检测转基因玉米nos终止子的引物、试剂盒和方法
检测转基因玉米nos终止子的引物、试剂盒和方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测转基因玉米NOS终止子及内源基因 Zein的引物；本发明还涉 及一种包括上述引物的双重荧光PC检测试剂盒，本发明还涉及一种采用上述试剂盒检测 转基因玉米NOS终止子及内源基因 Zein的方法。
【背景技术】
[0002] 玉米是世界上最重要的粮食作物之一，在世界农业生产中占有重要位置。2005年 转基因作物的发展和推广取得了重大突破，欧盟文员会首次允许转基因抗虫玉米M0N810 在欧盟25个国家商业化种植，捷克斯洛伐克加入转基因玉米种植的行列使欧盟种植转基 因作物的国家达到5个。
[0003] 农业转基因生物技术产业化的发展既是综合国力和竞争力的标志，又是国家科技 竞争优势的重要标志。随着人们生活水平的提高，科技含量低的农产品在国内外逐渐失去 竞争力，科技含量高的生物技术产品在未来市场竞争中将越来越占优势，农业转基因生物 的推广应用，降低了生产成本，减轻了环境污染，提高了产品价格竞争力。转基因作物使产 量增加，农药使用量减少，形成了巨大经济和生态效益。
[0004] 国际上对转基因生物安全性的争论已经不是纯粹的科学技术问题，包含政治、经 济、伦理等诸多方面。很多国家将他们研宄的转基因物种拿到发展中国家中进行试验研宄， 这会引起人们的广泛不满。这不仅仅是技术安全上的争论，也涉及到国家之间的政治与经 济的相互制约。在转基因产品的销售过程中，经营者与消费者之间缺乏公平，消费者经常是 在不知情或者是被动的情况下就进行了消费。由此，我们需要对食品及饲料中转基因玉米 的品系进行鉴定。
[0005] 在检测转基因作物或者来源于转基因作物的原料时有一项必须的检测，那就是检 测它们是否含有所有商业化转基因粮食作物都含有的转基因元素。其中最著名的就是花 挪菜花叶病毒Cauliflower Mosaic Virus的35S启动子和根瘤土壤杆菌grobacterium tumefaciens的NOS终止子。这两种材料被广泛用于转基因操作，能够帮助转基因表达，是 最容易被检测到的转基因材料。
[0006] 针对Zein基因和NOS相关基因，研宄人员已开展了常规PCR和荧光PCR方法研宄。 目前，我国出入境检验检疫行业标准SN/T1194-2003《植物及其产品中转基因成分检测抽 样和制样方法》、SN/T1204-2003《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验 方法》、SN/T《1196-2012转基因成分检测玉米检测方法》中规定了对玉米ZEIN、CaMV35S、 N0S、BAR、PAT、NPT II、CryIA(b)品系中转基因成分的定性检测。这些基因的检测方法大都 采用常规PCR方法和荧光PCR方法。
[0007] 但常规PCR方法需要PCR扩增后进行电泳，不仅操作繁琐，而且容易引起污染，还 需要使用可能致癌的荧光燃料，而探针法荧光PCR方法虽然灵敏准确，但TaqMan探针的线 性结构导致了较高的背景荧光，如果荧光基团和淬灭基团的距离太近，在PCR扩增过程中， 探针在它们之间降解的可能性将大为降低，从而起不到探针的作用。相反，如果荧光基团和 淬灭基团分别置于探针两端，荧光背景信号加强，影响其检测的灵敏度。TaqMan过高的特异 性会导致一个碱基的也限定了其检测目标过于狭窄，另外其合成成本较高，而且试剂有效 期短，很容易降解，因而不能得到广泛的应用。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种用于检测玉米Zein 基因即内源参照基因及转录终止子NOS的引物；
[0009] 本发明另一个目的是，提供一种包括上述引物，组分和配比合理，使用方便，检测 快捷，准确，适用于双重荧光PCR检测玉米Zein基因即内源参照基因及转录终止子NOS的 试剂盒；
[0010] 本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测玉米Zein基因即内源参照基 因及NOS终止子的方法，该方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
[0011] 为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
[0012] 一种检测转基因玉米NOS终止子及内源基因 Zein的引物，其特征在于该引物的序 列分别为：
[0013] 上游引物 Zein F :TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0014] 下游引物 Zein R :GTAATAGGGCTGATGATTG
[0015] 上游引物 NOS F :TAATTGCGGGACTCTAAT
[0016] 下游引物 NOS R :AATCCTGTTGCCGGTCTT。
[0017] 本发明一种检测转基因玉米NOS终止子及内源基因 Zein的试剂盒，其特征在于该 试剂盒中20 μ L反应体系包括以下组分：
[0018] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物Zein F 0.05- 0.8 u L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物Zein R 0.05-0.8 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物NOS F 0.05-0.9 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物NOS R 0.05-0.9 μ L DNA模版 IuL 水 补齐市20 μ L;
[0019] 其中所述上游引物Zein F的序列：TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0020] 所述下游引物 Zein R 的序列：GTAATAGGGCTGATGATTG
[0021] 所述上游引物 NOS F 的序列：TAATTGCGGGACTCTAAT
[0022] 所述下游引物 NOS R 的序列：AATCCTGTTGCCGGTCTT。
[0023] 如上所述的一种检测转基因玉米NOS终止子及内源基因 Zein的试剂盒，其特征在 于该试剂盒中20 μ L反应体系包括以下组分：
[0024] 终浓度i X的HRM反应预混液 10 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZeinF 0.5 U L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZeinR 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物NOS F 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物NOS R 0.5 μ L DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L。
[0025] 本发明一种检测转基因玉米NOS终止子及内源基因 Zein的方法，其特征在于包括 以下步骤：
[0026] A、提取样品DNA ;
[0027] Β、利用如权利要求2或3所述的试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增；
[0028] C、扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。
[0029] 如上所述一种检测转基因玉米NOS终止子及内源基因 Zein的方法，其特征在于步 骤B中PCR扩增的反应程序按以下步骤进行：
[0030] (1)92°C ~96°C预变性 30s ;
[0031] (2)92°C~95°C变性 IOs ~30s，54°C~64°C退火 IOs ~30s，72°C IOs ~30s，共 进行35~45个循环；
[0032] (3) 72°C延伸 IOs ~30s。
[0033] 如上所述一种检测转基因玉米NOS终止子及内源基因 Zein的方法，其特征在于步 骤C中所述高分辨率熔解曲线分析，按以下步骤进行：
[0034] (1)92°C ~96°C 变性 Imin ;
[0035] (2) 40 °C 复性 Imin ;
[0036] (3)然后初始熔解温度60°C~65°C，开始程序升温熔解至90°C~95°C，并在熔解 过程中实时检测荧光信号，15~25次/秒。
[0037] 如上所述一种检测转基因玉米NOS终止子及内源基因 Zein的方法，其特征在于步 骤A中所述提取样品DNA的具体步骤如下：
[0038] 称取LOg样品，加入到50mL的离心管中；加入5mL CTAB提取液和20yL蛋白酶K 溶液，充分混匀；65 °C孵育30min，不时振荡；吸水性大的样品，加入CTAB提取液的量应根据 液面是否能盖住样品并多出少许而定；65°C过夜后，8000r/min室温离心10min，取Iml上 清液入2ml离心管中；加入700 μ L氯仿后用力振荡，13000g离心10min，转移上清液600 μ L 到新的2ml离心管中；加入2倍体积的CTAB沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min，13000 X g 离心10min，弃去上清，加入350 μ L NaCl溶液将沉淀进行悬浮，再加入350 μ L氯仿，涡旋 振荡进行混勾，13000g离心10min，转移上清后加入0. 8倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室 温放置20min，13000g离心10min，弃去上清，加入500 μ L 70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于 50 μ L TE溶液中。
[0039] 本发明中标准品模板的制备：
[0040] 以常规PCR方法扩增目的基因。PCR产物经1 %凝胶电泳分析，采用PCR产物回收 试剂盒对PCR产物进行回收，将纯化后的PCR产物与载体pMD18-T连接，将连接产物转化至 感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选单菌落至含抗生素的液体培养基，过夜培养，提取质粒， 以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测序鉴定。提取验证正确 的阳性重组质粒，并测定其浓度，将其10倍倍比稀释。
[0041] 本发明中敏感性和特异性试验：
[0042] 采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行 Blast比较时，序列均与Genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的阳性质粒模板DNA加 入前述反应体系，采用〇. 1%标准品对其进行灵敏性实验（检测底限）。结果能达到〇. 1% 的检测阈值，重复试验显示检测样品过程中具有很好重复性。稀释模板浓度对数值和Cp值 之间也呈良好的线性关系（R2多0.95)。说明该方法具有较好的精确度和良好的稳定性。 [0043] 本发明与现有技术相比，具有以下优点 ：
[0044] 1)本发明试剂盒组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于荧光PCR检 测玉米Zein基因即内源参照基因和NOS终止子；
[0045] 2)本发明检测方法简化了检测流程，大大缩短了检测周期，检测时间比传统培养 分析方法缩短两天左右；
[0046] 3)本发明检测方法整个过程，PCR产物无需再转入其它分析装置，实现闭管操作， 避免交叉污染，而且可同时完成定量分析。
[0047] 4)采用本发明检测方法在同一反应体系即可实现同时检测玉米Zein基因即内源 参照基因和NOS终止子，操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
【附图说明】
[0048] 图1为仅有玉米Zein基因检出的扩增曲线图；
[0049] 图2为仅有玉米Zein基因检出的HRM分析图；
[0050] 图3为仅有NOS检出的扩增曲线图；
[0051] 图4为仅有NOS检出的的HRM分析图；
[0052] 图5为玉米Zein基因和NOS终止子同时检出的扩增曲线图；
[0053] 图6为玉米Zein基因和NOS终止子同时检出的HRM分析图；
【具体实施方式】
[0054] 下面结合【具体实施方式】对本发明做进一步描述：
[0055] 实施例1
[0056] 本发明用于检测转基因玉米NOS终止子及内源基因 Zein的引物，包括：
[0057] 上游引物 Zein F :TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0058] 下游引物 Zein R :GTAATAGGGCTGATGATTG
[0059] 上游引物 NOS F : TAATTGCGGGACTCTAAT
[0060] 下游引物 NOS R :AATCCTGTTGCCGGTCTT。
[0061] 实施例2
[0062] 本发明用于检测转基因玉米NOS终止子及内源基因 Zein的试剂盒，其中20. 0 yL 反应体系由以下组分组成：
[0063] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZeinF 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZeinR 0,5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物NOS F 05uL 终浓度0.5 pmol/L的下游引物NOS R 0 5 μ L DNA模版 I UL 水 补齐至20 μ L;
[0064] 其中引物序列为：
[0065] 上游引物 Zein F :TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0066] 下游引物 Zein R :GTAATAGGGCTGATGATTG
[0067] 上游引物 NOS F :TAATTGCGGGACTCTAAT
[0068] 下游引物 NOS R :AATCCTGTTGCCGGTCTT。
[0069] 实施例3
[0070] 本发明用于检测转基因玉米NOS终止子及内源基因 Zein的试剂盒，其中20. 0 yL 反应体系由以下组分组成：
[0071] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOpL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZEIN F 0.05 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZEIN R 0.05 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物NOS F 0.05 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物NOS R 0.05 U L DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L。
[0072] 其中：
[0073] 其中所述上游引物 Zein F :TTATGCTCCTTGGTCTTT ;
[0074] 所述下游引物 Zein R :GTAATAGGGCTGATGATTG ;
[0075] 所述上游引物 NOS F :TAATTGCGGGACTCTAAT ;
[0076] 所述下游引物 NOS R :AATCCTGTTGCCGGTCTT。
[0077] 实施例4
[0078] 本发明试剂盒中制备20 μ L反应体系由以下组分组成：
[0079] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL
[0080] 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZEIN F 0.8 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZEIN R 0.8 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物NOS F 0.9 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物NOS R 0.9 μ L DNA模版 I UL 水 补齐市20 μ L。
[0081] 其中所述上游引物 Zein F :TTATGCTCCTTGGTCTTT ;
[0082] 所述下游引物 Zein R :GTAATAGGGCTGATGATTG ;
[0083] 所述上游引物 NOS F :TAATTGCGGGACTCTAAT ;
[0084] 所述下游引物 NOS R :AATCCTGTTGCCGGTCTT。
[0085] 实施例5
[0086] 本发明试剂盒中制备20 μ L反应体系由以下组分组成：
[0087] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOy L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZEIN F 0.05 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZEIN R 0.05 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物NOS F 0.9 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物NOS R 0.9 μ L DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L。
[0088] 其中所述上游引物 Zein F :TTATGCTCCTTGGTCTTT ;
[0089] 所述下游引物 Zein R :GTAATAGGGCTGATGATTG ;
[0090] 所述上游引物 NOS F :TAATTGCGGGACTCTAAT ;
[0091] 所述下游引物 NOS R :AATCCTGTTGCCGGTCTT。
[0092] 实施例6
[0093] 本发明试剂盒中制备20 μ L反应体系由以下组分组成：
[0094] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZEIN F 0.8 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZEIN R 0.8 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物NOS F 0.05 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物NOS R 0.05 μ L DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L。
[0095] 其中所述上游引物 Zein F :TTATGCTCCTTGGTCTTT ;
[0096] 所述下游引物 Zein R :GTAATAGGGCTGATGATTG ;
[0097] 所述上游引物 NOS F :TAATTGCGGGACTCTAAT ;
[0098] 所述下游引物 NOS R :AATCCTGTTGCCGGTCTT。
[0099] 实施例7
[0100] 本发明试剂盒中制备20 μ L反应体系由以下组分组成：
[0101] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZEIN F 0 6 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZEIN R 0.6 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物NOS F 0.7 u L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物NOS R 0.7 μ L DNA模版 IuL
[0102] 水 补齐至20 μ L。
[0103] 其中所述上游引物 Zein F :TTATGCTCCTTGGTCTTT ;
[0104] 所述下游引物 Zein R :GTAATAGGGCTGATGATTG ;
[0105] 所述上游引物 NOS F : TAATTGCGGGACTCTAAT ;
[0106] 所述下游引物 NOS R :AATCCTGTTGCCGGTCTT。
[0107] 实施例8
[0108] 本发明一种检测转基因玉米NOS终止子及内源基因 Zein的方法，包括以下步骤：
[0109] A、提取样品DNA ;
[0110] B、利用检测转基因玉米NOS终止子及内源基因 Zein用的试剂盒，对步骤A中的样 品DNA进行PCR扩增；其中所述试剂盒中20 μ L反应体系包括以下组分：
[0111] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZEIN F 0 5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZEINR 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物NOS F 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物NOSR 0.5 μ L DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L。
[0112] 其中所述上游引物 Zein F :TTATGCTCCTTGGTCTTT ;
[0113] 所述下游引物 Zein R :GTAATAGGGCTGATGATTG ;
[0114] 所述上游引物 NOS F : TAATTGCGGGACTCTAAT ;
[0115] 所述下游引物 NOS R :AATCCTGTTGCCGGTCTT。
[0116] 其中PCR扩增的反应程序按以下步骤进行：
[0117] (1)92°C~96°C预变性 30s ;
[0118] (2)92°C~95°C变性 IOs ~30s，54°C~64°C退火 IOs ~30s，72°C IOs ~30s，共 进行35~45个循环；
[0119] (3)72°C延伸 IOs ~30s。
[0120] C、扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。所述高 分辨率熔解曲线分析，按以下步骤进行：
[0121] (1)92°C ~96°C 变性 Imin ;
[0122] (2) 40 °C 复性 Imin ;
[0123] (3)然后初始熔解温度60°C~65°C，开始程序升温熔解至90°C~95°C，并在熔解 过程中实时检测荧光信号，15~25次/秒。
[0124] 实施例9
[0125] 称取1.0 g样品（根据样品的DNA含量，可以调整样品量），加入到50mL的离心管 中；加入5mL CTAB提取液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混匀。65°C孵育30min，不时振荡； 吸水性大的样品，加入CTAB提取液的量应根据液面是否能盖住样品并多出少许而定；65°C 过夜后，8000r/min室温离心10min,取Iml上清液入2ml离心管中；加入700 μ L氯仿后 用力振荡，13000Xg离心10min，转移上清液600 μ L到新的2ml离心管中；加入2倍体积 的CTAB沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min，13000 X g离心10min，弃去上清，加入350 μ L NaCl溶液将沉淀进行悬浮，再加入350 μ L氯仿，祸旋振荡进行混勾，13000 Xg离心10min， 转移上清后加入0. 8倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20min，13000Xg离心10min， 弃去上清，加入500 μ L 70 %乙醇溶液洗涤沉淀，加入TE溶液溶解沉淀，然后取I. 0 μ L提取 物加入到以下反应体系，
[0126] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZEIN F 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZEINR 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物NOS F 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物NOSR 0.5 μ L DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L。
[0127] 其中所述上游引物 Zein F :TTATGCTCCTTGGTCTTT ;
[0128] 所述下游引物 Zein R :GTAATAGGGCTGATGATTG ;
[0129] 所述上游引物 NOS F : TAATTGCGGGACTCTAAT ;
[0130] 所述下游引物 NOS R :AATCCTGTTGCCGGTCTT。
[0131] 进行荧光PCR扩增，按以下步骤进行：
[0132] (1)92°C~96°C预变性 30s ;
[0133] (2)92°C~96°C变性5s~10s，54°C~64°C退火20s~40s，共进行35~45个循 环。
[0134] A、对扩增后的产物进行HRM分析后判定结果。
[0135] 对PCR扩增产物进行HRM分析，按以下步骤进行：
[0136] (1)92°C ~96°C 变性 Imin ;
[0137] (2) 40 °C 复性 Imin ;
[0138] (3)然后初始熔解温度60°C~65°C，开始程序升温熔解至92°C~96°C，并在熔解 过程中实时检测荧光信号，15~25次/秒。
[0139] 本发明中标准DNA模版的制备：
[0140] 以常规PCR方法扩增耐药基因目的基因 ZEIN和NOS。PCR产物经1 %凝胶电泳分 析，采用PCR产物回收试剂盒对PCR产物进行回收，将纯化后的PCR产物与载体pMD18-T 连接，将连接产物转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选单菌落至含抗生素的液体培养 基，过夜培养，提取质粒，以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测 序鉴定。提取验证正确的阳性重组质粒，并测定其浓度，将其10倍倍比稀释。
[0141] 结果分析：
[0142] 如果样品荧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值〈35,而且熔解曲线有一个特异性波 峰，Tm值为88. 23±0. 15°C，可判为玉米Zein基因即内源参照基因检出。
[0143] 如果样品荧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值〈35,熔解曲线有一个特异性波峰， Tm值为77. 69±0. 15°C，可判为NOS检出。
[0144] 如果样品荧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值〈35,而且有两个波峰，Tm值分别为 76. 68±0. 15°C和83. 75±0. 15°C，可判为玉米Zein基因即内源参照基因和NOS均检出。
[0145] 如果样品荧光PCR扩增曲线明显，35〈Ct值〈40,重复一次，如果仍有明显上升曲 线，则至少有一个目的基因为检出，同时根据前述HRM分析图波峰情况和Tm值进行相应判 断。
[0146] 如果样品荧光PCR扩增曲线明显Ct值>40,或无明显扩增曲线和Tm值，判为玉米 Zein基因即内源参照基因和NOS均检测阴性。
[0147] 本发明中敏感性和特异性试验：
[0148] 采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行 Blast比较时，序列均与Genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的阳性质粒模板DNA加 入前述反应体系，采用〇. 1%标准品对其进行灵敏性实验。结果能达到〇. 1%的检测阈值， 重复试验显示检测样品过程中具有很好重复性。稀释模板浓度对数值和Cp值之间也呈良 好的线性关系。说明该方法具有较好的精确度和良好的稳定性。
[0149] 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技 术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明 本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些 变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及 其等效物界定。
【主权项】
1. 一种检测转基因玉米NOS终止子的引物，其特征在于该引物的序列分别为： 上游引物 Zein F:TTATGCTCCTTGGTCTTT 下游引物 Zein R:GTAATAGGGCTGATGATTG 上游引物 NOS F :TAATTGCGGGACTCTAAT 下游引物 NOS R:AATCCTGTTGCCGGTCTT。2. -种检测转基因玉米NOS终止子的试剂盒，其特征在于该试剂盒中20 μ L反应体系 包括以下组分：其中所述上游引物Zein F的序列：TTATGCTCCTTGGTCTTT 所述下游引物Zein R的序列：GTAATAGGGCTGATGATTG 所述上游引物NOS F的序列：TAATTGCGGGACTCTAAT 所述下游引物NOS R的序列：AATCCTGTTGCCGGTCTT。3. 根据权利要求2所述的一种检测转基因玉米NOS终止子的试剂盒，其特征在于该试 剂盒中20 μ L反应体系包括以下组分：4. 一种检测转基因玉米NOS终止子的方法，其特征在于包括以下步骤： A、提取样品DNA ; B、 利用如权利要求2或3所述的试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增； C、 扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。5. 根据权利要求4所述一种检测转基因玉米NOS终止子的方法，其特征在于步骤B中 PCR扩增的反应程序按以下步骤进行： (1) 92°C ~96°C预变性 30s ; (2) 92°C~95°C变性 IOs ~30s，54°C~64°C退火 IOs ~30s，72°C IOs ~30s，共进行 35~45个循环； (3) 72°C延伸 IOs ~30s。6. 根据权利要求5所述一种检测转基因玉米NOS终止子的方法，其特征在于步骤C中 所述高分辨率熔解曲线分析，按以下步骤进行： (1) 92°C~96°C变性 Imin ; (2) 40 °C 复性 Imin ; (3) 然后初始熔解温度60°C~65°C，开始程序升温熔解至90°C~95°C，并在熔解过程 中实时检测荧光信号，15~25次/秒。7. 根据权利要求6所述一种检测转基因玉米NOS终止子的方法，其特征在于步骤A中 所述提取样品DNA的具体步骤如下： 称取1.0 g样品，加入到50mL的离心管中；加入5mL CTAB提取液和20 μ L蛋白酶K溶 液，充分混匀；65 °C孵育30min，不时振荡；吸水性大的样品，加入CTAB提取液的量应根据液 面是否能盖住样品并多出少许而定；65°C过夜后，8000r/min室温离心10min，取Iml上清 液入2ml离心管中；加入700 μ L氯仿后用力振荡，13000g离心10min，转移上清液600 μ L 到新的2ml离心管中；加入2倍体积的CTAB沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min，13000 X g 离心10min，弃去上清，加入350 μ L NaCl溶液将沉淀进行悬浮，再加入350 μ L氯仿，涡旋 振荡进行混勾，13000g离心10min，转移上清后加入0. 8倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室 温放置20min，13000g离心10min，弃去上清，加入500 μ L 70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于 50 μ L TE溶液中。
【专利摘要】本发明公开了检测转基因玉米CBH351的引物、试剂盒和方法，引物：Zein F：TTATGCTCCTTGGTCTTT；Zein R：GTAATAGGGCTGATGATTG；NOS F：TAATTGCGGGACTCTAAT；NOS R：AATCCTGTTGCCGGTCTT。试剂盒：HRM反应预混液10μL；引物0.2-3.4μL；DNA模版1μL；水补齐至20μL。检测方法：提取样品DNA；利用试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增；扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。目的提供一种用于检测玉米Zein基因即内源参照基因及转录终止子NOS的引物、试剂盒及方法，试剂盒的组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，该方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN104894280
【申请号】CN201510359745
【发明人】蔡先全, 邱德义, 张静, 岳巧云, 李蓉, 萧绮倩, 邱霞, 柏建山, 赵美转
【申请人】蔡先全
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月25日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测转基因玉米NOS终止子及内源基因 Zein的引物；本发明还涉 及一种包括上述引物的双重荧光PC检测试剂盒，本发明还涉及一种采用上述试剂盒检测 转基因玉米NOS终止子及内源基因 Zein的方法。
【背景技术】
[0002] 玉米是世界上最重要的粮食作物之一，在世界农业生产中占有重要位置。2005年 转基因作物的发展和推广取得了重大突破，欧盟文员会首次允许转基因抗虫玉米M0N810 在欧盟25个国家商业化种植，捷克斯洛伐克加入转基因玉米种植的行列使欧盟种植转基 因作物的国家达到5个。
[0003] 农业转基因生物技术产业化的发展既是综合国力和竞争力的标志，又是国家科技 竞争优势的重要标志。随着人们生活水平的提高，科技含量低的农产品在国内外逐渐失去 竞争力，科技含量高的生物技术产品在未来市场竞争中将越来越占优势，农业转基因生物 的推广应用，降低了生产成本，减轻了环境污染，提高了产品价格竞争力。转基因作物使产 量增加，农药使用量减少，形成了巨大经济和生态效益。
[0004] 国际上对转基因生物安全性的争论已经不是纯粹的科学技术问题，包含政治、经 济、伦理等诸多方面。很多国家将他们研宄的转基因物种拿到发展中国家中进行试验研宄， 这会引起人们的广泛不满。这不仅仅是技术安全上的争论，也涉及到国家之间的政治与经 济的相互制约。在转基因产品的销售过程中，经营者与消费者之间缺乏公平，消费者经常是 在不知情或者是被动的情况下就进行了消费。由此，我们需要对食品及饲料中转基因玉米 的品系进行鉴定。
[0005] 在检测转基因作物或者来源于转基因作物的原料时有一项必须的检测，那就是检 测它们是否含有所有商业化转基因粮食作物都含有的转基因元素。其中最著名的就是花 挪菜花叶病毒Cauliflower Mosaic Virus的35S启动子和根瘤土壤杆菌grobacterium tumefaciens的NOS终止子。这两种材料被广泛用于转基因操作，能够帮助转基因表达，是 最容易被检测到的转基因材料。
[0006] 针对Zein基因和NOS相关基因，研宄人员已开展了常规PCR和荧光PCR方法研宄。 目前，我国出入境检验检疫行业标准SN/T1194-2003《植物及其产品中转基因成分检测抽 样和制样方法》、SN/T1204-2003《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验 方法》、SN/T《1196-2012转基因成分检测玉米检测方法》中规定了对玉米ZEIN、CaMV35S、 N0S、BAR、PAT、NPT II、CryIA(b)品系中转基因成分的定性检测。这些基因的检测方法大都 采用常规PCR方法和荧光PCR方法。
[0007] 但常规PCR方法需要PCR扩增后进行电泳，不仅操作繁琐，而且容易引起污染，还 需要使用可能致癌的荧光燃料，而探针法荧光PCR方法虽然灵敏准确，但TaqMan探针的线 性结构导致了较高的背景荧光，如果荧光基团和淬灭基团的距离太近，在PCR扩增过程中， 探针在它们之间降解的可能性将大为降低，从而起不到探针的作用。相反，如果荧光基团和 淬灭基团分别置于探针两端，荧光背景信号加强，影响其检测的灵敏度。TaqMan过高的特异 性会导致一个碱基的也限定了其检测目标过于狭窄，另外其合成成本较高，而且试剂有效 期短，很容易降解，因而不能得到广泛的应用。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种用于检测玉米Zein 基因即内源参照基因及转录终止子NOS的引物；
[0009] 本发明另一个目的是，提供一种包括上述引物，组分和配比合理，使用方便，检测 快捷，准确，适用于双重荧光PCR检测玉米Zein基因即内源参照基因及转录终止子NOS的 试剂盒；
[0010] 本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测玉米Zein基因即内源参照基 因及NOS终止子的方法，该方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
[0011] 为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
[0012] 一种检测转基因玉米NOS终止子及内源基因 Zein的引物，其特征在于该引物的序 列分别为：
[0013] 上游引物 Zein F :TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0014] 下游引物 Zein R :GTAATAGGGCTGATGATTG
[0015] 上游引物 NOS F :TAATTGCGGGACTCTAAT
[0016] 下游引物 NOS R :AATCCTGTTGCCGGTCTT。
[0017] 本发明一种检测转基因玉米NOS终止子及内源基因 Zein的试剂盒，其特征在于该 试剂盒中20 μ L反应体系包括以下组分：
[0018] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物Zein F 0.05- 0.8 u L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物Zein R 0.05-0.8 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物NOS F 0.05-0.9 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物NOS R 0.05-0.9 μ L DNA模版 IuL 水 补齐市20 μ L;
[0019] 其中所述上游引物Zein F的序列：TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0020] 所述下游引物 Zein R 的序列：GTAATAGGGCTGATGATTG
[0021] 所述上游引物 NOS F 的序列：TAATTGCGGGACTCTAAT
[0022] 所述下游引物 NOS R 的序列：AATCCTGTTGCCGGTCTT。
[0023] 如上所述的一种检测转基因玉米NOS终止子及内源基因 Zein的试剂盒，其特征在 于该试剂盒中20 μ L反应体系包括以下组分：
[0024] 终浓度i X的HRM反应预混液 10 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZeinF 0.5 U L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZeinR 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物NOS F 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物NOS R 0.5 μ L DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L。
[0025] 本发明一种检测转基因玉米NOS终止子及内源基因 Zein的方法，其特征在于包括 以下步骤：
[0026] A、提取样品DNA ;
[0027] Β、利用如权利要求2或3所述的试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增；
[0028] C、扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。
[0029] 如上所述一种检测转基因玉米NOS终止子及内源基因 Zein的方法，其特征在于步 骤B中PCR扩增的反应程序按以下步骤进行：
[0030] (1)92°C ~96°C预变性 30s ;
[0031] (2)92°C~95°C变性 IOs ~30s，54°C~64°C退火 IOs ~30s，72°C IOs ~30s，共 进行35~45个循环；
[0032] (3) 72°C延伸 IOs ~30s。
[0033] 如上所述一种检测转基因玉米NOS终止子及内源基因 Zein的方法，其特征在于步 骤C中所述高分辨率熔解曲线分析，按以下步骤进行：
[0034] (1)92°C ~96°C 变性 Imin ;
[0035] (2) 40 °C 复性 Imin ;
[0036] (3)然后初始熔解温度60°C~65°C，开始程序升温熔解至90°C~95°C，并在熔解 过程中实时检测荧光信号，15~25次/秒。
[0037] 如上所述一种检测转基因玉米NOS终止子及内源基因 Zein的方法，其特征在于步 骤A中所述提取样品DNA的具体步骤如下：
[0038] 称取LOg样品，加入到50mL的离心管中；加入5mL CTAB提取液和20yL蛋白酶K 溶液，充分混匀；65 °C孵育30min，不时振荡；吸水性大的样品，加入CTAB提取液的量应根据 液面是否能盖住样品并多出少许而定；65°C过夜后，8000r/min室温离心10min，取Iml上 清液入2ml离心管中；加入700 μ L氯仿后用力振荡，13000g离心10min，转移上清液600 μ L 到新的2ml离心管中；加入2倍体积的CTAB沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min，13000 X g 离心10min，弃去上清，加入350 μ L NaCl溶液将沉淀进行悬浮，再加入350 μ L氯仿，涡旋 振荡进行混勾，13000g离心10min，转移上清后加入0. 8倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室 温放置20min，13000g离心10min，弃去上清，加入500 μ L 70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于 50 μ L TE溶液中。
[0039] 本发明中标准品模板的制备：
[0040] 以常规PCR方法扩增目的基因。PCR产物经1 %凝胶电泳分析，采用PCR产物回收 试剂盒对PCR产物进行回收，将纯化后的PCR产物与载体pMD18-T连接，将连接产物转化至 感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选单菌落至含抗生素的液体培养基，过夜培养，提取质粒， 以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测序鉴定。提取验证正确 的阳性重组质粒，并测定其浓度，将其10倍倍比稀释。
[0041] 本发明中敏感性和特异性试验：
[0042] 采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行 Blast比较时，序列均与Genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的阳性质粒模板DNA加 入前述反应体系，采用〇. 1%标准品对其进行灵敏性实验（检测底限）。结果能达到〇. 1% 的检测阈值，重复试验显示检测样品过程中具有很好重复性。稀释模板浓度对数值和Cp值 之间也呈良好的线性关系（R2多0.95)。说明该方法具有较好的精确度和良好的稳定性。 [0043] 本发明与现有技术相比，具有以下优点 ：
[0044] 1)本发明试剂盒组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于荧光PCR检 测玉米Zein基因即内源参照基因和NOS终止子；
[0045] 2)本发明检测方法简化了检测流程，大大缩短了检测周期，检测时间比传统培养 分析方法缩短两天左右；
[0046] 3)本发明检测方法整个过程，PCR产物无需再转入其它分析装置，实现闭管操作， 避免交叉污染，而且可同时完成定量分析。
[0047] 4)采用本发明检测方法在同一反应体系即可实现同时检测玉米Zein基因即内源 参照基因和NOS终止子，操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
【附图说明】
[0048] 图1为仅有玉米Zein基因检出的扩增曲线图；
[0049] 图2为仅有玉米Zein基因检出的HRM分析图；
[0050] 图3为仅有NOS检出的扩增曲线图；
[0051] 图4为仅有NOS检出的的HRM分析图；
[0052] 图5为玉米Zein基因和NOS终止子同时检出的扩增曲线图；
[0053] 图6为玉米Zein基因和NOS终止子同时检出的HRM分析图；
【具体实施方式】
[0054] 下面结合【具体实施方式】对本发明做进一步描述：
[0055] 实施例1
[0056] 本发明用于检测转基因玉米NOS终止子及内源基因 Zein的引物，包括：
[0057] 上游引物 Zein F :TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0058] 下游引物 Zein R :GTAATAGGGCTGATGATTG
[0059] 上游引物 NOS F : TAATTGCGGGACTCTAAT
[0060] 下游引物 NOS R :AATCCTGTTGCCGGTCTT。
[0061] 实施例2
[0062] 本发明用于检测转基因玉米NOS终止子及内源基因 Zein的试剂盒，其中20. 0 yL 反应体系由以下组分组成：
[0063] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZeinF 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZeinR 0,5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物NOS F 05uL 终浓度0.5 pmol/L的下游引物NOS R 0 5 μ L DNA模版 I UL 水 补齐至20 μ L;
[0064] 其中引物序列为：
[0065] 上游引物 Zein F :TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0066] 下游引物 Zein R :GTAATAGGGCTGATGATTG
[0067] 上游引物 NOS F :TAATTGCGGGACTCTAAT
[0068] 下游引物 NOS R :AATCCTGTTGCCGGTCTT。
[0069] 实施例3
[0070] 本发明用于检测转基因玉米NOS终止子及内源基因 Zein的试剂盒，其中20. 0 yL 反应体系由以下组分组成：
[0071] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOpL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZEIN F 0.05 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZEIN R 0.05 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物NOS F 0.05 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物NOS R 0.05 U L DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L。
[0072] 其中：
[0073] 其中所述上游引物 Zein F :TTATGCTCCTTGGTCTTT ;
[0074] 所述下游引物 Zein R :GTAATAGGGCTGATGATTG ;
[0075] 所述上游引物 NOS F :TAATTGCGGGACTCTAAT ;
[0076] 所述下游引物 NOS R :AATCCTGTTGCCGGTCTT。
[0077] 实施例4
[0078] 本发明试剂盒中制备20 μ L反应体系由以下组分组成：
[0079] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL
[0080] 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZEIN F 0.8 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZEIN R 0.8 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物NOS F 0.9 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物NOS R 0.9 μ L DNA模版 I UL 水 补齐市20 μ L。
[0081] 其中所述上游引物 Zein F :TTATGCTCCTTGGTCTTT ;
[0082] 所述下游引物 Zein R :GTAATAGGGCTGATGATTG ;
[0083] 所述上游引物 NOS F :TAATTGCGGGACTCTAAT ;
[0084] 所述下游引物 NOS R :AATCCTGTTGCCGGTCTT。
[0085] 实施例5
[0086] 本发明试剂盒中制备20 μ L反应体系由以下组分组成：
[0087] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOy L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZEIN F 0.05 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZEIN R 0.05 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物NOS F 0.9 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物NOS R 0.9 μ L DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L。
[0088] 其中所述上游引物 Zein F :TTATGCTCCTTGGTCTTT ;
[0089] 所述下游引物 Zein R :GTAATAGGGCTGATGATTG ;
[0090] 所述上游引物 NOS F :TAATTGCGGGACTCTAAT ;
[0091] 所述下游引物 NOS R :AATCCTGTTGCCGGTCTT。
[0092] 实施例6
[0093] 本发明试剂盒中制备20 μ L反应体系由以下组分组成：
[0094] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZEIN F 0.8 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZEIN R 0.8 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物NOS F 0.05 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物NOS R 0.05 μ L DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L。
[0095] 其中所述上游引物 Zein F :TTATGCTCCTTGGTCTTT ;
[0096] 所述下游引物 Zein R :GTAATAGGGCTGATGATTG ;
[0097] 所述上游引物 NOS F :TAATTGCGGGACTCTAAT ;
[0098] 所述下游引物 NOS R :AATCCTGTTGCCGGTCTT。
[0099] 实施例7
[0100] 本发明试剂盒中制备20 μ L反应体系由以下组分组成：
[0101] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZEIN F 0 6 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZEIN R 0.6 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物NOS F 0.7 u L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物NOS R 0.7 μ L DNA模版 IuL
[0102] 水 补齐至20 μ L。
[0103] 其中所述上游引物 Zein F :TTATGCTCCTTGGTCTTT ;
[0104] 所述下游引物 Zein R :GTAATAGGGCTGATGATTG ;
[0105] 所述上游引物 NOS F : TAATTGCGGGACTCTAAT ;
[0106] 所述下游引物 NOS R :AATCCTGTTGCCGGTCTT。
[0107] 实施例8
[0108] 本发明一种检测转基因玉米NOS终止子及内源基因 Zein的方法，包括以下步骤：
[0109] A、提取样品DNA ;
[0110] B、利用检测转基因玉米NOS终止子及内源基因 Zein用的试剂盒，对步骤A中的样 品DNA进行PCR扩增；其中所述试剂盒中20 μ L反应体系包括以下组分：
[0111] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZEIN F 0 5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZEINR 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物NOS F 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物NOSR 0.5 μ L DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L。
[0112] 其中所述上游引物 Zein F :TTATGCTCCTTGGTCTTT ;
[0113] 所述下游引物 Zein R :GTAATAGGGCTGATGATTG ;
[0114] 所述上游引物 NOS F : TAATTGCGGGACTCTAAT ;
[0115] 所述下游引物 NOS R :AATCCTGTTGCCGGTCTT。
[0116] 其中PCR扩增的反应程序按以下步骤进行：
[0117] (1)92°C~96°C预变性 30s ;
[0118] (2)92°C~95°C变性 IOs ~30s，54°C~64°C退火 IOs ~30s，72°C IOs ~30s，共 进行35~45个循环；
[0119] (3)72°C延伸 IOs ~30s。
[0120] C、扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。所述高 分辨率熔解曲线分析，按以下步骤进行：
[0121] (1)92°C ~96°C 变性 Imin ;
[0122] (2) 40 °C 复性 Imin ;
[0123] (3)然后初始熔解温度60°C~65°C，开始程序升温熔解至90°C~95°C，并在熔解 过程中实时检测荧光信号，15~25次/秒。
[0124] 实施例9
[0125] 称取1.0 g样品（根据样品的DNA含量，可以调整样品量），加入到50mL的离心管 中；加入5mL CTAB提取液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混匀。65°C孵育30min，不时振荡； 吸水性大的样品，加入CTAB提取液的量应根据液面是否能盖住样品并多出少许而定；65°C 过夜后，8000r/min室温离心10min,取Iml上清液入2ml离心管中；加入700 μ L氯仿后 用力振荡，13000Xg离心10min，转移上清液600 μ L到新的2ml离心管中；加入2倍体积 的CTAB沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min，13000 X g离心10min，弃去上清，加入350 μ L NaCl溶液将沉淀进行悬浮，再加入350 μ L氯仿，祸旋振荡进行混勾，13000 Xg离心10min， 转移上清后加入0. 8倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20min，13000Xg离心10min， 弃去上清，加入500 μ L 70 %乙醇溶液洗涤沉淀，加入TE溶液溶解沉淀，然后取I. 0 μ L提取 物加入到以下反应体系，
[0126] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZEIN F 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZEINR 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物NOS F 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物NOSR 0.5 μ L DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L。
[0127] 其中所述上游引物 Zein F :TTATGCTCCTTGGTCTTT ;
[0128] 所述下游引物 Zein R :GTAATAGGGCTGATGATTG ;
[0129] 所述上游引物 NOS F : TAATTGCGGGACTCTAAT ;
[0130] 所述下游引物 NOS R :AATCCTGTTGCCGGTCTT。
[0131] 进行荧光PCR扩增，按以下步骤进行：
[0132] (1)92°C~96°C预变性 30s ;
[0133] (2)92°C~96°C变性5s~10s，54°C~64°C退火20s~40s，共进行35~45个循 环。
[0134] A、对扩增后的产物进行HRM分析后判定结果。
[0135] 对PCR扩增产物进行HRM分析，按以下步骤进行：
[0136] (1)92°C ~96°C 变性 Imin ;
[0137] (2) 40 °C 复性 Imin ;
[0138] (3)然后初始熔解温度60°C~65°C，开始程序升温熔解至92°C~96°C，并在熔解 过程中实时检测荧光信号，15~25次/秒。
[0139] 本发明中标准DNA模版的制备：
[0140] 以常规PCR方法扩增耐药基因目的基因 ZEIN和NOS。PCR产物经1 %凝胶电泳分 析，采用PCR产物回收试剂盒对PCR产物进行回收，将纯化后的PCR产物与载体pMD18-T 连接，将连接产物转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选单菌落至含抗生素的液体培养 基，过夜培养，提取质粒，以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测 序鉴定。提取验证正确的阳性重组质粒，并测定其浓度，将其10倍倍比稀释。
[0141] 结果分析：
[0142] 如果样品荧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值〈35,而且熔解曲线有一个特异性波 峰，Tm值为88. 23±0. 15°C，可判为玉米Zein基因即内源参照基因检出。
[0143] 如果样品荧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值〈35,熔解曲线有一个特异性波峰， Tm值为77. 69±0. 15°C，可判为NOS检出。
[0144] 如果样品荧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值〈35,而且有两个波峰，Tm值分别为 76. 68±0. 15°C和83. 75±0. 15°C，可判为玉米Zein基因即内源参照基因和NOS均检出。
[0145] 如果样品荧光PCR扩增曲线明显，35〈Ct值〈40,重复一次，如果仍有明显上升曲 线，则至少有一个目的基因为检出，同时根据前述HRM分析图波峰情况和Tm值进行相应判 断。
[0146] 如果样品荧光PCR扩增曲线明显Ct值>40,或无明显扩增曲线和Tm值，判为玉米 Zein基因即内源参照基因和NOS均检测阴性。
[0147] 本发明中敏感性和特异性试验：
[0148] 采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行 Blast比较时，序列均与Genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的阳性质粒模板DNA加 入前述反应体系，采用〇. 1%标准品对其进行灵敏性实验。结果能达到〇. 1%的检测阈值， 重复试验显示检测样品过程中具有很好重复性。稀释模板浓度对数值和Cp值之间也呈良 好的线性关系。说明该方法具有较好的精确度和良好的稳定性。
[0149] 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技 术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明 本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些 变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及 其等效物界定。
【主权项】
1. 一种检测转基因玉米NOS终止子的引物，其特征在于该引物的序列分别为： 上游引物 Zein F:TTATGCTCCTTGGTCTTT 下游引物 Zein R:GTAATAGGGCTGATGATTG 上游引物 NOS F :TAATTGCGGGACTCTAAT 下游引物 NOS R:AATCCTGTTGCCGGTCTT。2. -种检测转基因玉米NOS终止子的试剂盒，其特征在于该试剂盒中20 μ L反应体系 包括以下组分：其中所述上游引物Zein F的序列：TTATGCTCCTTGGTCTTT 所述下游引物Zein R的序列：GTAATAGGGCTGATGATTG 所述上游引物NOS F的序列：TAATTGCGGGACTCTAAT 所述下游引物NOS R的序列：AATCCTGTTGCCGGTCTT。3. 根据权利要求2所述的一种检测转基因玉米NOS终止子的试剂盒，其特征在于该试 剂盒中20 μ L反应体系包括以下组分：4. 一种检测转基因玉米NOS终止子的方法，其特征在于包括以下步骤： A、提取样品DNA ; B、 利用如权利要求2或3所述的试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增； C、 扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。5. 根据权利要求4所述一种检测转基因玉米NOS终止子的方法，其特征在于步骤B中 PCR扩增的反应程序按以下步骤进行： (1) 92°C ~96°C预变性 30s ; (2) 92°C~95°C变性 IOs ~30s，54°C~64°C退火 IOs ~30s，72°C IOs ~30s，共进行 35~45个循环； (3) 72°C延伸 IOs ~30s。6. 根据权利要求5所述一种检测转基因玉米NOS终止子的方法，其特征在于步骤C中 所述高分辨率熔解曲线分析，按以下步骤进行： (1) 92°C~96°C变性 Imin ; (2) 40 °C 复性 Imin ; (3) 然后初始熔解温度60°C~65°C，开始程序升温熔解至90°C~95°C，并在熔解过程 中实时检测荧光信号，15~25次/秒。7. 根据权利要求6所述一种检测转基因玉米NOS终止子的方法，其特征在于步骤A中 所述提取样品DNA的具体步骤如下： 称取1.0 g样品，加入到50mL的离心管中；加入5mL CTAB提取液和20 μ L蛋白酶K溶 液，充分混匀；65 °C孵育30min，不时振荡；吸水性大的样品，加入CTAB提取液的量应根据液 面是否能盖住样品并多出少许而定；65°C过夜后，8000r/min室温离心10min，取Iml上清 液入2ml离心管中；加入700 μ L氯仿后用力振荡，13000g离心10min，转移上清液600 μ L 到新的2ml离心管中；加入2倍体积的CTAB沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min，13000 X g 离心10min，弃去上清，加入350 μ L NaCl溶液将沉淀进行悬浮，再加入350 μ L氯仿，涡旋 振荡进行混勾，13000g离心10min，转移上清后加入0. 8倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室 温放置20min，13000g离心10min，弃去上清，加入500 μ L 70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于 50 μ L TE溶液中。
【专利摘要】本发明公开了检测转基因玉米CBH351的引物、试剂盒和方法，引物：Zein F：TTATGCTCCTTGGTCTTT；Zein R：GTAATAGGGCTGATGATTG；NOS F：TAATTGCGGGACTCTAAT；NOS R：AATCCTGTTGCCGGTCTT。试剂盒：HRM反应预混液10μL；引物0.2-3.4μL；DNA模版1μL；水补齐至20μL。检测方法：提取样品DNA；利用试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增；扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。目的提供一种用于检测玉米Zein基因即内源参照基因及转录终止子NOS的引物、试剂盒及方法，试剂盒的组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，该方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN104894280
【申请号】CN201510359745
【发明人】蔡先全, 邱德义, 张静, 岳巧云, 李蓉, 萧绮倩, 邱霞, 柏建山, 赵美转
【申请人】蔡先全
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月25日
最新回复(0)