基于MassARRAY质谱平台Iplex分析的肺癌基因谱检测方法及试剂盒与应用
基于MassARRAY质谱平台Iplex分析的肺癌基因谱检测方法及试剂盒与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于检测肺癌的检测方法，特别涉及一种基于MassARRAY质谱平 台Iplex分析的肺癌基因谱检测方法及试剂盒与应用。
【背景技术】
[0002] 肺癌是我恶性肿瘤死亡原因之首，发病率持续上升，健康危害形势严峻，其发生、 发展以及治疗与基因变异关系密切，基于基因变异的"个体化"靶向治疗是继传统放化疗后 肿瘤领域的新突破。非小细胞肺癌（NSCLC)样本中基因靶点变异可从相应的靶向药物治疗 中获益，针对EGFR和ALK基因变异的酪氨酸激酶抑制剂（TKI)吉非替尼（gefitinib)/厄洛 替尼（erlotinib)和克佐替尼（crizotinb)等革El向治疗可延长患者的生存期。随着研宄深 入，ROSl、RET、ERBB2、STKll等分子变异被逐步确定为肺癌的驱动基因 （driver gene)，并 且新的低频基因被陆续报道。但是大部分患者在接受靶向治疗后一年左右最终都会对TKI 药物耐药。在非小细胞肺癌中，对EGFR TKI药物Gefitinib/Erlotinib的抗药性分子机 理包括 EGFR 二次变异（T790M、D761Y、L747S、T854A、G796A 和 Exon20 插入）以及 EGFR 基 因扩增、RAS/RAF基因变异、MAPK1基因扩增、MET基因扩增、HGF/MET激活、FGF/FGFR激活、 PTEN丢失、GAS6/AXL激活、IGFBP3丢失、BRCAl高表达和CRKL基因扩增。在抗ALK TKI药 物 Crizotinib 的肺癌中，ALK 二次突变（L1196M、C1156Y、F1174L、L1152R、G1202R、S1206Y 和1151T插入）及ALK基因扩增、⑶74-R0S1融合、KIT基因扩增，EGFR或KRAS变异也被 发现。目前本申请人所在肺癌研宄进行的临床试验正在研宄MET抑制剂INC280联合EGFR TKI治疗非小细胞肺癌靶向药物治疗耐药后MET突变的疗效。肿瘤发生发展耐药的多位点 变异决定了肿瘤靶点的分子分型、靶向治疗以及耐药后机制探索的复杂性。
[0003] 在肺癌的分子分型方面，目前临床单基因检测方法主要有qPCR、测序、FISH及IHC 等多平台技术，除了 EGFR、ALK、KRAS等主要基因的检测技术在临床相对成熟之外，R0S1、 RET、HER2、NRTK、NRG、RICTOR、mTOR、LKBl、MET、RITlA等分子变异的分型在临床主要限制 因素有：分析的通量化（high throughput)不够成熟和生物材料的有限性获得（limited procurement)。临床上肺癌早期患者接受手术（大手术或小手术活检）具有充足的组织， 晚期患者通常通过经皮肺穿刺、支气管镜活检、支气管内超声穿刺活检等获得只是少量标 本。这些小标本为了满足现有的临床病理诊断和个别基因的分子检测，很难有剩余材料进 一步用于其他重要分子分型（molecular classification/genotying)、药物耐药机制等分 析。可见肿瘤样本的匮乏、低通量、耗时性以及价格昂贵等是制约临床多次单个基因检测开 展的瓶颈。
[0004] 肿瘤发生发展、靶向治疗后耐药以及转移机制等分子靶点的复杂性分析，以及对 肺癌患者样本多靶点变异基因进行单基因检测的局限性，决定了在临床转化医学研宄中 开展多基因检测平台的必要性与紧迫性。MassARRAY分子量阵列技术通过扩增延伸反应 与质谱相结合实现基因的分型检测，基于此平台的Iplex技术可基于96/384孔板开展多 基因检测，操作程序简单，分型结果具有质谱的高准确性和敏感性。LungCarta试剂盒是 MassARRAY公司研发主要针对肺癌靶向基因检测的试剂盒，已在肺癌领域广泛应用，包含 26个癌症相关基因的214个突变位点。本发明申请人已经使用LungCarta试剂盒对肺癌患 者组织样本进行多基因多位点的高通量检测，检测样本目前已达到100多例，可明显提高 临床检测效率，改变传统单基因检测价格昂贵，耗时长，操作繁琐等劣势，为肺癌患者的临 床靶向治疗以及耐药后治疗、以及生物标志物转化医学研宄提供更全面的依据。但是由于 该试剂盒为国外研发，技术信息保密，价格昂贵，且未完全包括前沿分子靶点如原发MET基 因变异与EGFR TKI的靶向治疗耐药相关、ALK基因的多个位点突变与Crizotinib的靶向 治疗耐药相关等，以及中美地区驱动基因谱具有差异性等特点，因此研发适合中国人群的 多基因同步检测方法具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于MassARRAY质 谱平台Iplex分析的肺癌基因谱检测方法。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试 剂盒，是通过上述检测方法设计得到。
[0007] 本发明的再一目的在于提供上述试剂盒的应用
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于MassARRAY质谱平台Iplex分析 的肺癌基因谱检测方法，能检测肺癌13种驱动和耐药相关基因的99种热点变异位点，包括 如下步骤：
[0009] (1)设计如表1所示的扩增引物和如表2所示的延伸引物；
[0010] ⑵将如表1所示的扩增引物分为12组，扩增引物名称末尾为Pl-F和Pl-R为第 1组，扩增引物名称末尾为P2-F和P2-R为第2组，类推，分为12组；将分组后的扩增引物 混合，得到12管扩增引物混合液；将如表2所示的延伸引物进行分组，延伸引物名称末尾 为El的延伸引物混合得到第1管延伸引物混合物，延伸引物名称末尾为E2的延伸引物混 合得到第2管延伸引物混合物，类推，得到11管延伸引物混合物和1管单独延伸引物，共计 12管；
[0011] (3)以人肺组织基因组为模板，将12管扩增引物混合液分别进行PCR，获得PCR产 物；
[0012] (4)将步骤（3)获得的PCR产物进行碱性磷酸酶消化；
[0013] (5)将步骤（4)消化后的产物进行延伸反应：12管扩增引物得到的产物分别对应 12管延伸引物，Pl对应E1，以此类推；
[0014] (6)在96孔板或384孔板将步骤（5)延伸反应后得到的产物、清洁树脂和水混合； 旋转96孔板或384孔板进行脱盐去离子防干扰处理；接着离心；对上清进行分析；
[0015] (7) MassARRAY系统Nanodispenser点样仪进行芯片点样，利用Analyzer分析仪芯 片扫描；扫描结果以Typ er4. 0软件分析各目的基因的突变状况，在质谱峰变异碱基处出现 峰，则判断为突变。
[0016] 表1扩增引物
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[0025] 步骤（2)中所述的扩增引物混合物中的扩增引物优选为按等摩尔比混合；更优选 为每条扩增引物的浓度为0. 5 μΜ ;
[0026] 步骤（2)中所述的延伸引物混合物中的延伸引物优选为按如下摩尔比混合：
[0027] 第1管：如SEQ ID NO. 199~SEQ ID NO. 208所示的延伸引物的摩尔比为7. 04 : 7. 36 :8. 05 :8. 30 :9. 10 :9. 34 :10. 12 :10. 35 :10. 91 :11. 11 ;
[0028] 第2管：如SEQ ID NO. 209~SEQ ID NO. 218所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 83 :7. 11 :7. 84 :8. 05 :8. 93 :9. 16 :9. 76 :9. 94 :10. 42 :10. 90 ;
[0029] 第3管：如SEQ ID NO. 219~SEQ ID NO. 228所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 01 :7. 74 :7. 99 :8. 69 :8. 96 :9. 60 :9. 84 :10. 41 :10. 66 :11. 20 ;
[0030] 第4管：如SEQ ID NO. 229~SEQ ID NO. 238所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 89 ：7. 18 ：7. 89 ：8. 55 ：9. 44 ：9. 58 ：10. 15 ：10. 40 ：11. 02 ：11. 20 ；
[0031] 第5管：如SEQ ID NO. 239~SEQ ID NO. 248所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 94 ：7, 28 ：7, 59 ：8, 34 ：8, 59 ：9, 44 ：9, 63 ：10, 30 ：10, 45 ：11, 16 ；
[0032] 第6管：如SEQ ID NO. 249~SEQ ID NO. 258所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 94 ：7, 67 ：8, 34 ：8, 57 ：9, 31 ：9, 47 ：10, 03 ：10, 26 ：10, 91 ：11. 11 ；
[0033] 第7管：如SEQ ID NO. 259~SEQ ID NO. 268所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 05 ：7, 35 ：8. 11 ：8, 95 ：9, 18 ：9, 80 ：9, 99 ：10, 52 ：11, 01 ：11, 22 ；
[0034] 第8管：如SEQ ID NO. 269~SEQ ID NO. 278所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 87 ：7, 12 ：8, 09 ：8, 74 ：9, 00 ：9, 69 ：10, 42 ：10, 65 ：11, 13 ：11, 29 ；
[0035] 第9管：如SEQ ID NO. 279~SEQ ID NO. 285所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 11 ：8, 04 ：8, 72 ：8, 93 ：9, 63 ：10, 34 ：11, 10 ；
[0036] 第10管：如SEQ ID NO. 286~SEQ ID NO. 291所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 90 ：7, 97 ：8, 14 ：9. 11 ：9, 90 ：10, 74 ；
[0037] 第11管：如SEQ ID NO. 292~SEQ ID NO. 296所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 10 ：8, 14 ：9, 20 ：10, 09 ：10, 85 ；
[0038] 步骤⑵中所述的延伸引物混合物中的延伸引物的浓度优选为如表3所示；
[0039] 表3延伸引物浓度
[0040]
[0041]
[0042] 步骤（3)中所述的PCR的体系优选为：10XPCR缓冲液0. 5 μ 1、 MgCl2 (25mM) 0· 4 μ I、dNTPs (25mM) 0· 1 μ I、PCR 酶（5U/μ 1) 0· 2 μ 1、扩增引物混合液 1 μ 1、 人肺组织基因组（l〇ng/ μ 1)2 μ 1，水补足5 μ I ;
[0043] 步骤（3)中所述的PCR的条件优选为：94°C 2分钟；94°C 30秒、56°C 30秒、72°C I 分钟，45个循环；72 °C 5分钟；
[0044] 步骤⑷中所述的消化的体系为：在PCR产物中加入核酸外切酶SAP 0. 3 μ 1、SAP 缓冲液0. 17 μ I、水补足至7 μ I ;
[0045] 步骤（4)中所述的消化的条件优选为：37°C 40分钟，85°C 5分钟；
[0046] 步骤（5)中所述的延伸反应的体系优选为：在消化后得到的产物中加入Typeplex 缓冲液（IOX)〇·2 μ 1、Typ印Iex终止混合液（IOX)0.2 μ 1、Typ印Iex热测序酶（33U/ μ 1)0. 041 μ 1、延伸引物混合液或单独延伸引物溶液0. 804 μ 1、H2O补足至9 μ 1 ;
[0047] 步骤（5)中所述的延伸反应的条件优选为：94°C 30秒；〔94°C 5秒、（52°C 5秒、 80°C 5秒）5个循环〕，35个循环；72°C 3分钟。
[0048] 步骤（6)中：当使用96孔板操作时，将延伸反应后的产物9 μ 1、水41 μ 1和清洁树 脂（Clean Resin) 15mg混合；当使用384孔板操作时，将延伸反应后的产物9 μ 1、水16 μ 1 和清洁树脂6mg混合；
[0049] 步骤（6)中所述的脱盐去离子防干扰处理的时间优选为 30~60分钟；
[0050] 步骤（6)中所述的离心的条件优选为3200g离心5分钟。
[0051] 一种基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒，为依据上述基于 MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒设计得到，能检测肺癌13种驱动和耐药相关 基因的99种热点变异位点，包含如表1所示的扩增引物和表2所示的延伸引物：
[0052] 所述的基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒，优选包含12管扩增引 物混合物、11管延伸引物混合物和1管单独延伸引物；扩增引物名称末尾为Pl-F和Pl-R 的引物混合得到第1管引物混合物，扩增引物名称末尾为P2-F和P2-R的引物混合得到第 2管引物混合物，类推，为12管；按表2中的延伸引物进行分组，延伸引物名称末尾为El的 延伸引物混合得到第1管延伸引物混合物，延伸引物名称末尾为E2的延伸引物混合得到第 2管延伸引物混合物，类推，为12管；
[0053] 所述的扩增引物混合物中的扩增引物优选为按等摩尔比混合；更优选为每条扩增 引物的浓度为0.5 μΜ;
[0054] 所述的延伸引物混合物中的延伸引物优选为按如下摩尔比混合：
[0055] 第1管：如SEQ ID NO. 199~SEQ ID NO. 208所示的延伸引物的摩尔比为7. 04 : 7. 36 ：8, 05 ：8, 30 ：9. 10 ：9, 34 ：10, 12 ：10, 35 ：10, 91 ：11. 11 ；
[0056] 第2管：如SEQ ID NO. 209~SEQ ID NO. 218所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 83 ：7. 11 ：7, 84 ：8, 05 ：8, 93 ：9, 16 ：9, 76 ：9, 94 ：10, 42 ：10, 90 ；
[0057] 第3管：如SEQ ID NO. 219~SEQ ID NO. 228所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 01 ：7, 74 ：7, 99 ：8, 69 ：8, 96 ：9, 60 ：9, 84 ：10, 41 ：10, 66 ：11, 20 ；
[0058] 第4管：如SEQ ID NO. 229~SEQ ID NO. 238所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 89 ：7, 18 ：7, 89 ：8, 55 ：9, 44 ：9, 58 ：10, 15 ：10, 40 ：11, 02 ：11, 20 ；
[0059] 第5管：如SEQ ID NO. 239~SEQ ID NO. 248所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 94 ：7, 28 ：7, 59 ：8, 34 ：8, 59 ：9, 44 ：9, 63 ：10, 30 ：10, 45 ：11, 16 ；
[0060] 第6管：如SEQ ID NO. 249~SEQ ID NO. 258所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 94 ：7, 67 ：8, 34 ：8, 57 ：9, 31 ：9, 47 ：10, 03 ：10, 26 ：10, 91 ：11. 11 ；
[0061] 第7管：如SEQ ID NO. 259~SEQ ID NO. 268所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 05 ：7, 35 ：8. 11 ：8, 95 ：9, 18 ：9, 80 ：9, 99 ：10, 52 ：11, 01 ：11, 22 ；
[0062] 第8管：如SEQ ID NO. 269~SEQ ID NO. 278所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 87 ：7. 12 ：8. 09 ：8. 74 ：9. 00 ：9. 69 ：10. 42 ：10. 65 ：11. 13 ：11. 29 ；
[0063] 第9管：如SEQ ID NO. 279~SEQ ID NO. 285所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 11 ：8, 04 ：8, 72 ：8, 93 ：9, 63 ：10, 34 ：11. 10 ；
[0064] 第10管：如SEQ ID NO. 286~SEQ ID NO. 291所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 90 ：7, 97 ：8, 14 ：9. 11 ：9, 90 ：10, 74 ；
[0065] 第11管：如SEQ ID NO. 292~SEQ ID NO. 296所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 10 ：8, 14 ：9, 20 ：10, 09 ：10, 85 ；
[0066] 所述的延伸引物混合物和所述的单独延伸引物中延伸引物的浓度更优选为如表3 所示；
[0067] 所述的基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒还包括清洁树脂和PCR 用酶试剂中的一种或两种。
[0068] 所述的PCR用酶试剂包括PCR酶、dNTP、PCR缓冲液等。
[0069] 所述的基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒的应用，包含如下步 骤：
[0070] (1)将如表1所示的扩增引物分为12组，扩增引物名称末尾为Pl-F和Pl-R为第 1组，扩增引物名称末尾为P2-F和P2-R为第2组，类推，分为12组；将每条扩增引物配制成 浓度为10 μΜ的引物溶液后，再按分组进行混合，得到12管扩增引物混合液，每条引物的终 浓度为〇. 5 μ M ;以人肺组织基因组为模板，将12组扩增引物混合液分别进行PCR，获得PCR 产物；
[0071] PCR 的条件为：94°C 2 分钟；94°C 30 秒、56°C 30 秒、72°C 1 分钟，45 个循环；72°C 5 分钟；
[0072] PCR 的体系为：10XPCR 缓冲液 0· 5 μ l、MgCl2(25mM)0. 4μ l、dNTPs(25mM)0. 1 μ 1、 PCR酶（5U/ μ 1)0. 2 μ 1、扩增引物混合液I μ 1、人肺组织基因组（lOng/ μ I) 2 μ 1，水补足至 5μ1 ;
[0073] (2)将步骤（1)获得的PCR产物进行碱性磷酸酶消化；消化的体系为：在步骤（1) 得到的PCR产物中加入核酸外切酶SAP 0. 3 μ 1、SAP缓冲液0. 17 μ 1、水补足至7 μ 1 ;消化 的条件为：37 °C 40分钟，85 °C 5分钟；
[0074] (3)按表2中的延伸引物进行分组，延伸引物名称末尾为El的延伸引物混合得 到第1管延伸引物混合物，延伸引物名称末尾为E2的延伸引物混合得到第2管延伸引物 混合物，类推，为12管，按表3将延伸引物配制成11管延伸引物混合液和1管单独延伸 引物溶液；在步骤（2)得到的产物中进行延伸反应；12管扩增引物分别对应12管延伸引 物，Pl对应E1，以此类推；延伸反应的体系为：在步骤（2)得到的产物中加入Typeplex 缓冲液（10X)〇·2 μ 1、Typ印Iex终止混合液（10X)0.2 μ 1、Typ印Iex热测序酶（33U/ μ 1)0. 041 μ 1、延伸引物混合液或单独延伸引物溶液0. 804 μ 1、Η20补足至9 μ 1 ;延伸反应 的条件为：94°C 30秒；〔94°C 5秒、（52°C 5秒、80°C 5秒）5个循环〕，35个循环；72°C 3 分钟；
[0075] (4)使用96孔板操作时，将步骤⑶获得产物9 μ 1、水41 μ 1和清洁树脂（Clean Resin) 15mg混合；使用384孔板操作时，将步骤（3)获得产物9 μ 1、水16 μ 1和清洁树脂 6mg混合；旋转96孔板或384孔板30~60分钟进行脱盐去离子防干扰处理；3200g离心5 分钟；对上清进行分析；
[0076] (5) MassARRAY系统Nanodispenser点样仪进行芯片点样，利用Analyzer分析仪芯 片扫描；扫描结果以Typer4. 0软件分析各目的基因的突变状况，在质谱峰变异碱基处出现 峰，则判断为突变。
[0077] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0078] (1)本发明提供的检测试剂盒考虑了欧美人群与亚洲人群肺癌基因谱的差异性， 检测基因更前沿，并纳入了多个与肺癌靶向治疗耐药相关的位点，检测结果将为优化个体 化诊疗分子分型，筛查技术方案以及靶向治疗耐药的后续治疗和研宄提供依据。
[0079] (2)本发明提供的检测试剂盒自主研发，在价格上存在优势，降低了患者的临床检 测费用，可转化研宄应用于临床，产生经济效益和优化临床资源配置。
[0080] (3)本发明提供的检测试剂盒以96或384孔板多重反应分析为基础，具有高通量 性，可同时检测13个基因的99个位点。改变传统单基因检测价格昂贵，耗时长，操作繁琐 等劣势。具有在肺癌的穿刺活检小样本中实现"单个小样本多基因的检测"，满足小样本最 大化使用、获得最大信息量的临床实践需求。
[0081] (4)本发明提供的检测试剂盒进行的PCR反应产物片段短，不仅可在新鲜组织样 本中进行检测，还可在石蜡组织、胸水等疑难样本中进行检测。
[0082] (5)本发明提供的检测试剂盒基于MassARRAY平台具有质谱的高准确性与高敏感 性，并在石蜡样本残存DNA样本中检测结果稳定，较Sanger测序法具有明显优势，提高了检 测阳性率。
【附图说明】
[0083] 图1为使用本发明试剂盒检测K1747T肺癌组织样本得到FGFR2_N549H的结果图；
[0084] 其中，横坐标表示延伸产物（或延伸引物）的分组量大小；纵坐标表示质谱强度， 下同。
[0085] 图2为检测K1736T肺癌组织样本得到的EGFR_L858R、MET_N375S突变结果图；
[0086] 其中，A 为 LungCarta 检测 EGFR_L858R 突变 G 分子量为 6139. 00 ;
[0087] B 为 LungCarta 检测 MET_N375S 突变 G 分子量为 7253. 80 ;
[0088] C为本发明试剂盒检测EGFR_L858R突变G分子量为7679. 00 ;
[0089] D为本发明试剂盒检测MET_N375S突变G分子量为8195. 40。
[0090] 图3为检测K1744T肺癌组织样本得到的EGFR_Exonl9del突变结果图；
[0091] 其中，A 为 LungCarta 检测 EGFR_Exonl9del 分子量为 5376. 50 ;
[0092] B为本发明试剂盒检测EGFR_2235_2249dell5分子量为5376. 50。
[0093] 图4为检测K1748T肺癌组织样本得到的结果图；
[0094] 其中，A 为 LungCarta 检测 STKl 1_F354L 突变 G 分子量为 8239. 40 ;
[0095] B为本发明试剂盒检测STKl 1_F354L突变G分子量为6016. 90。
[0096] 图5为延伸引物浓度对第9孔检测结果质谱峰的影响的结果图；
[0097] 其中，A为优化延伸引物后的检测质谱图；
[0098] B为优化延伸引物前的检查质谱图。
[0099] 图6为树脂量对第10孔检测结果质谱峰的影响图；
[0100] 其中，A为优化树脂量后的检测质谱图；
[0101] B为优化树脂量前的检测质谱图。
【具体实施方式】
[0102] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0103] 实施例1肺癌多基因谱检测引物试剂盒的制备
[0104] 1、确定肺癌相关驱动基因或靶向耐药基因：通过网络检索PUBMED数据库，查 阅最新文献，统计与中国人群肺癌发病机理、化放疗、靶向耐药以及转移等相关的靶向基 因或其平行、相邻通路基因，确定纳入试剂盒的基因（13个）如下：EGFR(NM_005228)、 KRAS (匪_033360)、ALK(NM_004304)、FGFRl (ΝΜ_023110· 2)、FGFR2(M1_000141. 2)、 FGFR3 (ΝΜ_000142· 4)、PIK3CA(NM_006218. 2)、BRAF(NM_004333. 4)、ΡΤΕΝ(ΝΜ_000314· 4)、 MET(NM_001127500.1 )、ERBB2(NM_004448)、AKTl (NM_005163)、STKll (ΝΜ_000455· 4)。
[0105] 2、筛选目的基因的热点变异位点：在COSMIC数据库中查询上述13个基 因的 COSMIC 基因号分别为 EGFR (ENST00000275493)、KRAS (ENST00000256078)、 ALK (ENST00000389048)、FGFRl (ENST00000447712)、FGFR2 (ENST00000358487)、 FGFR3(ENST00000440486)、 PIK3CA(ENST00000263967)、 BRAF(ENST00000288602)、 PTEN(ENST00000371953)、MET (ENST00000318493)、ERBB2(ENST00000269571)、 AKTl (ENST00000349310)、STK11 (ENST00000326873)。查询上述基因在肿瘤中的热点变异位 点，结合国内外研宄进展以及本申请发明人的前期研宄成果，共确定99个与驱动肺癌发生 以及耐药相关的碱基位点以及相应的氨基酸位点（见表4)。
[0106] 表4引物试剂盒包含检测基因的蛋白变异位点
[0107]
[0108] 3、软件设计多重引物文档：在PUBMED数据库查询纳入试剂盒13个基因的基 因组 gDNA 序列，分别为 EGFR(NG_007726. 3)、KRAS(NG_007524. 2)、ALK(NG_009445. 1)、 FGFR1(NG_007729)、FGFR2(NG_012449. 1)、FGFR3(NG_012632. 1)、PIK3C(NG_012113. 2)、 BRAF(NG_007873. 3)、PTEN(NG_007466. 2)、MET(NG_008996. I)、ERBB2(NG_007503. I)、 AKTl (NG_012188. I)、STK11 (NG_007460. 2)。根据 COSMIC 中基因的 CDS 序列在 gDNA 序列中 标记变异位点，并根据SEQUEN0M公司突变标示方式，将变异位点侧翼约200个碱基拷贝到 引物设计固定格式文本中设计引物。
[0109] 4、多重引物设计：通过MassARRAY网站ADS(Assay Design Suite)引物设计软件， 运行第3步变异位点序列的文档，调整相关参数，将13个基因99个位点全部纳入引物设计 试剂盒。共设计297条引物，99条正向、99条反向PCR引物和99条延伸引物。依据延伸产 物的长度以及引物不形成二聚体且能特异性得到目标产物，将297条引物分别分布在12孔 里面，PCR引物（如表1所示）的分组以表1中的扩增引物进行分组，引物名称末尾为Pl-F 和Pl-R为第1组，引物名称末尾为P2-F和P2-R为第2组，类推，分为12组；延伸引物的分 组以表2中的延伸引物进行分组，引物名称末尾为El为第1组，引物名称末尾为E2为第2 组，类推，分为12组。12管扩增引物分别对应12管延伸引物，Pl对应E1，以此类推。
[0110] 5、多重引物的合成与配制（试剂盒制备）：在上海生工生物工程有限公司合成ADS 软件导出的297条引物，并进行配制：（I)PCR引物先稀释成10 μΜ，然后工作液以每条引物 浓度为0.5 μΜ进行混合，得到扩增引物混合液，共12管（每管包括正、反向引物）；（2)延 伸引物先稀释成500 μΜ，然后根据每一条延伸引物的分子量，按相应体积（如表3)进行混 合，得到延伸引物混合液，共12管。
[0111] 实施例2使用实施例1的试剂盒检测肺癌细胞株
[0112] 1、选用已知突变位点的 Η460、PC9、Η1650、Η1975、Α549、GLC82、HCC827、Η1299 的 8个肺癌细胞株（均能从ATCC购买得到）进行本试剂盒的可行性分析，同时设立正常人基 因组DNA(gDNA)(来源于就诊广东省人民医院的正常人的包皮组织提取得到）做为阴性对 照，水（H 2O)做为空白对照。每个样本检测需要DNA120ng，即IOng/孔X 12孔。本发明试 剂盒的操作如下：
[0113] (I)PCR 的体系为：10XPCR 缓冲液 0· 5 μ 1、MgCl2(25mM)0. 4 μ 1、 dNTPs(25mM)0. 1 μ 1、PCR酶（5U/ μ 1)0. 2 μ 1、扩增引物混合液1 μ 1、肺癌组织样本基因组 (IOng/ μ 1)2 μ 1，水补足至 5 μ 1。94°C 2 分钟；94°C 30 秒、56°C 30 秒、72°C 1 分钟，45 个循 环；72°C 5分钟。
[0114] (2)在步骤⑴得到的PCR产物中加入核酸外切酶SAP 0.3μ1、SAP缓冲液 0. 17 μ 1、水补足至7 μ 1。37°C 40分钟，85°C 5分钟，将步骤（1)获得的PCR产物进行碱性 磷酸酶消化。
[0115] (3)12管扩增引物分别对应12管延伸引物，Pl对应E1，以此类推。在步骤（2) 得到的产物中加入Typ印Iex缓冲液（IOX)O. 2 μ 1、Typ印Iex终止混合液（IOX)O. 2 μ 1、 Typ印lex热测序酶（33U/ μ 1) 0· 041 μ 1、延伸引物混合液0· 804 μ I、H2O补足至9 μ 1。 94°C 30秒；〔94°C 5秒、（52°C 5秒、80°C 5秒）5个循环〕，35个循环；72°C 3分钟，进行 延伸反应。
[0116] (4)将步骤⑶获得产物中加入水41 μ 1，清洁树脂（Clean Resin) 15mg(96孔板） 或者加入水16 μ I，清洁树脂6mg (384孔板），旋转板30-60分钟进行脱盐去离子防干扰处 理；3200g离心5分钟；
[0117] (5)MassARRAY系统Nanodispenser点样仪将上清液进行芯片点样，利用Analyzer 分析仪芯片扫描；扫描结果以Typer4. 0软件分析各目的基因的突变状况，在质谱峰变异碱 基处出现峰，则判断为突变。
[0118] 2、建立方法检测8例肺癌细胞株的变异位点，验证结果显示与美国标准菌种收藏 所（WWW. atcc.org)细胞株的变异情况一致，具体基因的变异蛋白与碱基位点结果如表5。 其中由于本发明试剂盒不包含PTEN缺失位点，因此未检测到H1650细胞株的PTEN缺失。阴 性对照以及空白对照均没有检测到基因变异，表明本试剂盒具有可行性。
[0119] 表5本发明试剂盒在肺癌细胞株检测的验证结果
[0120]
[0121] 实施例3使用实施例1的试剂盒检测肺癌患者组织样本
[0122] 1、验证选用已经使用LungCarta试剂盒检测出突变的3例人肺腺癌组织样（来自 广东省人民医院）以及未检测出突变的3例肺癌组织样本（来自广东省人民医院），同时设 立正常人基因组DNA (gDNA)做为阴性对照，水（H2O)做为空白对照。每个样本检测需要DNA 120ng，即IOng/孔X 12孔。其中，LungCarta试剂盒按其说明书操作。本发明试剂盒的操 作如下：
[0123] (I)PCR 的体系为：10XPCR 缓冲液 0· 5 μ 1、MgCl2(25mM)0. 4 μ 1、 dNTPs(25mM)0. 1 μ 1、PCR酶（5U/ μ 1)0. 2 μ 1、扩增引物混合液1 μ 1、肺癌组织样本基因组 (IOng/ μ 1)2 μ 1，水补足至 5 μ 1。94°C 2 分钟；94°C 30 秒、56°C 30 秒、72°C 1 分钟，45 个循 环；72°C 5分钟。
[0124] (2)在步骤⑴得到的PCR产物中加入核酸外切酶SAP 0.3μ1、SAP缓冲液 0. 17 μ 1、水补足至7 μ 1。37°C 40分钟，85°C 5分钟，将步骤（1)获得的PCR产物进行碱性 磷酸酶消化。
[0125] (3)12管扩增引物分别对应12管延伸引物，Pl对应E1，以此类推。在步骤（2) 得到的产物中加入Typ印Iex缓冲液（IOX)O. 2 μ 1、Typ印Iex终止混合液（IOX)O. 2 μ 1、 Typ印lex热测序酶（33U/ μ 1)0. 041 μ 1、延伸引物混合液0· 804 μ 1、Η20补足至9 μ 1。： 94°C 30秒；〔94°C 5秒、（52°C 5秒、80°C 5秒）5个循环〕，35个循环；72°C 3分钟，进行 延伸反应。
[0126] (4)将步骤（3)获得产物中加入水41 μ 1，清洁树脂（Clean Resin) 15mg(96孔板） 或者加入水16 μ I，清洁树脂6mg (384孔板），旋转板30-60分钟进行脱盐去离子防干扰处 理；3200g离心5分钟；
[0127] (5)MassARRAY系统Nanodispenser点样仪将上清液进行芯片点样，利用Analyzer 分析仪芯片扫描；扫描结果以Typer4. 0软件分析各目的基因的突变状况，在质谱峰变异碱 基处出现峰，则判断为突变。
[0128] 2、本发明试剂盒检测6例肺癌组织样本，与LungCarta试剂盒检测结果比较（见 表6)。使用本发明试剂盒在1例使用LungCarta试剂盒检测未发现突变的K1747T样本中 检测到FGFR2基因的突变（N549位点野生型A碱基分子量为7055. 7 ;突变C碱基分子量为 7031. 6,见图1)，在其它组织样本中与LungCarta试剂盒检测结果完全一致（图2~4)。 FGFR2基因是肿瘤治疗的新靶点，本试剂盒包含此新突变位点，而LungCarta试剂盒未含此 突变位点，表明本试剂盒具有前沿优势，可为临床患者提供更准确的基因变异信息。阴性对 照以及空白对照均没有检测到变异，表明本试剂盒具有可行性。
[0129] 表6本发明试剂盒与LungCarta试剂盒比较的验证结果
[0130]
[0131] 实施例4本发明试剂盒与直接测序法比较
[0132] 选取100例肺癌组织样本使用本发明试剂盒进行检测，与本研宄所已经建立的 EGFR、KRAS、PIK3CA、BRAF直接测序法比较敏感性与特异性。直接测序法按ABI 3730测 序仪标准操作流程进行。本发明试剂盒灵敏度为100%，特异度为96. 3%，阳性预测值为 95.8%，阴性预测值为100% (见表7)。结果显示本发明试剂盒具有高灵敏度，与直接测序 法比较特异度为96. 3%，可能与质谱的高敏感性相关，可弥补直接测序法低敏感度导致的 假阴性。
[0133] 表7本发明试剂盒的灵敏度与特异度
[0134]
[0135] 对比例1 :
[0136] 操作步骤与条件基本与实施例2、3所述的肺癌基因谱检测方法的应用一致，区别 仅在于：E9组延伸引物的浓度有变化，具体为FGFR1_T141A由9. 63μΜ变为3. 21μΜ，其他 六个延伸引物浓度不变。结果显示FGFR1_T141A的电泳峰明显降低，如图5所示。本对比 例旨在说明，在其他条件不变的情况下，延伸引物的混合物中，各个引物成分的浓度比例是 实验成败的一个关键因素。
[0137] 该对比例说明，在进行多重PCR及延伸反应时，引物混合物中，各种引物之间存在 着相互竞争作用，某些引物的反应效率高以及受分子量大小影响，产生的峰形较高，但有些 引物效率则受到抑制，所以引物混合中各种引物的浓度和比例对结果影响很大，需要不断 调整，获得最佳引物浓度比例。
[0138] 对比例2:
[0139] 操作步骤与条件基本与实施例2、3所述的肺癌基因谱检测方法的应用一致，区别 仅在于：建立应用方法的第4步在96孔板操作时清洁树脂（Clean Resin)每孔加入由15mg 变为l〇mg。结果显示在每个反应的主峰后面约40分子量大小处形成一个K+副峰，干扰结 果判读，如图6所示为反应第十孔6重反应6个主峰后面均含有1个副峰。本对比例旨在 说明，在其他条件不变的情况下，在树脂的脱离子（K+、Na +等）作用下对质谱结果的影响，树 脂加入量的多少是实验成败的一个关键因素。
[0140] 该对比例说明，在点样芯片进行质谱扫描前，应该对产物进行充分的脱离子处理， 调整树脂到合适量，否则将会在产物主峰的后面形成副峰，严重干扰结果判读。所以考虑树 脂量对结果的影响比较大，需要调整加入合适量的树脂，在芯片点样前将样本充分脱盐，减 少离子对结果的影响。
[0141] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种基于MassARRAY质谱平台Iplex分析的肺癌基因谱检测方法，其特征在于能检 测肺癌13种驱动和耐药相关基因的99种热点变异位点，包括如下步骤： (1)设计如SEQ ID NO. 1~SEQ ID NO. 198所示的扩增引物和如SEQ ID NO. 199~SEQ ID NO. 297所示的延伸引物； (2)将如SEQ ID NO. 1~SEQ ID NO. 198所示的扩增引物分为12组，扩增引物名称 末尾为Pl-F和Pl-R为第1组，扩增引物名称末尾为P2-F和P2-R为第2组，类推，分为12 组；将分组后的扩增引物混合，得到12管扩增引物混合液；将如SEQ ID NO. 199~SEQ ID NO. 297所示的延伸引物进行分组，延伸引物名称末尾为El的延伸引物混合得到第1管延伸 引物混合物，延伸引物名称末尾为E2的延伸引物混合得到第2管延伸引物混合物，类推，得 到11管延伸引物混合物和1管单独延伸引物，共计12管； (3) 以人肺组织基因组为模板，将12管扩增引物混合液分别进行PCR，获得PCR产物； (4) 将步骤（3)获得的PCR产物进行碱性磷酸酶消化； (5) ... 将步骤（4)消化后的产物进行延伸反应：12管扩增引物得到的产物分别对应12管 延伸引物，Pl对应E1，以此类推； (6) 在96孔板或384孔板将步骤（5)延伸反应后得到的产物、清洁树脂和水混合；旋 转96孔板或384孔板进行脱盐去离子防干扰处理；接着离心；对上清进行分析； (7) MassARRAY系统Nanodispenser点样仪进行芯片点样，利用Analyzer分析仪芯片扫 描；扫描结果以Typer4.O软件分析各目的基因的突变状况，在质谱峰变异碱基处出现峰， 则判断为突变。2. 根据权利要求1所述基于MassARRAY质谱平台Iplex分析的肺癌基因谱检测方法， 其特征在于： 步骤（2)中所述的扩增引物混合物中的扩增引物为按等摩尔比混合； 步骤⑵中所述的延伸引物混合物中的延伸引物为按如下摩尔比混合： 第1管：如SEQ ID NO. 199~SEQ ID NO. 208所示的延伸引物的摩尔比为7. 04 :7. 36 : 8. 05 ：8, 30 ：9, 10 ：9, 34 ：10, 12 ：10, 35 ：10, 91 ：11. 11 ； 第2管：如SEQ ID NO. 209~SEQ ID NO. 218所示的延伸引物的浓度分别依次为6.83: 7. 11 ：7, 84 ：8, 05 ：8, 93 ：9, 16 ：9, 76 ：9, 94 ：10, 42 ：10, 90 ； 第3管：如SEQ ID NO. 219~SEQ ID NO. 228所示的延伸引物的浓度分别依次为7.01 : 7. 74 ：7, 99 ：8, 69 ：8, 96 ：9, 60 ：9, 84 ：10, 41 ：10, 66 ：11, 20 ； 第4管：如SEQ ID NO. 229~SEQ ID NO. 238所示的延伸引物的浓度分别依次为6.89: 7. 18 ：7, 89 ：8, 55 ：9, 44 ：9, 58 ：10, 15 ：10, 40 ：11, 02 ：11, 20 ； 第5管：如SEQ ID NO. 239~SEQ ID NO. 248所示的延伸引物的浓度分别依次为6.94: 7. 28 ：7, 59 ：8, 34 ：8, 59 ：9, 44 ：9, 63 ：10, 30 ：10, 45 ：11, 16 ； 第6管：如SEQ ID NO. 249~SEQ ID NO. 258所示的延伸引物的浓度分别依次为6.94: 7. 67 ：8, 34 ：8, 57 ：9, 31 ：9, 47 ：10, 03 ：10, 26 ：10, 91 ：11. 11 ； 第7管：如SEQ ID NO. 259~SEQ ID NO. 268所示的延伸引物的浓度分别依次为7. 05: 7. 35 ：8. 11 ：8, 95 ：9, 18 ：9, 80 ：9, 99 ：10, 52 ：11, 01 ：11, 22 ； 第8管：如SEQ ID NO. 269~SEQ ID NO. 278所示的延伸引物的浓度分别依次为6.87: 7. 12 ：8, 09 ：8, 74 ：9, 00 ：9, 69 ：10, 42 ：10, 65 ：11, 13 ：11, 29 ； 第9管：如SEQIDNO. 279~SEQIDNO. 285所示的延伸引物的浓度分别依次为7. 11 : 8. 04 :8. 72 :8. 93 :9. 63 :10. 34 :11. 10 ; 第10管：如SEQIDNO. 286~SEQIDNO. 291所示的延伸引物的浓度分别依次为6. 90: 7. 97 ：8, 14 ：9. 11 ：9, 90 ：10, 74 ； 第11管：如SEQIDNO. 292~SEQIDNO. 296所示的延伸引物的浓度分别依次为7. 10: 8. 14 :9. 20 :10. 09 :10. 85。3.根据权利要求1所述基于MassARRAY质谱平台Iplex分析的肺癌基因谱检测方法， 其特征在于： 所述的扩增引物混合物中的每条引物的浓度为〇. 5yM; 所述的延伸引物混合物中的每条延伸引物的浓度如下： 第1管：如SEQIDNO. 199~SEQIDNO. 208所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 04yM、7. 36yM、8. 05yM、8. 30yM、9. 10yM、9. 34yM、10. 12yM、10. 35yM、10. 91yM、 11. 11yM； 第2管：如SEQIDNO. 209~SEQIDNO. 218所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 83yM、7. 11yM、7. 84yM、8. 05yM、8. 93yM、9. 16yM、9. 76yM、9. 94yM、10. 42yM、 10. 90yM; 第3管：如SEQIDNO. 219~SEQIDNO. 228所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 01yM、7. 74yM、7. 99yM、8. 69yM、8. 96yM、9. 60yM、9. 84yM、10. 41yM、10. 66yM、 11. 20yM； 第4管：如SEQIDNO. 229~SEQIDNO. 238所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 89yM、7. 18yM、7. 89yM、8. 55yM、9. 44yM、9. 58yM、10. 15yM、10. 40yM、ll. 02yM、 11. 20yM； 第5管：如SEQIDNO. 239~SEQIDNO. 248所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 94yM、7. 28yM、7. 59yM、8. 34yM、8. 59yM、9. 44yM、9. 63yM、10. 30yM、10. 45yM、 11. 16yM； 第6管：如SEQIDNO. 249~SEQIDNO. 258所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 94yM、7. 67yM、8. 34yM、8. 57yM、9. 31yM、9. 47yM、10. 03yM、10. 26yM、10. 91yM、 11. 11yM； 第7管：如SEQIDNO. 259~SEQIDNO. 268所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 05yM、7. 35yM、8. 11yM、8. 95yM、9. 18yM、9. 80yM、9. 99yM、10. 52yM、ll. 01yM、 11. 22yM； 第8管：如SEQIDNO. 269~SEQIDNO. 278所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 87yM、7. 12yM、8. 09yM、8. 74yM、9. 00yM、9. 69yM、10. 42yM、10. 65yM、ll. 13yM、 11. 29yM； 第9管：如SEQIDNO. 279~SEQIDNO. 285所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 11yM、8. 04yM、8. 72yM、8. 93yM、9. 63yM、10. 34yM、11. 10yM; 第10管：如SEQIDNO. 286~SEQIDNO. 291所示的延伸引物的浓度分别依次为 6.90yM、7.97yM、8. 14yM、9.llyM、9.90yM、10.74yM; 第11管：如SEQIDNO. 292~SEQIDNO. 296所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 10 y M、8. 14 y M、9. 20 y M、10. 09 y M、10. 85 y M ; 所述的单独延伸引物中的的延伸引物的浓度为7. 04yM; 步骤⑶中所述的PCR的条件为：94°C2分钟；94°C30秒、56°C30秒、72°C1分钟，45 个循环；72°C5分钟； 步骤⑶中所述的PCR的体系为：10XPCR缓冲液0. 5 y 1、浓度为25mM的MgCl2O. 4 y 1、浓度为25mM的dNTPs 0.1 y 1、PCR酶0. 2 y 1、扩增引物混合液I y l、10ng/ y 1的人肺组织 基因组2y1，水补足至5y1 ; 步骤（4)中所述的消化的体系为：在步骤（1)得到的PCR产物中加入核酸外切酶SAP0. 3y1、SAP缓冲液0. 17y1、水补足至7y1 ; 步骤（4)中所述的消化的条件为：37°C40分钟，85°C5分钟； 步骤（5)中所述的延伸反应的体系为：在步骤（2)得到的产物中加入Typeplex缓 冲液 0? 2U1、TypeplexTerminationMix0. 2yKTypeplexthermosequenaseenzyme 0. 041y1、延伸引物混合液或单独延伸引物溶液0. 804y1、H2O补足至9yI; 步骤（5)中所述的延伸反应的条件为：94°C30秒；〔94°C5秒、（52°C5秒、80°C5秒）5 个循环〕，35个循环；72°C3分钟 步骤（6)中：当使用96孔板操作时，将延伸反应后的产物9y1、水41y1和清洁树脂 15mg混合；当使用384孔板操作时，将延伸反应后的产物9y1、水16y1和清洁树脂6mg混 合。4. 一种基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒，其特征在于：依据权利要 求1所述的基于MassARRAY质谱平台Iplex分析的肺癌基因谱检测方法设计得到，包含如 SEQ ID NO. 1~SEQ ID NO. 198所示的扩增引物和如SEQ ID NO. 199~SEQ ID NO. 297所 示的延伸引物。5. 根据权利要求4所述基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒，其特征在 于：包含12管扩增引物混合物、11管延伸引物混合物和1管单独延伸引物； 第1管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQ ID NO. 1~SEQ ID NO. 20所示，第2管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQ ID NO. 21~SEQ ID NO. 40所示，第3管扩 增引物混合物中的扩增引物序列如SEQ ID NO. 41~SEQ ID NO. 60所示，第4管扩增引物 混合物中的扩增引物序列如SEQ ID NO. 61~SEQ ID NO. 80所示，第5管扩增引物混合物 中的扩增引物序列如SEQ ID NO. 81~SEQ ID NO. 100所示，第6管扩增引物混合物中的 扩增引物序列如SEQ ID NO. 101~SEQ ID NO. 120所示，第7管扩增引物混合物中的扩增 引物序列如SEQ ID NO. 121~SEQ ID NO. 140所示，第8管扩增引物混合物中的扩增引物 序列如SEQ ID NO. 141~SEQ ID NO. 160所示，第9管扩增引物混合物中的扩增引物序列 如SEQ ID NO. 161~SEQ ID NO. 174所示，第10管扩增引物混合物中的扩增引物序列如 SEQ ID NO. 175~SEQ ID NO. 186所示，第11管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQ ID NO. 187~SEQ ID NO. 196所示，第12管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQ ID NO. 197~SEQ ID NO. 198所示； 第1管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQIDNO. 199~SEQIDNO. 208所示， 第2管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQIDNO. 209~SEQIDNO. 218所示，第3 管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQIDNO. 219~SEQIDNO. 228所示，第4管延 伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQ ID NO. 229~SEQ ID NO. 238所示，第5管延伸引 物混合物中的延伸引物序列如SEQ ID NO. 239~SEQ ID NO. 248所示，第6管延伸引物混 合物中的延伸引物序列如SEQ ID NO. 249~SEQ ID NO. 258所示，第7管延伸引物混合物 中的延伸引物序列如SEQ ID NO. 259~SEQ ID NO. 268所示，第8管延伸引物混合物中的 延伸引物序列如SEQ ID NO. 269~SEQ ID NO. 278所示，第9管延伸引物混合物中的延伸 引物序列如SEQ ID NO. 279~SEQ ID NO. 285所示，第10管延伸引物混合物中的延伸引物 序列如SEQ ID NO. 286~SEQ ID NO. 291所示，第11管延伸引物混合物中的延伸引物序列 如SEQ ID NO. 292~SEQ ID NO. 296所示； 所述的单独延伸引物中的延伸引物序列如SEQ ID NO. 297所示。6.根据权利要求5所述基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒，其特征在 于： 所述的扩增引物混合物中的扩增引物为按等摩尔比混合； 所述的延伸引物混合物中延伸引物为按如下摩尔比混合： 第1管：如SEQ ID NO. 199~SEQ ID NO. 208所示的延伸引物的摩尔比为7. 04 :7. 36 : 8. 05 ：8, 30 ：9, 10 ：9, 34 ：10, 12 ：10, 35 ：10, 91 ：11. 11 ； 第2管：如SEQ ID NO. 209~SEQ ID NO. 218所示的延伸引物的浓度分别依次为6.83: 7. 11 ：7, 84 ：8, 05 ：8, 93 ：9, 16 ：9, 76 ：9, 94 ：10, 42 ：10, 90 ； 第3管：如SEQ ID NO. 219~SEQ ID NO. 228所示的延伸引物的浓度分别依次为7.01 : 7. 74 ：7, 99 ：8, 69 ：8, 96 ：9, 60 ：9, 8 4 ：10, 41 ：10, 66 ：11, 20 ； 第4管：如SEQ ID NO. 229~SEQ ID NO. 238所示的延伸引物的浓度分别依次为6.89: 7. 18 ：7, 89 ：8, 55 ：9, 44 ：9, 58 ：10, 15 ：10, 40 ：11, 02 ：11, 20 ； 第5管：如SEQ ID NO. 239~SEQ ID NO. 248所示的延伸引物的浓度分别依次为6.94: 7. 28 ：7, 59 ：8, 34 ：8, 59 ：9, 44 ：9, 63 ：10, 30 ：10, 45 ：11, 16 ； 第6管：如SEQ ID NO. 249~SEQ ID NO. 258所示的延伸引物的浓度分别依次为6.94: 7. 67 ：8, 34 ：8, 57 ：9, 31 ：9, 47 ：10, 03 ：10, 26 ：10, 91 ：11. 11 ； 第7管：如SEQ ID NO. 259~SEQ ID NO. 268所示的延伸引物的浓度分别依次为7. 05: 7. 35 ：8. 11 ：8, 95 ：9, 18 ：9, 80 ：9, 99 ：10, 52 ：11, 01 ：11, 22 ； 第8管：如SEQ ID NO. 269~SEQ ID NO. 278所示的延伸引物的浓度分别依次为6.87: 7. 12 ：8, 09 ：8, 74 ：9, 00 ：9, 69 ：10, 42 ：10, 65 ：11, 13 ：11, 29 ； 第9管：如SEQ ID NO. 279~SEQ ID NO. 285所示的延伸引物的浓度分别依次为7. 11 : 8. 04 :8. 72 :8. 93 :9. 63 :10. 34 :11. 10 ; 第10管：如SEQ ID NO. 286~SEQ ID NO. 291所示的延伸引物的浓度分别依次为6. 90: 7. 97 ：8, 14 ：9. 11 ：9, 90 ：10, 74 ； 第11管：如SEQ ID NO. 292~SEQ ID NO. 296所示的延伸引物的浓度分别依次为7. 10: 8. 14 :9. 20 :10. 09 :10. 85。7.根据权利要求5所述基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒，其特征在 于： 所述的扩增引物混合物中的每条引物的浓度为〇.5 yM ; 所述的延伸引物混合物中的每条延伸引物的浓度如下： 第1管：如SEQIDNO. 199~SEQIDNO. 208所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 04yM、7. 36yM、8. 05yM、8. 30yM、9. 10yM、9. 34yM、10. 12yM、10. 35yM、10. 91yM、 11. 11yM； 第2管：如SEQIDNO. 209~SEQIDNO. 218所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 83yM、7. 11yM、7. 84yM、8. 05yM、8. 93yM、9. 16yM、9. 76yM、9. 94yM、10. 42yM、 10. 90yM; 第3管：如SEQIDNO. 219~SEQIDNO. 228所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 01yM、7. 74yM、7. 99yM、8. 69yM、8. 96yM、9. 60yM、9. 84yM、10. 41yM、10. 66yM、 11. 20yM； 第4管：如SEQIDNO. 229~SEQIDNO. 238所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 89yM、7. 18yM、7. 89yM、8. 55yM、9. 44yM、9. 58yM、10. 15yM、10. 40yM、ll. 02yM、 11. 20yM； 第5管：如SEQIDNO. 239~SEQIDNO. 248所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 94yM、7. 28yM、7. 59yM、8. 34yM、8. 59yM、9. 44yM、9. 63yM、10. 30yM、10. 45yM、 11. 16yM； 第6管：如SEQIDNO. 249~SEQIDNO. 258所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 94yM、7. 67yM、8. 34yM、8. 57yM、9. 31yM、9. 47yM、10. 03yM、10. 26yM、10. 91yM、 11. 11yM； 第7管：如SEQIDNO. 259~SEQIDNO. 268所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 05yM、7. 35yM、8. 11yM、8. 95yM、9. 18yM、9. 80yM、9. 99yM、10. 52yM、ll. 01yM、 11. 22yM； 第8管：如SEQIDNO. 269~SEQIDNO. 278所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 87yM、7. 12yM、8. 09yM、8. 74yM、9. 00yM、9. 69yM、10. 42yM、10. 65yM、ll. 13yM、 11. 29yM； 第9管：如SEQIDNO. 279~SEQIDNO. 285所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 11yM、8. 04yM、8. 72yM、8. 93yM、9. 63yM、10. 34yM、11. 10yM; 第10管：如SEQIDNO. 286~SEQIDNO. 291所示的延伸引物的浓度分别依次为 6.90yM、7.97yM、8. 14yM、9.llyM、9.90yM、10.74yM; 第11管：如SEQIDNO. 292~SEQIDNO. 296所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 10yM、8. 14yM、9. 20yM、10. 09yM、10. 85yM; 所述的单独延伸引物中的的延伸引物的浓度为7. 04yM。8. 根据权利要求4~7任一项所述的基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂 盒，其特征在于：还包括清洁树脂和PCR用酶试剂中的一种或两种。9. 根据权利要求8所述的基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒，其特征 在于：所述的PCR用酶试剂包括PCR酶、dNTP和PCR缓冲液。10. 权利要求4所述的基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒的应用，其特 征在于包含如下步骤： (1)将如SEQIDNO. 1~SEQIDNO. 198所示的扩增引物分为12组，扩增引物名称末 尾为Pl-F和Pl-R为第1组，扩增引物名称末尾为P2-F和P2-R为第2组，类推，分为12组； 将每条扩增引物配制成浓度为10UM的引物溶液后，再按分组进行混合，得到12管扩增引 物混合液，每条引物的终浓度为0. 5yM;以人肺基因组DNA为模板，将12管扩增引物混合 液分别进行PCR，获得PCR产物； PCR的条件为：94°C2分钟；94°C30秒、56°C30秒、72°C1分钟，45个循环；72°C5分 钟； PCR的体系为：10XPCR缓冲液0. 5y1、浓度为25mM的MgCl2O. 4y1、浓度为25mM的dNTPs0.Iy1、PCR酶0. 2y1、扩增引物混合液Iy1、IOng/y1的人肺组织基因组2y1，水 补足至5y1 ; (2) 将步骤（1)获得的PCR产物进行碱性磷酸酶消化；消化的体系为：在步骤（1)得到 的PCR产物中加入核酸外切酶SAP0. 3y1、SAP缓冲液0. 17y1、水补足至7y1 ;消化的条 件为：37°C40分钟，85°C5分钟； (3) 将如SEQIDNO. 199~SEQIDNO. 297所示的延伸引物进行分组，延伸引物名称末 尾为El的延伸引物混合得到第1管延伸引物混合物，延伸引物名称末尾为E2的延伸引物 混合得到第2管延伸引物混合物，类推，为12管，配制成11管延伸引物混合液和1管单独 延伸引物溶液；在步骤（2)得到的产物中进行延伸反应；12管扩增引物分别对应12管延伸 引物，Pl对应E1，以此类推； 其中，所述的延伸引物混合物中的每条延伸引物的浓度如下： 第1管：如SEQIDNO. 199~SEQIDNO. 208所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 04yM、7. 36yM、8. 05yM、8. 30yM、9. 10yM、9. 34yM、10. 12yM、10. 35yM、10. 91yM、 11. 11yM； 第2管：如SEQIDNO. 209~SEQIDNO. 218所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 83yM、7. 11yM、7. 84yM、8. 05yM、8. 93yM、9. 16yM、9. 76yM、9. 94yM、10. 42yM、 10. 90yM; 第3管：如SEQIDNO. 219~SEQIDNO. 228所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 01yM、7. 74yM、7. 99yM、8. 69yM、8. 96yM、9. 60yM、9. 84yM、10. 41yM、10. 66yM、 11. 20yM； 第4管：如SEQIDNO. 229~SEQIDNO. 238所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 89yM、7. 18yM、7. 89yM、8. 55yM、9. 44yM、9. 58yM、10. 15yM、10. 40yM、ll. 02yM、 11. 20yM； 第5管：如SEQIDNO. 239~SEQIDNO. 248所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 94yM、7. 28yM、7. 59yM、8. 34yM、8. 59yM、9. 44yM、9. 63yM、10. 30yM、10. 45yM、 11. 16yM； 第6管：如SEQIDNO. 249~SEQIDNO. 258所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 94yM、7. 67yM、8. 34yM、8. 57yM、9. 31yM、9. 47yM、10. 03yM、10. 26yM、10. 91yM、 11. 11yM； 第7管：如SEQIDNO. 259~SEQIDNO. 268所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 05yM、7. 35yM、8. 11yM、8. 95yM、9. 18yM、9. 80yM、9. 99yM、10. 52yM、ll. 01yM、 11. 22yM； 第8管：如SEQIDNO. 269~SEQIDNO. 278所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 87yM、7. 12yM、8. 09yM、8. 74yM、9.OOyM、9. 69yM、10. 42yM、10. 65yM、ll. 13yM、 11. 29yM； 第9管：如SEQIDNO. 279~SEQIDNO. 285所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 11yM、8. 04yM、8. 72yM、8. 93yM、9. 63yM、10. 34yM、11. 10yM; 第10管：如SEQIDNO. 286~SEQIDNO. 291所示的延伸引物的浓度分别依次为 6.90yM、7.97yM、8. 14yM、9.llyM、9.90yM、10.74yM; 第11管：如SEQIDNO. 292~SEQIDNO. 296所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 10yM、8. 14yM、9. 20yM、10. 09yM、10. 85yM; 所述的单独延伸引物中的的延伸引物的浓度为7. 04yM; 延伸反应的体系为：在步骤（2)得到的产物中加入Typeplex缓冲液0. 2yl、Typeplex TerminationMix0.2yl、Typeplexthermosequenaseenzyme0.041U1、延伸引物混合液 或单独延伸引物溶液0. 804yI、H2O补足至9yI; 延伸反应的条件为：94°C30秒；〔94°C5秒、（52°C5秒、80°C5秒）5个循环〕，35个 循环；72°C3分钟； (4) 使用96孔板操作时，将步骤（3)获得产物9y1、水41y1和清洁树脂15mg混合； 使用384孔板操作时，将步骤（3)获得产物9y1、水16y1和清洁树脂6mg混合；旋转96孔 板或384孔板30~60分钟进行脱盐去离子防干扰处理；3200g离心5分钟；对上清进行分 析； (5) MassARRAY系统Nanodispenser点样仪进行芯片点样，利用Analyzer分析仪芯片扫 描；扫描结果以Typer4. 0软件分析各目的基因的突变状况，在质谱峰变异碱基处出现峰， 则判断为突变。
【专利摘要】本发明公开一种基于MassARRAY质谱平台Iplex分析的肺癌基因谱检测方法及试剂盒与应用。该方法能检测肺癌13种驱动和耐药相关基因的99种热点变异位点，通过使用如SEQ ID NO.1～198所示的扩增引物进行扩增反应，接着消化反应，再使用如SEQ ID NO.199～297所示的延伸引物进行延伸反应，得到的产物进行MassARRAY质谱平台Iplex分析。依据该方法设计得到一款检测试剂盒，其具有如下优点：紧跟肺癌诊治国际前沿，考虑了欧美人群与亚洲人群基因谱的差异，检测位点多；价格较低；高通量，用时短；检测样本不限；高准确性与高敏感性。因此，该试剂盒在临床上应用推广的潜力大。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894269
【申请号】CN201510311868
【发明人】吴一龙, 张绪超, 田红霞
【申请人】广东省人民医院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月9日...
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于检测肺癌的检测方法，特别涉及一种基于MassARRAY质谱平 台Iplex分析的肺癌基因谱检测方法及试剂盒与应用。
【背景技术】
[0002] 肺癌是我恶性肿瘤死亡原因之首，发病率持续上升，健康危害形势严峻，其发生、 发展以及治疗与基因变异关系密切，基于基因变异的"个体化"靶向治疗是继传统放化疗后 肿瘤领域的新突破。非小细胞肺癌（NSCLC)样本中基因靶点变异可从相应的靶向药物治疗 中获益，针对EGFR和ALK基因变异的酪氨酸激酶抑制剂（TKI)吉非替尼（gefitinib)/厄洛 替尼（erlotinib)和克佐替尼（crizotinb)等革El向治疗可延长患者的生存期。随着研宄深 入，ROSl、RET、ERBB2、STKll等分子变异被逐步确定为肺癌的驱动基因 （driver gene)，并 且新的低频基因被陆续报道。但是大部分患者在接受靶向治疗后一年左右最终都会对TKI 药物耐药。在非小细胞肺癌中，对EGFR TKI药物Gefitinib/Erlotinib的抗药性分子机 理包括 EGFR 二次变异（T790M、D761Y、L747S、T854A、G796A 和 Exon20 插入）以及 EGFR 基 因扩增、RAS/RAF基因变异、MAPK1基因扩增、MET基因扩增、HGF/MET激活、FGF/FGFR激活、 PTEN丢失、GAS6/AXL激活、IGFBP3丢失、BRCAl高表达和CRKL基因扩增。在抗ALK TKI药 物 Crizotinib 的肺癌中，ALK 二次突变（L1196M、C1156Y、F1174L、L1152R、G1202R、S1206Y 和1151T插入）及ALK基因扩增、⑶74-R0S1融合、KIT基因扩增，EGFR或KRAS变异也被 发现。目前本申请人所在肺癌研宄进行的临床试验正在研宄MET抑制剂INC280联合EGFR TKI治疗非小细胞肺癌靶向药物治疗耐药后MET突变的疗效。肿瘤发生发展耐药的多位点 变异决定了肿瘤靶点的分子分型、靶向治疗以及耐药后机制探索的复杂性。
[0003] 在肺癌的分子分型方面，目前临床单基因检测方法主要有qPCR、测序、FISH及IHC 等多平台技术，除了 EGFR、ALK、KRAS等主要基因的检测技术在临床相对成熟之外，R0S1、 RET、HER2、NRTK、NRG、RICTOR、mTOR、LKBl、MET、RITlA等分子变异的分型在临床主要限制 因素有：分析的通量化（high throughput)不够成熟和生物材料的有限性获得（limited procurement)。临床上肺癌早期患者接受手术（大手术或小手术活检）具有充足的组织， 晚期患者通常通过经皮肺穿刺、支气管镜活检、支气管内超声穿刺活检等获得只是少量标 本。这些小标本为了满足现有的临床病理诊断和个别基因的分子检测，很难有剩余材料进 一步用于其他重要分子分型（molecular classification/genotying)、药物耐药机制等分 析。可见肿瘤样本的匮乏、低通量、耗时性以及价格昂贵等是制约临床多次单个基因检测开 展的瓶颈。
[0004] 肿瘤发生发展、靶向治疗后耐药以及转移机制等分子靶点的复杂性分析，以及对 肺癌患者样本多靶点变异基因进行单基因检测的局限性，决定了在临床转化医学研宄中 开展多基因检测平台的必要性与紧迫性。MassARRAY分子量阵列技术通过扩增延伸反应 与质谱相结合实现基因的分型检测，基于此平台的Iplex技术可基于96/384孔板开展多 基因检测，操作程序简单，分型结果具有质谱的高准确性和敏感性。LungCarta试剂盒是 MassARRAY公司研发主要针对肺癌靶向基因检测的试剂盒，已在肺癌领域广泛应用，包含 26个癌症相关基因的214个突变位点。本发明申请人已经使用LungCarta试剂盒对肺癌患 者组织样本进行多基因多位点的高通量检测，检测样本目前已达到100多例，可明显提高 临床检测效率，改变传统单基因检测价格昂贵，耗时长，操作繁琐等劣势，为肺癌患者的临 床靶向治疗以及耐药后治疗、以及生物标志物转化医学研宄提供更全面的依据。但是由于 该试剂盒为国外研发，技术信息保密，价格昂贵，且未完全包括前沿分子靶点如原发MET基 因变异与EGFR TKI的靶向治疗耐药相关、ALK基因的多个位点突变与Crizotinib的靶向 治疗耐药相关等，以及中美地区驱动基因谱具有差异性等特点，因此研发适合中国人群的 多基因同步检测方法具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于MassARRAY质 谱平台Iplex分析的肺癌基因谱检测方法。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试 剂盒，是通过上述检测方法设计得到。
[0007] 本发明的再一目的在于提供上述试剂盒的应用
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于MassARRAY质谱平台Iplex分析 的肺癌基因谱检测方法，能检测肺癌13种驱动和耐药相关基因的99种热点变异位点，包括 如下步骤：
[0009] (1)设计如表1所示的扩增引物和如表2所示的延伸引物；
[0010] ⑵将如表1所示的扩增引物分为12组，扩增引物名称末尾为Pl-F和Pl-R为第 1组，扩增引物名称末尾为P2-F和P2-R为第2组，类推，分为12组；将分组后的扩增引物 混合，得到12管扩增引物混合液；将如表2所示的延伸引物进行分组，延伸引物名称末尾 为El的延伸引物混合得到第1管延伸引物混合物，延伸引物名称末尾为E2的延伸引物混 合得到第2管延伸引物混合物，类推，得到11管延伸引物混合物和1管单独延伸引物，共计 12管；
[0011] (3)以人肺组织基因组为模板，将12管扩增引物混合液分别进行PCR，获得PCR产 物；
[0012] (4)将步骤（3)获得的PCR产物进行碱性磷酸酶消化；
[0013] (5)将步骤（4)消化后的产物进行延伸反应：12管扩增引物得到的产物分别对应 12管延伸引物，Pl对应E1，以此类推；
[0014] (6)在96孔板或384孔板将步骤（5)延伸反应后得到的产物、清洁树脂和水混合； 旋转96孔板或384孔板进行脱盐去离子防干扰处理；接着离心；对上清进行分析；
[0015] (7) MassARRAY系统Nanodispenser点样仪进行芯片点样，利用Analyzer分析仪芯 片扫描；扫描结果以Typ er4. 0软件分析各目的基因的突变状况，在质谱峰变异碱基处出现 峰，则判断为突变。
[0016] 表1扩增引物
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[0024] I ' '
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[0025] 步骤（2)中所述的扩增引物混合物中的扩增引物优选为按等摩尔比混合；更优选 为每条扩增引物的浓度为0. 5 μΜ ;
[0026] 步骤（2)中所述的延伸引物混合物中的延伸引物优选为按如下摩尔比混合：
[0027] 第1管：如SEQ ID NO. 199~SEQ ID NO. 208所示的延伸引物的摩尔比为7. 04 : 7. 36 :8. 05 :8. 30 :9. 10 :9. 34 :10. 12 :10. 35 :10. 91 :11. 11 ;
[0028] 第2管：如SEQ ID NO. 209~SEQ ID NO. 218所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 83 :7. 11 :7. 84 :8. 05 :8. 93 :9. 16 :9. 76 :9. 94 :10. 42 :10. 90 ;
[0029] 第3管：如SEQ ID NO. 219~SEQ ID NO. 228所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 01 :7. 74 :7. 99 :8. 69 :8. 96 :9. 60 :9. 84 :10. 41 :10. 66 :11. 20 ;
[0030] 第4管：如SEQ ID NO. 229~SEQ ID NO. 238所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 89 ：7. 18 ：7. 89 ：8. 55 ：9. 44 ：9. 58 ：10. 15 ：10. 40 ：11. 02 ：11. 20 ；
[0031] 第5管：如SEQ ID NO. 239~SEQ ID NO. 248所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 94 ：7, 28 ：7, 59 ：8, 34 ：8, 59 ：9, 44 ：9, 63 ：10, 30 ：10, 45 ：11, 16 ；
[0032] 第6管：如SEQ ID NO. 249~SEQ ID NO. 258所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 94 ：7, 67 ：8, 34 ：8, 57 ：9, 31 ：9, 47 ：10, 03 ：10, 26 ：10, 91 ：11. 11 ；
[0033] 第7管：如SEQ ID NO. 259~SEQ ID NO. 268所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 05 ：7, 35 ：8. 11 ：8, 95 ：9, 18 ：9, 80 ：9, 99 ：10, 52 ：11, 01 ：11, 22 ；
[0034] 第8管：如SEQ ID NO. 269~SEQ ID NO. 278所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 87 ：7, 12 ：8, 09 ：8, 74 ：9, 00 ：9, 69 ：10, 42 ：10, 65 ：11, 13 ：11, 29 ；
[0035] 第9管：如SEQ ID NO. 279~SEQ ID NO. 285所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 11 ：8, 04 ：8, 72 ：8, 93 ：9, 63 ：10, 34 ：11, 10 ；
[0036] 第10管：如SEQ ID NO. 286~SEQ ID NO. 291所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 90 ：7, 97 ：8, 14 ：9. 11 ：9, 90 ：10, 74 ；
[0037] 第11管：如SEQ ID NO. 292~SEQ ID NO. 296所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 10 ：8, 14 ：9, 20 ：10, 09 ：10, 85 ；
[0038] 步骤⑵中所述的延伸引物混合物中的延伸引物的浓度优选为如表3所示；
[0039] 表3延伸引物浓度
[0040]
[0041]
[0042] 步骤（3)中所述的PCR的体系优选为：10XPCR缓冲液0. 5 μ 1、 MgCl2 (25mM) 0· 4 μ I、dNTPs (25mM) 0· 1 μ I、PCR 酶（5U/μ 1) 0· 2 μ 1、扩增引物混合液 1 μ 1、 人肺组织基因组（l〇ng/ μ 1)2 μ 1，水补足5 μ I ;
[0043] 步骤（3)中所述的PCR的条件优选为：94°C 2分钟；94°C 30秒、56°C 30秒、72°C I 分钟，45个循环；72 °C 5分钟；
[0044] 步骤⑷中所述的消化的体系为：在PCR产物中加入核酸外切酶SAP 0. 3 μ 1、SAP 缓冲液0. 17 μ I、水补足至7 μ I ;
[0045] 步骤（4)中所述的消化的条件优选为：37°C 40分钟，85°C 5分钟；
[0046] 步骤（5)中所述的延伸反应的体系优选为：在消化后得到的产物中加入Typeplex 缓冲液（IOX)〇·2 μ 1、Typ印Iex终止混合液（IOX)0.2 μ 1、Typ印Iex热测序酶（33U/ μ 1)0. 041 μ 1、延伸引物混合液或单独延伸引物溶液0. 804 μ 1、H2O补足至9 μ 1 ;
[0047] 步骤（5)中所述的延伸反应的条件优选为：94°C 30秒；〔94°C 5秒、（52°C 5秒、 80°C 5秒）5个循环〕，35个循环；72°C 3分钟。
[0048] 步骤（6)中：当使用96孔板操作时，将延伸反应后的产物9 μ 1、水41 μ 1和清洁树 脂（Clean Resin) 15mg混合；当使用384孔板操作时，将延伸反应后的产物9 μ 1、水16 μ 1 和清洁树脂6mg混合；
[0049] 步骤（6)中所述的脱盐去离子防干扰处理的时间优选为 30~60分钟；
[0050] 步骤（6)中所述的离心的条件优选为3200g离心5分钟。
[0051] 一种基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒，为依据上述基于 MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒设计得到，能检测肺癌13种驱动和耐药相关 基因的99种热点变异位点，包含如表1所示的扩增引物和表2所示的延伸引物：
[0052] 所述的基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒，优选包含12管扩增引 物混合物、11管延伸引物混合物和1管单独延伸引物；扩增引物名称末尾为Pl-F和Pl-R 的引物混合得到第1管引物混合物，扩增引物名称末尾为P2-F和P2-R的引物混合得到第 2管引物混合物，类推，为12管；按表2中的延伸引物进行分组，延伸引物名称末尾为El的 延伸引物混合得到第1管延伸引物混合物，延伸引物名称末尾为E2的延伸引物混合得到第 2管延伸引物混合物，类推，为12管；
[0053] 所述的扩增引物混合物中的扩增引物优选为按等摩尔比混合；更优选为每条扩增 引物的浓度为0.5 μΜ;
[0054] 所述的延伸引物混合物中的延伸引物优选为按如下摩尔比混合：
[0055] 第1管：如SEQ ID NO. 199~SEQ ID NO. 208所示的延伸引物的摩尔比为7. 04 : 7. 36 ：8, 05 ：8, 30 ：9. 10 ：9, 34 ：10, 12 ：10, 35 ：10, 91 ：11. 11 ；
[0056] 第2管：如SEQ ID NO. 209~SEQ ID NO. 218所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 83 ：7. 11 ：7, 84 ：8, 05 ：8, 93 ：9, 16 ：9, 76 ：9, 94 ：10, 42 ：10, 90 ；
[0057] 第3管：如SEQ ID NO. 219~SEQ ID NO. 228所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 01 ：7, 74 ：7, 99 ：8, 69 ：8, 96 ：9, 60 ：9, 84 ：10, 41 ：10, 66 ：11, 20 ；
[0058] 第4管：如SEQ ID NO. 229~SEQ ID NO. 238所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 89 ：7, 18 ：7, 89 ：8, 55 ：9, 44 ：9, 58 ：10, 15 ：10, 40 ：11, 02 ：11, 20 ；
[0059] 第5管：如SEQ ID NO. 239~SEQ ID NO. 248所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 94 ：7, 28 ：7, 59 ：8, 34 ：8, 59 ：9, 44 ：9, 63 ：10, 30 ：10, 45 ：11, 16 ；
[0060] 第6管：如SEQ ID NO. 249~SEQ ID NO. 258所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 94 ：7, 67 ：8, 34 ：8, 57 ：9, 31 ：9, 47 ：10, 03 ：10, 26 ：10, 91 ：11. 11 ；
[0061] 第7管：如SEQ ID NO. 259~SEQ ID NO. 268所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 05 ：7, 35 ：8. 11 ：8, 95 ：9, 18 ：9, 80 ：9, 99 ：10, 52 ：11, 01 ：11, 22 ；
[0062] 第8管：如SEQ ID NO. 269~SEQ ID NO. 278所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 87 ：7. 12 ：8. 09 ：8. 74 ：9. 00 ：9. 69 ：10. 42 ：10. 65 ：11. 13 ：11. 29 ；
[0063] 第9管：如SEQ ID NO. 279~SEQ ID NO. 285所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 11 ：8, 04 ：8, 72 ：8, 93 ：9, 63 ：10, 34 ：11. 10 ；
[0064] 第10管：如SEQ ID NO. 286~SEQ ID NO. 291所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 90 ：7, 97 ：8, 14 ：9. 11 ：9, 90 ：10, 74 ；
[0065] 第11管：如SEQ ID NO. 292~SEQ ID NO. 296所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 10 ：8, 14 ：9, 20 ：10, 09 ：10, 85 ；
[0066] 所述的延伸引物混合物和所述的单独延伸引物中延伸引物的浓度更优选为如表3 所示；
[0067] 所述的基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒还包括清洁树脂和PCR 用酶试剂中的一种或两种。
[0068] 所述的PCR用酶试剂包括PCR酶、dNTP、PCR缓冲液等。
[0069] 所述的基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒的应用，包含如下步 骤：
[0070] (1)将如表1所示的扩增引物分为12组，扩增引物名称末尾为Pl-F和Pl-R为第 1组，扩增引物名称末尾为P2-F和P2-R为第2组，类推，分为12组；将每条扩增引物配制成 浓度为10 μΜ的引物溶液后，再按分组进行混合，得到12管扩增引物混合液，每条引物的终 浓度为〇. 5 μ M ;以人肺组织基因组为模板，将12组扩增引物混合液分别进行PCR，获得PCR 产物；
[0071] PCR 的条件为：94°C 2 分钟；94°C 30 秒、56°C 30 秒、72°C 1 分钟，45 个循环；72°C 5 分钟；
[0072] PCR 的体系为：10XPCR 缓冲液 0· 5 μ l、MgCl2(25mM)0. 4μ l、dNTPs(25mM)0. 1 μ 1、 PCR酶（5U/ μ 1)0. 2 μ 1、扩增引物混合液I μ 1、人肺组织基因组（lOng/ μ I) 2 μ 1，水补足至 5μ1 ;
[0073] (2)将步骤（1)获得的PCR产物进行碱性磷酸酶消化；消化的体系为：在步骤（1) 得到的PCR产物中加入核酸外切酶SAP 0. 3 μ 1、SAP缓冲液0. 17 μ 1、水补足至7 μ 1 ;消化 的条件为：37 °C 40分钟，85 °C 5分钟；
[0074] (3)按表2中的延伸引物进行分组，延伸引物名称末尾为El的延伸引物混合得 到第1管延伸引物混合物，延伸引物名称末尾为E2的延伸引物混合得到第2管延伸引物 混合物，类推，为12管，按表3将延伸引物配制成11管延伸引物混合液和1管单独延伸 引物溶液；在步骤（2)得到的产物中进行延伸反应；12管扩增引物分别对应12管延伸引 物，Pl对应E1，以此类推；延伸反应的体系为：在步骤（2)得到的产物中加入Typeplex 缓冲液（10X)〇·2 μ 1、Typ印Iex终止混合液（10X)0.2 μ 1、Typ印Iex热测序酶（33U/ μ 1)0. 041 μ 1、延伸引物混合液或单独延伸引物溶液0. 804 μ 1、Η20补足至9 μ 1 ;延伸反应 的条件为：94°C 30秒；〔94°C 5秒、（52°C 5秒、80°C 5秒）5个循环〕，35个循环；72°C 3 分钟；
[0075] (4)使用96孔板操作时，将步骤⑶获得产物9 μ 1、水41 μ 1和清洁树脂（Clean Resin) 15mg混合；使用384孔板操作时，将步骤（3)获得产物9 μ 1、水16 μ 1和清洁树脂 6mg混合；旋转96孔板或384孔板30~60分钟进行脱盐去离子防干扰处理；3200g离心5 分钟；对上清进行分析；
[0076] (5) MassARRAY系统Nanodispenser点样仪进行芯片点样，利用Analyzer分析仪芯 片扫描；扫描结果以Typer4. 0软件分析各目的基因的突变状况，在质谱峰变异碱基处出现 峰，则判断为突变。
[0077] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0078] (1)本发明提供的检测试剂盒考虑了欧美人群与亚洲人群肺癌基因谱的差异性， 检测基因更前沿，并纳入了多个与肺癌靶向治疗耐药相关的位点，检测结果将为优化个体 化诊疗分子分型，筛查技术方案以及靶向治疗耐药的后续治疗和研宄提供依据。
[0079] (2)本发明提供的检测试剂盒自主研发，在价格上存在优势，降低了患者的临床检 测费用，可转化研宄应用于临床，产生经济效益和优化临床资源配置。
[0080] (3)本发明提供的检测试剂盒以96或384孔板多重反应分析为基础，具有高通量 性，可同时检测13个基因的99个位点。改变传统单基因检测价格昂贵，耗时长，操作繁琐 等劣势。具有在肺癌的穿刺活检小样本中实现"单个小样本多基因的检测"，满足小样本最 大化使用、获得最大信息量的临床实践需求。
[0081] (4)本发明提供的检测试剂盒进行的PCR反应产物片段短，不仅可在新鲜组织样 本中进行检测，还可在石蜡组织、胸水等疑难样本中进行检测。
[0082] (5)本发明提供的检测试剂盒基于MassARRAY平台具有质谱的高准确性与高敏感 性，并在石蜡样本残存DNA样本中检测结果稳定，较Sanger测序法具有明显优势，提高了检 测阳性率。
【附图说明】
[0083] 图1为使用本发明试剂盒检测K1747T肺癌组织样本得到FGFR2_N549H的结果图；
[0084] 其中，横坐标表示延伸产物（或延伸引物）的分组量大小；纵坐标表示质谱强度， 下同。
[0085] 图2为检测K1736T肺癌组织样本得到的EGFR_L858R、MET_N375S突变结果图；
[0086] 其中，A 为 LungCarta 检测 EGFR_L858R 突变 G 分子量为 6139. 00 ;
[0087] B 为 LungCarta 检测 MET_N375S 突变 G 分子量为 7253. 80 ;
[0088] C为本发明试剂盒检测EGFR_L858R突变G分子量为7679. 00 ;
[0089] D为本发明试剂盒检测MET_N375S突变G分子量为8195. 40。
[0090] 图3为检测K1744T肺癌组织样本得到的EGFR_Exonl9del突变结果图；
[0091] 其中，A 为 LungCarta 检测 EGFR_Exonl9del 分子量为 5376. 50 ;
[0092] B为本发明试剂盒检测EGFR_2235_2249dell5分子量为5376. 50。
[0093] 图4为检测K1748T肺癌组织样本得到的结果图；
[0094] 其中，A 为 LungCarta 检测 STKl 1_F354L 突变 G 分子量为 8239. 40 ;
[0095] B为本发明试剂盒检测STKl 1_F354L突变G分子量为6016. 90。
[0096] 图5为延伸引物浓度对第9孔检测结果质谱峰的影响的结果图；
[0097] 其中，A为优化延伸引物后的检测质谱图；
[0098] B为优化延伸引物前的检查质谱图。
[0099] 图6为树脂量对第10孔检测结果质谱峰的影响图；
[0100] 其中，A为优化树脂量后的检测质谱图；
[0101] B为优化树脂量前的检测质谱图。
【具体实施方式】
[0102] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0103] 实施例1肺癌多基因谱检测引物试剂盒的制备
[0104] 1、确定肺癌相关驱动基因或靶向耐药基因：通过网络检索PUBMED数据库，查 阅最新文献，统计与中国人群肺癌发病机理、化放疗、靶向耐药以及转移等相关的靶向基 因或其平行、相邻通路基因，确定纳入试剂盒的基因（13个）如下：EGFR(NM_005228)、 KRAS (匪_033360)、ALK(NM_004304)、FGFRl (ΝΜ_023110· 2)、FGFR2(M1_000141. 2)、 FGFR3 (ΝΜ_000142· 4)、PIK3CA(NM_006218. 2)、BRAF(NM_004333. 4)、ΡΤΕΝ(ΝΜ_000314· 4)、 MET(NM_001127500.1 )、ERBB2(NM_004448)、AKTl (NM_005163)、STKll (ΝΜ_000455· 4)。
[0105] 2、筛选目的基因的热点变异位点：在COSMIC数据库中查询上述13个基 因的 COSMIC 基因号分别为 EGFR (ENST00000275493)、KRAS (ENST00000256078)、 ALK (ENST00000389048)、FGFRl (ENST00000447712)、FGFR2 (ENST00000358487)、 FGFR3(ENST00000440486)、 PIK3CA(ENST00000263967)、 BRAF(ENST00000288602)、 PTEN(ENST00000371953)、MET (ENST00000318493)、ERBB2(ENST00000269571)、 AKTl (ENST00000349310)、STK11 (ENST00000326873)。查询上述基因在肿瘤中的热点变异位 点，结合国内外研宄进展以及本申请发明人的前期研宄成果，共确定99个与驱动肺癌发生 以及耐药相关的碱基位点以及相应的氨基酸位点（见表4)。
[0106] 表4引物试剂盒包含检测基因的蛋白变异位点
[0107]
[0108] 3、软件设计多重引物文档：在PUBMED数据库查询纳入试剂盒13个基因的基 因组 gDNA 序列，分别为 EGFR(NG_007726. 3)、KRAS(NG_007524. 2)、ALK(NG_009445. 1)、 FGFR1(NG_007729)、FGFR2(NG_012449. 1)、FGFR3(NG_012632. 1)、PIK3C(NG_012113. 2)、 BRAF(NG_007873. 3)、PTEN(NG_007466. 2)、MET(NG_008996. I)、ERBB2(NG_007503. I)、 AKTl (NG_012188. I)、STK11 (NG_007460. 2)。根据 COSMIC 中基因的 CDS 序列在 gDNA 序列中 标记变异位点，并根据SEQUEN0M公司突变标示方式，将变异位点侧翼约200个碱基拷贝到 引物设计固定格式文本中设计引物。
[0109] 4、多重引物设计：通过MassARRAY网站ADS(Assay Design Suite)引物设计软件， 运行第3步变异位点序列的文档，调整相关参数，将13个基因99个位点全部纳入引物设计 试剂盒。共设计297条引物，99条正向、99条反向PCR引物和99条延伸引物。依据延伸产 物的长度以及引物不形成二聚体且能特异性得到目标产物，将297条引物分别分布在12孔 里面，PCR引物（如表1所示）的分组以表1中的扩增引物进行分组，引物名称末尾为Pl-F 和Pl-R为第1组，引物名称末尾为P2-F和P2-R为第2组，类推，分为12组；延伸引物的分 组以表2中的延伸引物进行分组，引物名称末尾为El为第1组，引物名称末尾为E2为第2 组，类推，分为12组。12管扩增引物分别对应12管延伸引物，Pl对应E1，以此类推。
[0110] 5、多重引物的合成与配制（试剂盒制备）：在上海生工生物工程有限公司合成ADS 软件导出的297条引物，并进行配制：（I)PCR引物先稀释成10 μΜ，然后工作液以每条引物 浓度为0.5 μΜ进行混合，得到扩增引物混合液，共12管（每管包括正、反向引物）；（2)延 伸引物先稀释成500 μΜ，然后根据每一条延伸引物的分子量，按相应体积（如表3)进行混 合，得到延伸引物混合液，共12管。
[0111] 实施例2使用实施例1的试剂盒检测肺癌细胞株
[0112] 1、选用已知突变位点的 Η460、PC9、Η1650、Η1975、Α549、GLC82、HCC827、Η1299 的 8个肺癌细胞株（均能从ATCC购买得到）进行本试剂盒的可行性分析，同时设立正常人基 因组DNA(gDNA)(来源于就诊广东省人民医院的正常人的包皮组织提取得到）做为阴性对 照，水（H 2O)做为空白对照。每个样本检测需要DNA120ng，即IOng/孔X 12孔。本发明试 剂盒的操作如下：
[0113] (I)PCR 的体系为：10XPCR 缓冲液 0· 5 μ 1、MgCl2(25mM)0. 4 μ 1、 dNTPs(25mM)0. 1 μ 1、PCR酶（5U/ μ 1)0. 2 μ 1、扩增引物混合液1 μ 1、肺癌组织样本基因组 (IOng/ μ 1)2 μ 1，水补足至 5 μ 1。94°C 2 分钟；94°C 30 秒、56°C 30 秒、72°C 1 分钟，45 个循 环；72°C 5分钟。
[0114] (2)在步骤⑴得到的PCR产物中加入核酸外切酶SAP 0.3μ1、SAP缓冲液 0. 17 μ 1、水补足至7 μ 1。37°C 40分钟，85°C 5分钟，将步骤（1)获得的PCR产物进行碱性 磷酸酶消化。
[0115] (3)12管扩增引物分别对应12管延伸引物，Pl对应E1，以此类推。在步骤（2) 得到的产物中加入Typ印Iex缓冲液（IOX)O. 2 μ 1、Typ印Iex终止混合液（IOX)O. 2 μ 1、 Typ印lex热测序酶（33U/ μ 1) 0· 041 μ 1、延伸引物混合液0· 804 μ I、H2O补足至9 μ 1。 94°C 30秒；〔94°C 5秒、（52°C 5秒、80°C 5秒）5个循环〕，35个循环；72°C 3分钟，进行 延伸反应。
[0116] (4)将步骤⑶获得产物中加入水41 μ 1，清洁树脂（Clean Resin) 15mg(96孔板） 或者加入水16 μ I，清洁树脂6mg (384孔板），旋转板30-60分钟进行脱盐去离子防干扰处 理；3200g离心5分钟；
[0117] (5)MassARRAY系统Nanodispenser点样仪将上清液进行芯片点样，利用Analyzer 分析仪芯片扫描；扫描结果以Typer4. 0软件分析各目的基因的突变状况，在质谱峰变异碱 基处出现峰，则判断为突变。
[0118] 2、建立方法检测8例肺癌细胞株的变异位点，验证结果显示与美国标准菌种收藏 所（WWW. atcc.org)细胞株的变异情况一致，具体基因的变异蛋白与碱基位点结果如表5。 其中由于本发明试剂盒不包含PTEN缺失位点，因此未检测到H1650细胞株的PTEN缺失。阴 性对照以及空白对照均没有检测到基因变异，表明本试剂盒具有可行性。
[0119] 表5本发明试剂盒在肺癌细胞株检测的验证结果
[0120]
[0121] 实施例3使用实施例1的试剂盒检测肺癌患者组织样本
[0122] 1、验证选用已经使用LungCarta试剂盒检测出突变的3例人肺腺癌组织样（来自 广东省人民医院）以及未检测出突变的3例肺癌组织样本（来自广东省人民医院），同时设 立正常人基因组DNA (gDNA)做为阴性对照，水（H2O)做为空白对照。每个样本检测需要DNA 120ng，即IOng/孔X 12孔。其中，LungCarta试剂盒按其说明书操作。本发明试剂盒的操 作如下：
[0123] (I)PCR 的体系为：10XPCR 缓冲液 0· 5 μ 1、MgCl2(25mM)0. 4 μ 1、 dNTPs(25mM)0. 1 μ 1、PCR酶（5U/ μ 1)0. 2 μ 1、扩增引物混合液1 μ 1、肺癌组织样本基因组 (IOng/ μ 1)2 μ 1，水补足至 5 μ 1。94°C 2 分钟；94°C 30 秒、56°C 30 秒、72°C 1 分钟，45 个循 环；72°C 5分钟。
[0124] (2)在步骤⑴得到的PCR产物中加入核酸外切酶SAP 0.3μ1、SAP缓冲液 0. 17 μ 1、水补足至7 μ 1。37°C 40分钟，85°C 5分钟，将步骤（1)获得的PCR产物进行碱性 磷酸酶消化。
[0125] (3)12管扩增引物分别对应12管延伸引物，Pl对应E1，以此类推。在步骤（2) 得到的产物中加入Typ印Iex缓冲液（IOX)O. 2 μ 1、Typ印Iex终止混合液（IOX)O. 2 μ 1、 Typ印lex热测序酶（33U/ μ 1)0. 041 μ 1、延伸引物混合液0· 804 μ 1、Η20补足至9 μ 1。： 94°C 30秒；〔94°C 5秒、（52°C 5秒、80°C 5秒）5个循环〕，35个循环；72°C 3分钟，进行 延伸反应。
[0126] (4)将步骤（3)获得产物中加入水41 μ 1，清洁树脂（Clean Resin) 15mg(96孔板） 或者加入水16 μ I，清洁树脂6mg (384孔板），旋转板30-60分钟进行脱盐去离子防干扰处 理；3200g离心5分钟；
[0127] (5)MassARRAY系统Nanodispenser点样仪将上清液进行芯片点样，利用Analyzer 分析仪芯片扫描；扫描结果以Typer4. 0软件分析各目的基因的突变状况，在质谱峰变异碱 基处出现峰，则判断为突变。
[0128] 2、本发明试剂盒检测6例肺癌组织样本，与LungCarta试剂盒检测结果比较（见 表6)。使用本发明试剂盒在1例使用LungCarta试剂盒检测未发现突变的K1747T样本中 检测到FGFR2基因的突变（N549位点野生型A碱基分子量为7055. 7 ;突变C碱基分子量为 7031. 6,见图1)，在其它组织样本中与LungCarta试剂盒检测结果完全一致（图2~4)。 FGFR2基因是肿瘤治疗的新靶点，本试剂盒包含此新突变位点，而LungCarta试剂盒未含此 突变位点，表明本试剂盒具有前沿优势，可为临床患者提供更准确的基因变异信息。阴性对 照以及空白对照均没有检测到变异，表明本试剂盒具有可行性。
[0129] 表6本发明试剂盒与LungCarta试剂盒比较的验证结果
[0130]
[0131] 实施例4本发明试剂盒与直接测序法比较
[0132] 选取100例肺癌组织样本使用本发明试剂盒进行检测，与本研宄所已经建立的 EGFR、KRAS、PIK3CA、BRAF直接测序法比较敏感性与特异性。直接测序法按ABI 3730测 序仪标准操作流程进行。本发明试剂盒灵敏度为100%，特异度为96. 3%，阳性预测值为 95.8%，阴性预测值为100% (见表7)。结果显示本发明试剂盒具有高灵敏度，与直接测序 法比较特异度为96. 3%，可能与质谱的高敏感性相关，可弥补直接测序法低敏感度导致的 假阴性。
[0133] 表7本发明试剂盒的灵敏度与特异度
[0134]
[0135] 对比例1 :
[0136] 操作步骤与条件基本与实施例2、3所述的肺癌基因谱检测方法的应用一致，区别 仅在于：E9组延伸引物的浓度有变化，具体为FGFR1_T141A由9. 63μΜ变为3. 21μΜ，其他 六个延伸引物浓度不变。结果显示FGFR1_T141A的电泳峰明显降低，如图5所示。本对比 例旨在说明，在其他条件不变的情况下，延伸引物的混合物中，各个引物成分的浓度比例是 实验成败的一个关键因素。
[0137] 该对比例说明，在进行多重PCR及延伸反应时，引物混合物中，各种引物之间存在 着相互竞争作用，某些引物的反应效率高以及受分子量大小影响，产生的峰形较高，但有些 引物效率则受到抑制，所以引物混合中各种引物的浓度和比例对结果影响很大，需要不断 调整，获得最佳引物浓度比例。
[0138] 对比例2:
[0139] 操作步骤与条件基本与实施例2、3所述的肺癌基因谱检测方法的应用一致，区别 仅在于：建立应用方法的第4步在96孔板操作时清洁树脂（Clean Resin)每孔加入由15mg 变为l〇mg。结果显示在每个反应的主峰后面约40分子量大小处形成一个K+副峰，干扰结 果判读，如图6所示为反应第十孔6重反应6个主峰后面均含有1个副峰。本对比例旨在 说明，在其他条件不变的情况下，在树脂的脱离子（K+、Na +等）作用下对质谱结果的影响，树 脂加入量的多少是实验成败的一个关键因素。
[0140] 该对比例说明，在点样芯片进行质谱扫描前，应该对产物进行充分的脱离子处理， 调整树脂到合适量，否则将会在产物主峰的后面形成副峰，严重干扰结果判读。所以考虑树 脂量对结果的影响比较大，需要调整加入合适量的树脂，在芯片点样前将样本充分脱盐，减 少离子对结果的影响。
[0141] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种基于MassARRAY质谱平台Iplex分析的肺癌基因谱检测方法，其特征在于能检 测肺癌13种驱动和耐药相关基因的99种热点变异位点，包括如下步骤： (1)设计如SEQ ID NO. 1~SEQ ID NO. 198所示的扩增引物和如SEQ ID NO. 199~SEQ ID NO. 297所示的延伸引物； (2)将如SEQ ID NO. 1~SEQ ID NO. 198所示的扩增引物分为12组，扩增引物名称 末尾为Pl-F和Pl-R为第1组，扩增引物名称末尾为P2-F和P2-R为第2组，类推，分为12 组；将分组后的扩增引物混合，得到12管扩增引物混合液；将如SEQ ID NO. 199~SEQ ID NO. 297所示的延伸引物进行分组，延伸引物名称末尾为El的延伸引物混合得到第1管延伸 引物混合物，延伸引物名称末尾为E2的延伸引物混合得到第2管延伸引物混合物，类推，得 到11管延伸引物混合物和1管单独延伸引物，共计12管； (3) 以人肺组织基因组为模板，将12管扩增引物混合液分别进行PCR，获得PCR产物； (4) 将步骤（3)获得的PCR产物进行碱性磷酸酶消化； (5) ... 将步骤（4)消化后的产物进行延伸反应：12管扩增引物得到的产物分别对应12管 延伸引物，Pl对应E1，以此类推； (6) 在96孔板或384孔板将步骤（5)延伸反应后得到的产物、清洁树脂和水混合；旋 转96孔板或384孔板进行脱盐去离子防干扰处理；接着离心；对上清进行分析； (7) MassARRAY系统Nanodispenser点样仪进行芯片点样，利用Analyzer分析仪芯片扫 描；扫描结果以Typer4.O软件分析各目的基因的突变状况，在质谱峰变异碱基处出现峰， 则判断为突变。2. 根据权利要求1所述基于MassARRAY质谱平台Iplex分析的肺癌基因谱检测方法， 其特征在于： 步骤（2)中所述的扩增引物混合物中的扩增引物为按等摩尔比混合； 步骤⑵中所述的延伸引物混合物中的延伸引物为按如下摩尔比混合： 第1管：如SEQ ID NO. 199~SEQ ID NO. 208所示的延伸引物的摩尔比为7. 04 :7. 36 : 8. 05 ：8, 30 ：9, 10 ：9, 34 ：10, 12 ：10, 35 ：10, 91 ：11. 11 ； 第2管：如SEQ ID NO. 209~SEQ ID NO. 218所示的延伸引物的浓度分别依次为6.83: 7. 11 ：7, 84 ：8, 05 ：8, 93 ：9, 16 ：9, 76 ：9, 94 ：10, 42 ：10, 90 ； 第3管：如SEQ ID NO. 219~SEQ ID NO. 228所示的延伸引物的浓度分别依次为7.01 : 7. 74 ：7, 99 ：8, 69 ：8, 96 ：9, 60 ：9, 84 ：10, 41 ：10, 66 ：11, 20 ； 第4管：如SEQ ID NO. 229~SEQ ID NO. 238所示的延伸引物的浓度分别依次为6.89: 7. 18 ：7, 89 ：8, 55 ：9, 44 ：9, 58 ：10, 15 ：10, 40 ：11, 02 ：11, 20 ； 第5管：如SEQ ID NO. 239~SEQ ID NO. 248所示的延伸引物的浓度分别依次为6.94: 7. 28 ：7, 59 ：8, 34 ：8, 59 ：9, 44 ：9, 63 ：10, 30 ：10, 45 ：11, 16 ； 第6管：如SEQ ID NO. 249~SEQ ID NO. 258所示的延伸引物的浓度分别依次为6.94: 7. 67 ：8, 34 ：8, 57 ：9, 31 ：9, 47 ：10, 03 ：10, 26 ：10, 91 ：11. 11 ； 第7管：如SEQ ID NO. 259~SEQ ID NO. 268所示的延伸引物的浓度分别依次为7. 05: 7. 35 ：8. 11 ：8, 95 ：9, 18 ：9, 80 ：9, 99 ：10, 52 ：11, 01 ：11, 22 ； 第8管：如SEQ ID NO. 269~SEQ ID NO. 278所示的延伸引物的浓度分别依次为6.87: 7. 12 ：8, 09 ：8, 74 ：9, 00 ：9, 69 ：10, 42 ：10, 65 ：11, 13 ：11, 29 ； 第9管：如SEQIDNO. 279~SEQIDNO. 285所示的延伸引物的浓度分别依次为7. 11 : 8. 04 :8. 72 :8. 93 :9. 63 :10. 34 :11. 10 ; 第10管：如SEQIDNO. 286~SEQIDNO. 291所示的延伸引物的浓度分别依次为6. 90: 7. 97 ：8, 14 ：9. 11 ：9, 90 ：10, 74 ； 第11管：如SEQIDNO. 292~SEQIDNO. 296所示的延伸引物的浓度分别依次为7. 10: 8. 14 :9. 20 :10. 09 :10. 85。3.根据权利要求1所述基于MassARRAY质谱平台Iplex分析的肺癌基因谱检测方法， 其特征在于： 所述的扩增引物混合物中的每条引物的浓度为〇. 5yM; 所述的延伸引物混合物中的每条延伸引物的浓度如下： 第1管：如SEQIDNO. 199~SEQIDNO. 208所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 04yM、7. 36yM、8. 05yM、8. 30yM、9. 10yM、9. 34yM、10. 12yM、10. 35yM、10. 91yM、 11. 11yM； 第2管：如SEQIDNO. 209~SEQIDNO. 218所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 83yM、7. 11yM、7. 84yM、8. 05yM、8. 93yM、9. 16yM、9. 76yM、9. 94yM、10. 42yM、 10. 90yM; 第3管：如SEQIDNO. 219~SEQIDNO. 228所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 01yM、7. 74yM、7. 99yM、8. 69yM、8. 96yM、9. 60yM、9. 84yM、10. 41yM、10. 66yM、 11. 20yM； 第4管：如SEQIDNO. 229~SEQIDNO. 238所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 89yM、7. 18yM、7. 89yM、8. 55yM、9. 44yM、9. 58yM、10. 15yM、10. 40yM、ll. 02yM、 11. 20yM； 第5管：如SEQIDNO. 239~SEQIDNO. 248所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 94yM、7. 28yM、7. 59yM、8. 34yM、8. 59yM、9. 44yM、9. 63yM、10. 30yM、10. 45yM、 11. 16yM； 第6管：如SEQIDNO. 249~SEQIDNO. 258所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 94yM、7. 67yM、8. 34yM、8. 57yM、9. 31yM、9. 47yM、10. 03yM、10. 26yM、10. 91yM、 11. 11yM； 第7管：如SEQIDNO. 259~SEQIDNO. 268所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 05yM、7. 35yM、8. 11yM、8. 95yM、9. 18yM、9. 80yM、9. 99yM、10. 52yM、ll. 01yM、 11. 22yM； 第8管：如SEQIDNO. 269~SEQIDNO. 278所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 87yM、7. 12yM、8. 09yM、8. 74yM、9. 00yM、9. 69yM、10. 42yM、10. 65yM、ll. 13yM、 11. 29yM； 第9管：如SEQIDNO. 279~SEQIDNO. 285所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 11yM、8. 04yM、8. 72yM、8. 93yM、9. 63yM、10. 34yM、11. 10yM; 第10管：如SEQIDNO. 286~SEQIDNO. 291所示的延伸引物的浓度分别依次为 6.90yM、7.97yM、8. 14yM、9.llyM、9.90yM、10.74yM; 第11管：如SEQIDNO. 292~SEQIDNO. 296所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 10 y M、8. 14 y M、9. 20 y M、10. 09 y M、10. 85 y M ; 所述的单独延伸引物中的的延伸引物的浓度为7. 04yM; 步骤⑶中所述的PCR的条件为：94°C2分钟；94°C30秒、56°C30秒、72°C1分钟，45 个循环；72°C5分钟； 步骤⑶中所述的PCR的体系为：10XPCR缓冲液0. 5 y 1、浓度为25mM的MgCl2O. 4 y 1、浓度为25mM的dNTPs 0.1 y 1、PCR酶0. 2 y 1、扩增引物混合液I y l、10ng/ y 1的人肺组织 基因组2y1，水补足至5y1 ; 步骤（4)中所述的消化的体系为：在步骤（1)得到的PCR产物中加入核酸外切酶SAP0. 3y1、SAP缓冲液0. 17y1、水补足至7y1 ; 步骤（4)中所述的消化的条件为：37°C40分钟，85°C5分钟； 步骤（5)中所述的延伸反应的体系为：在步骤（2)得到的产物中加入Typeplex缓 冲液 0? 2U1、TypeplexTerminationMix0. 2yKTypeplexthermosequenaseenzyme 0. 041y1、延伸引物混合液或单独延伸引物溶液0. 804y1、H2O补足至9yI; 步骤（5)中所述的延伸反应的条件为：94°C30秒；〔94°C5秒、（52°C5秒、80°C5秒）5 个循环〕，35个循环；72°C3分钟 步骤（6)中：当使用96孔板操作时，将延伸反应后的产物9y1、水41y1和清洁树脂 15mg混合；当使用384孔板操作时，将延伸反应后的产物9y1、水16y1和清洁树脂6mg混 合。4. 一种基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒，其特征在于：依据权利要 求1所述的基于MassARRAY质谱平台Iplex分析的肺癌基因谱检测方法设计得到，包含如 SEQ ID NO. 1~SEQ ID NO. 198所示的扩增引物和如SEQ ID NO. 199~SEQ ID NO. 297所 示的延伸引物。5. 根据权利要求4所述基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒，其特征在 于：包含12管扩增引物混合物、11管延伸引物混合物和1管单独延伸引物； 第1管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQ ID NO. 1~SEQ ID NO. 20所示，第2管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQ ID NO. 21~SEQ ID NO. 40所示，第3管扩 增引物混合物中的扩增引物序列如SEQ ID NO. 41~SEQ ID NO. 60所示，第4管扩增引物 混合物中的扩增引物序列如SEQ ID NO. 61~SEQ ID NO. 80所示，第5管扩增引物混合物 中的扩增引物序列如SEQ ID NO. 81~SEQ ID NO. 100所示，第6管扩增引物混合物中的 扩增引物序列如SEQ ID NO. 101~SEQ ID NO. 120所示，第7管扩增引物混合物中的扩增 引物序列如SEQ ID NO. 121~SEQ ID NO. 140所示，第8管扩增引物混合物中的扩增引物 序列如SEQ ID NO. 141~SEQ ID NO. 160所示，第9管扩增引物混合物中的扩增引物序列 如SEQ ID NO. 161~SEQ ID NO. 174所示，第10管扩增引物混合物中的扩增引物序列如 SEQ ID NO. 175~SEQ ID NO. 186所示，第11管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQ ID NO. 187~SEQ ID NO. 196所示，第12管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQ ID NO. 197~SEQ ID NO. 198所示； 第1管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQIDNO. 199~SEQIDNO. 208所示， 第2管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQIDNO. 209~SEQIDNO. 218所示，第3 管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQIDNO. 219~SEQIDNO. 228所示，第4管延 伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQ ID NO. 229~SEQ ID NO. 238所示，第5管延伸引 物混合物中的延伸引物序列如SEQ ID NO. 239~SEQ ID NO. 248所示，第6管延伸引物混 合物中的延伸引物序列如SEQ ID NO. 249~SEQ ID NO. 258所示，第7管延伸引物混合物 中的延伸引物序列如SEQ ID NO. 259~SEQ ID NO. 268所示，第8管延伸引物混合物中的 延伸引物序列如SEQ ID NO. 269~SEQ ID NO. 278所示，第9管延伸引物混合物中的延伸 引物序列如SEQ ID NO. 279~SEQ ID NO. 285所示，第10管延伸引物混合物中的延伸引物 序列如SEQ ID NO. 286~SEQ ID NO. 291所示，第11管延伸引物混合物中的延伸引物序列 如SEQ ID NO. 292~SEQ ID NO. 296所示； 所述的单独延伸引物中的延伸引物序列如SEQ ID NO. 297所示。6.根据权利要求5所述基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒，其特征在 于： 所述的扩增引物混合物中的扩增引物为按等摩尔比混合； 所述的延伸引物混合物中延伸引物为按如下摩尔比混合： 第1管：如SEQ ID NO. 199~SEQ ID NO. 208所示的延伸引物的摩尔比为7. 04 :7. 36 : 8. 05 ：8, 30 ：9, 10 ：9, 34 ：10, 12 ：10, 35 ：10, 91 ：11. 11 ； 第2管：如SEQ ID NO. 209~SEQ ID NO. 218所示的延伸引物的浓度分别依次为6.83: 7. 11 ：7, 84 ：8, 05 ：8, 93 ：9, 16 ：9, 76 ：9, 94 ：10, 42 ：10, 90 ； 第3管：如SEQ ID NO. 219~SEQ ID NO. 228所示的延伸引物的浓度分别依次为7.01 : 7. 74 ：7, 99 ：8, 69 ：8, 96 ：9, 60 ：9, 8 4 ：10, 41 ：10, 66 ：11, 20 ； 第4管：如SEQ ID NO. 229~SEQ ID NO. 238所示的延伸引物的浓度分别依次为6.89: 7. 18 ：7, 89 ：8, 55 ：9, 44 ：9, 58 ：10, 15 ：10, 40 ：11, 02 ：11, 20 ； 第5管：如SEQ ID NO. 239~SEQ ID NO. 248所示的延伸引物的浓度分别依次为6.94: 7. 28 ：7, 59 ：8, 34 ：8, 59 ：9, 44 ：9, 63 ：10, 30 ：10, 45 ：11, 16 ； 第6管：如SEQ ID NO. 249~SEQ ID NO. 258所示的延伸引物的浓度分别依次为6.94: 7. 67 ：8, 34 ：8, 57 ：9, 31 ：9, 47 ：10, 03 ：10, 26 ：10, 91 ：11. 11 ； 第7管：如SEQ ID NO. 259~SEQ ID NO. 268所示的延伸引物的浓度分别依次为7. 05: 7. 35 ：8. 11 ：8, 95 ：9, 18 ：9, 80 ：9, 99 ：10, 52 ：11, 01 ：11, 22 ； 第8管：如SEQ ID NO. 269~SEQ ID NO. 278所示的延伸引物的浓度分别依次为6.87: 7. 12 ：8, 09 ：8, 74 ：9, 00 ：9, 69 ：10, 42 ：10, 65 ：11, 13 ：11, 29 ； 第9管：如SEQ ID NO. 279~SEQ ID NO. 285所示的延伸引物的浓度分别依次为7. 11 : 8. 04 :8. 72 :8. 93 :9. 63 :10. 34 :11. 10 ; 第10管：如SEQ ID NO. 286~SEQ ID NO. 291所示的延伸引物的浓度分别依次为6. 90: 7. 97 ：8, 14 ：9. 11 ：9, 90 ：10, 74 ； 第11管：如SEQ ID NO. 292~SEQ ID NO. 296所示的延伸引物的浓度分别依次为7. 10: 8. 14 :9. 20 :10. 09 :10. 85。7.根据权利要求5所述基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒，其特征在 于： 所述的扩增引物混合物中的每条引物的浓度为〇.5 yM ; 所述的延伸引物混合物中的每条延伸引物的浓度如下： 第1管：如SEQIDNO. 199~SEQIDNO. 208所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 04yM、7. 36yM、8. 05yM、8. 30yM、9. 10yM、9. 34yM、10. 12yM、10. 35yM、10. 91yM、 11. 11yM； 第2管：如SEQIDNO. 209~SEQIDNO. 218所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 83yM、7. 11yM、7. 84yM、8. 05yM、8. 93yM、9. 16yM、9. 76yM、9. 94yM、10. 42yM、 10. 90yM; 第3管：如SEQIDNO. 219~SEQIDNO. 228所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 01yM、7. 74yM、7. 99yM、8. 69yM、8. 96yM、9. 60yM、9. 84yM、10. 41yM、10. 66yM、 11. 20yM； 第4管：如SEQIDNO. 229~SEQIDNO. 238所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 89yM、7. 18yM、7. 89yM、8. 55yM、9. 44yM、9. 58yM、10. 15yM、10. 40yM、ll. 02yM、 11. 20yM； 第5管：如SEQIDNO. 239~SEQIDNO. 248所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 94yM、7. 28yM、7. 59yM、8. 34yM、8. 59yM、9. 44yM、9. 63yM、10. 30yM、10. 45yM、 11. 16yM； 第6管：如SEQIDNO. 249~SEQIDNO. 258所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 94yM、7. 67yM、8. 34yM、8. 57yM、9. 31yM、9. 47yM、10. 03yM、10. 26yM、10. 91yM、 11. 11yM； 第7管：如SEQIDNO. 259~SEQIDNO. 268所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 05yM、7. 35yM、8. 11yM、8. 95yM、9. 18yM、9. 80yM、9. 99yM、10. 52yM、ll. 01yM、 11. 22yM； 第8管：如SEQIDNO. 269~SEQIDNO. 278所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 87yM、7. 12yM、8. 09yM、8. 74yM、9. 00yM、9. 69yM、10. 42yM、10. 65yM、ll. 13yM、 11. 29yM； 第9管：如SEQIDNO. 279~SEQIDNO. 285所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 11yM、8. 04yM、8. 72yM、8. 93yM、9. 63yM、10. 34yM、11. 10yM; 第10管：如SEQIDNO. 286~SEQIDNO. 291所示的延伸引物的浓度分别依次为 6.90yM、7.97yM、8. 14yM、9.llyM、9.90yM、10.74yM; 第11管：如SEQIDNO. 292~SEQIDNO. 296所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 10yM、8. 14yM、9. 20yM、10. 09yM、10. 85yM; 所述的单独延伸引物中的的延伸引物的浓度为7. 04yM。8. 根据权利要求4~7任一项所述的基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂 盒，其特征在于：还包括清洁树脂和PCR用酶试剂中的一种或两种。9. 根据权利要求8所述的基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒，其特征 在于：所述的PCR用酶试剂包括PCR酶、dNTP和PCR缓冲液。10. 权利要求4所述的基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒的应用，其特 征在于包含如下步骤： (1)将如SEQIDNO. 1~SEQIDNO. 198所示的扩增引物分为12组，扩增引物名称末 尾为Pl-F和Pl-R为第1组，扩增引物名称末尾为P2-F和P2-R为第2组，类推，分为12组； 将每条扩增引物配制成浓度为10UM的引物溶液后，再按分组进行混合，得到12管扩增引 物混合液，每条引物的终浓度为0. 5yM;以人肺基因组DNA为模板，将12管扩增引物混合 液分别进行PCR，获得PCR产物； PCR的条件为：94°C2分钟；94°C30秒、56°C30秒、72°C1分钟，45个循环；72°C5分 钟； PCR的体系为：10XPCR缓冲液0. 5y1、浓度为25mM的MgCl2O. 4y1、浓度为25mM的dNTPs0.Iy1、PCR酶0. 2y1、扩增引物混合液Iy1、IOng/y1的人肺组织基因组2y1，水 补足至5y1 ; (2) 将步骤（1)获得的PCR产物进行碱性磷酸酶消化；消化的体系为：在步骤（1)得到 的PCR产物中加入核酸外切酶SAP0. 3y1、SAP缓冲液0. 17y1、水补足至7y1 ;消化的条 件为：37°C40分钟，85°C5分钟； (3) 将如SEQIDNO. 199~SEQIDNO. 297所示的延伸引物进行分组，延伸引物名称末 尾为El的延伸引物混合得到第1管延伸引物混合物，延伸引物名称末尾为E2的延伸引物 混合得到第2管延伸引物混合物，类推，为12管，配制成11管延伸引物混合液和1管单独 延伸引物溶液；在步骤（2)得到的产物中进行延伸反应；12管扩增引物分别对应12管延伸 引物，Pl对应E1，以此类推； 其中，所述的延伸引物混合物中的每条延伸引物的浓度如下： 第1管：如SEQIDNO. 199~SEQIDNO. 208所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 04yM、7. 36yM、8. 05yM、8. 30yM、9. 10yM、9. 34yM、10. 12yM、10. 35yM、10. 91yM、 11. 11yM； 第2管：如SEQIDNO. 209~SEQIDNO. 218所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 83yM、7. 11yM、7. 84yM、8. 05yM、8. 93yM、9. 16yM、9. 76yM、9. 94yM、10. 42yM、 10. 90yM; 第3管：如SEQIDNO. 219~SEQIDNO. 228所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 01yM、7. 74yM、7. 99yM、8. 69yM、8. 96yM、9. 60yM、9. 84yM、10. 41yM、10. 66yM、 11. 20yM； 第4管：如SEQIDNO. 229~SEQIDNO. 238所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 89yM、7. 18yM、7. 89yM、8. 55yM、9. 44yM、9. 58yM、10. 15yM、10. 40yM、ll. 02yM、 11. 20yM； 第5管：如SEQIDNO. 239~SEQIDNO. 248所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 94yM、7. 28yM、7. 59yM、8. 34yM、8. 59yM、9. 44yM、9. 63yM、10. 30yM、10. 45yM、 11. 16yM； 第6管：如SEQIDNO. 249~SEQIDNO. 258所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 94yM、7. 67yM、8. 34yM、8. 57yM、9. 31yM、9. 47yM、10. 03yM、10. 26yM、10. 91yM、 11. 11yM； 第7管：如SEQIDNO. 259~SEQIDNO. 268所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 05yM、7. 35yM、8. 11yM、8. 95yM、9. 18yM、9. 80yM、9. 99yM、10. 52yM、ll. 01yM、 11. 22yM； 第8管：如SEQIDNO. 269~SEQIDNO. 278所示的延伸引物的浓度分别依次为 6. 87yM、7. 12yM、8. 09yM、8. 74yM、9.OOyM、9. 69yM、10. 42yM、10. 65yM、ll. 13yM、 11. 29yM； 第9管：如SEQIDNO. 279~SEQIDNO. 285所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 11yM、8. 04yM、8. 72yM、8. 93yM、9. 63yM、10. 34yM、11. 10yM; 第10管：如SEQIDNO. 286~SEQIDNO. 291所示的延伸引物的浓度分别依次为 6.90yM、7.97yM、8. 14yM、9.llyM、9.90yM、10.74yM; 第11管：如SEQIDNO. 292~SEQIDNO. 296所示的延伸引物的浓度分别依次为 7. 10yM、8. 14yM、9. 20yM、10. 09yM、10. 85yM; 所述的单独延伸引物中的的延伸引物的浓度为7. 04yM; 延伸反应的体系为：在步骤（2)得到的产物中加入Typeplex缓冲液0. 2yl、Typeplex TerminationMix0.2yl、Typeplexthermosequenaseenzyme0.041U1、延伸引物混合液 或单独延伸引物溶液0. 804yI、H2O补足至9yI; 延伸反应的条件为：94°C30秒；〔94°C5秒、（52°C5秒、80°C5秒）5个循环〕，35个 循环；72°C3分钟； (4) 使用96孔板操作时，将步骤（3)获得产物9y1、水41y1和清洁树脂15mg混合； 使用384孔板操作时，将步骤（3)获得产物9y1、水16y1和清洁树脂6mg混合；旋转96孔 板或384孔板30~60分钟进行脱盐去离子防干扰处理；3200g离心5分钟；对上清进行分 析； (5) MassARRAY系统Nanodispenser点样仪进行芯片点样，利用Analyzer分析仪芯片扫 描；扫描结果以Typer4. 0软件分析各目的基因的突变状况，在质谱峰变异碱基处出现峰， 则判断为突变。
【专利摘要】本发明公开一种基于MassARRAY质谱平台Iplex分析的肺癌基因谱检测方法及试剂盒与应用。该方法能检测肺癌13种驱动和耐药相关基因的99种热点变异位点，通过使用如SEQ ID NO.1～198所示的扩增引物进行扩增反应，接着消化反应，再使用如SEQ ID NO.199～297所示的延伸引物进行延伸反应，得到的产物进行MassARRAY质谱平台Iplex分析。依据该方法设计得到一款检测试剂盒，其具有如下优点：紧跟肺癌诊治国际前沿，考虑了欧美人群与亚洲人群基因谱的差异，检测位点多；价格较低；高通量，用时短；检测样本不限；高准确性与高敏感性。因此，该试剂盒在临床上应用推广的潜力大。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894269
【申请号】CN201510311868
【发明人】吴一龙, 张绪超, 田红霞
【申请人】广东省人民医院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月9日...
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