一种t细胞活化调节剂生物学活性的报告基因检测方法
一种t细胞活化调节剂生物学活性的报告基因检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制药技术领域，具体地说是涉及一种T细胞活化调节剂生物学活 性的报告基因检测方法。
【背景技术】
[0002] 胸腺依赖性淋巴细胞（Thymus-dependent lymphocyte，简称T细胞）功能的抑制 或激活在肿瘤免疫、自身免疫疾病及移植排斥反应中起着极为重要的作用，T细胞活化，不 仅需要T细胞受体的第一信号，而且需要第二信号。第一信号来自于T细胞上的⑶3/TCR(T cell receptor，T细胞受体）复合物与抗原提呈细胞或其它种类细胞上的主要组织相容性 复合体（major histocompatibility complex，MHC)及抗原复合物；第二信号即共刺激信号 来源于T细胞上的CD28与抗原提呈细胞上的CD80/86的结合，对该信号通路进行调节，如 通过CTLA-4竞争性抑制⑶28与⑶80/86的结合，进而阻断第二信号通路，或者通过⑶3抗 体竞争性结合CD3/TCR复合物，从而阻断第一信号通路，可起到调节（抑制或激活）T细胞 活性的效果。基于此，涌现出大量已上市或在研的针对T细胞活化过程中所涉及的分子事 件而设计的药物，以下统称为T细胞活化调节剂。对T细胞活化程度进行检测，是基于细胞 水平的在开发此类药物时对其药效进行评估的重要指标。
[0003] 现有的在细胞水平对T细胞活化程度进行检测的方法分为以下几类：第一，检测 T细胞活化引起的T细胞增殖效应（如专利CN 101427135 A)，该方法需要使用原代T细 胞，材料来源相对困难且重复性没有保障，同时实验持续时间较长，通常为5-7天；第二，直 接检测T细胞活化过程中相关分子，例如mRNA或蛋白的表达（如专利CN 101427135 A、 US 6114129 A、US 5180662 A、CN 102811739 A 和 EP 2510948 A1，以及参考文献：Stohl W et al·，J Immunol. 1990Aug 15 ;145(4) :1078-87.)，该方法实验流程复杂，重复性相 对欠缺；第三，检测T细胞对ICAMl等粘附分子的粘附性（如专利CN 102811739 A和EP 2510948 Al)，该体系同样需要分离原代细胞并存在实验流程复杂，重复性相对欠缺等问 题；第四，检测T细胞活化过程中相关分子的启动子驱动的报告基因的表达（如专利US 5474897 A ;以及参考文献：Schwarz EM et al. ,Proc Natl Acad Sci U S A. 1993Aug 15 ; 90(16):7734-8. ；Qiu D et al., J Biol Chem. 1999May 7 ；274(19):13443-50. ；Yang XY et al.,J Biol Chem. 2000Febl8 ；275 (7):4541-4. ；ffeaver JR et al.,Mol Immunol. 2007Apr ； 44(11) :2813-9.)，此类方法相对上述三种方法而言，具有快速、简便、重复性较好的特点。
[0004] 基于报告基因系统的在细胞水平对T细胞活化程度进行检测的方法，国内 目前尚无相关专利报道。国外已有报道的第四类检测手段中，US 5474897 A所提 供的实验体系中采用了 IL-2启动子中的⑶28RE驱动报告基因的表达，⑶28RE位 于IL-2转录起始位点上游-164到-154位（参考文献：Butscher WG et al·，J Biol Chem. 1998Jan 2 ;273(1) :552-60.)，而 IL-2 启动子包括-300 位到 +40 位，含有除 CD28 之外的多个反应元件，IL-2的转录表达受到这些反应元件的共同调控，仅用CD28E不 能很好的模拟并反映在外界刺激作用下T细胞活化后内源IL-2的转录表达情况；第 四类检测手段中另一类技术手段（如参考文献：Schwarz EM et al.，Proc Natl Acad Sci U S A. 1993Aug 15 ；90 (16) : 7734-8. ；Qiu D et al. , J Biol Chem. 1999May 7； 274(19):13443-50. ；Yang XY et al. , J Biol Chem. 2000Feb 18 ；275 (7):4541-4. ；ffeaver JR et al.，Mol Immunol. 2007Apr ;44 (II) :2813-9.)，使用的为 phorbol-12-myristate 13-acetate (PMA)+ionomycin类的组合刺激方式，PMA可以自由进入细胞膜，直接作用于细 胞内的PKC(蛋白激酶C) ;in〇n〇mycin为钙离子载体，使细胞外Ca2+内流，PKC和Ca2+产 生的信号共同作用于核内的转录因子，启动T细胞活化相关基因（如IL-2)的转录和蛋白 合成；该刺激方式作用快，但由于直接作用于T细胞活化信号通路的中下游，无法模拟肿瘤 免疫、自身免疫疾病及移植排斥反应等病理条件下T细胞的活化方式。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供了一种T细胞活化调节剂生 物学活性的报告基因检测方法，T细胞活化调节剂可促进或抑制T细胞激活，若此类调节 剂具备生物学活性，可通过检测此类调节剂来检测到T细胞活化程度的变化；本发明根据 T细胞活化需要第一信号和第二信号的同时激活，且该过程中的关键事件为IL-2表达上调 的机理，利用在第一信号和第二信号同时激活时可大量表达IL-2的T细胞Jurkat，全基因 合成IL-2启动子-329到+48位，将其连接至报告基因萤光素酶（Luciferase)上游，构建 IL-2启动子驱动的报告基因萤光素酶表达载体，将该表达载体电转染Jurkat细胞，通过转 染效率检测、加压筛选，获得带有IL-2启动子驱动的萤光素酶表达框架的稳定细胞株（以 下简称为Jurkat IL-2P Luc细胞株），在此基础上，使用CD3抗体和表达CD80/86的Raji 细胞作为上游刺激，对该细胞株的效应功能进行检测，并对该检测体系进行优化，对其特异 性和重复性进行了评估。本发明具有检测快速、操作简便、重复性好和灵敏度高的特点。
[0006] 为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
[0007] 本发明提供了一种T细胞活化调节剂生物学活性的报告基因检测方法；包括：
[0008] 步骤一 ：IL_2启动子驱动的报告基因载体的构建；
[0009] 步骤二：带有IL-2启动子驱动的报告基因的稳定细胞株的构建；
[0010] 步骤三：对T细胞活化调节剂的生物学活性进行检测；其检测方法包括：
[0011] 在⑶3抗体和表达⑶80/86的B细胞系Raji共同作用下，上述稳定细胞株被激 活，IL-2启动子驱动的萤光素酶报告基因表达上调，同步加入T细胞活化调节剂，通过检测 报告基因表达量，定量评估T细胞活化调节剂生物学活性。
[0012] 优选地，所述步骤一中，所述IL-2启动子驱动的报告基因载体的构建方法包括： 将IL-2启动子，从-329到+48位，构建至萤光素酶报告基因上游，用以驱动IL-2表达。
[0013] 更加优选地，所述步骤二中，带有IL-2启动子驱动的报告基因的所述稳定细胞株 的构建方法包括：所述细胞株为T细胞，T细胞被激活后，IL-2表达上调，同时，T细胞株转 染了 IL-2启动子驱动的萤光素酶报告基因，通过加压筛选和单克隆分离培养，用于T细胞 活化调节剂的生物学活性检测；
[0014] 其中，所述Jurkat为人急性T淋巴细胞白血病细胞；
[0015] 所述Raji为人B淋巴细胞瘤细胞；
[0016] 所述 PBMC，peripheral blood mononuclear cell 为外周血单个核细胞；
[0017] 所述 CD 为 cluster of differentiation，决定族分子；
[0018] 所述 PHA，phytohaemagglutinin 为植物血凝素；
[0019] 所述 PMA，phorbol-12-myristate 13-acetate 为佛波醋；
[0020] 所述Ionomycin为离子霉素；
[0021] 所述 IL-2, interleukin 2 为白细胞介素 2 ;
[0022] 所述 CD28RE，CD28response element 为 CD28 反应元件；
[0023] 所述 CTLA4, cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4 为细胞毒 T 淋巴细 胞相关抗原4 ;
[0024] 所述 Fe, crystalline fragment 为结晶片段。
[0025] 本发明与现有技术相比具有以下优点：
[0026] 国内尚无用报告基因检测法对T细胞活化调节剂生物学活性进行定量评估的实 验体系相关报道，本发明填补了这一空白；与使用原代T细胞进行检测的实验体系相比，本 发明所提供的检测方法，无需使用人外周血，解决了目前人外周血来源困难且不同人来源 的外周血所对应的实验结果一致性较差这一难题；同时无需分离原代T细胞，避免了繁琐 的PBMC分离及T细胞磁珠分选等流程，缩短实验流程，简化实验操作步骤；所使用的上游刺 激为⑶3抗体和表达⑶80/86的Raji细胞，与传统的PHA或PMA+ionomycin的刺激模式相 比，本发明所采用的这种刺激方式，更接近肿瘤免疫、自身免疫疾病及移植排斥反应等病理 情况下体内T细胞激活时的真实情况；同时我们选用了 T细胞活化过程中的关键事件IL-2 表达为检验点，选取IL-2启动子-329到+48位，用以驱动报告基因萤光素酶的表达，相较 于已有报道的实验体系中所采用的CD28RE (位于IL-2转录起始位点上游-164到-154位）， 其所含有的IL-2转录因子作用位点更为全面，能更加全面真实的反映 IL-2在转录水平激 活的状态，定量评估T细胞活化程度，进而对T细胞活化调节剂生物学活性进行定量检测； 该体系具有快速、操作简便、重复性好的特点，对T细胞活化调节剂质量控制和临床应用具 有重要意义。
[0027] 说明书附图
[0028] 图1示例性地示出了未转染质粒的Jurkat细胞通过流式细胞术检测的GFP表达 情况示意图；
[0029] 图2示例性地示出了转染GFP的Jurkat细胞通过流式细 胞术检测的GFP表达情 况示意图；
[0030] 图3示例性地示出了检测⑶3抗体和Raji共刺激后，不同克隆萤光素酶表达情况 示意图；
[0031] 图4示例性地示出了 CTLA4-Fc融合蛋白抑制IL-2表达剂量依赖曲线示意图；
[0032] 图5示例性地示出了初步方法学验证-特异性示意图；
[0033] 图6示例性地示出了初步方法学验证-重复性示意图。
【具体实施方式】
[0034] 以下结合附图和实施例详述本发明。
[0035] I. pGL4. 15-IL-2P 质粒的构建
[0036] I. 1全基因合成IL-2启动子（-329到+48位），其中上游带有KpnI酶切位点 GGTACC，下游带HindIII酶切位点AAGCTT，全序列如下：
[0037] GGTACCGAAAATTTTCTGAGTTACTTTTGTATCCCCACCCCCTTAAAGAAAGGA
[0038] GGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTTAATTGCATGAATTAGAGCTATCACCT
[0039] AAGTGTGGGCTAATGTAACAAAGAGGGATTTCACCTACATCCATTCAGTCAGTC
[0040] TTTGGGGGTTTAAAGAATTCCAAAGAGTCATCAGAAGAGGAAAAATGAAGGT
[0041] AATGTTTTTTCAGACAGGTAAAGTCTTTGAAAATATGTGTAATATGTAAAACATT
[0042] TTGACACCCCCATAATATTTTTCCAGAATTAACAGTATAAATTGCATCTCTTGTTC
[0043] AAGAGTTCCCTATCACTCTCTTTAATCACTACTCACAGTAACCTCAACTCCTGCCA
[0044] CAAAGCTT
[0045] 1. 2全基因合成产物与pGL4. 15质粒（购自Promega,货号E6701)经KpnI和 HindIII酶切后，将IL-2启动子连入pGL4. 15,构建pGL4. 15-IL-2P质粒，送北京诺赛基因 组研宄中心有限公司测序，完全正确。
[0046] 2稳定细胞株的筛选
[0047] 2. 1 转染
[0048] (1)提前2天，复苏Jurkat细胞（购自ATCC，货号TIB-152);
[0049] (2)取生长培养基（RPMI1640(购自 GIBC0,货号 61870-036500ML)+10% 牛血清 (购自ExCell，货号FDN500)+1%双抗（购自Life，货号15070-063))加入6孔板的2孔中， 3ml/孔，在培养箱中预热；另取220ul Cell line Nucleofector Solution V(购自 Lonza， 货号VCA-1003))在培养箱中预热IOmin ;
[0050] (3)分别取5ug pGL4. 15-IL-2P质粒，5ug pmaxGFP质粒（转染对照）于2支无菌 1.5ml离心管中备用；
[0051] (4) Nucleofector 电转仪（Lonza)开机，选择程序 X-001 ;
[0052] (5) Jurkat细胞计数，分别取300万个细胞于2支无菌I. 5ml离心管中，90g离心 5min，弃尽上清；
[0053] (6)每管加入 IOOul 预热的 Cell line Nucleofector Solution V，轻吹加入含有 质粒的无菌I. 5ml离心管中，再轻吹加入电转杯中；
[0054] (7)将电转杯放入电转仪，按'X'键，完成电转后，用试剂盒提供的吸管取预热的 生长培养基加入电转杯底部略吹吸后吸出细胞，加至6孔板培养基中，培养24h。
[0055] 2. 2检测转染效率
[0056] 取转染pmaxGFP质粒的细胞10万个，流式细胞术检测转染效率。转染后位于1通 道的细胞的荧光强度明显增强，转染率高达88. 5%，转染有效（图1)。
[0057] 2. 3加压筛选及Jurkat IL-2P Luc单克隆细胞株分离培养
[0058] (1)转染后24h，加入选择培养基（生长培养基+250ug/ml潮霉素），筛选3周，每 3-4天更换一次选择培养基；
[0059] (2)待对照组细胞全死，筛选完成。计数，选择培养基将细胞稀释至30个细胞 /15ml，150ul/孔铺至U底96孔板；
[0060] (3)每3-4天更换一次选择培养基，培养2周，显微镜下观察，挑选有有单克隆生长 的细胞孔，并转移至24孔板，1周后再传至6孔板扩大培养。
[0061] 3.效应功能检测
[0062] 3. IT细胞活化检测体系的建立
[0063] (1)计数Jurkat IL-2P Luc细胞，选择培养基将细胞稀释至200万个细胞/ml ;
[0064] (2)计数Raji细胞，选择培养基将细胞稀释至200万个细胞/ml ;
[0065] (3)将上述两种稀释好的细胞等体积混勾，按照IOOul/孔的密度铺至V底96孔 板；
[0066] (4)用选择培养基将CD3抗体（购自BD Pharmingen，货号：555337)稀释至终浓 度为0. 4ug/ml，按照IOOul/孔的体积加至上述V底96孔板中，吹吸使其与细胞混匀；
[0067] (5)细胞于二氧化碳培养箱中培养6h ;
[0068] (6)3000rpm离心5min，吸去细胞上清，50ul/孔加入裂解液Glo-Iysis(购自 Promega，货号：E2661)，室温裂解 5min ;
[0069] (6)吸取IOul细胞裂解物转入白色384孔板（购自PerkinElmer，型号： ProxiPlate_384Plus)，加入萤光素酶底物 Bright-Glo Luciferase Assay System(购自 Promega，货号E2610)，IOul/孔，反应5min，检测萤光素酶活性。
[0070] ⑶3抗体和Raji共刺激细胞后使细胞被激活而表达IL-2,与无刺激的对照组比较 IL-2表达量明显增高，说明⑶3抗体和Raji共刺激可以激活该转染细胞使其表达IL-2,同 步刺激报告基因萤光素酶的表达（图2)。
[0071] 3. 2T细胞活化调节剂（以CTLA4-FC融合蛋白为例）生物学活性检测体系的建立
[0072] 筛选得到的IL-2P Luc阳性细胞株，根据3. 1实验结果，选取1号克隆进行后续实 验。检测对CTLA4-FC融合蛋白的反应性，细胞密度为10万个/孔，CTLA4-FC起始浓度为 67ug/ml，10倍比系列稀释13个梯度，共14个浓度点。CTLA4-FC作用6小时检测萤光素酶 活性。
[0073] 加入梯度稀释的CTLA4-FC融合蛋白后，随着CTLA4-FC浓度增大，萤光强度逐渐减 小，即IL-2表达量逐渐减少，可见细胞的活化率降低，说明该体系可用于定量检测T细胞活 化调节剂的生物学活性（图3)。
[0074] 4初步方法学验证
[0075] 选用无关IgG作为阴性对照，评估该方法的特异性；对同一批次的CTLA4-FC融合 蛋白进行同次多样品检测，评估该方法的重复性。
[0076] 结果显示，加入无关IgG，未观察到T细胞活化的抑制，加入CTLA4-FC融合蛋白后， T细胞活化被显著抑制（图4)。重复性结果显示，CV% (变异系数）为9. 32%，具有较好 的重复性（表1，图5)。
[0077] 表1、初步方法学验证-重复性
[0078]
[0079] 对于本领域的普通技术人员而言，具体实施例只是对本发明进行了示例性描述， 显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案 进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合 的，均在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种T细胞活化调节剂生物学活性的报告基因检测方法；包括： 步骤一 ：IL-2启动子驱动的报告基因载体的构建； 步骤二：带有IL-2启动子驱动的报告基因的稳定细胞株的构建； 步骤三：对T细胞活化调节剂的生物学活性进行检测，其检测方法包括： 在⑶3抗体和表达⑶80/86的B细胞系Raji共同作用下，上述稳定细胞株被激活，IL-2 启动子驱动的萤光素酶报告基因表达上调，同步加入T细胞活化调节剂，通过检测报告基 因表达量，定量评估T细胞活化调节剂生物学活性。2. 根据权利要求1所述的T细胞活化调节剂生物学活性的报告基因检测方法，所述步 骤一中，所述IL-2启动子驱动的报告基因载体的构建方法包括：将IL-2启动子构建至萤光 素酶报告基因上游，用以驱动IL-2表达。3. 根据权利要求1所述的T细胞活化调节剂生物学活性的报告基因检测方法，所述步 骤二中，带有IL-2启动子驱动的报告基因的所述稳定细胞株的构建方法包括：所述细胞株 为T细胞，T细胞被激活后，IL-2表达上调，同时，T细胞株转染了IL-2启动子驱动的萤光素 酶报告基因，通过加压筛选和单克隆分离培养，用于T细胞活化调节剂的生物学活性检测。
【专利摘要】本发明涉及生物制药技术领域，公开了一种T细胞活化调节剂生物学活性的报告基因检测方法；本发明将一个IL-2启动子驱动的报告基因载体转染Jurkat细胞，经加压筛选和单克隆分离培养得到稳定单克隆细胞株Jurkat IL-2P Luc。加入CD3抗体和表达共刺激分子CD80/86的Raji细胞，同时激活T细胞活化所需的第一通路和第二通路，使T细胞活化，同时加入待测调节剂，检测IL-2启动子驱动的报告基因萤光素酶的表达。通过所加调节剂用量与萤光素酶表达量的剂量依赖关系对T细胞活化调节剂的生物学活性进行定量检测。本发明操作简单，灵敏度高，可重复性好，对于T细胞活化调节剂质量控制和临床应用具有重要意义。
【IPC分类】C12N5/10, C12Q1/68, C12Q1/02, C12N15/85
【公开号】CN104894273
【申请号】CN201510319461
【发明人】汪瑞, 张琼, 梁爽, 白义, 白先宏
【申请人】北京东方百泰生物科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月11日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制药技术领域，具体地说是涉及一种T细胞活化调节剂生物学活 性的报告基因检测方法。
【背景技术】
[0002] 胸腺依赖性淋巴细胞（Thymus-dependent lymphocyte，简称T细胞）功能的抑制 或激活在肿瘤免疫、自身免疫疾病及移植排斥反应中起着极为重要的作用，T细胞活化，不 仅需要T细胞受体的第一信号，而且需要第二信号。第一信号来自于T细胞上的⑶3/TCR(T cell receptor，T细胞受体）复合物与抗原提呈细胞或其它种类细胞上的主要组织相容性 复合体（major histocompatibility complex，MHC)及抗原复合物；第二信号即共刺激信号 来源于T细胞上的CD28与抗原提呈细胞上的CD80/86的结合，对该信号通路进行调节，如 通过CTLA-4竞争性抑制⑶28与⑶80/86的结合，进而阻断第二信号通路，或者通过⑶3抗 体竞争性结合CD3/TCR复合物，从而阻断第一信号通路，可起到调节（抑制或激活）T细胞 活性的效果。基于此，涌现出大量已上市或在研的针对T细胞活化过程中所涉及的分子事 件而设计的药物，以下统称为T细胞活化调节剂。对T细胞活化程度进行检测，是基于细胞 水平的在开发此类药物时对其药效进行评估的重要指标。
[0003] 现有的在细胞水平对T细胞活化程度进行检测的方法分为以下几类：第一，检测 T细胞活化引起的T细胞增殖效应（如专利CN 101427135 A)，该方法需要使用原代T细 胞，材料来源相对困难且重复性没有保障，同时实验持续时间较长，通常为5-7天；第二，直 接检测T细胞活化过程中相关分子，例如mRNA或蛋白的表达（如专利CN 101427135 A、 US 6114129 A、US 5180662 A、CN 102811739 A 和 EP 2510948 A1，以及参考文献：Stohl W et al·，J Immunol. 1990Aug 15 ;145(4) :1078-87.)，该方法实验流程复杂，重复性相 对欠缺；第三，检测T细胞对ICAMl等粘附分子的粘附性（如专利CN 102811739 A和EP 2510948 Al)，该体系同样需要分离原代细胞并存在实验流程复杂，重复性相对欠缺等问 题；第四，检测T细胞活化过程中相关分子的启动子驱动的报告基因的表达（如专利US 5474897 A ;以及参考文献：Schwarz EM et al. ,Proc Natl Acad Sci U S A. 1993Aug 15 ; 90(16):7734-8. ；Qiu D et al., J Biol Chem. 1999May 7 ；274(19):13443-50. ；Yang XY et al.,J Biol Chem. 2000Febl8 ；275 (7):4541-4. ；ffeaver JR et al.,Mol Immunol. 2007Apr ； 44(11) :2813-9.)，此类方法相对上述三种方法而言，具有快速、简便、重复性较好的特点。
[0004] 基于报告基因系统的在细胞水平对T细胞活化程度进行检测的方法，国内 目前尚无相关专利报道。国外已有报道的第四类检测手段中，US 5474897 A所提 供的实验体系中采用了 IL-2启动子中的⑶28RE驱动报告基因的表达，⑶28RE位 于IL-2转录起始位点上游-164到-154位（参考文献：Butscher WG et al·，J Biol Chem. 1998Jan 2 ;273(1) :552-60.)，而 IL-2 启动子包括-300 位到 +40 位，含有除 CD28 之外的多个反应元件，IL-2的转录表达受到这些反应元件的共同调控，仅用CD28E不 能很好的模拟并反映在外界刺激作用下T细胞活化后内源IL-2的转录表达情况；第 四类检测手段中另一类技术手段（如参考文献：Schwarz EM et al.，Proc Natl Acad Sci U S A. 1993Aug 15 ；90 (16) : 7734-8. ；Qiu D et al. , J Biol Chem. 1999May 7； 274(19):13443-50. ；Yang XY et al. , J Biol Chem. 2000Feb 18 ；275 (7):4541-4. ；ffeaver JR et al.，Mol Immunol. 2007Apr ;44 (II) :2813-9.)，使用的为 phorbol-12-myristate 13-acetate (PMA)+ionomycin类的组合刺激方式，PMA可以自由进入细胞膜，直接作用于细 胞内的PKC(蛋白激酶C) ;in〇n〇mycin为钙离子载体，使细胞外Ca2+内流，PKC和Ca2+产 生的信号共同作用于核内的转录因子，启动T细胞活化相关基因（如IL-2)的转录和蛋白 合成；该刺激方式作用快，但由于直接作用于T细胞活化信号通路的中下游，无法模拟肿瘤 免疫、自身免疫疾病及移植排斥反应等病理条件下T细胞的活化方式。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供了一种T细胞活化调节剂生 物学活性的报告基因检测方法，T细胞活化调节剂可促进或抑制T细胞激活，若此类调节 剂具备生物学活性，可通过检测此类调节剂来检测到T细胞活化程度的变化；本发明根据 T细胞活化需要第一信号和第二信号的同时激活，且该过程中的关键事件为IL-2表达上调 的机理，利用在第一信号和第二信号同时激活时可大量表达IL-2的T细胞Jurkat，全基因 合成IL-2启动子-329到+48位，将其连接至报告基因萤光素酶（Luciferase)上游，构建 IL-2启动子驱动的报告基因萤光素酶表达载体，将该表达载体电转染Jurkat细胞，通过转 染效率检测、加压筛选，获得带有IL-2启动子驱动的萤光素酶表达框架的稳定细胞株（以 下简称为Jurkat IL-2P Luc细胞株），在此基础上，使用CD3抗体和表达CD80/86的Raji 细胞作为上游刺激，对该细胞株的效应功能进行检测，并对该检测体系进行优化，对其特异 性和重复性进行了评估。本发明具有检测快速、操作简便、重复性好和灵敏度高的特点。
[0006] 为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
[0007] 本发明提供了一种T细胞活化调节剂生物学活性的报告基因检测方法；包括：
[0008] 步骤一 ：IL_2启动子驱动的报告基因载体的构建；
[0009] 步骤二：带有IL-2启动子驱动的报告基因的稳定细胞株的构建；
[0010] 步骤三：对T细胞活化调节剂的生物学活性进行检测；其检测方法包括：
[0011] 在⑶3抗体和表达⑶80/86的B细胞系Raji共同作用下，上述稳定细胞株被激 活，IL-2启动子驱动的萤光素酶报告基因表达上调，同步加入T细胞活化调节剂，通过检测 报告基因表达量，定量评估T细胞活化调节剂生物学活性。
[0012] 优选地，所述步骤一中，所述IL-2启动子驱动的报告基因载体的构建方法包括： 将IL-2启动子，从-329到+48位，构建至萤光素酶报告基因上游，用以驱动IL-2表达。
[0013] 更加优选地，所述步骤二中，带有IL-2启动子驱动的报告基因的所述稳定细胞株 的构建方法包括：所述细胞株为T细胞，T细胞被激活后，IL-2表达上调，同时，T细胞株转 染了 IL-2启动子驱动的萤光素酶报告基因，通过加压筛选和单克隆分离培养，用于T细胞 活化调节剂的生物学活性检测；
[0014] 其中，所述Jurkat为人急性T淋巴细胞白血病细胞；
[0015] 所述Raji为人B淋巴细胞瘤细胞；
[0016] 所述 PBMC，peripheral blood mononuclear cell 为外周血单个核细胞；
[0017] 所述 CD 为 cluster of differentiation，决定族分子；
[0018] 所述 PHA，phytohaemagglutinin 为植物血凝素；
[0019] 所述 PMA，phorbol-12-myristate 13-acetate 为佛波醋；
[0020] 所述Ionomycin为离子霉素；
[0021] 所述 IL-2, interleukin 2 为白细胞介素 2 ;
[0022] 所述 CD28RE，CD28response element 为 CD28 反应元件；
[0023] 所述 CTLA4, cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4 为细胞毒 T 淋巴细 胞相关抗原4 ;
[0024] 所述 Fe, crystalline fragment 为结晶片段。
[0025] 本发明与现有技术相比具有以下优点：
[0026] 国内尚无用报告基因检测法对T细胞活化调节剂生物学活性进行定量评估的实 验体系相关报道，本发明填补了这一空白；与使用原代T细胞进行检测的实验体系相比，本 发明所提供的检测方法，无需使用人外周血，解决了目前人外周血来源困难且不同人来源 的外周血所对应的实验结果一致性较差这一难题；同时无需分离原代T细胞，避免了繁琐 的PBMC分离及T细胞磁珠分选等流程，缩短实验流程，简化实验操作步骤；所使用的上游刺 激为⑶3抗体和表达⑶80/86的Raji细胞，与传统的PHA或PMA+ionomycin的刺激模式相 比，本发明所采用的这种刺激方式，更接近肿瘤免疫、自身免疫疾病及移植排斥反应等病理 情况下体内T细胞激活时的真实情况；同时我们选用了 T细胞活化过程中的关键事件IL-2 表达为检验点，选取IL-2启动子-329到+48位，用以驱动报告基因萤光素酶的表达，相较 于已有报道的实验体系中所采用的CD28RE (位于IL-2转录起始位点上游-164到-154位）， 其所含有的IL-2转录因子作用位点更为全面，能更加全面真实的反映 IL-2在转录水平激 活的状态，定量评估T细胞活化程度，进而对T细胞活化调节剂生物学活性进行定量检测； 该体系具有快速、操作简便、重复性好的特点，对T细胞活化调节剂质量控制和临床应用具 有重要意义。
[0027] 说明书附图
[0028] 图1示例性地示出了未转染质粒的Jurkat细胞通过流式细胞术检测的GFP表达 情况示意图；
[0029] 图2示例性地示出了转染GFP的Jurkat细胞通过流式细 胞术检测的GFP表达情 况示意图；
[0030] 图3示例性地示出了检测⑶3抗体和Raji共刺激后，不同克隆萤光素酶表达情况 示意图；
[0031] 图4示例性地示出了 CTLA4-Fc融合蛋白抑制IL-2表达剂量依赖曲线示意图；
[0032] 图5示例性地示出了初步方法学验证-特异性示意图；
[0033] 图6示例性地示出了初步方法学验证-重复性示意图。
【具体实施方式】
[0034] 以下结合附图和实施例详述本发明。
[0035] I. pGL4. 15-IL-2P 质粒的构建
[0036] I. 1全基因合成IL-2启动子（-329到+48位），其中上游带有KpnI酶切位点 GGTACC，下游带HindIII酶切位点AAGCTT，全序列如下：
[0037] GGTACCGAAAATTTTCTGAGTTACTTTTGTATCCCCACCCCCTTAAAGAAAGGA
[0038] GGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTTAATTGCATGAATTAGAGCTATCACCT
[0039] AAGTGTGGGCTAATGTAACAAAGAGGGATTTCACCTACATCCATTCAGTCAGTC
[0040] TTTGGGGGTTTAAAGAATTCCAAAGAGTCATCAGAAGAGGAAAAATGAAGGT
[0041] AATGTTTTTTCAGACAGGTAAAGTCTTTGAAAATATGTGTAATATGTAAAACATT
[0042] TTGACACCCCCATAATATTTTTCCAGAATTAACAGTATAAATTGCATCTCTTGTTC
[0043] AAGAGTTCCCTATCACTCTCTTTAATCACTACTCACAGTAACCTCAACTCCTGCCA
[0044] CAAAGCTT
[0045] 1. 2全基因合成产物与pGL4. 15质粒（购自Promega,货号E6701)经KpnI和 HindIII酶切后，将IL-2启动子连入pGL4. 15,构建pGL4. 15-IL-2P质粒，送北京诺赛基因 组研宄中心有限公司测序，完全正确。
[0046] 2稳定细胞株的筛选
[0047] 2. 1 转染
[0048] (1)提前2天，复苏Jurkat细胞（购自ATCC，货号TIB-152);
[0049] (2)取生长培养基（RPMI1640(购自 GIBC0,货号 61870-036500ML)+10% 牛血清 (购自ExCell，货号FDN500)+1%双抗（购自Life，货号15070-063))加入6孔板的2孔中， 3ml/孔，在培养箱中预热；另取220ul Cell line Nucleofector Solution V(购自 Lonza， 货号VCA-1003))在培养箱中预热IOmin ;
[0050] (3)分别取5ug pGL4. 15-IL-2P质粒，5ug pmaxGFP质粒（转染对照）于2支无菌 1.5ml离心管中备用；
[0051] (4) Nucleofector 电转仪（Lonza)开机，选择程序 X-001 ;
[0052] (5) Jurkat细胞计数，分别取300万个细胞于2支无菌I. 5ml离心管中，90g离心 5min，弃尽上清；
[0053] (6)每管加入 IOOul 预热的 Cell line Nucleofector Solution V，轻吹加入含有 质粒的无菌I. 5ml离心管中，再轻吹加入电转杯中；
[0054] (7)将电转杯放入电转仪，按'X'键，完成电转后，用试剂盒提供的吸管取预热的 生长培养基加入电转杯底部略吹吸后吸出细胞，加至6孔板培养基中，培养24h。
[0055] 2. 2检测转染效率
[0056] 取转染pmaxGFP质粒的细胞10万个，流式细胞术检测转染效率。转染后位于1通 道的细胞的荧光强度明显增强，转染率高达88. 5%，转染有效（图1)。
[0057] 2. 3加压筛选及Jurkat IL-2P Luc单克隆细胞株分离培养
[0058] (1)转染后24h，加入选择培养基（生长培养基+250ug/ml潮霉素），筛选3周，每 3-4天更换一次选择培养基；
[0059] (2)待对照组细胞全死，筛选完成。计数，选择培养基将细胞稀释至30个细胞 /15ml，150ul/孔铺至U底96孔板；
[0060] (3)每3-4天更换一次选择培养基，培养2周，显微镜下观察，挑选有有单克隆生长 的细胞孔，并转移至24孔板，1周后再传至6孔板扩大培养。
[0061] 3.效应功能检测
[0062] 3. IT细胞活化检测体系的建立
[0063] (1)计数Jurkat IL-2P Luc细胞，选择培养基将细胞稀释至200万个细胞/ml ;
[0064] (2)计数Raji细胞，选择培养基将细胞稀释至200万个细胞/ml ;
[0065] (3)将上述两种稀释好的细胞等体积混勾，按照IOOul/孔的密度铺至V底96孔 板；
[0066] (4)用选择培养基将CD3抗体（购自BD Pharmingen，货号：555337)稀释至终浓 度为0. 4ug/ml，按照IOOul/孔的体积加至上述V底96孔板中，吹吸使其与细胞混匀；
[0067] (5)细胞于二氧化碳培养箱中培养6h ;
[0068] (6)3000rpm离心5min，吸去细胞上清，50ul/孔加入裂解液Glo-Iysis(购自 Promega，货号：E2661)，室温裂解 5min ;
[0069] (6)吸取IOul细胞裂解物转入白色384孔板（购自PerkinElmer，型号： ProxiPlate_384Plus)，加入萤光素酶底物 Bright-Glo Luciferase Assay System(购自 Promega，货号E2610)，IOul/孔，反应5min，检测萤光素酶活性。
[0070] ⑶3抗体和Raji共刺激细胞后使细胞被激活而表达IL-2,与无刺激的对照组比较 IL-2表达量明显增高，说明⑶3抗体和Raji共刺激可以激活该转染细胞使其表达IL-2,同 步刺激报告基因萤光素酶的表达（图2)。
[0071] 3. 2T细胞活化调节剂（以CTLA4-FC融合蛋白为例）生物学活性检测体系的建立
[0072] 筛选得到的IL-2P Luc阳性细胞株，根据3. 1实验结果，选取1号克隆进行后续实 验。检测对CTLA4-FC融合蛋白的反应性，细胞密度为10万个/孔，CTLA4-FC起始浓度为 67ug/ml，10倍比系列稀释13个梯度，共14个浓度点。CTLA4-FC作用6小时检测萤光素酶 活性。
[0073] 加入梯度稀释的CTLA4-FC融合蛋白后，随着CTLA4-FC浓度增大，萤光强度逐渐减 小，即IL-2表达量逐渐减少，可见细胞的活化率降低，说明该体系可用于定量检测T细胞活 化调节剂的生物学活性（图3)。
[0074] 4初步方法学验证
[0075] 选用无关IgG作为阴性对照，评估该方法的特异性；对同一批次的CTLA4-FC融合 蛋白进行同次多样品检测，评估该方法的重复性。
[0076] 结果显示，加入无关IgG，未观察到T细胞活化的抑制，加入CTLA4-FC融合蛋白后， T细胞活化被显著抑制（图4)。重复性结果显示，CV% (变异系数）为9. 32%，具有较好 的重复性（表1，图5)。
[0077] 表1、初步方法学验证-重复性
[0078]
[0079] 对于本领域的普通技术人员而言，具体实施例只是对本发明进行了示例性描述， 显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案 进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合 的，均在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种T细胞活化调节剂生物学活性的报告基因检测方法；包括： 步骤一 ：IL-2启动子驱动的报告基因载体的构建； 步骤二：带有IL-2启动子驱动的报告基因的稳定细胞株的构建； 步骤三：对T细胞活化调节剂的生物学活性进行检测，其检测方法包括： 在⑶3抗体和表达⑶80/86的B细胞系Raji共同作用下，上述稳定细胞株被激活，IL-2 启动子驱动的萤光素酶报告基因表达上调，同步加入T细胞活化调节剂，通过检测报告基 因表达量，定量评估T细胞活化调节剂生物学活性。2. 根据权利要求1所述的T细胞活化调节剂生物学活性的报告基因检测方法，所述步 骤一中，所述IL-2启动子驱动的报告基因载体的构建方法包括：将IL-2启动子构建至萤光 素酶报告基因上游，用以驱动IL-2表达。3. 根据权利要求1所述的T细胞活化调节剂生物学活性的报告基因检测方法，所述步 骤二中，带有IL-2启动子驱动的报告基因的所述稳定细胞株的构建方法包括：所述细胞株 为T细胞，T细胞被激活后，IL-2表达上调，同时，T细胞株转染了IL-2启动子驱动的萤光素 酶报告基因，通过加压筛选和单克隆分离培养，用于T细胞活化调节剂的生物学活性检测。
【专利摘要】本发明涉及生物制药技术领域，公开了一种T细胞活化调节剂生物学活性的报告基因检测方法；本发明将一个IL-2启动子驱动的报告基因载体转染Jurkat细胞，经加压筛选和单克隆分离培养得到稳定单克隆细胞株Jurkat IL-2P Luc。加入CD3抗体和表达共刺激分子CD80/86的Raji细胞，同时激活T细胞活化所需的第一通路和第二通路，使T细胞活化，同时加入待测调节剂，检测IL-2启动子驱动的报告基因萤光素酶的表达。通过所加调节剂用量与萤光素酶表达量的剂量依赖关系对T细胞活化调节剂的生物学活性进行定量检测。本发明操作简单，灵敏度高，可重复性好，对于T细胞活化调节剂质量控制和临床应用具有重要意义。
【IPC分类】C12N5/10, C12Q1/68, C12Q1/02, C12N15/85
【公开号】CN104894273
【申请号】CN201510319461
【发明人】汪瑞, 张琼, 梁爽, 白义, 白先宏
【申请人】北京东方百泰生物科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月11日
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