一种茶炭疽病病叶的分子检测方法
一种茶炭疽病病叶的分子检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于农作物病害检测及防治技术领域，具体涉及一种茶炭疽病病叶的分子 检测方法。
【背景技术】
[0002] 茶炭疽病是我国各茶叶产区常见病害之一，在茶叶上可产生1/3左右的灰白或红 褐色病斑，往往造成5%以上的减产，干茶外形破碎、滋味变淡。其病原菌从茶树嫩叶背面入 侵，潜伏5-20天，病症与茶云纹叶枯病、褐色叶斑病等叶部病害混淆，因此，以形态特征为 基础的常规病害诊断技术难以及时准确检测到茶炭疽病的发生，从而导致该病难以得到及 时高效的防控，自2009年，本研宄组建立了茶炭疽病原菌的PCR鉴定方法后，一直未见自然 病样的直接分子检测，因此，建立一种能够监测茶炭疽病叶越冬及越春情况的的快速、准确 检测技术意义十分重大。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是针对上述现有技术的缺陷和提供一种快速、准确检测茶炭疽病叶 的分子方法。
[0004] 本发明所采用的技术方案是，一种茶炭疽病病叶的分子检测方法，包括以下步 骤：
[0005] 1)样品采集，随机采集茶炭疽病病叶样本，用去离子水冲洗叶片，-80°c保存备 用；
[0006] 2)采用TIANGEN公司真菌基因组DNA试剂盒提取叶片基因组DNA ;
[0007] 3)以步骤2)中提取的叶片基因组DNA为模板进行特异性PCR扩增；
[0008] 4)将PCR扩增产物进行电泳，437bp处出现特异条带，则叶片带菌。
[0009] 本发明的特点还在于，
[0010] 步骤 3 中 PCR 扩增体系如下：10XBuffer 2. 5 yL、25mmol/LMgCL22. 0 yL、 2.5mmol/LdNTP 1.5yL、上游引物及下游引物各20~40ng、叶片基因组DNA 10~40ng、Taq DNA聚合酶I. 0U，最后用无菌去离子水补齐至25 μ L。
[0011] 上游引物的基因序列如SEQ ID NO. 2所示，具体为：ITSF : TTACGTCCCTGCCCTTTGTA ;下游引物的基因序列如SEQ ID NO. 3所示，具体为：ITSR : AATGTGCGTTCAAAGATTCG。
[0012] 步骤3中的PCR反应程序为：第一循环94°C预变性2min ;然后94°C变性lmin， 54°C退火 lmin，72°C延伸 2min，共 35 个循环；72°C延伸 lOmin。
[0013] 步骤3中的电泳条件为：PCR产物在1. 0%琼脂糖凝胶上用0. 5XTBE缓冲液中电 泳分析，电压为4_5V/cm。
[0014] 本发明的有益效果是：分子鉴定是融合了光谱技术的精确定量、DNA杂交的特异 性以及其敏感性，在对病菌进行检验过程中，与形态观察及病菌分离回接鉴定比较，可以实 现在茶炭疽病的早期未显症时期的快速鉴定，2天时间即可准确完成批量的样品鉴定，有利 于病害的及时准确防治，从而实现茶园有效的提质增效。
【附图说明】
[0015] 图1是本发明引物在54°C退火温度下特异扩增的电泳图谱，其中，M:Marker2000 ; 1:茶炭疽病菌UACT引物）；2:茶炭疽病菌2 (ACT引物）；3:病叶-ITS-植物试剂盒（ITS 引物，437bp);
[0016] 图2是本发明测序产物与比对4条序列的进化树构建。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0018] 本发明提供一种茶炭疽病叶分子检测方法，包括下列步骤：
[0019] 1.茶炭疽病叶检测的特殊引物设计
[0020] 根据茶炭疽病叶DNA序列的特性，合成了对茶炭疽病叶具特异扩增作用的一对引 物：ITSF :TTACGTCCCTGCCCTTTGTA，ITSR :AATGTGCG TTCAAAGATTCG ;
[0021] 2.茶炭疽病叶检测体系的建立
[0022] (1)采用TIANGEN公司真菌基因组DNA试剂盒提取感染茶炭疽病叶片的总DNA。
[0023] (2)?〇?扩增，25以1^反应体系分别在？〇?薄壁管中依次放入：10\81^6以5 4 1^、 25mmol/LMgCL22. 0 μ L、2. 5mmol/LdNTP 1. 5 μ L、上游引物及下游引物各 20 ~40ng、叶片基 因组DNA 10~40ng、Taq DNA聚合酶1.0U，最后用无菌去离子水补齐至25yL。离心lOsec， 将PCR薄壁管放入PCR仪中扩增。扩增条件为：第一循环94°C预变性2min ;然后94°C变性 lmin，54°C退火lmin，72°C延伸2min，共35个循环；72°C延伸IOmin补齐末端，扩增完成。
[0024] (3) PCR产物在I. 0 %琼脂糖凝胶上用0. 5 X TBE缓冲液中电泳分析，电压为4-5V/ cm，电泳结束后用凝胶成像系统分析，如图1所示，437bp处出现特异条带，则叶片带菌。
[0025] 本发明所用引物对茶炭疽病叶具有很高的特异性，能够用于区别茶炭疽病叶的茶 炭疽病的检测。
[0026] 实施例1
[0027] 1、样品采集
[0028] 2014年8月22日，湖南省平江县随机采集300株病叶样本。去离子水冲洗叶 片，-80 °C保存备用。
[0029] 2、茶炭疽病叶检测
[0030] (1)采用TIANGEN公司真菌基因组DNA试剂盒提取叶片基因组DNA。
[0031] (2)PCR扩增，50yL反应体系分别在PCR薄壁管中依次放入：10XTaq Buffer 5yL、10mMdNTP I yL、10uM上游引物及IOuM下游引物各I yL、叶片基因组DNA10ng、2U/yL Taq DNA聚合酶1 μ L，最后用无菌去离子水补齐至50 μ L。混匀后将PCR薄壁管放入PCR仪 中扩增。将PCR薄壁管放入PCR仪中扩增。扩增条件为：第一循环94°C预变性2min ;然后 94°C变性lmin，54°C退火lmin，72°C延伸2min，共35个循环；72°C延伸IOmin补齐末端，扩 增完成。
[0032] (3) PCR产物在I. 0 %琼脂糖凝胶上用0. 5 X TBE缓冲液中电泳分析，电压为4-5V/ cm，电泳结束后用凝胶成像系统分析。
[0033] 3、检测结果
[0034] 共有3株样本在437bp出现了一条特异带，其检出率为1.33%，该结果与2003年 茶炭疽病叶越冬前菌源田间病情普查的结果基本一致，这表明该检测体系能够在早期监测 越冬菌源地带茶炭疽病叶的田间带菌情况。
[0035] 4、利用宝生物公司pMDTM19-T载体进行PCR产物的克隆，方法参照pMDTM19-T载 体说明书。选择插入片段长度与克隆片段长度一致的克隆，送交华大生物公司测序分析， 序列如SEQ ID NO. 1。将测定所得序列利用Blast程序从GenBank搜索相关序列，分别在 Mega6.0软件里构建系统树进行分类鉴定，结果见图2,根据图2可知，本发明得到的PCR特 异扩增序列与炭疽病菌属于同一个种属。
[0036]
【主权项】
1. 一种茶炭疽病病叶的分子检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 样品采集，随机采集茶炭疽病病叶样本，用去离子水冲洗叶片，-80°C保存备用； 2) 采用TIANGEN公司真菌基因组DNA试剂盒提取叶片基因组DNA; 3) 以步骤2)中提取的叶片基因组DNA为模板进行特异性PCR扩增； 4) 将PCR扩增产物进行电泳，437bp处出现特异条带，则叶片带菌。2. 根据权利要求1所述的茶炭疽病病叶的分子检测方法，其特征在于，所述步骤3中 PCR扩增体系如下：10XBufTer2.5yL、25mmol/LMgCL22.OyL、2.5mmol/LdNTP1.5yL、 上游引物及下游引物各20~40ng、叶片基因组DNA10~40ng、TaqDNA聚合酶1.0U，最后 用无菌去离子水补齐至25yL。3. 根据权利要求2所述的茶炭疽病病叶的分子检测方法，其特征在于，所述上游引物 的基因序列如SEQIDNO. 2所示，具体为：ITSF:TTACGTCCCTGCCCTTTGTA;下游引物的基因 序列如SEQIDNO. 3 所示，具体为：ITSR:AATGTGCGITCAAAGAITCG。4. 根据权利要求1所述的茶炭疽病病叶的分子检测方法，其特征在于，所述步骤3中 的PCR反应程序为：第一循环94°C预变性2min;然后94°C变性lmin，54°C退火lmin，72°C 延伸2min，共35个循环；72°C延伸lOmin。5. 根据权利要求1所述的茶炭疽病病叶的分子检测方法，其特征在于，所述步骤3中的 电泳条件为：PCR产物在I. 0%琼脂糖凝胶上用0. 5XTBE缓冲液中电泳分析，电压为4-5V/ cm〇
【专利摘要】本发明公开了一种茶炭疽病病叶的分子检测方法，主要采用TIANGEN公司真菌基因组DNA试剂盒提取自然发病叶片的DNA，采用ITS引物，经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳，通过扩增产物(片段长度约437bp)检测田间的带菌情况。所发明的特异分子检测引物及其用法可被用于生产实践中茶炭疽病叶感染的茶叶快速、灵敏、特异的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病叶的监测和鉴定，为感茶炭疽病茶叶防治提供可靠的技术和理论依据。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/04
【公开号】CN104894272
【申请号】CN201510319221
【发明人】周凌云
【申请人】湖南省茶叶研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月11日
【技术领域】
[0001] 本发明属于农作物病害检测及防治技术领域，具体涉及一种茶炭疽病病叶的分子 检测方法。
【背景技术】
[0002] 茶炭疽病是我国各茶叶产区常见病害之一，在茶叶上可产生1/3左右的灰白或红 褐色病斑，往往造成5%以上的减产，干茶外形破碎、滋味变淡。其病原菌从茶树嫩叶背面入 侵，潜伏5-20天，病症与茶云纹叶枯病、褐色叶斑病等叶部病害混淆，因此，以形态特征为 基础的常规病害诊断技术难以及时准确检测到茶炭疽病的发生，从而导致该病难以得到及 时高效的防控，自2009年，本研宄组建立了茶炭疽病原菌的PCR鉴定方法后，一直未见自然 病样的直接分子检测，因此，建立一种能够监测茶炭疽病叶越冬及越春情况的的快速、准确 检测技术意义十分重大。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是针对上述现有技术的缺陷和提供一种快速、准确检测茶炭疽病叶 的分子方法。
[0004] 本发明所采用的技术方案是，一种茶炭疽病病叶的分子检测方法，包括以下步 骤：
[0005] 1)样品采集，随机采集茶炭疽病病叶样本，用去离子水冲洗叶片，-80°c保存备 用；
[0006] 2)采用TIANGEN公司真菌基因组DNA试剂盒提取叶片基因组DNA ;
[0007] 3)以步骤2)中提取的叶片基因组DNA为模板进行特异性PCR扩增；
[0008] 4)将PCR扩增产物进行电泳，437bp处出现特异条带，则叶片带菌。
[0009] 本发明的特点还在于，
[0010] 步骤 3 中 PCR 扩增体系如下：10XBuffer 2. 5 yL、25mmol/LMgCL22. 0 yL、 2.5mmol/LdNTP 1.5yL、上游引物及下游引物各20~40ng、叶片基因组DNA 10~40ng、Taq DNA聚合酶I. 0U，最后用无菌去离子水补齐至25 μ L。
[0011] 上游引物的基因序列如SEQ ID NO. 2所示，具体为：ITSF : TTACGTCCCTGCCCTTTGTA ;下游引物的基因序列如SEQ ID NO. 3所示，具体为：ITSR : AATGTGCGTTCAAAGATTCG。
[0012] 步骤3中的PCR反应程序为：第一循环94°C预变性2min ;然后94°C变性lmin， 54°C退火 lmin，72°C延伸 2min，共 35 个循环；72°C延伸 lOmin。
[0013] 步骤3中的电泳条件为：PCR产物在1. 0%琼脂糖凝胶上用0. 5XTBE缓冲液中电 泳分析，电压为4_5V/cm。
[0014] 本发明的有益效果是：分子鉴定是融合了光谱技术的精确定量、DNA杂交的特异 性以及其敏感性，在对病菌进行检验过程中，与形态观察及病菌分离回接鉴定比较，可以实 现在茶炭疽病的早期未显症时期的快速鉴定，2天时间即可准确完成批量的样品鉴定，有利 于病害的及时准确防治，从而实现茶园有效的提质增效。
【附图说明】
[0015] 图1是本发明引物在54°C退火温度下特异扩增的电泳图谱，其中，M:Marker2000 ; 1:茶炭疽病菌UACT引物）；2:茶炭疽病菌2 (ACT引物）；3:病叶-ITS-植物试剂盒（ITS 引物，437bp);
[0016] 图2是本发明测序产物与比对4条序列的进化树构建。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0018] 本发明提供一种茶炭疽病叶分子检测方法，包括下列步骤：
[0019] 1.茶炭疽病叶检测的特殊引物设计
[0020] 根据茶炭疽病叶DNA序列的特性，合成了对茶炭疽病叶具特异扩增作用的一对引 物：ITSF :TTACGTCCCTGCCCTTTGTA，ITSR :AATGTGCG TTCAAAGATTCG ;
[0021] 2.茶炭疽病叶检测体系的建立
[0022] (1)采用TIANGEN公司真菌基因组DNA试剂盒提取感染茶炭疽病叶片的总DNA。
[0023] (2)?〇?扩增，25以1^反应体系分别在？〇?薄壁管中依次放入：10\81^6以5 4 1^、 25mmol/LMgCL22. 0 μ L、2. 5mmol/LdNTP 1. 5 μ L、上游引物及下游引物各 20 ~40ng、叶片基 因组DNA 10~40ng、Taq DNA聚合酶1.0U，最后用无菌去离子水补齐至25yL。离心lOsec， 将PCR薄壁管放入PCR仪中扩增。扩增条件为：第一循环94°C预变性2min ;然后94°C变性 lmin，54°C退火lmin，72°C延伸2min，共35个循环；72°C延伸IOmin补齐末端，扩增完成。
[0024] (3) PCR产物在I. 0 %琼脂糖凝胶上用0. 5 X TBE缓冲液中电泳分析，电压为4-5V/ cm，电泳结束后用凝胶成像系统分析，如图1所示，437bp处出现特异条带，则叶片带菌。
[0025] 本发明所用引物对茶炭疽病叶具有很高的特异性，能够用于区别茶炭疽病叶的茶 炭疽病的检测。
[0026] 实施例1
[0027] 1、样品采集
[0028] 2014年8月22日，湖南省平江县随机采集300株病叶样本。去离子水冲洗叶 片，-80 °C保存备用。
[0029] 2、茶炭疽病叶检测
[0030] (1)采用TIANGEN公司真菌基因组DNA试剂盒提取叶片基因组DNA。
[0031] (2)PCR扩增，50yL反应体系分别在PCR薄壁管中依次放入：10XTaq Buffer 5yL、10mMdNTP I yL、10uM上游引物及IOuM下游引物各I yL、叶片基因组DNA10ng、2U/yL Taq DNA聚合酶1 μ L，最后用无菌去离子水补齐至50 μ L。混匀后将PCR薄壁管放入PCR仪 中扩增。将PCR薄壁管放入PCR仪中扩增。扩增条件为：第一循环94°C预变性2min ;然后 94°C变性lmin，54°C退火lmin，72°C延伸2min，共35个循环；72°C延伸IOmin补齐末端，扩 增完成。
[0032] (3) PCR产物在I. 0 %琼脂糖凝胶上用0. 5 X TBE缓冲液中电泳分析，电压为4-5V/ cm，电泳结束后用凝胶成像系统分析。
[0033] 3、检测结果
[0034] 共有3株样本在437bp出现了一条特异带，其检出率为1.33%，该结果与2003年 茶炭疽病叶越冬前菌源田间病情普查的结果基本一致，这表明该检测体系能够在早期监测 越冬菌源地带茶炭疽病叶的田间带菌情况。
[0035] 4、利用宝生物公司pMDTM19-T载体进行PCR产物的克隆，方法参照pMDTM19-T载 体说明书。选择插入片段长度与克隆片段长度一致的克隆，送交华大生物公司测序分析， 序列如SEQ ID NO. 1。将测定所得序列利用Blast程序从GenBank搜索相关序列，分别在 Mega6.0软件里构建系统树进行分类鉴定，结果见图2,根据图2可知，本发明得到的PCR特 异扩增序列与炭疽病菌属于同一个种属。
[0036]
【主权项】
1. 一种茶炭疽病病叶的分子检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 样品采集，随机采集茶炭疽病病叶样本，用去离子水冲洗叶片，-80°C保存备用； 2) 采用TIANGEN公司真菌基因组DNA试剂盒提取叶片基因组DNA; 3) 以步骤2)中提取的叶片基因组DNA为模板进行特异性PCR扩增； 4) 将PCR扩增产物进行电泳，437bp处出现特异条带，则叶片带菌。2. 根据权利要求1所述的茶炭疽病病叶的分子检测方法，其特征在于，所述步骤3中 PCR扩增体系如下：10XBufTer2.5yL、25mmol/LMgCL22.OyL、2.5mmol/LdNTP1.5yL、 上游引物及下游引物各20~40ng、叶片基因组DNA10~40ng、TaqDNA聚合酶1.0U，最后 用无菌去离子水补齐至25yL。3. 根据权利要求2所述的茶炭疽病病叶的分子检测方法，其特征在于，所述上游引物 的基因序列如SEQIDNO. 2所示，具体为：ITSF:TTACGTCCCTGCCCTTTGTA;下游引物的基因 序列如SEQIDNO. 3 所示，具体为：ITSR:AATGTGCGITCAAAGAITCG。4. 根据权利要求1所述的茶炭疽病病叶的分子检测方法，其特征在于，所述步骤3中 的PCR反应程序为：第一循环94°C预变性2min;然后94°C变性lmin，54°C退火lmin，72°C 延伸2min，共35个循环；72°C延伸lOmin。5. 根据权利要求1所述的茶炭疽病病叶的分子检测方法，其特征在于，所述步骤3中的 电泳条件为：PCR产物在I. 0%琼脂糖凝胶上用0. 5XTBE缓冲液中电泳分析，电压为4-5V/ cm〇
【专利摘要】本发明公开了一种茶炭疽病病叶的分子检测方法，主要采用TIANGEN公司真菌基因组DNA试剂盒提取自然发病叶片的DNA，采用ITS引物，经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳，通过扩增产物(片段长度约437bp)检测田间的带菌情况。所发明的特异分子检测引物及其用法可被用于生产实践中茶炭疽病叶感染的茶叶快速、灵敏、特异的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病叶的监测和鉴定，为感茶炭疽病茶叶防治提供可靠的技术和理论依据。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/04
【公开号】CN104894272
【申请号】CN201510319221
【发明人】周凌云
【申请人】湖南省茶叶研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月11日
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