用引物、三斑海马鉴定用引物、大海马鉴定用引物、管海马鉴定 用引物中至少一种；当加入多种引物时，若样品颜色为黄色或黄绿色，则样品中至少含有一 种引物所对应的海马； 其中，所述的日本海马鉴定用引物序列如SeqIDNO. 1和SeqIDNO. 2所示，所述的三 斑海马鉴定用引物序列如SeqIDNO. 3和SeqIDNO. 4所示，所述的大海马鉴定用引物序 列如SeqIDNO. 5和SeqIDNO. 6所示，所述的管海马鉴定用引物序列如SeqIDNO. 7和 SeqIDNO. 8 所示。
【专利摘要】本发明涉及海马的鉴定方法，属于分子生物学领域。本发明解决的技术问题是提供了一种海马的鉴定方法，该方法可以实现日本海马、三斑海马、大海马或管海马的准确鉴定。本发明海马的鉴定方法，包括如下步骤：a、提取海马DNA；b、PCR扩增：对海马DNA进行PCR扩增；c、PCR扩增结束后，在反应体系内加入1μL 100X SYBR Green I染料，在紫外灯下检测样品颜色；若样品颜色不为黄色或黄绿色，则样品中不含有相应海马，鉴定结束；若样品颜色为黄色或黄绿色，则样品中含有相应海马；取5μL PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，确定海马种类。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894265
【申请号】CN201510304857
【发明人】国锦琳, 袁媛, 王茜, 侯飞侠, 彭成
【申请人】成都中医药大学, 中国中医科学院中药研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月5日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及海马的鉴定方法，属于分子生物学领域。
【背景技术】
[0002] 海马是硬骨鱼纲（Osteichthyes)海龙目（Syngnathiformes)海龙科 (Syngnathidae)海马属（Hippocampus)鱼类的统称，在东亚地区主要作为传统药材被人们 加以利用。海马为我国传统名贵中药材，首载于《本草经集注》。2010版《中国药典》收载海马 为海龙科动物线纹海马 Hippocampus, kelloggi Jordan et Snyder、刺海马 Hippocampus, histris Kaup 大海马 Hippocampus kuda Bleeker、三斑海马 Hippocampus, trimaulatus Leachh或小海马Hippocampus japonicus Kaup5种（《中国鱼类系统检索》记载线纹 海马H. kelloggi为大海马，大海马H. kuda为管海马，小海马H. japonicus为日本海马 H.mohnkei,本研宄采用《中国鱼类检索》所载海马名称）均被列入CITES (the Convention on Internaitional Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora)附录 II 〇
[0003] 全世界海马约有33种，也有报道为35种。普遍认为，我国近海海驻要有6种，即 日本海马、冠海马、三斑海马、大海马，刺海马及克氏海马等。海马是珍贵的海洋药源动物， 有极高的经济价值和药用价值，全世界不少于51个国家和地区在进行海马的贸易。有报道 称：仅1995年，全球约至少有2千万只的海马被交易，用于中药材、养殖和观赏等方面，而最 大的进口地区依次为中国大陆、台湾省及香港，每年的进口量分别为20、11、7吨。海马种类 复杂，流通种类同药典差异较大，近年来掺假掺伪、以次充好、错用及混用等现象愈演愈烈， 严重影响了海马药材临床用药安全，为其质量控制和规范市场销售秩序带来较大的困扰。
[0004] 现有海马的真伪鉴别包括外观形状鉴别，显微鉴别等传统方法，扫描电镜，高效毛 细管电泳，高效液相指纹图谱，X射线衍射等化学鉴别方法。传统的形态学鉴别手段经验化 要求高，而化学鉴别操作繁琐，多需要大型仪器。与之相比，分子标记具有稳定，不受器官和 环境因素影响的特点，目前以聚合酶链式反应[PCR]为基础的的技术已逐步成为中药鉴定 的核心方法如DNA条形码，SCAR，ISSR，RAH)等多种分子标记技术已广泛应用于中药鉴定。 目前已报道用于海马的分子鉴别方法操作复杂（PCR-RFLP)、周期长（DNA barcoding)，已不 能满足对海马掺伪现象的控制和监管需要，建立科学、准确、快速、高通量的海马真伪鉴定 方法已十分必要。特异引物PCR技术以其简单、快速、准确及成本低等优点，备受检验检疫 部门青睐。该技术目前在石斛，鳖甲，金银花，紫苏中已有报道，2010版《中国药典》已收录 该方法为蕲蛇，乌梢蛇的分子鉴定方法，目前尚未见该方法用于海马鉴定。
[0005] 长期以来DNA的提取一直是DNA分析技术实验中最耗时、繁琐的步骤，严重制约了 分子鉴定方法的使用和推广。快速提取DNA -直是分子研宄者的目标和追求，煮沸碱裂解 法是一种有效的DNA快速提取方法，目前已广泛用于小麦、花生、水稻等，在分子辅助育种、 转基因植物鉴定、SSR鉴定等众起到了重要作用。碱裂解法[通过0. 2M~IM的氢氧化钠 或氢氧化钾处理材料，裂解细胞并获得DNA，方法简单，操作步骤少、步骤少、不需要酚、氯仿 等有毒试剂。蒋超等采用碱裂解法提取了 144种中药材的DNA并进行DNA条形码扩增，均 可扩增出明显条带。
[0006] PCR扩增是各种分子标记的基础，常规扩增过程一般耗时3h左右，快速PCR (rapdi PCR或fast PCR)是指在保证PCR扩增反应结果准确性的前提下，尽量缩短PCR反应时间， 实现快速扩增。目前主要在临床快速诊断、病原体快速检测、药物快速鉴别、动植物DNA快 速检测等方面有较广泛的实际应用。
[0007] 常规PCR反应每个循环包括3个温度梯度：（1)94°C变性，双链解链成单链DNA ; (2)复性，引物与模板特异结合；(3) 72°C延伸，DNA聚合酶在4种dNTP的参与下扩增模 板。常规PCR反应需要30~35个循环，时间至少需要2个h。若扩增DNA片段较小（小 于200bp)，从55°C复性到94°C左右变性过程中，引物与第五模板结合后，继而DNA聚合酶 就可以在升温过程中很快完成DNA链的催化合成。Wittwer等采用毛细血管作为PCR反应 容器，以空气作热传导介质，使用快速循环仪在15min内完成了三温度循环PCR的35个循 环。Cha RS等进一步简化了传统的PCR程序，取消了延伸这一温度梯度，采用两温度法PCR 扩增了大鼠 CHa ras基因的突变，获得了理想的扩增结果。
[0008] SYBR Green I是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料，其只有与双链结合方可发 出荧光，且信号强弱与双链DNA分子数成正比，随扩增产物增加而增加。向PCR产物中直接 加入SYBR Green I后在紫外下观察颜色，可直接判别是否有扩增产物，省去了琼脂糖凝胶 电泳时间。
[0009] 在一个反应管中使用多套引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增的 过程即为多重PCR，可满足同时分析不同DNA序列的需要。在同一反应体系中加入多对引物 的多重PCR技术可提高检测效率和检测通量。目前，该技术多用于微生物检验，也有其用于 鹿的亚种以及白术、苍术鉴定的报道。
【发明内容】
[0010] 本发明要解决的技术问题是提供一种海马的鉴定方法，该方法可以实现日本海 马、三斑海马、大海马或管海马的准确鉴定。
[0011] 本发明海马的鉴定方法，包括如下步骤：
[0012] a、提取海马DNA ;
[0013] b、PCR扩增：对海马DNA进行PCR扩增；
[0014] 反应体系为：2X Taq master mix缓冲液12.5 μ L，引物终浓度0.8 μ M，待海马DNA I UL ;引物为上述四种引物中的至少一种，CldH2O补足25 yL ;
[0015] 反应程序为：94°0预变性111^11，94°0变性3〇8,64°0退火3〇8,30个循环，反应结束 后15°C保存；PCR反应设置无模板DNA的阴性对照；
[0016] c、PCR扩增结束后，在反应体系内加入I yL 100X SYBR Green I染料，在紫外灯 下检测样品颜色；
[0017] 若样品颜色不为黄色或黄绿色，则样品中不含有相应海马，鉴定结束；
[0018] 若样品颜色为黄色或黄绿色，则样品中含有相应海马；取5yL PCR产物进行 1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，确定海马种类。
[0019] 进一步的，作为优选方案，海马DNA的提取方法可采用试剂盒法或下述快速提取 法。
[0020] 所述快速提取法为：
[0021] 取海马药材约50mg，加入60~80 μ L提取试剂A，混匀后，100°C孵育30s，加入 200 μ L中和试剂B，混勾后，9000rpm离心5min，取上清；
[0022] 其中，所述提取试剂A为0. 5M氢氧化钠、1% PVP 40、1% Triton X-100 ;中和试剂 B 为 0· IM Tris-Hcl。
[0023] 上述快速提取法通过煮沸法碱裂解快速提取，通过氢氧化钠裂解样品释放DNA，能 快速提取海马DNA，从而实现海马PCR扩增。
[0024] 进一步的，所述b步骤中PCR扩增的引物为日本海马鉴定用引物、三斑海马鉴定 用引物、大海马鉴定用引物、管海马鉴定用引物中至少一种；当加入多种引物时，若样品颜 色为黄色或黄绿色，则样品中至少含有一种引物所对应的海马；例如，加入的引物为日本海 马、大海马、管海马，当样品颜色为黄色或黄绿色时，则说明样品中至少含有上述三种海马 中的一种。
[0025] 其中，所述的日本海马鉴定用引物序列如Seq ID NO. 1和Seq ID NO. 2所示，所述 的三斑海马鉴定用引物序列如Seq ID NO. 3和Seq ID NO. 4所示，所述的大海马鉴定用引 物序列如Seq ID NO. 5和Seq ID NO. 6所示，所述的管海马鉴定用引物序列如Seq ID NO. 7 和Seq ID NO. 8所示。具体如下：
[0026] 日本海马（H. mohnkei)鉴定用引物：
[0027] Mo-F :5' -ACCCTCATTCCTTCTTCTCCGC-3'，（Seq ID NO.1)
[0028] Mo-R :5, -GGTGTTTGGTATTGCGTGATTGAC-3, ；（Seq ID NO. 2)
[0029] 三斑海马（H. trimaculate)鉴定用引物：
[0030] Tr-F :5, -TCTTTCCTTCTCCTCCTTGCCTC-3，，（Seq ID NO. 3)
[0031] Tr-R :5' -GGTGTTTGGTATTGTGAGATTGAGTGA-3' ；（Seq ID NO. 4)
[0032] 大海马（H. kelloggi)鉴定用引物：
[0033] Ke-F :5' -CGTCAGGAGTAGAAGCTGGGTCG-3'，（Seq ID NO. 5)
[0034] Ke-R :5, -GTCTGTGAGAAGTATGGTAATCCCG-3, ；（Seq ID NO. 6)
[0035] 管海马（H. kuda)鉴定用引物：
[0036] Ku-F :5, -TTTCTTCTCCTCCTTGCTTCCTCAG-3，，（Seq ID NO. 7)
[0037] Ku-R :5, -GAAATTGATGGGGGTTTTATGGTG-3，。（Seq ID NO. 8)
[0038] 本发明针对日本海马，三斑海马，大海马，管海马分别设计了一对特异引物，此外 首次利用二温度法结合多重PCR这一技术来进行海马的快速鉴定。为建立海马的二温度 PCR检测方法，首先要选择海马所特有的核苷酸序列，然后进行引物设计和合成。研宄表明 海马的COI序列能作为DNA条形码，用于海马的鉴定和检测。且为了实现二温度法扩增，所 设计的引物退火温度应尽量高，实现延伸退火在同一个阶段完成。为了满足上述需要，通过 引物设计软件Primer Primer 5.0设计得到海马的特异引物。上述引物可以特异扩增海马 的部分COI基因。
[0039] 其中，本发明中海马名称均采用《中国鱼类系统检索》所载海马名称。在药典中， 日本海马又称为小海马（H. japonicus Kaup)，大海马称为线纹海马，管海马称为大海马。
[0040] 本发明有益效果：
[0041] 1、采用本发明海马鉴定用引物以及鉴定方法对海马进行鉴定，所用时间短，仅 1~2h内即可获得检测结果，比现有的分子生物学检测方法缩短2~3h。
[0042] 2、本发明海马的鉴定方法操作简单，检测结果清晰，肉眼观察颜色即可判断。
[0043] 3、本发明海马的鉴定方法中不涉及酚、氯仿等有毒试剂，极大的保护了实验人员 的健康。
【附图说明】
[0044] 图1海马和其混淆品COI片段扩增（阴性对照）；
[0045] 样品编号：M-DL2000 DNA marker, 1-鲍氏海马，2-H. cf. fuscus，3-虎尾海马， 4一太平洋海马，5-日本海马，6-三斑海马，7-大海马，8-昆士兰海马，9一管海马，CK一 阴性对照；
[0046] 图2-a日本海马的特异引物电泳；
[0047] 图2-b三斑海马的特异引物电泳；
[0048] 图2-c大海马的特异引物电泳；
[0049] 图2-d管海马的特异引物电泳；
[0050] 样品编号：M - DL2000 DNA marker, 1-鲍氏海马，2 - H. cf. fuscus，3-虎尾海 马，4一太平洋海马，5-日本海马，6-三斑海马，7-大海马，8-昆士兰海马，9一.管海 马，CK一 阴性对照；
[0051] 图3-a日本海马的特异引物紫外检测结果；
[0052] 图3-b三斑海马的特异引物紫外检测结果；
[0053] 图3-c大海马的特异引物紫外检测结果；
[0054] 图3-d管海马的特异引物紫外检测结果；
[0055] 样品编号：1.鲍氏海马，2. H. cf. fuscus 3虎尾海马，4.太平洋海马，5.日本海马， 6.三斑海马，7.线纹海马，8.昆士兰海马，9.管海马，CK:阴性对照；
[0056] 图4多重PCR电泳；
[0057] 样品编号：M-DL2000 DNA marker, 1-鲍氏海马，2-H. cf. fuscus，3-虎尾海马， 4一太平洋海马，5-日本海马，6-三斑海马，7-大海马，8-昆士兰海马，9一管海马，CK一 阴性对照；
[0058] 图5多重PCR紫外检测结果；
[0059] 样品编号：1 一鲍氏海马，2-H. cf. fuscus, 3一虎尾海马，4一太平洋海马，5-日本 海马，6-三斑海马，7-线纹海马，8-昆士兰海马，9一管海马，CK一阴性对照。
【具体实施方式】
[0060] 本发明海马的鉴定方法，包括如下步骤：
[0061] a、提取海马DNA ;
[0062] b、PCR扩增：对海马DNA进行PCR扩增；
[0063] 反应体系为：2X Taq master mix缓冲液12.5 μ L，引物终浓度0.8 μ M，待海马DNA I UL ;引物为上述四种引物中的至少一种，CldH2O补足25 yL ;
[0064] 反应程序为：94°C预变性lmin，94°C变性30s，64°C退火30s，30个循环，反应结束 后15°C保存；PCR反应设置无模板DNA的阴性对照；
[0065] c、PCR扩增结束后，在反应体系内加入I yL IOOX SYBR Green I染料，在紫外灯 下检测样品颜色；
[0066] 若样品颜色不为黄色或黄绿色，则样品中不含有相应海马，鉴定结束；
[0067] 若样品颜色为黄色或黄绿色，则样品中含有相应海马；取5yL PCR产物进行 1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，确定海马种类。
[0068] 进一步的，作为优选方案，海马DNA的提取方法可采用试剂盒法或下述快速提取 法。
[0069] 所述快速提取法为：
[0070] 取海马药材约50mg，加入60~80 μ L提取试剂A，混匀后，100°C孵育30s，加入 200 μ L中和试剂B，混勾后，9000rpm离心5min，取上清；
[0071] 其中，所述提取试剂A为0· 5M氢氧化钠、1% PVP 40、1% Triton X-100 ;中和试剂 B 为 0· IM Tris-Hcl。
[0072] 上述快速提取法通过煮沸法碱裂解快速提取，通过氢氧化钠裂解样品释放DNA，能 快速提取海马DNA，从而实现海马PCR扩增。
[0073] 进一步的，所述b步骤中PCR扩增的引物为日本海马鉴定用引物、三斑海马鉴定 用引物、大海马鉴定用引物、管海马鉴定用引物中至少一种；当加入多种引物时，若样品颜 色为黄色或黄绿色，则样品中至少含有一种引物所对应的海马；例如，加入的引物为日本海 马、大海马、管海马，当样品颜色为黄色或黄绿色时，则说明样品中至少含有上述三种海马 中的一种。
[0074] 其中，所述的日本海马鉴定用引物序列如Seq ID NO. 1和Seq ID NO. 2所示，所述 的三斑海马鉴定用引物序列如Seq ID NO. 3和Seq ID NO. 4所示，所述的大海马鉴定用引 物序列如Seq ID NO. 5和Seq ID NO. 6所示，所述的管海马鉴定用引物序列如Seq ID NO. 7 和Seq ID NO. 8所示。具体如下：
[0075] 日本海马（H.mohnkei)鉴定用引物：
[0076] Mo-F :5, -ACCCTCATTCCTTCTTCTCCGC-3，，（Seq ID NO. 1)
[0077] Mo-R :5, -GGTGTTTGGTATTGCGTGATTGAC-3, ；（Seq ID NO. 2)
[0078] 三斑海马（H. trimaculate)鉴定用引物：
[0079] Tr-F :5' -TCTTTCCTTCTCCTCCTTGCCTC-3'，（Seq ID NO. 3)
[0080] Tr-R :5, -GGTGTTTGGTATTGTGAGATTGAGTGA-3, ；（Seq ID NO. 4)
[0081] 大海马（H. kelloggi)鉴定用引物：
[0082] Ke-F :5' -CGTCAGGAGTAGAAGCTGGGTCG-3'，（Seq ID NO. 5)
[0083] Ke-R :5, -GTCTGTGAGAAGTATGGTAATCCCG-3, ；（Seq ID NO. 6)
[0084] 管海马（H. kuda)鉴定用引物：
[0085] Ku-F :5' -TTTCTTCTCCTCCTTGCTTCCTCAG-3'，（Seq ID NO. 7)
[0086] Ku-R :5' -GAAATTGATGGGGGTTTTATGGTG-3'。（Seq ID NO. 8)
[0087] 下面结合实施例对本发明的【具体实施方式】做进一步的描述，并不因此将本发明限 制在所述的实施例范围之中。
[0088] 实施例1
[0089] 1、海马DNA提取方法
[0090] I. 1材料和方法
[0091] I. LI 材料
[0092] 实验所用材料如表1所示，包括：
[0093] 表1海马相关样品基本情况
[0094]
[0095] 注："*"为药典收载海马，本研宄采用《中国鱼类系统检索》所载名称，括号内为药 典名称。
[0096] L L 2实验仪器
[0097] Icycle per仪（美国Bio-Rad公司）；离心机，恒温金属浴，紫外灯
[0098] I. L 3 方法
[0099] 模板DNA提取：选取无霉变的干燥药材标本50mg，用剪刀剪碎至粉末后，转移至 I. 5mL微量离心管中，加入60 μ L碱裂解缓冲液（0· 5mol/L NaOH, 1 % PVP-40, 1 % Triton X-100);使用漩涡振荡器振荡20s混匀，煮沸30s，取出；分别加入0.1 M Tris-HCl (pH = 8) 200uL，轻微漩涡混匀；13000r/min离心5min，保存上清（内含DNA)，作为PCR反应模板。
[0100] PCR 扩增：
[0101] 反应总体系：25 yL，包括 2x Taq master mix 12. 5 yL,引物为 M〇-F/M〇-R、Ku-F/ Ku-R、Tr-F/Tr-R 或 Ke-F/Ke-R 0· 5 μ L (20 μ mol/L)，模板 1 μ L (约 30ng)，加 ddH20 补足至 25 μ L。反应程序：94°C预变性Imin ;94°C变性30s，64°C 30s，共30个循环。反应结束后加 入100倍稀释的SYBR Green I染料1 μ L，在紫外灯下检测被检样品反应产物的颜色，另取 5 μ L产物，1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测条带，紫外凝胶成像观察。
[0102] 1.2 结果
[0103] 紫外等下检视若颜色为绿色或黄绿色则表示检测药材中存在引物对应的海马，非 引物对应的海马，其余的海马均不显绿色或黄绿色荧光。琼脂糖凝胶电泳检测显示引物对 应的海马在约200bp处显示唯一条带，在用COI通用引物进行扩增的阳性对照，均应在约 700bp处出现唯一明亮条带，如图I.
[0104] 实施例2
[0105] 采用实施例1的方法制备模板DNA。
[0106] PCR 扩增反应总体系为 25 μ L，包括 2x Taq master mix 12.5 μ L,引物（Mo-F/ Mo-R, Ku-F/Ku-R, Tr-F/Tr-R)各 0· 5 μ L (20 μ mol/L)，模板 1 μ L (约 30ng),加 ddH20 补足 至25 μ L。94°C预变性Imin ;94°C变性30s，64°C 30s，共30个循环。反应结束后加入100 倍稀释的SYBR Green I染料1 μ L，在紫外灯下检测被检样品反应产物的颜色。另取5 μ L 产物，1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测条带，紫外凝胶成像观察，如图4。
[0107] 2.、结果
[0108] 紫外荧光检视，若颜色为绿色或黄绿色则表示检测药材中至少存在日本海马，管 海马，三斑海马三者其中之一，其余的海马均不显绿色或黄绿色荧光。琼脂糖凝胶电泳检测 结果显示日本海马，管海马，三斑海马均在约200bp处有唯一条带，其余海马均无条带，如 图5,也即，样品中同时含有日本海马、管海马和三斑海马。
【主权项】
1. 海马的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤： a、 提取海马DNA; b、PCR扩增：对海马DNA进行PCR扩增； 反应体系为：2XTaqmastermix缓冲液12.5yL，引物终浓度0.8yM，待海马DNA IUL;引物为上述四种引物中的至少一种，CldH2O补足25yL; 反应程序为：94°C预变性lmin，94°C变性30s，64°C退火30s，30个循环，反应结束后 15°C保存；PCR反应设置无模板DNA的阴性对照； c、PCR扩增结束后，在反应体系内加入IyL100XSYBRGreenI染料，在紫外灯下检 测样品颜色； 若样品颜色不为黄色或黄绿色，则样品中不含有相应海马，鉴定结束； 若样品颜色为黄色或黄绿色，则样品中含有相应海马；取5yLPCR产物进行1. 5%琼 脂糖凝胶电泳检测，确定海马种类。2. 根据权利要求1所述的海马的鉴定方法，其特征在于：a步骤中提取海马DNA的方法 采用下述快速提取法： 取海马药材约50mg，加入60~80yL提取试剂A，混匀后，100°C孵育30s，加入200yL中和试剂B，混勾后，9000rpm离心5min，取上清； 其中，所述提取试剂A为0.5M氢氧化钠、1 %PVP40、1 %TritonX-100 ;中和试剂B为 0.IMTris-Hcl。3. 根据权利要求2所述的海马的鉴定方法，其特征在于：所述快速提取法通过煮沸法 碱裂解快速提取。4. 根据权利要求1~3任一项所述的海马的鉴定方法，其特征在于：所述b步骤中PCR 扩增的引物为日本海马鉴定用引物、三斑海马鉴定用引物、大海马鉴定用引物、管海马鉴定 用引物中至少一种；当加入多种引物时，若样品颜色为黄色或黄绿色，则样品中至少含有一 种引物所对应的海马； 其中，所述的日本海马鉴定用引物序列如SeqIDNO. 1和SeqIDNO. 2所示，所述的三 斑海马鉴定用引物序列如SeqIDNO. 3和SeqIDNO. 4所示，所述的大海马鉴定用引物序 列如SeqIDNO. 5和SeqIDNO. 6所示，所述的管海马鉴定用引物序列如SeqIDNO. 7和 SeqIDNO. 8 所示。
【专利摘要】本发明涉及海马的鉴定方法，属于分子生物学领域。本发明解决的技术问题是提供了一种海马的鉴定方法，该方法可以实现日本海马、三斑海马、大海马或管海马的准确鉴定。本发明海马的鉴定方法，包括如下步骤：a、提取海马DNA；b、PCR扩增：对海马DNA进行PCR扩增；c、PCR扩增结束后，在反应体系内加入1μL 100X SYBR Green I染料，在紫外灯下检测样品颜色；若样品颜色不为黄色或黄绿色，则样品中不含有相应海马，鉴定结束；若样品颜色为黄色或黄绿色，则样品中含有相应海马；取5μL PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，确定海马种类。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894265
【申请号】CN201510304857
【发明人】国锦琳, 袁媛, 王茜, 侯飞侠, 彭成
【申请人】成都中医药大学, 中国中医科学院中药研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月5日
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