海水及沉积物中多环芳烃污染的检测方法
海水及沉积物中多环芳烃污染的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及海水及沉积物的生物检测方法，尤其是涉及一种应用沙蚕P450基因 标记检测海水及沉积物中多环芳烃污染的方法。
【背景技术】
[0002] 多环芳香烃类（PAHs)污染是海水及沉积物中主要污染之一，现有的检测海水及 沉积物中多环芳烃污染的方法，大都为化学检测方法，如：
[0003] 紫外和荧光分光光度法{夏星辉，周劲松，余晖，等.黄河水体石油类污染物生 物降解模拟实验研宄[J].环境科学，2004, 25 (1) : 103-106. }
[0004] 薄层色谱（TLC)法{汪瑗，朱若华，陈惠.薄层色谱分析法及其进展[J].大学 化学，2006, 21(3) :34-40. }
[0005] 气相色谱一质谱联用法（GC - MS) {王摆，高士博，董颖，等.6种苯系物对球等 鞭金藻和新月菱形藻的生长抑制[J].生态毒理学报，2014, 2:013.}
[0006] 高效液相色谱法（HPLC) {周建科，龙堃，彭静.微萃取瓶富集-高效液相色谱 法测定海水中多环芳烃[J].分析科学学报，2010, 26^):709-712. }等化学方法及微流 控芯片{Hu W, Jun-feng W E I, Gu〇-xia Z. Application of microfluidics in aquatic environmental pollution analysis[J]. Yingyong Shengtai Xuebao, 2014, 25(4). }
[0007] 中国专利CN103898162A公开一种检测环境中多环芳烃化学物的质粒及应用，涉 及分子生物学及环境生物技术领域。该发明通过提取人源性AHR基因启动子，以含萤火虫 荧光素酶、海肾荧光素酶双报告基因的CV060质粒为载体，插入特定序列的AHR基因启动 子，构建了含AHR基因启动子的内参内置型双荧光素酶报告基因的重组慢病毒质粒。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种应用沙蚕P450基因标记检测海水及沉积物中多环芳 烃污染的方法。
[0009] 本发明所述应用沙蚕P450基因标记检测海水及沉积物中多环芳烃污染的方法的 具体步骤如下：
[0010] 1)利用沙蚕三个细胞色素 P450基因设计引物，运用荧光定量PCR的方法检测所 述沙蚕三个细胞色素 P450基因的表达情况，用于检测海水及沉积物中多环芳烃的污染，所 述沙蚕三个细胞色素 P450基因为CYP4BB2、CYP423A1和CYP424A1 ;
[0011] 所述沙蚕三个细胞色素 P450基因的全序列如下：
[0012] <110〉国家海洋局第三海洋研究所 <120〉海水及沉积物中多环芳烃污染的检测方法 <130> 2015 <160> 3 <170> PatentIn version 3. 3 <210〉 1 <211> 1809 <212〉 DNA <213〉多齿围沙香（Perinereis mintia) <400〉 1 gagtttccat tcatgcttta ggaagcactg ctgtacattc aagtgtggtt tagcccactc 60 acgaaatagc atttgaacat gaatccattg atgacatcag ttgcagtggt tttattggtg 120 ccagtgctat accatgttta ccaatacatc acctggatat acaggacatg gtttgtcatt 180 rgaaaggctg tgaacaaatt cccrggggat ccrgtgaaat ggycctatgg gaacctacac 240 caaactgact tcagcgaaaa acttttccct cacatgaaag aaatggcgac aaagttcaac 300 agaaagtggc gacagtggtt cggacccttc gttccgtttg tcaccttatg tcatccagac 360 actgtcaaaa tcttggtcaa gactgaggaa ccaaagttta ttgaaggaaa tagtttatac 420 atccttggtg aaccttggct tggtgatggg ctactactca ccagtggacc aaagtggaaa 480 agaaacagga gactcttaac acctgcgttt cattttgaca ttcttaaaag ttacattgct 540 gtttacaatg agcagttgga aatattgctg aaaaaatgga cagaaaaatg ctctactggt 600 gaaagttttg aaatccagac tgacgtctgt ttgtgtacgc tgagcatcwt tttgcagtgt 660 gcgttctcat atggtgaaaa cattcaacaa gcaggcgaac gtcatccata tgctgccgct 720 gtcctggaaa tgtcacactt gatggtcaaa agggctttaa accctctggt ccgcatgagt 780 aaatttctgt atggcctcac cgctaacgga cgtctattct tcaaaaactg tgactatgtc 840 catgaaatag ctgaaaatgt catttccctg aggaggaaag cattgcaaga gaatcctgat 900
[0013] gccttgaaag acaagaaata cttggacttc ctggacattt tgttgcaagc gagagatcag 960 gatgggacag ggctgactga ccttcagatt cgtgatgaag tggatacttt cctctttgaa 1020 ggccatgaca ccacagcatc aggaatatcg tggactctgt actccctagc aaagcatcca 1080 gagtttcaga aaaaggctca acaagaaatt gacgatttgc tggctgacag accaaataag 1140 tggatattgt gggaagactt gaatcagctg ccatacctca cccagtgtat caaagagtcc 1200 atgagacttt ggtgtccagt kcccttaatc agccgacaac tttctcagcc attaacgatc 1260 gagggtgtta ctcttccacc acrcacwctc attgacatca acatygttgc tcttcaccac 1320 aatccwacag tgtggggtga agaccatgat gaatacaagc ctgacagatt yctgcctgaa 1380 aacatcaata aaatggacac cttcgctttc ctgccctttt cygcagggcc gagaaactgc 1440 attgggcaaa attttgccat gaatgaacag aaagtgacaa tagcaagaat tattcaaagg 1500 tttgatttgt cagtggatga ragtcacccr gtgcagcctc ggcctgaact ggtcacccgy 1560 gckatkcagg gcataaaact cttyatgaag ccaagatgaa gcraacttwm wwratstawt 1620 yratctkctk wtctgttyas ctgattgrsa rtgctscrca ttstkaatst grwtrmtatk 1680 IDynrtrywttwtryattyaraartkagwLsatsanitcacyI: tsytattswy wgmackyryw 1740 rcawymtwtk mcrtwgakgm mwcarkgtas ratgcymrrgm rkcygytygr aakctctara 1800 rrawaaaaa 1809 <210〉 2 <211〉 1837 <212〉 DNA <213〉多S'围沙蚕（Perinereis nuntia) <400> 2 aaattcaagc ctccattaca atgactcaga taagctttgt cacaggaatg gattctaaag 60 cagaggcctt gttagcatct gctgcaacac tgtctgtgat ttacgtctta tcaggcagtc 120 gccgcaaact gaataaaatt ccaggccctc gtggaacacc tttctttgga aatgcccttc 180 aactggacaa agacaaacca catgaaagcc tgtcaaagtg ggttgaccag tatggagata 240 tatacaagat aaacctcttt ggagaagatg tcgtggtagt caacagttat gagggaatca 300 ctgagctgct gttgaccaaa tcaaatgact atgcaggtcg tccttacaac tatcgcacca 360 gctggtttat tcgtgacaca gatttggcct ttgctgattt gagtccaaca tggagtgtcc 420 tgaagagagc ttgcagcaga ggactgaaac aggttggaga gcaactggtg gagcttgatg 480 atattctggc aggctataca gaagacctga ctgaaaccct gacttcccac aatgggaaac 540
[0014] ctgtggatgt caggaaggat atccatgctg tgatcacacg tatcactggc acactggttt 600 acggcagagc acttagcaag aaggaatatg aagagttcaa aacagtcaca ggagacatca 660 atgattgctt gaatcccacc gctgataacg ctatcctgga catcattcca tggttaagga 720 atccactttt ctcaaaatac aatgaaataa aatccaaagc caagaggtca gaaatgttgt 780 tcaccagcca attgaataag acaattgacg attacgaagg ggacgtgagg tgcgctctgg 840 atggactgat aagtgagctc aagcggccat cagcaccact gaccacagaa aacatttgtg 900 cgattgggat taacctttct cttggaggga ttttgacaac atccagtgcc ttgtactatt 960 tggtgggtct cctggcagta tatccagcca cacagaagga aattcacgaa cacataatga 1020 aagccatagg cgacaggaca ccaacattgc aagacagatt tgcagttccc ataattgaag 1080 caattatttt tgaactactg aggttaatgt cacatctgcc tgttggaaca ccacataagg I140 caatggttga ctccaccctc cttggatatg aaataccaaa aggcacacag gtttggtcaa 1200 atctctggca tcttcaccat gacccgaaat tgtgggatga tGCctggtcc ttcaagccaa 1260 agcgtttcct ggatagccaa ggaaatcttt tgactgcaga tcatccattg aggaaacagt 1320 tttatgcctt tggtgrcggc agaagagtgt gtgttggaga ggccctggcc aagaatcgca. 1380 tgttcctgtt tattgtcacc ttaatgcaaa ggtttgagtt tgtggaacca gaeggagaaa 1440 atatcacaac agacccaagg aaatttcagc ttggctttgt ccttcgccca gatgacttta 1500 aagttatcgt taaaccaaga ttatcaaatt agcacatagg aggaaaaaaa gaaaaaaatc 1560 ctgactgtat tatatataag ttgttcaact ttttttttat cagcaccttc aattgcttag 1620 ttcaaccccc aaagtttcat gtgaagttgt gcgtttgcag agaatggaaa gaaggagggg 1680 tacatgacct caaccatggt gctcaagacc taactgccaa ggacaataat acttttcaaa 1740 gacatcattc taattattgc tgtgttaata taattactgt aactacagta catttgaagt 1800 ggattaaaat ttctctaaag ttgacaaaaa aaaaaaa 1837 <210〉 3 <211〉 1799 <212> DNA <213〉多齿围沙蛋（Perinereis nuntia) <400〉 3 actttttgct tcacacttcy gtggatttgc cacaaagacc agcaggatgg gctccacggt 60 ttcgaaaact gttccaattc catcagaatt tgttcattac tacctcctct tcaggcaaag 120 aattggtctc atgagatttg tcctacttct acttggctct tggactttgt acaaacttgc 180
[0015] aatcaaactt tatttttcac ctctacgaaa gataccagga ccaccataca accccctttt 240 cggaaatgtc agggaagcca tggttggtga agcaatggac acttccgtca agtgggtgaa 300 aaaatatggt ggaatagttc acttttatca cctcctggga agagaccgag tgttagtggc 360 aagtccggag ggtttgagac acgtccttgt cacaaacgaa cagaactatg caagaaacgt 420 tatcacaaat gatggtgctt tatcaatttt gaatggatca gtttttggag tcataggatc 480 agtacatgca agtcagagaa gacttctcaa tcctctattt acaaaggatg ccatcaaagg 540 ttatctggat gtctttcaaa tgaatatcaa tgaactcatt gagtcatggc atagtaagat 600 gacttcagat tcccctacca tgattgaagt ccaagaagat ttctcaagaa tgacattgga 660 tgtttttggc aaagctgtga ttggcataga cattgacagt cttcatcaac cagacaatga 720 aatggcttgg gctttccgca ctttcacaaa agtagatacc gtcagtgttg cctcaacatt 780 tcccataata cgatcgctac ccttggcatc aaacacagct ttccaagaac aactgaaggc 840 tgctcacaaa gtgtgtcaac tcatggagga attaattgac aactgtgaca atgcaatgga 900 ccatgacagc aagaagttaa ccttgctaca aaggctcaaa cttgcaagag atgcagaaac 960 tggccagggc ttcatgaagg atgagattgt cgctcagctt acagccctca ttgtagcagg 1020 ccatgataca acatctggga ctctatcctg gattctactg acactggccc accacccaga 1080 agtgcaagag aaagtgcgag aggaggtctt gcaggtgttg ccctctggtg gatatgcatc 1140 atttgaccac ctggacaaaa tgccatactt aactgcagtt gttaaggaat gccagagact 1200 gtacccagct gcaccgactt tcactcggag agctataaac gacgacaaaa ttggacaata 1260 ctttatacct gcagggacag ttgtgattat tcactatggc gcattaatga ggaatgatga 1320 catttggcca gaagcagaga agttcaagcc ggagcgattc acagatggca aaagcccxga 1380 catttaccac tacttgccct tttcaacagg gccccacacc tgtctcggta tccagtttgc 1440 cagagcccag cttcgaatcg taatagctcg acttctccag caatttcggt ttttggttcc 1500 tgacaatgtc catttcaagc gcaaactgag agtgaccctg aagtctgagc ccgcggtcag 1560 gctccttgtt caaagattga actcataatt acggtaaccg agagaattct tcacagaaga 1620 atatctgaaa acatxtatcc aggacagaac ccagtacatg cagaatttta aaatttggaa 1680 agtagacctg tgagtcacac atttttgagr atgtgactga cagagcccaa attcgactga 1740 cttttatatt acaaaygatg catcataata aaattttaty tcacttcaaa aaaaaaaaa 1799
[0016] 2)检测沙蚕三个细胞色素 P450基因 CYP4BB2、CYP423A1和CYP424A1的表达水 平与无污染对照组比是否显著升高，判断海水及沉积物是否被多环芳香烃（polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)污染，若与对照组比表达水平显著升高说明被PAHs或类似 有机污染物污染。
[0017] 在步骤2)中，所述沙蚕三个细胞色素 P450基因 CYP4BB2、CYP423A1和CYP424A1 的表达水平的具体方法可为：
[0018] (1)提取RNA，具体方法如下：
[0019] 将沙蚕组织中加入500 μ L Trizol Reagent裂解液（应迅速将组织溶于Trizol Reagent中，以防组织内源性RNase对RNA的降解），快速匀浆，再加入500 yL Trizol Reagent上下颠倒混勾，冰置IOmin使之充分裂解；之后加入氯仿200 μ L，振荡30s后转入 2mL离心管中，4°C，12000g离心10min ;将上清液转至另一新离心管中，加入等体积异丙醇， 振荡混匀后冰置20min，4°C，12000g离心10min ;弃上清，留沉淀，加入75%的乙醇ImL以洗 去盐离子，振荡混匀后，4°C，12000g离心5min，弃上清后用75 %的乙醇再洗一次，室温静置 晾干（5min左右，不宜时间过长），即得到总RNA沉淀。
[0020] (2)晾干除去乙醇后充分溶于20~50 μ L无 RNA酶的水中，涡旋混合，再取1 μ L 检测其OD值。取总RNA500ng跑电泳以检查RNA的质量，若有基因组DNA污染，则先用无 RNA酶的DNase I去除，再取等量（500ng)处理后的总RNA进行电泳检测。
[0021] SYBR Green法定量PCR检测引物及PCR程序
[0022] 引物序列：
[0023] CYP423A1 5' -TCA CAG ATG GCA AAA GCC CC GA-3' 5，-TTT GAA CAA GGA GCC TGA CCG 03' CYP4BB2 5' -TCC CTA GCA AAG CAT CCA GAG T-3' 5， -CAG GCT TGT \Α? CAT CAT GGT CTT-3， CYP424A1 5' -AGG CGA CAG GAC ACC AAC A-3' 5，-TGG CU GAA GGA CCA GGG AT-3,
[0024] 内参 18s rRNA
[0025] 5' -CCC GTC TCG TTG GTG ACT CTG G_3 5' -TGC TGC CTT CCT TGG ATG TGG T-3，
[0026] PCR 程序：
[0027] 95°C 30s，然后95°C 5s，55°C 10s，72°C 20s，循环40次；最后作溶解曲线分析 (50 ~99°C )
[0028] 所述判断海水及沉积物是否被多环芳香径（polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)污染的具体方法如下：[0029] 采用Δ ACt方法判断实验组成对照组沙蚕的CYP4BB2、CYP423A1和CYP424A1 mRNA的表达水平，t-test方法检测实验组与对照组之间的差异。受多环芳烃污染等有机污 染物污染的海水或沉积物会显著诱导沙蚕CYP基因的转录水平。
[0030] 本发明检测环境中多环芳烃化学物的质粒及应用，涉及分子生物学及环境生物
技术领域一种质粒，用人源性AHR基因启动子连接内参内置型双荧光素酶报告基因的慢病 毒载体，构建AHR过表达的重组慢病毒质粒。可广泛地应用于环境中多环芳烃类物质的检 测。
[0031] 与现有技术相比，本发明具有如下突出优点和技术效果：
[0032]与现有所用的化学检测方法如色谱法等相比，本发明首次应用海洋底栖环节动物 P450标记基因的表达变化来指示海水或沉积物环境中多环芳烃污染等有机污染物污染，通 过标记基因的响应来指示环境中有机污染情况，适用于海水及沉积物中多环芳烃类污染物 的初步生物监测，并可指征有机污染的综合效应。
【具体实施方式】
[0033] 以下给出具体实施例详细说明本发明。
[0034] 1.沙蚕培养检测方法
[0035] 0. 5~I. 5cm粒径的清洁砂烁层500mL铺于2L玻璃烧杯底部，待测与清洁对照的 海水IL倒入烧杯，用曝气头充气使溶解氧保持不低于5mg/L。放入受试的活体沙蚕（多齿 围沙蚕），正常个体应能避光较快地钻入砂砾层，在20°C恒温培养96h。对照组无个体死亡 或上浮现象即可接受实验结果。
[0036] 2.沙蚕P450基因全序列及定量PCR检测方法
[0037] (1)三个沙蚕P450基因全序列
[0038] CYP423A1 (全长 1512bp)
[0039] 基因序列
[0040] 5' -
[0041] AAATTCAAGCCTCCATTACAATGACTCAGATAAGCTTTGTCACAGGAATGGATTCTAAAGCAGAGGCCT TGTTAGCATCTGCTGCAACACTGTCTGTGATTTACGTCTTATCAGGCAGTCGCCGCAAACTGAATAAAATTCCAGGC CCTCGTGGAACACCTTTCTTTGGAAATGCCCTTCAACTGGACAAAGACAAACCACATGAAAGCCTGTCAAAGTGGGT TGACCAGTATGGAGATATATACAAGATAAACCTCTTTGGAGAAGATGTCGTGGTAGTCAACAGTTATGAGGGAATCA CTGAGCTGCTGTTGACCAAATCAAATGACTATGCAGGTCGTCCTTACAACTATCGCACCAGCTGGTTTATTCGTGAC ACAGATTTGGCCTTTGCTGATTTGAGTCCAACATGGAGTGTCCTGAAGAGAGCTTGCAGCAGAGGACTGAAACAGGT TGGAGAGCAACTGGTGGAGCTTGATGATATTCTGGCAGGCTATACAGAAGACCTGACTGAAACCCTGACTTCCCACA ATGGGAAACCTGTGGATGTCAGGAAGGATATCCATGCTGTGATCACACGTATCACTGGCACACTGGTTTACGGCAGA GCACTTAGCAAGAAGGAATATGAAGAGTTCAAAACAGTCACAGGAGACATCAATGATTGCTTGAATCCCACCGCTGA TAACGCTATCCTGGACATCATTCCATGGTTAAGGAATCCACTTTTCTCAAAATACAATGAAATAAAATCCAAAGCCA AGAGGTCAGAAATGTTGTTCACCAGCCAATTGAATAAGACAATTGACGATTACGAAGGGGACGTGAGGTGCGCTCTG GATGGACTGATAAGTGAGCTCAAGCGGCCATCAGCACCACTGACCACAGAAAACATTTGTGCGATTGGGATTAACCT TTCTCTTGGAGGGATTTTGACAACATCCAGTGCCTTGTACTATTTGGTGGGTCTCCTGGCAGTATATCCAGCCACAC AGAAGGAAATTCACGAACACATAATGAAAGCCATAGGCGACAGGACACCAACATTGCAAGACAGATTTGCAGTTCCC ATAATTGAAGCAATTATTTTTGAACTACTGAGGTTAATGTCACATCTGCCTGTTGGAACACCACATAAGGCAATGGT TGACTCCACCCTCCTTGGATATGAAATACCAAAAGGCACACAGGTTTGGTCAAATCTCTGGCATCTTCACCATGACC CGAAATTGTGGGATGATCCCTGGTCCTTCAAGCCAAAGCGTTTCCTGGATAGCCAAGGAAATCTTTTGACTGCAGAT CATCCATTGAGGAAACAGTTTTATGCCTTTGGTGCCGGCAGAAGAGTGTGTGTTGGAGAGGCCCTGGCCAAGAATCG CATGTTCCTGTTTATTGTCACCTTAATGCAAAGGTTTGAGTTTGTGGAACCAGACGGAGAAAATATCACAACAGACC CAAGGAAATTTCAGCTTGGCTTTGTCCTTCGCCCAGATGACTTTAAAGTTATCGTTAAACCAAGATTATCAAATTA GCACATAGGAGGAAAAAAAGAAAAAAATCCTGACTGTATTATATATAAGTTGTTCAACTTTTTTTTTATCAGCACC TTCAATTGCTTAGTTCAACCCCCAAAGTTTCATGTGAAGTTGTGCGTTTGCAGAGAATGGAAAGAAGGAGGGGTAC ATGACCTCAACCATGGTGCTCAAGACCTAACTGCCAAGGACAATAATACTTTTCAAAGACATCATTCTAATTATTG CTGTGTTAATATAATTACTGTAACTACAGTACATTTGAAGTGGATTAAAATTTCTCTAAAGTTGACAAAAAAAAAA AA-3' ；
[0042] CYP424A1 (全长 1542bp)
[0043] 基因序列
[0044] 5' -ACTTTTTGCTTCACACTTCYGTGGATTTGCCACAAAGACCAGCAGGATGGGCTCCACGGTTTCGAA AACTGTTCCAATTCCATCAGAATTTGTTCATTACTACCTCCTCTTCAGGCAAAGAATTGGTCTCATGAGATTTGTCC TACTTCTACTTGGCTCTTGGACTTTGTACAAACTTGCAATCAAACTTTATTTTTCACCTCTACGAAAGATACCAGGA CCACCATACAACCCCCTTTTCGGAAATGTCAGGGAAGCCATGGTTGGTGAAGCAATGGACACTTCCGTCAAGTGGGT GAAAAAATATGGTGGAATAGTTCACTTTTATCACCTCCTGGGAAGAGACCGAGTGTTAGTGGCAAGTCCGGAGGGTT TGAGACACGTCCTTGTCACAAACGAACAGAACTATGCAAGAAACGTTATCACAAATGATGGTGCTTTATCAATTTTG AATGGATCAGTTTTTGGAGTCATAGGATCAGTACATGCAAGTCAGAGAAGACTTCTCAATCCTCTATTTACAAAGGA TGCCATCAAAGGTTATCTGGATGTCTTTCAAATGAATATCAATGAACTCATTGAGTCATGGCATAGTAAGATGACTT CAGATTCCCCTACCATGATTGAAGTCCAAGAAGATTTCTCAAGAATGACATTGGATGTTTTTGGCAAAGCTGTGATT GGCATAGACATTGACAGTCTTCATCAACCAGACAATGAAATGGCTTGGGCTTTCCGCACTTTCACAAAAGTAGATAC CGTCAGTGTTGCCTCAACATTTCCCATAATACGATCGCTACCCTTGGCATCAAACACAGCTTTCCAAGAACAACTGA AGGCTGCTCACAAAGTGTGTCAACTCATGGAGGAATTAATTGACAACTGTGACAATGCAATGGACCATGACAGCAAG AAGTTAACCTTGCTACAAAGGCTCAAACTTGCAAGAGATGCAGAAACTGGCCAGGGCTTCATGAAGGATGAGATTGT CGCTCAGCTTACAGCCCTCATTGTAGCAGGCCATGATACAACATCTGGGACTCTATCCTGGATTCTACTGACACTGG CCCACCACCCAGAAGTGCAAGAGAAAGTGCGAGAGGAGGTCTTGCAGGTGTTGCCCTCTGGTGGATATGCATCATTT GACCACCTGGACAAAATGCCATACTTAACTGCAGTTGTTAAGGAATGCCAGAGACTGTACCCAGCTGCACCGACTTT CACTCGGAGAGCTATAAACGACGACAAAATTGGACAATACTTTATACCTGCAGGGACAGTTGTGATTATTCACTATG GCGCATTAATGAGGAATGATGACATTTGGCCAGAAGCAGAGAAGTTCAAGCCGGAGCGATTCACAGATGGCAAAAGC CCCGACATTTACCACTACTTGCCCTTTTCAACAGGGCCCCACACCTGTCTCGGTATCCAGTTTGCCAGAGCCCAGCT TCGAATCGTAATAGCTCGACTTCTCCAGCAATTTCGGTTTTTGGTTCCTGACAATGTCCATTTCAAGCGCAAACTGA GAGTGACCCTGAAGTCTGAGCCCGCGGTCAGGCTCCTTGTTCAAAGATTGAACTCATAATTACGGTAACCGAGAGAA TTCTTCACAGAAGAATATCTGAAAACATCTATCCAGGACAGAACCCAGTACATGCAGAATTTTAAAATTTGGAAAGT AGACCTGTGAGTCACACATTTTTGAGRATGTGACTGACAGAGCCCAAATTCGACTGACTTTTATATTACAAAYGATG CATCATAATAAAATTTTATYTCACTTCAAAAAAAAAAAA-3 ' ；
[0045] CYP4BB2 (全长 1521bp)
[0046] 5' -
[0047] GAGTTTCCATTCATGCTTTAGGAAGCACTGCTGTA CATTCAAGTGTGGTTTAGCCCACTCACGAAATAG CATTTGAACATGAATCCATTGATGACATCAGTTGCAGTGGTTTTATTGGTGCCAGTGCTATACCATGTTTACCAATA CATCACCTGGATATACAGGACATGGTTTGTCATTRGAAAGGCTGTGAACAAATTCCCRGGGGATCCRGTGAAATGGY CCTATGGGAACCTACACCAAACTGACTTCAGCGAAAAACTTTTCCCTCACATGAAAGAAATGGCGACAAAGTTCAAC AGAAAGTGGCGACAGTGGTTCGGACCCTTCGTTCCGTTTGTCACCTTATGTCATCCAGACACTGTCAAAATCTTGGT CAAGACTGAGGAACCAAAGTTTATTGAAGGAAATAGTTTATACATCCTTGGTGAACCTTGGCTTGGTGATGGGCTAC TACTCACCAGTGGACCAAAGTGGAAAAGAAACAGGAGACTCTTAACACCTGCGTTTCATTTTGACATTCTTAAAAGT TACATTGCTGTTTACAATGAGCAGTTGGAAATATTGCTGAAAAAATGGACAGAAAAATGCTCTACTGGTGAAAGTTT TGAAATCCAGACTGACGTCTGTTTGTGTACGCTGAGCATCffTTTTGCAGTGTGCGTTCTCATATGGTGAAAACATTC AACAAGCAGGCGAACGTCATCCATATGCTGCCGCTGTCCTGGAAATGTCACACTTGATGGTCAAAAGGGCTTTAAAC CCTCTGGTCCGCATGAGTAAATTTCTGTATGGCCTCACCGCTAACGGACGTCTATTCTTCAAAAACTGTGACTATGT CCATGAAATAGCTGAAAATGTCATTTCCCTGAGGAGGAAAGCATTGCAAGAGAATCCTGATGCCTTGAAAGACAAGA AATACTTGGACTTCCTGGACATTTTGTTGCAAGCGAGAGATCAGGATGGGACAGGGCTGACTGACCTTCAGATTCGT GATGAAGTGGATACTTTCCTCTTTGAAGGCCATGACACCACAGCATCAGGAATATCGTGGACTCTGTACTCCCTAGC AAAGCATCCAGAGTTTCAGAAAAAGGCTCAACAAGAAATTGACGATTTGCTGGCTGACAGACCAAATAAGTGGATAT TGTGGGAAGACTTGAATCAGCTGCCATACCTCACCCAGTGTATCAAAGAGTCCATGAGACTTTGGTGTCCAGTKCCC TTAATCAGCCGACAACTTTCTCAGCCATTAACGATCGAGGGTGTTACTCTTCCACCACRCACffCTCATTGACATCAA CATYGTTGCTCTTCACCACAATCCffACAGTGTGGGGTGAAGACCATGATGAATACAAGCCTGACAGATTYCTGCCTG AAAACATCAATAAAATGGACACCTTCGCTTTCCTGCCCTTTTCYGCAGGGCCGAGAAACTGCATTGGGCAAAATTTT GCCATGAATGAACAGAAAGTGACAATAGCAAGAATTATTCAAAGGTTTGATTTGTCAGTGGATGARAGTCACCCRGT GCAGCCTCGGCCTGAACTGGTCACCCGYGCKATKCAGGGCATAAAACTCTTYATGAAGCCAAGATGAAGCRAACTTff MWWRATSTAWTYRATCTKCTKWTCTGTTYASCTGATTGRSARTGCTSCRCATTSTKAATSTGRffTRMTATKMYMTRY WTTffTRYATTYARAARTKAGffTSATSAMTCACYTTSYTATTSffYffGMACKYRYffRCAWYMTffTKMCRTffGAKGMMffC ARKGTASMTGCYMRRGMRKCYGYTYGRAAKCTCTARARRAffAAAAA-3 ? 〇
[0048] (2)沙蚕P450基因定量PCR检测方法
[0049] RNA提取，具体方法如下：
[0050] 将沙蚕组织中加入500 μ L Trizol Reagent裂解液（应迅速将组织溶于Trizol Reagent中，以防组织内源性RNase对RNA的降解），勾衆后，再加入500 yL Trizol Reagent 上下颠倒混匀，冰置IOmin使之充分裂解；之后加入氯仿200 μ L，振荡30s后转入2mL离心 管中，4°C，12000g离心10min ;再将上清液转至另一新离心管中，加入等体积异丙醇，振荡 混匀后冰置2〇11^11，4°0，1200(^离心1〇1^11 ;弃上清，留沉淀，加入75%的乙醇11^以洗去盐 离子，振荡混匀后，4°C，12000g离心5min，弃上清后用75 %的乙醇再洗一次，室温静置晾干 (5min左右，不宜时间过长），即得到总RNA沉淀。
[0051] 晾干除去乙醇后充分溶于20~50 μ L无 RNA酶的水中，涡旋混合，再取1 μ L检测 其OD值。取总RNA500ng跑电泳以检查RNA的质量，若有基因组DNA污染，则先用无 RNA酶 的DNase I去除，再取等量（500ng)处理后的总RNA进行电泳检测。
[0052] SYBR Green法定量PCR检测引物及PCR程序
[0053] 引物序列：
[0054] CYP423A1 5? -TCA CAG ATG GCA AAA GCC CC GA-3' 5，-TTT GAA CAA GGA GCC TGA CCG 03' CYP4BB2 5' -TCC CTA GCA AAG CAT CCA GAG T-3' 5' -CAG GCT TGT AAT CAT CAT GGT CTT-3' CYP424A1 5' -AGG CGA CAG GAC ACC AAC A-3' 5，-TGG CTT GAA GGA CCA GGG AT-3'
[0055] 内参 18s rRNA
[0056] 5' -CCC GTC TCG TTG GTG ACT CTG G_3' 5' -TGC TGC CTT CCT TGG ATG TGG T_3，
[0057] PCR 程序：
[0058] 95°C 30s，然后95°C 5s，55°C 10s，72°C 20s，循环40次；最后作溶解曲线分析 (50 ~99°C )。
[0059] 表达水平差异的显著性判断，具体方法如下：
[0060] 采用Δ Λ Ct方法判断实验组成对照组沙蚕的CYP4BB2、CYP423A1和CYP424AlmRNA 的表达水平，t-test方法检测实验组与对照组之间的差异。受多环芳烃污染等有机污染物 污染的海水或沉积物会显著诱导沙蚕CYP基因的转录水平。
【主权项】
1. 海水及沉积物中多环芳烃污染的检测方法，其特征在于其具体步骤如下： 1) 利用沙蚕三个细胞色素 P450基因设计引物，运用荧光定量PCR的方法检测所述沙 蚕三个细胞色素 P450基因的表达情况，用于检测海水及沉积物中多环芳烃的污染，所述沙 蚕三个细胞色素 P450基因为CYP4BB2、CYP423A1和CYP424A1 ; 2) 检测沙蚕三个细胞色素 P450基因 CYP4BB2、CYP423A1和CYP424A1的表达水平与无 污染对照组比是否显著升高，判断海水及沉积物是否被多环芳香烃污染，若与对照组比表 达水平显著升高，说明被PAHs或类似有机污染物污染。2. 如权利要求1所述检测方法，其特征在于所述沙蚕三个细胞色素 P450基因的全序列 如下：3.如权利要求1所述检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述引物的序列如下：4. 如权利要求1所述检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述荧光定量PCR的方法检 测的程序如下：95°C 30s，然后95°C 5s，55°C 10s，72°C 20s，循环40次；最后作溶解曲线分 析。5. 如权利要求1所述检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述判断海水及沉积物 是否被多环芳香烃污染的具体方法如下：采用△ ACt方法判断实验组成对照组沙蚕的 CYP4BB2、CYP423A1和CYP424AlmRNA的表达水平，t-test方法检测实验组与对照组之间的 差异，受多环芳烃污染等有机污染物污染的海水或沉积物会显著诱导沙蚕CYP基因的转录 水平。6. 如权利要求1所述检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述沙蚕三个细胞色素 P450 基因 CYP4BB2、CYP423A1和CYP424A1的表达水平的具体方法为： (1) 提取RNA，具体方法为：将沙蚕组织中加入500 μ L Trizol Reagent裂解液，匀浆 后，加入500 μ L Trizol Reagent上下颠倒混勾，冰置IOmin使之裂解；再加入氯仿200 μ L， 振荡30s后转入2mL离心管中，4°C，12000g离心10min ;将上清液转至另一新离心管中， 加入等体积异丙醇，振荡混勾后冰置20min，4°C，12000g离心10min ;弃上清，留沉淀，加入 75%的乙醇ImL以洗去盐离子，振荡混匀后，4°C，12000g离心5min，弃上清后用75%的乙醇 再洗一次，室温静置晾干，即得到总RNA沉淀； (2) 晾干除去乙醇后充分溶于20~50 μ L无 RNA酶的水中，涡旋混合，再取1 μ L检测 其OD值，取总RNA500ng跑电泳以检查RNA的质量，若有基因组DNA污染，则先用无 RNA酶 的DNase I去除，再取等量处理后的总RNA进行电泳检测。
【专利摘要】海水及沉积物中多环芳烃污染的检测方法，涉及海水及沉积物的生物检测方法。利用沙蚕三个细胞色素P450基因设计引物,运用荧光定量PCR的方法检测沙蚕三个基因表达情况，用于检测海水及沉积物中多环芳烃的污染，检测沙蚕三个基因的表达水平与无污染对照组比是否显著升高，判断海水及沉积物是否被多环芳香烃污染,若与对照组比表达水平显著升高说明被PAHs或类似有机污染物污染。应用海洋底栖环节动物P450标记基因的表达变化来指示海水或沉积物环境中多环芳烃污染等有机污染物污染，通过标记基因的响应来指示环境中有机污染情况，适用于海水及沉积物中多环芳烃类污染物的初步生物监测，并可指征有机污染的综合效应。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894275
【申请号】CN201510321244
【发明人】郑森林
【申请人】国家海洋局第三海洋研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月12日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及海水及沉积物的生物检测方法，尤其是涉及一种应用沙蚕P450基因 标记检测海水及沉积物中多环芳烃污染的方法。
【背景技术】
[0002] 多环芳香烃类（PAHs)污染是海水及沉积物中主要污染之一，现有的检测海水及 沉积物中多环芳烃污染的方法，大都为化学检测方法，如：
[0003] 紫外和荧光分光光度法{夏星辉，周劲松，余晖，等.黄河水体石油类污染物生 物降解模拟实验研宄[J].环境科学，2004, 25 (1) : 103-106. }
[0004] 薄层色谱（TLC)法{汪瑗，朱若华，陈惠.薄层色谱分析法及其进展[J].大学 化学，2006, 21(3) :34-40. }
[0005] 气相色谱一质谱联用法（GC - MS) {王摆，高士博，董颖，等.6种苯系物对球等 鞭金藻和新月菱形藻的生长抑制[J].生态毒理学报，2014, 2:013.}
[0006] 高效液相色谱法（HPLC) {周建科，龙堃，彭静.微萃取瓶富集-高效液相色谱 法测定海水中多环芳烃[J].分析科学学报，2010, 26^):709-712. }等化学方法及微流 控芯片{Hu W, Jun-feng W E I, Gu〇-xia Z. Application of microfluidics in aquatic environmental pollution analysis[J]. Yingyong Shengtai Xuebao, 2014, 25(4). }
[0007] 中国专利CN103898162A公开一种检测环境中多环芳烃化学物的质粒及应用，涉 及分子生物学及环境生物技术领域。该发明通过提取人源性AHR基因启动子，以含萤火虫 荧光素酶、海肾荧光素酶双报告基因的CV060质粒为载体，插入特定序列的AHR基因启动 子，构建了含AHR基因启动子的内参内置型双荧光素酶报告基因的重组慢病毒质粒。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种应用沙蚕P450基因标记检测海水及沉积物中多环芳 烃污染的方法。
[0009] 本发明所述应用沙蚕P450基因标记检测海水及沉积物中多环芳烃污染的方法的 具体步骤如下：
[0010] 1)利用沙蚕三个细胞色素 P450基因设计引物，运用荧光定量PCR的方法检测所 述沙蚕三个细胞色素 P450基因的表达情况，用于检测海水及沉积物中多环芳烃的污染，所 述沙蚕三个细胞色素 P450基因为CYP4BB2、CYP423A1和CYP424A1 ;
[0011] 所述沙蚕三个细胞色素 P450基因的全序列如下：
[0012] <110〉国家海洋局第三海洋研究所 <120〉海水及沉积物中多环芳烃污染的检测方法 <130> 2015 <160> 3 <170> PatentIn version 3. 3 <210〉 1 <211> 1809 <212〉 DNA <213〉多齿围沙香（Perinereis mintia) <400〉 1 gagtttccat tcatgcttta ggaagcactg ctgtacattc aagtgtggtt tagcccactc 60 acgaaatagc atttgaacat gaatccattg atgacatcag ttgcagtggt tttattggtg 120 ccagtgctat accatgttta ccaatacatc acctggatat acaggacatg gtttgtcatt 180 rgaaaggctg tgaacaaatt cccrggggat ccrgtgaaat ggycctatgg gaacctacac 240 caaactgact tcagcgaaaa acttttccct cacatgaaag aaatggcgac aaagttcaac 300 agaaagtggc gacagtggtt cggacccttc gttccgtttg tcaccttatg tcatccagac 360 actgtcaaaa tcttggtcaa gactgaggaa ccaaagttta ttgaaggaaa tagtttatac 420 atccttggtg aaccttggct tggtgatggg ctactactca ccagtggacc aaagtggaaa 480 agaaacagga gactcttaac acctgcgttt cattttgaca ttcttaaaag ttacattgct 540 gtttacaatg agcagttgga aatattgctg aaaaaatgga cagaaaaatg ctctactggt 600 gaaagttttg aaatccagac tgacgtctgt ttgtgtacgc tgagcatcwt tttgcagtgt 660 gcgttctcat atggtgaaaa cattcaacaa gcaggcgaac gtcatccata tgctgccgct 720 gtcctggaaa tgtcacactt gatggtcaaa agggctttaa accctctggt ccgcatgagt 780 aaatttctgt atggcctcac cgctaacgga cgtctattct tcaaaaactg tgactatgtc 840 catgaaatag ctgaaaatgt catttccctg aggaggaaag cattgcaaga gaatcctgat 900
[0013] gccttgaaag acaagaaata cttggacttc ctggacattt tgttgcaagc gagagatcag 960 gatgggacag ggctgactga ccttcagatt cgtgatgaag tggatacttt cctctttgaa 1020 ggccatgaca ccacagcatc aggaatatcg tggactctgt actccctagc aaagcatcca 1080 gagtttcaga aaaaggctca acaagaaatt gacgatttgc tggctgacag accaaataag 1140 tggatattgt gggaagactt gaatcagctg ccatacctca cccagtgtat caaagagtcc 1200 atgagacttt ggtgtccagt kcccttaatc agccgacaac tttctcagcc attaacgatc 1260 gagggtgtta ctcttccacc acrcacwctc attgacatca acatygttgc tcttcaccac 1320 aatccwacag tgtggggtga agaccatgat gaatacaagc ctgacagatt yctgcctgaa 1380 aacatcaata aaatggacac cttcgctttc ctgccctttt cygcagggcc gagaaactgc 1440 attgggcaaa attttgccat gaatgaacag aaagtgacaa tagcaagaat tattcaaagg 1500 tttgatttgt cagtggatga ragtcacccr gtgcagcctc ggcctgaact ggtcacccgy 1560 gckatkcagg gcataaaact cttyatgaag ccaagatgaa gcraacttwm wwratstawt 1620 yratctkctk wtctgttyas ctgattgrsa rtgctscrca ttstkaatst grwtrmtatk 1680 IDynrtrywttwtryattyaraartkagwLsatsanitcacyI: tsytattswy wgmackyryw 1740 rcawymtwtk mcrtwgakgm mwcarkgtas ratgcymrrgm rkcygytygr aakctctara 1800 rrawaaaaa 1809 <210〉 2 <211〉 1837 <212〉 DNA <213〉多S'围沙蚕（Perinereis nuntia) <400> 2 aaattcaagc ctccattaca atgactcaga taagctttgt cacaggaatg gattctaaag 60 cagaggcctt gttagcatct gctgcaacac tgtctgtgat ttacgtctta tcaggcagtc 120 gccgcaaact gaataaaatt ccaggccctc gtggaacacc tttctttgga aatgcccttc 180 aactggacaa agacaaacca catgaaagcc tgtcaaagtg ggttgaccag tatggagata 240 tatacaagat aaacctcttt ggagaagatg tcgtggtagt caacagttat gagggaatca 300 ctgagctgct gttgaccaaa tcaaatgact atgcaggtcg tccttacaac tatcgcacca 360 gctggtttat tcgtgacaca gatttggcct ttgctgattt gagtccaaca tggagtgtcc 420 tgaagagagc ttgcagcaga ggactgaaac aggttggaga gcaactggtg gagcttgatg 480 atattctggc aggctataca gaagacctga ctgaaaccct gacttcccac aatgggaaac 540
[0014] ctgtggatgt caggaaggat atccatgctg tgatcacacg tatcactggc acactggttt 600 acggcagagc acttagcaag aaggaatatg aagagttcaa aacagtcaca ggagacatca 660 atgattgctt gaatcccacc gctgataacg ctatcctgga catcattcca tggttaagga 720 atccactttt ctcaaaatac aatgaaataa aatccaaagc caagaggtca gaaatgttgt 780 tcaccagcca attgaataag acaattgacg attacgaagg ggacgtgagg tgcgctctgg 840 atggactgat aagtgagctc aagcggccat cagcaccact gaccacagaa aacatttgtg 900 cgattgggat taacctttct cttggaggga ttttgacaac atccagtgcc ttgtactatt 960 tggtgggtct cctggcagta tatccagcca cacagaagga aattcacgaa cacataatga 1020 aagccatagg cgacaggaca ccaacattgc aagacagatt tgcagttccc ataattgaag 1080 caattatttt tgaactactg aggttaatgt cacatctgcc tgttggaaca ccacataagg I140 caatggttga ctccaccctc cttggatatg aaataccaaa aggcacacag gtttggtcaa 1200 atctctggca tcttcaccat gacccgaaat tgtgggatga tGCctggtcc ttcaagccaa 1260 agcgtttcct ggatagccaa ggaaatcttt tgactgcaga tcatccattg aggaaacagt 1320 tttatgcctt tggtgrcggc agaagagtgt gtgttggaga ggccctggcc aagaatcgca. 1380 tgttcctgtt tattgtcacc ttaatgcaaa ggtttgagtt tgtggaacca gaeggagaaa 1440 atatcacaac agacccaagg aaatttcagc ttggctttgt ccttcgccca gatgacttta 1500 aagttatcgt taaaccaaga ttatcaaatt agcacatagg aggaaaaaaa gaaaaaaatc 1560 ctgactgtat tatatataag ttgttcaact ttttttttat cagcaccttc aattgcttag 1620 ttcaaccccc aaagtttcat gtgaagttgt gcgtttgcag agaatggaaa gaaggagggg 1680 tacatgacct caaccatggt gctcaagacc taactgccaa ggacaataat acttttcaaa 1740 gacatcattc taattattgc tgtgttaata taattactgt aactacagta catttgaagt 1800 ggattaaaat ttctctaaag ttgacaaaaa aaaaaaa 1837 <210〉 3 <211〉 1799 <212> DNA <213〉多齿围沙蛋（Perinereis nuntia) <400〉 3 actttttgct tcacacttcy gtggatttgc cacaaagacc agcaggatgg gctccacggt 60 ttcgaaaact gttccaattc catcagaatt tgttcattac tacctcctct tcaggcaaag 120 aattggtctc atgagatttg tcctacttct acttggctct tggactttgt acaaacttgc 180
[0015] aatcaaactt tatttttcac ctctacgaaa gataccagga ccaccataca accccctttt 240 cggaaatgtc agggaagcca tggttggtga agcaatggac acttccgtca agtgggtgaa 300 aaaatatggt ggaatagttc acttttatca cctcctggga agagaccgag tgttagtggc 360 aagtccggag ggtttgagac acgtccttgt cacaaacgaa cagaactatg caagaaacgt 420 tatcacaaat gatggtgctt tatcaatttt gaatggatca gtttttggag tcataggatc 480 agtacatgca agtcagagaa gacttctcaa tcctctattt acaaaggatg ccatcaaagg 540 ttatctggat gtctttcaaa tgaatatcaa tgaactcatt gagtcatggc atagtaagat 600 gacttcagat tcccctacca tgattgaagt ccaagaagat ttctcaagaa tgacattgga 660 tgtttttggc aaagctgtga ttggcataga cattgacagt cttcatcaac cagacaatga 720 aatggcttgg gctttccgca ctttcacaaa agtagatacc gtcagtgttg cctcaacatt 780 tcccataata cgatcgctac ccttggcatc aaacacagct ttccaagaac aactgaaggc 840 tgctcacaaa gtgtgtcaac tcatggagga attaattgac aactgtgaca atgcaatgga 900 ccatgacagc aagaagttaa ccttgctaca aaggctcaaa cttgcaagag atgcagaaac 960 tggccagggc ttcatgaagg atgagattgt cgctcagctt acagccctca ttgtagcagg 1020 ccatgataca acatctggga ctctatcctg gattctactg acactggccc accacccaga 1080 agtgcaagag aaagtgcgag aggaggtctt gcaggtgttg ccctctggtg gatatgcatc 1140 atttgaccac ctggacaaaa tgccatactt aactgcagtt gttaaggaat gccagagact 1200 gtacccagct gcaccgactt tcactcggag agctataaac gacgacaaaa ttggacaata 1260 ctttatacct gcagggacag ttgtgattat tcactatggc gcattaatga ggaatgatga 1320 catttggcca gaagcagaga agttcaagcc ggagcgattc acagatggca aaagcccxga 1380 catttaccac tacttgccct tttcaacagg gccccacacc tgtctcggta tccagtttgc 1440 cagagcccag cttcgaatcg taatagctcg acttctccag caatttcggt ttttggttcc 1500 tgacaatgtc catttcaagc gcaaactgag agtgaccctg aagtctgagc ccgcggtcag 1560 gctccttgtt caaagattga actcataatt acggtaaccg agagaattct tcacagaaga 1620 atatctgaaa acatxtatcc aggacagaac ccagtacatg cagaatttta aaatttggaa 1680 agtagacctg tgagtcacac atttttgagr atgtgactga cagagcccaa attcgactga 1740 cttttatatt acaaaygatg catcataata aaattttaty tcacttcaaa aaaaaaaaa 1799
[0016] 2)检测沙蚕三个细胞色素 P450基因 CYP4BB2、CYP423A1和CYP424A1的表达水 平与无污染对照组比是否显著升高，判断海水及沉积物是否被多环芳香烃（polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)污染，若与对照组比表达水平显著升高说明被PAHs或类似 有机污染物污染。
[0017] 在步骤2)中，所述沙蚕三个细胞色素 P450基因 CYP4BB2、CYP423A1和CYP424A1 的表达水平的具体方法可为：
[0018] (1)提取RNA，具体方法如下：
[0019] 将沙蚕组织中加入500 μ L Trizol Reagent裂解液（应迅速将组织溶于Trizol Reagent中，以防组织内源性RNase对RNA的降解），快速匀浆，再加入500 yL Trizol Reagent上下颠倒混勾，冰置IOmin使之充分裂解；之后加入氯仿200 μ L，振荡30s后转入 2mL离心管中，4°C，12000g离心10min ;将上清液转至另一新离心管中，加入等体积异丙醇， 振荡混匀后冰置20min，4°C，12000g离心10min ;弃上清，留沉淀，加入75%的乙醇ImL以洗 去盐离子，振荡混匀后，4°C，12000g离心5min，弃上清后用75 %的乙醇再洗一次，室温静置 晾干（5min左右，不宜时间过长），即得到总RNA沉淀。
[0020] (2)晾干除去乙醇后充分溶于20~50 μ L无 RNA酶的水中，涡旋混合，再取1 μ L 检测其OD值。取总RNA500ng跑电泳以检查RNA的质量，若有基因组DNA污染，则先用无 RNA酶的DNase I去除，再取等量（500ng)处理后的总RNA进行电泳检测。
[0021] SYBR Green法定量PCR检测引物及PCR程序
[0022] 引物序列：
[0023] CYP423A1 5' -TCA CAG ATG GCA AAA GCC CC GA-3' 5，-TTT GAA CAA GGA GCC TGA CCG 03' CYP4BB2 5' -TCC CTA GCA AAG CAT CCA GAG T-3' 5， -CAG GCT TGT \Α? CAT CAT GGT CTT-3， CYP424A1 5' -AGG CGA CAG GAC ACC AAC A-3' 5，-TGG CU GAA GGA CCA GGG AT-3,
[0024] 内参 18s rRNA
[0025] 5' -CCC GTC TCG TTG GTG ACT CTG G_3 5' -TGC TGC CTT CCT TGG ATG TGG T-3，
[0026] PCR 程序：
[0027] 95°C 30s，然后95°C 5s，55°C 10s，72°C 20s，循环40次；最后作溶解曲线分析 (50 ~99°C )
[0028] 所述判断海水及沉积物是否被多环芳香径（polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)污染的具体方法如下：[0029] 采用Δ ACt方法判断实验组成对照组沙蚕的CYP4BB2、CYP423A1和CYP424A1 mRNA的表达水平，t-test方法检测实验组与对照组之间的差异。受多环芳烃污染等有机污 染物污染的海水或沉积物会显著诱导沙蚕CYP基因的转录水平。
[0030] 本发明检测环境中多环芳烃化学物的质粒及应用，涉及分子生物学及环境生物
技术领域一种质粒，用人源性AHR基因启动子连接内参内置型双荧光素酶报告基因的慢病 毒载体，构建AHR过表达的重组慢病毒质粒。可广泛地应用于环境中多环芳烃类物质的检 测。
[0031] 与现有技术相比，本发明具有如下突出优点和技术效果：
[0032]与现有所用的化学检测方法如色谱法等相比，本发明首次应用海洋底栖环节动物 P450标记基因的表达变化来指示海水或沉积物环境中多环芳烃污染等有机污染物污染，通 过标记基因的响应来指示环境中有机污染情况，适用于海水及沉积物中多环芳烃类污染物 的初步生物监测，并可指征有机污染的综合效应。
【具体实施方式】
[0033] 以下给出具体实施例详细说明本发明。
[0034] 1.沙蚕培养检测方法
[0035] 0. 5~I. 5cm粒径的清洁砂烁层500mL铺于2L玻璃烧杯底部，待测与清洁对照的 海水IL倒入烧杯，用曝气头充气使溶解氧保持不低于5mg/L。放入受试的活体沙蚕（多齿 围沙蚕），正常个体应能避光较快地钻入砂砾层，在20°C恒温培养96h。对照组无个体死亡 或上浮现象即可接受实验结果。
[0036] 2.沙蚕P450基因全序列及定量PCR检测方法
[0037] (1)三个沙蚕P450基因全序列
[0038] CYP423A1 (全长 1512bp)
[0039] 基因序列
[0040] 5' -
[0041] AAATTCAAGCCTCCATTACAATGACTCAGATAAGCTTTGTCACAGGAATGGATTCTAAAGCAGAGGCCT TGTTAGCATCTGCTGCAACACTGTCTGTGATTTACGTCTTATCAGGCAGTCGCCGCAAACTGAATAAAATTCCAGGC CCTCGTGGAACACCTTTCTTTGGAAATGCCCTTCAACTGGACAAAGACAAACCACATGAAAGCCTGTCAAAGTGGGT TGACCAGTATGGAGATATATACAAGATAAACCTCTTTGGAGAAGATGTCGTGGTAGTCAACAGTTATGAGGGAATCA CTGAGCTGCTGTTGACCAAATCAAATGACTATGCAGGTCGTCCTTACAACTATCGCACCAGCTGGTTTATTCGTGAC ACAGATTTGGCCTTTGCTGATTTGAGTCCAACATGGAGTGTCCTGAAGAGAGCTTGCAGCAGAGGACTGAAACAGGT TGGAGAGCAACTGGTGGAGCTTGATGATATTCTGGCAGGCTATACAGAAGACCTGACTGAAACCCTGACTTCCCACA ATGGGAAACCTGTGGATGTCAGGAAGGATATCCATGCTGTGATCACACGTATCACTGGCACACTGGTTTACGGCAGA GCACTTAGCAAGAAGGAATATGAAGAGTTCAAAACAGTCACAGGAGACATCAATGATTGCTTGAATCCCACCGCTGA TAACGCTATCCTGGACATCATTCCATGGTTAAGGAATCCACTTTTCTCAAAATACAATGAAATAAAATCCAAAGCCA AGAGGTCAGAAATGTTGTTCACCAGCCAATTGAATAAGACAATTGACGATTACGAAGGGGACGTGAGGTGCGCTCTG GATGGACTGATAAGTGAGCTCAAGCGGCCATCAGCACCACTGACCACAGAAAACATTTGTGCGATTGGGATTAACCT TTCTCTTGGAGGGATTTTGACAACATCCAGTGCCTTGTACTATTTGGTGGGTCTCCTGGCAGTATATCCAGCCACAC AGAAGGAAATTCACGAACACATAATGAAAGCCATAGGCGACAGGACACCAACATTGCAAGACAGATTTGCAGTTCCC ATAATTGAAGCAATTATTTTTGAACTACTGAGGTTAATGTCACATCTGCCTGTTGGAACACCACATAAGGCAATGGT TGACTCCACCCTCCTTGGATATGAAATACCAAAAGGCACACAGGTTTGGTCAAATCTCTGGCATCTTCACCATGACC CGAAATTGTGGGATGATCCCTGGTCCTTCAAGCCAAAGCGTTTCCTGGATAGCCAAGGAAATCTTTTGACTGCAGAT CATCCATTGAGGAAACAGTTTTATGCCTTTGGTGCCGGCAGAAGAGTGTGTGTTGGAGAGGCCCTGGCCAAGAATCG CATGTTCCTGTTTATTGTCACCTTAATGCAAAGGTTTGAGTTTGTGGAACCAGACGGAGAAAATATCACAACAGACC CAAGGAAATTTCAGCTTGGCTTTGTCCTTCGCCCAGATGACTTTAAAGTTATCGTTAAACCAAGATTATCAAATTA GCACATAGGAGGAAAAAAAGAAAAAAATCCTGACTGTATTATATATAAGTTGTTCAACTTTTTTTTTATCAGCACC TTCAATTGCTTAGTTCAACCCCCAAAGTTTCATGTGAAGTTGTGCGTTTGCAGAGAATGGAAAGAAGGAGGGGTAC ATGACCTCAACCATGGTGCTCAAGACCTAACTGCCAAGGACAATAATACTTTTCAAAGACATCATTCTAATTATTG CTGTGTTAATATAATTACTGTAACTACAGTACATTTGAAGTGGATTAAAATTTCTCTAAAGTTGACAAAAAAAAAA AA-3' ；
[0042] CYP424A1 (全长 1542bp)
[0043] 基因序列
[0044] 5' -ACTTTTTGCTTCACACTTCYGTGGATTTGCCACAAAGACCAGCAGGATGGGCTCCACGGTTTCGAA AACTGTTCCAATTCCATCAGAATTTGTTCATTACTACCTCCTCTTCAGGCAAAGAATTGGTCTCATGAGATTTGTCC TACTTCTACTTGGCTCTTGGACTTTGTACAAACTTGCAATCAAACTTTATTTTTCACCTCTACGAAAGATACCAGGA CCACCATACAACCCCCTTTTCGGAAATGTCAGGGAAGCCATGGTTGGTGAAGCAATGGACACTTCCGTCAAGTGGGT GAAAAAATATGGTGGAATAGTTCACTTTTATCACCTCCTGGGAAGAGACCGAGTGTTAGTGGCAAGTCCGGAGGGTT TGAGACACGTCCTTGTCACAAACGAACAGAACTATGCAAGAAACGTTATCACAAATGATGGTGCTTTATCAATTTTG AATGGATCAGTTTTTGGAGTCATAGGATCAGTACATGCAAGTCAGAGAAGACTTCTCAATCCTCTATTTACAAAGGA TGCCATCAAAGGTTATCTGGATGTCTTTCAAATGAATATCAATGAACTCATTGAGTCATGGCATAGTAAGATGACTT CAGATTCCCCTACCATGATTGAAGTCCAAGAAGATTTCTCAAGAATGACATTGGATGTTTTTGGCAAAGCTGTGATT GGCATAGACATTGACAGTCTTCATCAACCAGACAATGAAATGGCTTGGGCTTTCCGCACTTTCACAAAAGTAGATAC CGTCAGTGTTGCCTCAACATTTCCCATAATACGATCGCTACCCTTGGCATCAAACACAGCTTTCCAAGAACAACTGA AGGCTGCTCACAAAGTGTGTCAACTCATGGAGGAATTAATTGACAACTGTGACAATGCAATGGACCATGACAGCAAG AAGTTAACCTTGCTACAAAGGCTCAAACTTGCAAGAGATGCAGAAACTGGCCAGGGCTTCATGAAGGATGAGATTGT CGCTCAGCTTACAGCCCTCATTGTAGCAGGCCATGATACAACATCTGGGACTCTATCCTGGATTCTACTGACACTGG CCCACCACCCAGAAGTGCAAGAGAAAGTGCGAGAGGAGGTCTTGCAGGTGTTGCCCTCTGGTGGATATGCATCATTT GACCACCTGGACAAAATGCCATACTTAACTGCAGTTGTTAAGGAATGCCAGAGACTGTACCCAGCTGCACCGACTTT CACTCGGAGAGCTATAAACGACGACAAAATTGGACAATACTTTATACCTGCAGGGACAGTTGTGATTATTCACTATG GCGCATTAATGAGGAATGATGACATTTGGCCAGAAGCAGAGAAGTTCAAGCCGGAGCGATTCACAGATGGCAAAAGC CCCGACATTTACCACTACTTGCCCTTTTCAACAGGGCCCCACACCTGTCTCGGTATCCAGTTTGCCAGAGCCCAGCT TCGAATCGTAATAGCTCGACTTCTCCAGCAATTTCGGTTTTTGGTTCCTGACAATGTCCATTTCAAGCGCAAACTGA GAGTGACCCTGAAGTCTGAGCCCGCGGTCAGGCTCCTTGTTCAAAGATTGAACTCATAATTACGGTAACCGAGAGAA TTCTTCACAGAAGAATATCTGAAAACATCTATCCAGGACAGAACCCAGTACATGCAGAATTTTAAAATTTGGAAAGT AGACCTGTGAGTCACACATTTTTGAGRATGTGACTGACAGAGCCCAAATTCGACTGACTTTTATATTACAAAYGATG CATCATAATAAAATTTTATYTCACTTCAAAAAAAAAAAA-3 ' ；
[0045] CYP4BB2 (全长 1521bp)
[0046] 5' -
[0047] GAGTTTCCATTCATGCTTTAGGAAGCACTGCTGTA CATTCAAGTGTGGTTTAGCCCACTCACGAAATAG CATTTGAACATGAATCCATTGATGACATCAGTTGCAGTGGTTTTATTGGTGCCAGTGCTATACCATGTTTACCAATA CATCACCTGGATATACAGGACATGGTTTGTCATTRGAAAGGCTGTGAACAAATTCCCRGGGGATCCRGTGAAATGGY CCTATGGGAACCTACACCAAACTGACTTCAGCGAAAAACTTTTCCCTCACATGAAAGAAATGGCGACAAAGTTCAAC AGAAAGTGGCGACAGTGGTTCGGACCCTTCGTTCCGTTTGTCACCTTATGTCATCCAGACACTGTCAAAATCTTGGT CAAGACTGAGGAACCAAAGTTTATTGAAGGAAATAGTTTATACATCCTTGGTGAACCTTGGCTTGGTGATGGGCTAC TACTCACCAGTGGACCAAAGTGGAAAAGAAACAGGAGACTCTTAACACCTGCGTTTCATTTTGACATTCTTAAAAGT TACATTGCTGTTTACAATGAGCAGTTGGAAATATTGCTGAAAAAATGGACAGAAAAATGCTCTACTGGTGAAAGTTT TGAAATCCAGACTGACGTCTGTTTGTGTACGCTGAGCATCffTTTTGCAGTGTGCGTTCTCATATGGTGAAAACATTC AACAAGCAGGCGAACGTCATCCATATGCTGCCGCTGTCCTGGAAATGTCACACTTGATGGTCAAAAGGGCTTTAAAC CCTCTGGTCCGCATGAGTAAATTTCTGTATGGCCTCACCGCTAACGGACGTCTATTCTTCAAAAACTGTGACTATGT CCATGAAATAGCTGAAAATGTCATTTCCCTGAGGAGGAAAGCATTGCAAGAGAATCCTGATGCCTTGAAAGACAAGA AATACTTGGACTTCCTGGACATTTTGTTGCAAGCGAGAGATCAGGATGGGACAGGGCTGACTGACCTTCAGATTCGT GATGAAGTGGATACTTTCCTCTTTGAAGGCCATGACACCACAGCATCAGGAATATCGTGGACTCTGTACTCCCTAGC AAAGCATCCAGAGTTTCAGAAAAAGGCTCAACAAGAAATTGACGATTTGCTGGCTGACAGACCAAATAAGTGGATAT TGTGGGAAGACTTGAATCAGCTGCCATACCTCACCCAGTGTATCAAAGAGTCCATGAGACTTTGGTGTCCAGTKCCC TTAATCAGCCGACAACTTTCTCAGCCATTAACGATCGAGGGTGTTACTCTTCCACCACRCACffCTCATTGACATCAA CATYGTTGCTCTTCACCACAATCCffACAGTGTGGGGTGAAGACCATGATGAATACAAGCCTGACAGATTYCTGCCTG AAAACATCAATAAAATGGACACCTTCGCTTTCCTGCCCTTTTCYGCAGGGCCGAGAAACTGCATTGGGCAAAATTTT GCCATGAATGAACAGAAAGTGACAATAGCAAGAATTATTCAAAGGTTTGATTTGTCAGTGGATGARAGTCACCCRGT GCAGCCTCGGCCTGAACTGGTCACCCGYGCKATKCAGGGCATAAAACTCTTYATGAAGCCAAGATGAAGCRAACTTff MWWRATSTAWTYRATCTKCTKWTCTGTTYASCTGATTGRSARTGCTSCRCATTSTKAATSTGRffTRMTATKMYMTRY WTTffTRYATTYARAARTKAGffTSATSAMTCACYTTSYTATTSffYffGMACKYRYffRCAWYMTffTKMCRTffGAKGMMffC ARKGTASMTGCYMRRGMRKCYGYTYGRAAKCTCTARARRAffAAAAA-3 ? 〇
[0048] (2)沙蚕P450基因定量PCR检测方法
[0049] RNA提取，具体方法如下：
[0050] 将沙蚕组织中加入500 μ L Trizol Reagent裂解液（应迅速将组织溶于Trizol Reagent中，以防组织内源性RNase对RNA的降解），勾衆后，再加入500 yL Trizol Reagent 上下颠倒混匀，冰置IOmin使之充分裂解；之后加入氯仿200 μ L，振荡30s后转入2mL离心 管中，4°C，12000g离心10min ;再将上清液转至另一新离心管中，加入等体积异丙醇，振荡 混匀后冰置2〇11^11，4°0，1200(^离心1〇1^11 ;弃上清，留沉淀，加入75%的乙醇11^以洗去盐 离子，振荡混匀后，4°C，12000g离心5min，弃上清后用75 %的乙醇再洗一次，室温静置晾干 (5min左右，不宜时间过长），即得到总RNA沉淀。
[0051] 晾干除去乙醇后充分溶于20~50 μ L无 RNA酶的水中，涡旋混合，再取1 μ L检测 其OD值。取总RNA500ng跑电泳以检查RNA的质量，若有基因组DNA污染，则先用无 RNA酶 的DNase I去除，再取等量（500ng)处理后的总RNA进行电泳检测。
[0052] SYBR Green法定量PCR检测引物及PCR程序
[0053] 引物序列：
[0054] CYP423A1 5? -TCA CAG ATG GCA AAA GCC CC GA-3' 5，-TTT GAA CAA GGA GCC TGA CCG 03' CYP4BB2 5' -TCC CTA GCA AAG CAT CCA GAG T-3' 5' -CAG GCT TGT AAT CAT CAT GGT CTT-3' CYP424A1 5' -AGG CGA CAG GAC ACC AAC A-3' 5，-TGG CTT GAA GGA CCA GGG AT-3'
[0055] 内参 18s rRNA
[0056] 5' -CCC GTC TCG TTG GTG ACT CTG G_3' 5' -TGC TGC CTT CCT TGG ATG TGG T_3，
[0057] PCR 程序：
[0058] 95°C 30s，然后95°C 5s，55°C 10s，72°C 20s，循环40次；最后作溶解曲线分析 (50 ~99°C )。
[0059] 表达水平差异的显著性判断，具体方法如下：
[0060] 采用Δ Λ Ct方法判断实验组成对照组沙蚕的CYP4BB2、CYP423A1和CYP424AlmRNA 的表达水平，t-test方法检测实验组与对照组之间的差异。受多环芳烃污染等有机污染物 污染的海水或沉积物会显著诱导沙蚕CYP基因的转录水平。
【主权项】
1. 海水及沉积物中多环芳烃污染的检测方法，其特征在于其具体步骤如下： 1) 利用沙蚕三个细胞色素 P450基因设计引物，运用荧光定量PCR的方法检测所述沙 蚕三个细胞色素 P450基因的表达情况，用于检测海水及沉积物中多环芳烃的污染，所述沙 蚕三个细胞色素 P450基因为CYP4BB2、CYP423A1和CYP424A1 ; 2) 检测沙蚕三个细胞色素 P450基因 CYP4BB2、CYP423A1和CYP424A1的表达水平与无 污染对照组比是否显著升高，判断海水及沉积物是否被多环芳香烃污染，若与对照组比表 达水平显著升高，说明被PAHs或类似有机污染物污染。2. 如权利要求1所述检测方法，其特征在于所述沙蚕三个细胞色素 P450基因的全序列 如下：3.如权利要求1所述检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述引物的序列如下：4. 如权利要求1所述检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述荧光定量PCR的方法检 测的程序如下：95°C 30s，然后95°C 5s，55°C 10s，72°C 20s，循环40次；最后作溶解曲线分 析。5. 如权利要求1所述检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述判断海水及沉积物 是否被多环芳香烃污染的具体方法如下：采用△ ACt方法判断实验组成对照组沙蚕的 CYP4BB2、CYP423A1和CYP424AlmRNA的表达水平，t-test方法检测实验组与对照组之间的 差异，受多环芳烃污染等有机污染物污染的海水或沉积物会显著诱导沙蚕CYP基因的转录 水平。6. 如权利要求1所述检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述沙蚕三个细胞色素 P450 基因 CYP4BB2、CYP423A1和CYP424A1的表达水平的具体方法为： (1) 提取RNA，具体方法为：将沙蚕组织中加入500 μ L Trizol Reagent裂解液，匀浆 后，加入500 μ L Trizol Reagent上下颠倒混勾，冰置IOmin使之裂解；再加入氯仿200 μ L， 振荡30s后转入2mL离心管中，4°C，12000g离心10min ;将上清液转至另一新离心管中， 加入等体积异丙醇，振荡混勾后冰置20min，4°C，12000g离心10min ;弃上清，留沉淀，加入 75%的乙醇ImL以洗去盐离子，振荡混匀后，4°C，12000g离心5min，弃上清后用75%的乙醇 再洗一次，室温静置晾干，即得到总RNA沉淀； (2) 晾干除去乙醇后充分溶于20~50 μ L无 RNA酶的水中，涡旋混合，再取1 μ L检测 其OD值，取总RNA500ng跑电泳以检查RNA的质量，若有基因组DNA污染，则先用无 RNA酶 的DNase I去除，再取等量处理后的总RNA进行电泳检测。
【专利摘要】海水及沉积物中多环芳烃污染的检测方法，涉及海水及沉积物的生物检测方法。利用沙蚕三个细胞色素P450基因设计引物,运用荧光定量PCR的方法检测沙蚕三个基因表达情况，用于检测海水及沉积物中多环芳烃的污染，检测沙蚕三个基因的表达水平与无污染对照组比是否显著升高，判断海水及沉积物是否被多环芳香烃污染,若与对照组比表达水平显著升高说明被PAHs或类似有机污染物污染。应用海洋底栖环节动物P450标记基因的表达变化来指示海水或沉积物环境中多环芳烃污染等有机污染物污染，通过标记基因的响应来指示环境中有机污染情况，适用于海水及沉积物中多环芳烃类污染物的初步生物监测，并可指征有机污染的综合效应。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894275
【申请号】CN201510321244
【发明人】郑森林
【申请人】国家海洋局第三海洋研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月12日
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