检测转基因大豆mon87708的引物、试剂盒和方法
检测转基因大豆mon87708的引物、试剂盒和方法
【技术领域】
[0001] 本发明设计一种检测转基因大豆M0N87708及内源基因 Lectin的双重荧光PC检 测试剂盒，本发明还涉及一种采用上述试剂盒转基因大豆M0N87708及内源基因 Lectin的 方法。
【背景技术】
[0002] 20世纪80年代，除草剂生产公司孟山都研宄人员，从矮牵牛中克隆获得抗性基 因一EPSPS基因即脓杆菌的5 -烯酮丙酮酸莽草酸一 3 -磷酸酶基因。应用Ti质粒介导 转移DNA即TV-DNA技术，将矮牵牛Ti质粒CaMv中35S启动子控制的EPSPS基因导入大豆 基因组中，进而育成抗除草剂草甘磷的转基因大豆品种Roundup Ready Soybean，简称RR大 豆。这种转基因大豆于1994年获得美国FDA批准，并较早地成为进行商业化大规模推广生 产的转基因作物之一。
[0003] 2012年全球转基因作物的种植面积达1. 703亿公顷，与2011年的1. 6亿公顷相 比，增长了 6. 4%。2012年全球种植转基因作物的国家共有28个，总种植面积达1. 7亿公 顷。美国、巴西、阿根廷、加拿大和印度是全球种植面积排名前五的国家，这五个国家的种植 面积占据了全球总转基因作物种植面积的将近90%。美国是全球转基因作物种植面积最大 的国家，棉花，玉米和大豆这三种作物的转基因品种的总种植面积占三种作物总种植面积 的90%左右。2001年世界种植大豆总面积7200万公顷，而转基因大豆有3330万公顷占据 全球转基因作物的63%。2012年全球种植的大豆有81%为转基因品种，且均为抗除草剂 大豆。当然除此外，还有一些改良性状的新品种大豆也相继问世。营养学家则称21世纪是 "大豆的世纪"。由此可见，转基因大豆在转基因作物及未来食品中占有重要地位。
[0004] 我国自1995年起，大豆由净出口变为净进口，而且进口量逐年增加。进口大豆主 要来源于美国、加拿大、阿根廷和巴西等转基因作物种植面积大国。我国种植的大豆是非转 基因品种，这是我国大豆及其加工产品在国际竞争中的优势所在。非转基因大豆走俏国际 市场，其价格要高出转基因大豆20%~30%。加强转基因大豆的检测，全面实行"标签制 度"，对发展我国大豆产业具有重要意义。由此，我们需要对食品及饲料中转基因大豆的品 系进行鉴定。
[0005] 2015年4月30日，欧盟发布EU NO 2015/700委员会实施条令，批准孟山都转基因 大豆M0N87708用于食品。根据欧盟EC NO 1829/2003号法规4 (2)章节与16(2)章节的要 求，批准以下产品：含有、包括或产自转基因大豆M0N87708的食品与食品配料；含有、包括 或产自转基因大豆M0N87708的饲料；含有、包括转基因大豆M0N87708的其他产品，农业种 植除外。为了加强对转基因大豆特别是进口转基因大豆的品系鉴定，根据欧盟转基因品系 准入相关文献，迫切需要建立食品和饲料中转基因大豆品系荧光PCR检测方法。
[0006] 针对Lectin基因和MON 87708基因，研宄人员已开展了常规PCR和荧光PCR方法 研宄。目前，我国出入境检验检疫行业标准SN/T1203-2010《食用油脂中转基因植物成分实 时荧光PCR定性检测方法》、SNT 1204-2003《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR 定性检验方法》中规定了对35S、M0N87708、EPSPS、BAR品系中转基因成分的定性检测。欧 盟标准委员会《Quantitative PCR method for detection of soybean event M0N87708》 则公布了 M0N87708荧光PCR检测方法。这些基因的检测方法大都采用常规PCR方法或荧 光PCR方法。
[0007] 但常规PCR方法需要PCR扩增后进行电泳，不仅操作繁琐，而且容易引起污染，还 需要使用可能致癌的荧光燃料，而探针法荧光PCR方法虽然灵敏准确，但TaqMan探针的线 性结构导致了较高的背景荧光，如果荧光基团和淬灭基团的距离太近，在PCR扩增过程中， 探针在它们之间降解的可能性将大为降低，从而起不到探针的作用。相反，如果荧光基团和 淬灭基团分别置于探针两端，荧光背景信号加强，影响其检测的灵敏度。TaqMan过高的特异 性会导致一个碱基的也限定了其检测目标过于狭窄，另外其合成成本较高，而且试剂有效 期短，很容易降解，因而，不能在基层得到广泛的应用。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种检测转基因大豆 M0N87708及内源基因 Lectin的引物；
[0009] 本发明还涉及一种包括上述引物且组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确， 适用于双重荧光PCR检测转基因大豆M0N87708及内源基因 Lectin的试剂盒；
[0010] 本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测转基因大豆M0N87708及内源 基因 Lectin的方法，该方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
[0011] 为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
[0012] -种转基因大? M0N87708及内源基因 Lectin的引物，其特征在于该引物的序列 分别为：
[0013] 上游引物 LectinF :TCTGTCGTTGTGGTGCTA
[0014] 下游引物 LectinR :CTGCGAGATTTGCTATGT
[0015] 上游引物 MON 87708F :GTCAAGGAGGACAAGGTCG
[0016] 下游引物 MON877O8R :CCAATGCCATAATACTCAAAC。
[0017] 一种检测转基因大豆M0N87708及内源基因 Lectin的试剂盒，其特征在于该试剂 盒中20 μ L反应体系包括以下组分：
[0018] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度 0.5 pmol/L 的上游引物 Lectin F 0.05- 0.8 μ L 终浓度 0.5 pmol/L 的下游引物 LectinR 0.05- 0.8 μ L 终浓度 0.5 pmol/L 的上游引物 MON87708F 0.05-0.9 u L 终浓度 0.5 pmol/L 的下游引物 MON87708R 0.05- 0.9 μ L DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L;
[0019] 其中所述上游引物LectinF的序列：TCTGTCGTTGTGGTGCTA
[0020] 所述下游引物 LectinR 的序列：CTGCGAGATTTGCTATGT
[0021] 所述上游引物 MON 87708F 的序列：GTCAAGGAGGACAAGGTCG
[0022] 所述下游引物 M0N87708R 的序列：CCAATGCCATAATACTCAAAC。
[0023] 如上所述的一种检测转基因大豆M0N87708及内源基因 Lectin的试剂盒，其特征 在于该试剂盒中20 μ L反应体系包括以下组分：
[0024] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物LectinF 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物LectinR 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物M0N87708F 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物MON87708R 0.5 u L DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L。
[0025] 一种检测Lectin及转基因大豆的方法，其特征在于包括以下步骤：
[0026] A、提取样品DNA ;
[0027] B、利用如权利要求2或3所述的试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增；
[0028] C、扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。
[0029] 如上所述检测Lectin及转基因大豆的方法，其特征在于步骤B中PCR扩增的反应 程序按以下步骤进行：
[0030] (1)92°C ~96°C预变性 30s ;
[0031] (2)92°C~95°C变性 IOs ~30s，54°C~64°C退火 IOs ~30s，72°C IOs ~30s，共 进行35~45个循环；
[0032] (3) 72°C延伸 IOs ~30s。
[0033] 如上所述检测Lectin及转基因大豆的方法，其特征在于步骤C中所述高分辨率熔 解曲线分析，按以下步骤进行：
[0034] (1)92°C ~96°C 变性 Imin ;
[0035] (2) 40 °C 复性 Imin ;
[0036] (3)然后初始熔解温度60°C~65°C，开始程序升温熔解至90°C~95°C，并在熔解 过程中实时检测荧光信号，15~25次/秒。
[0037] 如上所述检测Lectin及转基因大豆的方法，其特征在于步骤A中所述提取样品 DNA的具体步骤如下：
[0038] 称取Ig样品，加入到50mL的离心管中；加入5mL CTAB提取液和20 μ L蛋白酶K 溶液，充分混匀；65°C孵育30min，不时振荡；吸水性大的食品样品，加入CTAB提取液的量 应根据液面是否能盖住样品并多出少许而定；65°C过夜后，8000r/min室温离心10min，取 Iml上清液入2ml离心管中；加入700 μ L氯仿后用力振荡，13000g离心10min，转移上清液 600 μ L到新的2ml离心管中；加入2倍体积的CTAB沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min， 13000 Xg离心10min，弃去上清，加入350 μ L NaCl溶液将沉淀进行悬浮，再加入350 μ L氯 仿，涡旋振荡进行混匀，13000g离心10min，转移上清后加入0. 8倍体积的异丙醇用来沉淀 核酸，室温放置20min，13000g离心10min，弃去上清，加入500 μ L 70%乙醇溶液洗涤沉淀， 溶解于50 μ L TE溶液中。
[0039] 本发明中标准品模板的制备：
[0040] 以常规PCR方法扩增目的基因。PCR产物经1 %凝胶电泳分析，采用PCR产物回收 试剂盒对PCR产物进行回收，将纯化后的PCR产物与载体pMD18-T连接，将连接产物转化至 感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选单菌落至含抗生素的液体培养基，过夜培养，提取质粒， 以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测序鉴定。提取验证正确 的阳性重组质粒，并测定其浓度，将其10倍倍比稀释。
[0041] 本发明中敏感性和特异性试验：
[0042] 采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行 Blast比 较时，序列均与Genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的阳性质粒模板DNA加 入前述反应体系，采用〇. 1%标准品对其进行灵敏性实验。结果能达到〇. 1%的检测阈值， 重复试验显示检测样品过程中具有很好重复性。稀释模板浓度对数值和Cp值之间也呈良 好的线性关系R 2多〇. 95。说明该方法具有较好的精确度和良好的稳定性。
[0043] 本发明与现有技术相比，具有以下优点：
[0044] 1)本发明试剂盒组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于荧光PCR检 测大豆Lectin基因和MON 87708基因；
[0045] 2)本发明检测方法简化了检测流程，大大缩短了检测周期，检测时间比传统培养 分析方法缩短两天左右；
[0046] 3)本发明检测方法整个过程，PCR产物无需再转入其它分析装置，实现闭管操作， 避免交叉污染，而且可同时完成定量分析。
[0047] 4)采用本发明检测方法在同一反应体系即可实现同时检测大豆Lectin基因和 MON 87708基因，操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
【附图说明】
[0048] 图1为仅有大豆Lectin基因检出的扩增曲线图；
[0049] 图2为仅有大豆Lectin基因检出的HRM分析图；
[0050] 图3为仅有MON 87708检出的扩增曲线图；
[0051] 图4为仅有MON 87708检出的的HRM分析图；
[0052] 图5为大豆Lectin基因和MON 87708基因同时检出的扩增曲线图；
[0053] 图6为大豆Lectin基因和MON 87708基因同时检出的HRM分析图；
【具体实施方式】
[0054] 下面结合【具体实施方式】对本发明做进一步描述：
[0055] 实施例1
[0056] 本发明检测转基因大? M0N87708及内源基因 Lectin的引物，该引物的序列分别 为：
[0057] 上游引物 LectinF :TCTGTCGTTGTGGTGCTA
[0058] 下游引物 LectinR :CTGCGAGAITTGCTATGT
[0059] 上游引物 MON 87708F :GTCAAGGAGGACAAGGTCG
[0060] 下游引物 MON877O8R :CCAATGCCATAATACTCAAAC。
[0061] 实施例2
[0062] 本发明一种检测转基因大豆M0N87708及内源基因 Lectin的试剂盒，其中20 μ L 反应体系包括以下组分：
[0063] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物LectinF 0.5 U L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物LectinR 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物M0N87708F 0 5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物M0N87708R 0.5 μ L DNA模版 I UL 水 补齐.申:20 μ L。
[0064] 其中引物序列如下：
[0065] 上游引物 LectinF :TCTGTCGTTGTGGTGCTA
[0066] 下游引物 LectinR :CTGCGAGATTTGCTATGT
[0067] 上游引物 MON 87708F :GTCAAGGAGGACAAGGTCG
[0068] 下游引物 MON877O8R :CCAATGCCATAATACTCAAAC。
[0069] 实施例3
[0070] 本发明用于检测转基因大豆M0N87708及内源基因 Lectin的试剂盒，其中20. 0 μ L 反应体系由以下组分组成：
[0071] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物LECTIN F 0.05 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物LECTIN R 0.05 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ΜΟΝ87708 F 0.05 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ΜΟΝ87708 R 0.05 μ L
[0072] DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L。
[0073] 其中：
[0074] 其中引物序列如下：
[0075] 上游引物 LectinF :TCTGTCGTTGTGGTGCTA
[0076] 下游引物 LectinR :CTGCGAGATTTGCTATGT
[0077] 上游引物 MON 87708F :GTCAAGGAGGACAAGGTCG
[0078] 下游引物 MON877O8R :CCAATGCCATAATACTCAAAC。
[0079] 实施例4
[0080] 本发明试剂盒中制备20 μ L反应体系由以下组分组成：
[0081] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物LECTIN F 0 8 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物LECTIN R 0.8 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ΜΟΝ87708 F 0,9 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ΜΟΝ87708 R 0.9 μ L DNA模版 IuL 水 补齐至20 PL。
[0082] 其中引物序列如下：
[0083] 上游引物 LectinF :TCTGTCGTTGTGGTGCTA
[0084] 下游引物 LectinR :CTGCGAGAITTGCTATGT
[0085] 上游引物 MON 87708F :GTCAAGGAGGACAAGGTCG
[0086] 下游引物 M0N87708R :CCAATGCCATAATACTCAAAC。
[0087] 实施例5
[0088] 本发明试剂盒中制备20 μ L反应体系由以下组分组成：
[0089] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物LECTIN F 0.05 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物LECTIN R 0.05 u L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物MON87708 F 0.9 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ΜΟΝ87708 R 0.9 μ L DNA模版 IpL 水 补齐至20 μ L 〇
[0090] 其中引物序列如下：
[0091] 上游引物 LectinF :TCTGTCGTTGTGGTGCTA
[0092] 下游引物 LectinR :CTGCGAGAITTGCTATGT
[0093] 上游引物 MON 87708F :GTCAAGGAGGACAAGGTCG
[0094] 下游引物 M0N87708R :CCAATGCCATAATACTCAAAC。
[0095] 实施例6
[0096] 本发明试剂盒中制备20 μ L反应体系由以下组分组成：
[0097] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物LECTINF 0.8 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物LECTIN R 0.8 U L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物MON87708 F 0.05 μ L 终浓皮0.5 pmol/L的下游引物ΜΟΝ87708 R 0.05 μ L DNA模版 IPL
[0098] 水 补齐至20 μ L。
[0099] 其中引物序列如下：
[0100] 上游引物 LectinF :TCTGTCGTTGTGGTGCTA
[0101] 下游引物 LectinR :CTGCGAGATTTGCTATGT
[0102] 上游引物 MON 87708F :GTCAAGGAGGACAAGGTCG
[0103] 下游引物 M0N87708R :CCAATGCCATAATACTCAAAC。
[0104] 实施例7
[0105] 本发明试剂盒中制备20 μ L反应体系由以下组分组成：
[0106] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物LECTIN F 0 6 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物LECTIN R 0,6 U L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物MON87708 F 0.7 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ΜΟΝ87708 R 0.7 μ L DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L 。
[0107] 其中引物序列如下：
[0108] 上游引物 LectinF :TCTGTCGTTGTGGTGCTA
[0109] 下游引物 LectinR :CTGCGAGATTTGCTATGT
[0110] 上游引物 MON 87708F :GTCAAGGAGGACAAGGTCG
[0111] 下游引物 M0N87708R :CCAATGCCATAATACTCAAAC。
[0112] 实施例8
[0113] 本发明检测转基因大豆M0N87708及内源基因 Lectin的方法，包括以下步骤：
[0114] A、提取样品DNA ;
[0115] B、对步骤A中的样品DNA进行荧光PCR扩增，其中反应体系由以下组分组成：
[0116] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOpL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物LectinF 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物LectinR 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物MON87708F 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物MON87708R 0.5 μ L DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L 。
[0117] 其中引物序列如下：
[0118] 上游引物 LectinF :TCTGTCGTTGTGGTGCTA
[0119] 下游引物 LectinR :CTGCGAGATTTGCTATGT
[0120] 上游引物 MON 87708F :GTCAAGGAGGACAAGGTCG
[0121] 下游引物 M0N87708R :CCAATGCCATAATACTCAAAC。
[0122] 所述的荧光PCR扩增按以下步骤进行：
[0123] (1)92°C ~96°C预变性 30s ;
[0124] (2)92°C~96°C变性5s~10s，54°C~64°C退火20s~40s，共进行 35~45个循 环。
[0125] C、对扩增后的产物进行HRM分析后判定结果。
[0126] 其中对PCR扩增产物进行HRM分析，按以下步骤进行：
[0127] (1)92°C~96°C变性 Imin ;
[0128] (2) 40 °C 复性 Imin ;
[0129] (3)然后初始熔解温度60°C~65°C，开始程序升温熔解至92°C~96°C，并在熔解 过程中实时检测荧光信号，15~25次/秒。
[0130] 实施例4
[0131] 称取Ig样品，其中可根据样品的DNA含量，调整样品量，加入到50mL的离心管中； 加入5mL CTAB提取液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混匀。65°C孵育30min，不时振荡；吸水 性大的食品样品，加入CTAB提取液的量应根据液面是否能盖住样品并多出少许而定；65°C 过夜后，8000r/min室温离心10min，取Iml上清液入2ml离心管中；加入700 μ L氯仿后用 力振荡，13000g离心10min，转移上清液600 μ L到新的2ml离心管中；加入2倍体积的CTAB 沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min，13000 X g离心10min，弃去上清，加入350 μ L NaCl溶 液将沉淀进行悬浮，再加入350 μ L氯仿，祸旋振荡进行混勾，13000g离心10min，转移上清 后加入0. 8倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20min，13000g离心10min，弃去上清， 加入500 μ L 70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于50 μ L TE溶液中。然后取I. 0 μ L提取物加入 到以下反应体系，
[0132] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOpL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物LectinF 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物LectinR 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物MON87708F 0.5 μ L
[0133] 终浓度0.5 pmol/L的下游引物MON87708R 0.5 μ L DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L 〇
[0134] 其中引物序列如下：
[0135] 上游引物 LectinF :TCTGTCGTTGTGGTGCTA
[0136] 下游引物 LectinR :CTGCGAGATTTGCTATGT
[0137] 上游引物 MON 87708F :GTCAAGGAGGACAAGGTCG
[0138] 下游引物 M0N87708R :CCAATGCCATAATACTCAAAC。
[0139] 进行荧光PCR扩增，按以下步骤进行：
[0140] (1)92°C~96°C预变性 30s ;
[0141] (2)92°C~96°C变性5s~10s，54°C~64°C退火20s~40s，共进行35~45个循 环。
[0142] A、对扩增后的产物进行HRM分析后判定结果。
[0143] 对PCR扩增产物进行HRM分析，按以下步骤进行：
[0144] (1)92°C ~96°C 变性 Imin ;
[0145] (2) 40 °C 复性 Imin ;
[0146] (3)然后初始熔解温度60 °C~65 °C，开始程序升温熔解至92 °C~96 °C，并在熔解 过程中实时检测荧光信号，15~25次/秒。
[0147] 本发明中标准DNA模版的制备：
[0148] 以常规PCR方法扩增耐药基因目的基因 Lectin和MON 87708。PCR产物经1 %凝 胶电泳分析，采用PCR产物回收试剂盒对PCR产物进行回收，将纯化后的PCR产物与载体 PMD18-T连接，将连接产物转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选单菌落至含抗生素的 液体培养基，过夜培养，提取质粒，以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质 粒进行测序鉴定。提取验证正确的阳性重组质粒，并测定其浓度，将其10倍倍比稀释。
[0149] 结果分析
[0150] 如果样品荧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值〈35,而且熔解曲线有一个特异性波 峰，Tm值为87. 49±0. 15°C，可判为大豆Lectin基因检出。
[0151] 如果样品荧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值〈35,熔解曲线有一个特异性波峰， Tm 值为 83. 60±0. 15°C，可判为 MON 87708 检出。
[0152] 如果样品荧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值〈35,而且有两个波峰，Tm值分别为 82. 51±0. 15°C和 87. 43±0. 15°C，可判为大豆 Lectin 基因和 MON 87708 均检出。
[0153] 如果样品荧光PCR扩增曲线明显，35〈Ct值〈40,重复一次，如果仍有明显上升曲 线，则至少有一个目的基因为检出，同时根据前述熔解曲线分析图波峰发生情况和Tm值进 行相应判断。
[0154] 如果样品荧光PCR扩增曲线明显Ct值>40,或无明显扩增曲线和Tm值，判为大豆 Lectin基因和MON 87708均检测阴性。
[0155] 本发明中敏感性和特异性试验：
[0156] 采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行 Blast比较时，序列均与Genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的阳性质粒模板DNA加 入前述反应体系，采用〇. 1%标准品对其进行灵敏性实验。结果能达到〇. 1%的检测阈值， 重复试验显示检测样品过程中具有很好重复性。稀释模板浓度对数值和Cp值之间也呈良 好的线性关系R 2多〇. 95。说明该方法具有较好的精确度和良好的稳定性。
[0157] 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技 术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明 本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些 变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及 其等效物界定。
【主权项】
1. 一种检测转基因大豆M0N87708的引物，其特征在于该引物的序列分别为： 上游引物 LectinF :TCTGTCGTTGTGGTGCTA 下游引物 LectinR :CTGCGAGATTTGCTATGT 上游引物 MON 87708F :GTCAAGGAGGACAAGGTCG 下游引物 M0N87708R :CCAATGCCATAATACTCAAAC。2. -种检测转基因大豆M0N87708的试剂盒，其特征在于该试剂盒中20 μ L反应体系包 括以下组分：其中所述上游引物LectinF的序列：TCTGTCGTTGTGGTGCTA 所述下游引物LectinR的序列：CTGCGAGATTTGCTATGT 所述上游引物 MON 87708F 的序列：GTCAAGGAGGACAAGGTCG 所述下游引物 M0N87708R 的序列：CCAATGCCATAATACTCAAAC。3. 根据权利要求2所述的一种检测转基因大豆M0N87708的试剂盒，其特征在于该试剂 盒中20 μ L反应体系包括以下组分：4. 一种检测转基因大豆Μ0Ν87708的方法，其特征在于包括以下步骤： A、提取样品DNA ; B、 利用如权利要求2或3所述的试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增； C、 扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。5. 根据权利要求4所述检测转基因大豆M0N87708的方法，其特征在于步骤B中PCR扩 增的反应程序按以下步骤进行： (1) 92°C ~96°C预变性 30s ; (2) 92°C~95°C变性 IOs ~30s，54°C~64°C退火 IOs ~30s，72°C IOs ~30s，共进行 35~45个循环； (3) 72°C延伸 IOs ~30s。6. 根据权利要求5所述检测转基因大豆M0N87708的方法，其特征在于步骤C中所述高 分辨率熔解曲线分析，按以下步骤进行： (1) 92°C~96°C变性 Imin ; (2) 40 °C 复性 Imin ; (3) 然后初始熔解温度60°C~65°C，开始程序升温熔解至90°C~95°C，并在熔解过程 中实时检测荧光信号，15~25次/秒。7. 根据权利要求6所述检测转基因大豆M0N87708的方法，其特征在于步骤A中所述提 取样品DNA的具体步骤如下： 称取Ig食品样品，加入到50mL的离心管中；加入5mL CTAB提取液和20 μ L蛋白酶K 溶液，充分混匀；65°C孵育30min，不时振荡；吸水性大的食品样品，加入CTAB提取液的量 应根据液面是否能盖住样品并多出少许而定；65°C过夜后，8000r/min室温离心10min，取 Iml上清液入2ml离心管中；加入700 μ L氯仿后用力振荡，13000g离心10min，转移上清液 600 μ L到新的2ml离心管中；加入2倍体积的CTAB沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min， 13000 Xg离心10min，弃去上清，加入350 μ L NaCl溶液将沉淀进行悬浮，再加入350 μ L氯 仿，涡旋振荡进行混匀，13000g离心10min，转移上清后加入0. 8倍体积的异丙醇用来沉淀 核酸，室温放置20min，13000g离心10min，弃去上清，加入500 μ L 70%乙醇溶液洗涤沉淀， 溶解于50 μ L TE溶液中。
【专利摘要】本发明公开了检测转基因大豆MON87708的引物、试剂盒和方法，引物：LectinF：TCTGTCGTTGTGGTGCTA；LectinR：CTGCGAGATTTGCTATGT；MON87708F：GTCAAGGAGGACAAGGTCG；MON87708R：CCAATGCCATAATACTCAAAC。试剂盒：HRM反应预混液10μL；引物0.2-3.4μL；DNA模版1μL；水补齐至20μL。检测方法：提取样品DNA；利用试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增；扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。目的提供一种检测转基因大豆MON87708及内源基因Lectin的引物、试剂盒及方法，试剂盒组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确；该方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104894281
【申请号】CN201510362478
【发明人】蔡先全, 岳巧云, 单振菊, 李蓉, 柏建山, 邱德义, 吴坚明, 周思渝
【申请人】蔡先全
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月25日
【技术领域】
[0001] 本发明设计一种检测转基因大豆M0N87708及内源基因 Lectin的双重荧光PC检 测试剂盒，本发明还涉及一种采用上述试剂盒转基因大豆M0N87708及内源基因 Lectin的 方法。
【背景技术】
[0002] 20世纪80年代，除草剂生产公司孟山都研宄人员，从矮牵牛中克隆获得抗性基 因一EPSPS基因即脓杆菌的5 -烯酮丙酮酸莽草酸一 3 -磷酸酶基因。应用Ti质粒介导 转移DNA即TV-DNA技术，将矮牵牛Ti质粒CaMv中35S启动子控制的EPSPS基因导入大豆 基因组中，进而育成抗除草剂草甘磷的转基因大豆品种Roundup Ready Soybean，简称RR大 豆。这种转基因大豆于1994年获得美国FDA批准，并较早地成为进行商业化大规模推广生 产的转基因作物之一。
[0003] 2012年全球转基因作物的种植面积达1. 703亿公顷，与2011年的1. 6亿公顷相 比，增长了 6. 4%。2012年全球种植转基因作物的国家共有28个，总种植面积达1. 7亿公 顷。美国、巴西、阿根廷、加拿大和印度是全球种植面积排名前五的国家，这五个国家的种植 面积占据了全球总转基因作物种植面积的将近90%。美国是全球转基因作物种植面积最大 的国家，棉花，玉米和大豆这三种作物的转基因品种的总种植面积占三种作物总种植面积 的90%左右。2001年世界种植大豆总面积7200万公顷，而转基因大豆有3330万公顷占据 全球转基因作物的63%。2012年全球种植的大豆有81%为转基因品种，且均为抗除草剂 大豆。当然除此外，还有一些改良性状的新品种大豆也相继问世。营养学家则称21世纪是 "大豆的世纪"。由此可见，转基因大豆在转基因作物及未来食品中占有重要地位。
[0004] 我国自1995年起，大豆由净出口变为净进口，而且进口量逐年增加。进口大豆主 要来源于美国、加拿大、阿根廷和巴西等转基因作物种植面积大国。我国种植的大豆是非转 基因品种，这是我国大豆及其加工产品在国际竞争中的优势所在。非转基因大豆走俏国际 市场，其价格要高出转基因大豆20%~30%。加强转基因大豆的检测，全面实行"标签制 度"，对发展我国大豆产业具有重要意义。由此，我们需要对食品及饲料中转基因大豆的品 系进行鉴定。
[0005] 2015年4月30日，欧盟发布EU NO 2015/700委员会实施条令，批准孟山都转基因 大豆M0N87708用于食品。根据欧盟EC NO 1829/2003号法规4 (2)章节与16(2)章节的要 求，批准以下产品：含有、包括或产自转基因大豆M0N87708的食品与食品配料；含有、包括 或产自转基因大豆M0N87708的饲料；含有、包括转基因大豆M0N87708的其他产品，农业种 植除外。为了加强对转基因大豆特别是进口转基因大豆的品系鉴定，根据欧盟转基因品系 准入相关文献，迫切需要建立食品和饲料中转基因大豆品系荧光PCR检测方法。
[0006] 针对Lectin基因和MON 87708基因，研宄人员已开展了常规PCR和荧光PCR方法 研宄。目前，我国出入境检验检疫行业标准SN/T1203-2010《食用油脂中转基因植物成分实 时荧光PCR定性检测方法》、SNT 1204-2003《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR 定性检验方法》中规定了对35S、M0N87708、EPSPS、BAR品系中转基因成分的定性检测。欧 盟标准委员会《Quantitative PCR method for detection of soybean event M0N87708》 则公布了 M0N87708荧光PCR检测方法。这些基因的检测方法大都采用常规PCR方法或荧 光PCR方法。
[0007] 但常规PCR方法需要PCR扩增后进行电泳，不仅操作繁琐，而且容易引起污染，还 需要使用可能致癌的荧光燃料，而探针法荧光PCR方法虽然灵敏准确，但TaqMan探针的线 性结构导致了较高的背景荧光，如果荧光基团和淬灭基团的距离太近，在PCR扩增过程中， 探针在它们之间降解的可能性将大为降低，从而起不到探针的作用。相反，如果荧光基团和 淬灭基团分别置于探针两端，荧光背景信号加强，影响其检测的灵敏度。TaqMan过高的特异 性会导致一个碱基的也限定了其检测目标过于狭窄，另外其合成成本较高，而且试剂有效 期短，很容易降解，因而，不能在基层得到广泛的应用。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种检测转基因大豆 M0N87708及内源基因 Lectin的引物；
[0009] 本发明还涉及一种包括上述引物且组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确， 适用于双重荧光PCR检测转基因大豆M0N87708及内源基因 Lectin的试剂盒；
[0010] 本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测转基因大豆M0N87708及内源 基因 Lectin的方法，该方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
[0011] 为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
[0012] -种转基因大? M0N87708及内源基因 Lectin的引物，其特征在于该引物的序列 分别为：
[0013] 上游引物 LectinF :TCTGTCGTTGTGGTGCTA
[0014] 下游引物 LectinR :CTGCGAGATTTGCTATGT
[0015] 上游引物 MON 87708F :GTCAAGGAGGACAAGGTCG
[0016] 下游引物 MON877O8R :CCAATGCCATAATACTCAAAC。
[0017] 一种检测转基因大豆M0N87708及内源基因 Lectin的试剂盒，其特征在于该试剂 盒中20 μ L反应体系包括以下组分：
[0018] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度 0.5 pmol/L 的上游引物 Lectin F 0.05- 0.8 μ L 终浓度 0.5 pmol/L 的下游引物 LectinR 0.05- 0.8 μ L 终浓度 0.5 pmol/L 的上游引物 MON87708F 0.05-0.9 u L 终浓度 0.5 pmol/L 的下游引物 MON87708R 0.05- 0.9 μ L DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L;
[0019] 其中所述上游引物LectinF的序列：TCTGTCGTTGTGGTGCTA
[0020] 所述下游引物 LectinR 的序列：CTGCGAGATTTGCTATGT
[0021] 所述上游引物 MON 87708F 的序列：GTCAAGGAGGACAAGGTCG
[0022] 所述下游引物 M0N87708R 的序列：CCAATGCCATAATACTCAAAC。
[0023] 如上所述的一种检测转基因大豆M0N87708及内源基因 Lectin的试剂盒，其特征 在于该试剂盒中20 μ L反应体系包括以下组分：
[0024] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物LectinF 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物LectinR 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物M0N87708F 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物MON87708R 0.5 u L DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L。
[0025] 一种检测Lectin及转基因大豆的方法，其特征在于包括以下步骤：
[0026] A、提取样品DNA ;
[0027] B、利用如权利要求2或3所述的试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增；
[0028] C、扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。
[0029] 如上所述检测Lectin及转基因大豆的方法，其特征在于步骤B中PCR扩增的反应 程序按以下步骤进行：
[0030] (1)92°C ~96°C预变性 30s ;
[0031] (2)92°C~95°C变性 IOs ~30s，54°C~64°C退火 IOs ~30s，72°C IOs ~30s，共 进行35~45个循环；
[0032] (3) 72°C延伸 IOs ~30s。
[0033] 如上所述检测Lectin及转基因大豆的方法，其特征在于步骤C中所述高分辨率熔 解曲线分析，按以下步骤进行：
[0034] (1)92°C ~96°C 变性 Imin ;
[0035] (2) 40 °C 复性 Imin ;
[0036] (3)然后初始熔解温度60°C~65°C，开始程序升温熔解至90°C~95°C，并在熔解 过程中实时检测荧光信号，15~25次/秒。
[0037] 如上所述检测Lectin及转基因大豆的方法，其特征在于步骤A中所述提取样品 DNA的具体步骤如下：
[0038] 称取Ig样品，加入到50mL的离心管中；加入5mL CTAB提取液和20 μ L蛋白酶K 溶液，充分混匀；65°C孵育30min，不时振荡；吸水性大的食品样品，加入CTAB提取液的量 应根据液面是否能盖住样品并多出少许而定；65°C过夜后，8000r/min室温离心10min，取 Iml上清液入2ml离心管中；加入700 μ L氯仿后用力振荡，13000g离心10min，转移上清液 600 μ L到新的2ml离心管中；加入2倍体积的CTAB沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min， 13000 Xg离心10min，弃去上清，加入350 μ L NaCl溶液将沉淀进行悬浮，再加入350 μ L氯 仿，涡旋振荡进行混匀，13000g离心10min，转移上清后加入0. 8倍体积的异丙醇用来沉淀 核酸，室温放置20min，13000g离心10min，弃去上清，加入500 μ L 70%乙醇溶液洗涤沉淀， 溶解于50 μ L TE溶液中。
[0039] 本发明中标准品模板的制备：
[0040] 以常规PCR方法扩增目的基因。PCR产物经1 %凝胶电泳分析，采用PCR产物回收 试剂盒对PCR产物进行回收，将纯化后的PCR产物与载体pMD18-T连接，将连接产物转化至 感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选单菌落至含抗生素的液体培养基，过夜培养，提取质粒， 以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测序鉴定。提取验证正确 的阳性重组质粒，并测定其浓度，将其10倍倍比稀释。
[0041] 本发明中敏感性和特异性试验：
[0042] 采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行 Blast比 较时，序列均与Genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的阳性质粒模板DNA加 入前述反应体系，采用〇. 1%标准品对其进行灵敏性实验。结果能达到〇. 1%的检测阈值， 重复试验显示检测样品过程中具有很好重复性。稀释模板浓度对数值和Cp值之间也呈良 好的线性关系R 2多〇. 95。说明该方法具有较好的精确度和良好的稳定性。
[0043] 本发明与现有技术相比，具有以下优点：
[0044] 1)本发明试剂盒组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于荧光PCR检 测大豆Lectin基因和MON 87708基因；
[0045] 2)本发明检测方法简化了检测流程，大大缩短了检测周期，检测时间比传统培养 分析方法缩短两天左右；
[0046] 3)本发明检测方法整个过程，PCR产物无需再转入其它分析装置，实现闭管操作， 避免交叉污染，而且可同时完成定量分析。
[0047] 4)采用本发明检测方法在同一反应体系即可实现同时检测大豆Lectin基因和 MON 87708基因，操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
【附图说明】
[0048] 图1为仅有大豆Lectin基因检出的扩增曲线图；
[0049] 图2为仅有大豆Lectin基因检出的HRM分析图；
[0050] 图3为仅有MON 87708检出的扩增曲线图；
[0051] 图4为仅有MON 87708检出的的HRM分析图；
[0052] 图5为大豆Lectin基因和MON 87708基因同时检出的扩增曲线图；
[0053] 图6为大豆Lectin基因和MON 87708基因同时检出的HRM分析图；
【具体实施方式】
[0054] 下面结合【具体实施方式】对本发明做进一步描述：
[0055] 实施例1
[0056] 本发明检测转基因大? M0N87708及内源基因 Lectin的引物，该引物的序列分别 为：
[0057] 上游引物 LectinF :TCTGTCGTTGTGGTGCTA
[0058] 下游引物 LectinR :CTGCGAGAITTGCTATGT
[0059] 上游引物 MON 87708F :GTCAAGGAGGACAAGGTCG
[0060] 下游引物 MON877O8R :CCAATGCCATAATACTCAAAC。
[0061] 实施例2
[0062] 本发明一种检测转基因大豆M0N87708及内源基因 Lectin的试剂盒，其中20 μ L 反应体系包括以下组分：
[0063] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物LectinF 0.5 U L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物LectinR 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物M0N87708F 0 5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物M0N87708R 0.5 μ L DNA模版 I UL 水 补齐.申:20 μ L。
[0064] 其中引物序列如下：
[0065] 上游引物 LectinF :TCTGTCGTTGTGGTGCTA
[0066] 下游引物 LectinR :CTGCGAGATTTGCTATGT
[0067] 上游引物 MON 87708F :GTCAAGGAGGACAAGGTCG
[0068] 下游引物 MON877O8R :CCAATGCCATAATACTCAAAC。
[0069] 实施例3
[0070] 本发明用于检测转基因大豆M0N87708及内源基因 Lectin的试剂盒，其中20. 0 μ L 反应体系由以下组分组成：
[0071] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物LECTIN F 0.05 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物LECTIN R 0.05 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ΜΟΝ87708 F 0.05 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ΜΟΝ87708 R 0.05 μ L
[0072] DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L。
[0073] 其中：
[0074] 其中引物序列如下：
[0075] 上游引物 LectinF :TCTGTCGTTGTGGTGCTA
[0076] 下游引物 LectinR :CTGCGAGATTTGCTATGT
[0077] 上游引物 MON 87708F :GTCAAGGAGGACAAGGTCG
[0078] 下游引物 MON877O8R :CCAATGCCATAATACTCAAAC。
[0079] 实施例4
[0080] 本发明试剂盒中制备20 μ L反应体系由以下组分组成：
[0081] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物LECTIN F 0 8 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物LECTIN R 0.8 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ΜΟΝ87708 F 0,9 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ΜΟΝ87708 R 0.9 μ L DNA模版 IuL 水 补齐至20 PL。
[0082] 其中引物序列如下：
[0083] 上游引物 LectinF :TCTGTCGTTGTGGTGCTA
[0084] 下游引物 LectinR :CTGCGAGAITTGCTATGT
[0085] 上游引物 MON 87708F :GTCAAGGAGGACAAGGTCG
[0086] 下游引物 M0N87708R :CCAATGCCATAATACTCAAAC。
[0087] 实施例5
[0088] 本发明试剂盒中制备20 μ L反应体系由以下组分组成：
[0089] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物LECTIN F 0.05 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物LECTIN R 0.05 u L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物MON87708 F 0.9 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ΜΟΝ87708 R 0.9 μ L DNA模版 IpL 水 补齐至20 μ L 〇
[0090] 其中引物序列如下：
[0091] 上游引物 LectinF :TCTGTCGTTGTGGTGCTA
[0092] 下游引物 LectinR :CTGCGAGAITTGCTATGT
[0093] 上游引物 MON 87708F :GTCAAGGAGGACAAGGTCG
[0094] 下游引物 M0N87708R :CCAATGCCATAATACTCAAAC。
[0095] 实施例6
[0096] 本发明试剂盒中制备20 μ L反应体系由以下组分组成：
[0097] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物LECTINF 0.8 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物LECTIN R 0.8 U L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物MON87708 F 0.05 μ L 终浓皮0.5 pmol/L的下游引物ΜΟΝ87708 R 0.05 μ L DNA模版 IPL
[0098] 水 补齐至20 μ L。
[0099] 其中引物序列如下：
[0100] 上游引物 LectinF :TCTGTCGTTGTGGTGCTA
[0101] 下游引物 LectinR :CTGCGAGATTTGCTATGT
[0102] 上游引物 MON 87708F :GTCAAGGAGGACAAGGTCG
[0103] 下游引物 M0N87708R :CCAATGCCATAATACTCAAAC。
[0104] 实施例7
[0105] 本发明试剂盒中制备20 μ L反应体系由以下组分组成：
[0106] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物LECTIN F 0 6 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物LECTIN R 0,6 U L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物MON87708 F 0.7 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ΜΟΝ87708 R 0.7 μ L DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L 。
[0107] 其中引物序列如下：
[0108] 上游引物 LectinF :TCTGTCGTTGTGGTGCTA
[0109] 下游引物 LectinR :CTGCGAGATTTGCTATGT
[0110] 上游引物 MON 87708F :GTCAAGGAGGACAAGGTCG
[0111] 下游引物 M0N87708R :CCAATGCCATAATACTCAAAC。
[0112] 实施例8
[0113] 本发明检测转基因大豆M0N87708及内源基因 Lectin的方法，包括以下步骤：
[0114] A、提取样品DNA ;
[0115] B、对步骤A中的样品DNA进行荧光PCR扩增，其中反应体系由以下组分组成：
[0116] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOpL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物LectinF 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物LectinR 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物MON87708F 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物MON87708R 0.5 μ L DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L 。
[0117] 其中引物序列如下：
[0118] 上游引物 LectinF :TCTGTCGTTGTGGTGCTA
[0119] 下游引物 LectinR :CTGCGAGATTTGCTATGT
[0120] 上游引物 MON 87708F :GTCAAGGAGGACAAGGTCG
[0121] 下游引物 M0N87708R :CCAATGCCATAATACTCAAAC。
[0122] 所述的荧光PCR扩增按以下步骤进行：
[0123] (1)92°C ~96°C预变性 30s ;
[0124] (2)92°C~96°C变性5s~10s，54°C~64°C退火20s~40s，共进行 35~45个循 环。
[0125] C、对扩增后的产物进行HRM分析后判定结果。
[0126] 其中对PCR扩增产物进行HRM分析，按以下步骤进行：
[0127] (1)92°C~96°C变性 Imin ;
[0128] (2) 40 °C 复性 Imin ;
[0129] (3)然后初始熔解温度60°C~65°C，开始程序升温熔解至92°C~96°C，并在熔解 过程中实时检测荧光信号，15~25次/秒。
[0130] 实施例4
[0131] 称取Ig样品，其中可根据样品的DNA含量，调整样品量，加入到50mL的离心管中； 加入5mL CTAB提取液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混匀。65°C孵育30min，不时振荡；吸水 性大的食品样品，加入CTAB提取液的量应根据液面是否能盖住样品并多出少许而定；65°C 过夜后，8000r/min室温离心10min，取Iml上清液入2ml离心管中；加入700 μ L氯仿后用 力振荡，13000g离心10min，转移上清液600 μ L到新的2ml离心管中；加入2倍体积的CTAB 沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min，13000 X g离心10min，弃去上清，加入350 μ L NaCl溶 液将沉淀进行悬浮，再加入350 μ L氯仿，祸旋振荡进行混勾，13000g离心10min，转移上清 后加入0. 8倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20min，13000g离心10min，弃去上清， 加入500 μ L 70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于50 μ L TE溶液中。然后取I. 0 μ L提取物加入 到以下反应体系，
[0132] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOpL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物LectinF 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物LectinR 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物MON87708F 0.5 μ L
[0133] 终浓度0.5 pmol/L的下游引物MON87708R 0.5 μ L DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L 〇
[0134] 其中引物序列如下：
[0135] 上游引物 LectinF :TCTGTCGTTGTGGTGCTA
[0136] 下游引物 LectinR :CTGCGAGATTTGCTATGT
[0137] 上游引物 MON 87708F :GTCAAGGAGGACAAGGTCG
[0138] 下游引物 M0N87708R :CCAATGCCATAATACTCAAAC。
[0139] 进行荧光PCR扩增，按以下步骤进行：
[0140] (1)92°C~96°C预变性 30s ;
[0141] (2)92°C~96°C变性5s~10s，54°C~64°C退火20s~40s，共进行35~45个循 环。
[0142] A、对扩增后的产物进行HRM分析后判定结果。
[0143] 对PCR扩增产物进行HRM分析，按以下步骤进行：
[0144] (1)92°C ~96°C 变性 Imin ;
[0145] (2) 40 °C 复性 Imin ;
[0146] (3)然后初始熔解温度60 °C~65 °C，开始程序升温熔解至92 °C~96 °C，并在熔解 过程中实时检测荧光信号，15~25次/秒。
[0147] 本发明中标准DNA模版的制备：
[0148] 以常规PCR方法扩增耐药基因目的基因 Lectin和MON 87708。PCR产物经1 %凝 胶电泳分析，采用PCR产物回收试剂盒对PCR产物进行回收，将纯化后的PCR产物与载体 PMD18-T连接，将连接产物转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选单菌落至含抗生素的 液体培养基，过夜培养，提取质粒，以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质 粒进行测序鉴定。提取验证正确的阳性重组质粒，并测定其浓度，将其10倍倍比稀释。
[0149] 结果分析
[0150] 如果样品荧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值〈35,而且熔解曲线有一个特异性波 峰，Tm值为87. 49±0. 15°C，可判为大豆Lectin基因检出。
[0151] 如果样品荧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值〈35,熔解曲线有一个特异性波峰， Tm 值为 83. 60±0. 15°C，可判为 MON 87708 检出。
[0152] 如果样品荧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值〈35,而且有两个波峰，Tm值分别为 82. 51±0. 15°C和 87. 43±0. 15°C，可判为大豆 Lectin 基因和 MON 87708 均检出。
[0153] 如果样品荧光PCR扩增曲线明显，35〈Ct值〈40,重复一次，如果仍有明显上升曲 线，则至少有一个目的基因为检出，同时根据前述熔解曲线分析图波峰发生情况和Tm值进 行相应判断。
[0154] 如果样品荧光PCR扩增曲线明显Ct值>40,或无明显扩增曲线和Tm值，判为大豆 Lectin基因和MON 87708均检测阴性。
[0155] 本发明中敏感性和特异性试验：
[0156] 采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行 Blast比较时，序列均与Genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的阳性质粒模板DNA加 入前述反应体系，采用〇. 1%标准品对其进行灵敏性实验。结果能达到〇. 1%的检测阈值， 重复试验显示检测样品过程中具有很好重复性。稀释模板浓度对数值和Cp值之间也呈良 好的线性关系R 2多〇. 95。说明该方法具有较好的精确度和良好的稳定性。
[0157] 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技 术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明 本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些 变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及 其等效物界定。
【主权项】
1. 一种检测转基因大豆M0N87708的引物，其特征在于该引物的序列分别为： 上游引物 LectinF :TCTGTCGTTGTGGTGCTA 下游引物 LectinR :CTGCGAGATTTGCTATGT 上游引物 MON 87708F :GTCAAGGAGGACAAGGTCG 下游引物 M0N87708R :CCAATGCCATAATACTCAAAC。2. -种检测转基因大豆M0N87708的试剂盒，其特征在于该试剂盒中20 μ L反应体系包 括以下组分：其中所述上游引物LectinF的序列：TCTGTCGTTGTGGTGCTA 所述下游引物LectinR的序列：CTGCGAGATTTGCTATGT 所述上游引物 MON 87708F 的序列：GTCAAGGAGGACAAGGTCG 所述下游引物 M0N87708R 的序列：CCAATGCCATAATACTCAAAC。3. 根据权利要求2所述的一种检测转基因大豆M0N87708的试剂盒，其特征在于该试剂 盒中20 μ L反应体系包括以下组分：4. 一种检测转基因大豆Μ0Ν87708的方法，其特征在于包括以下步骤： A、提取样品DNA ; B、 利用如权利要求2或3所述的试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增； C、 扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。5. 根据权利要求4所述检测转基因大豆M0N87708的方法，其特征在于步骤B中PCR扩 增的反应程序按以下步骤进行： (1) 92°C ~96°C预变性 30s ; (2) 92°C~95°C变性 IOs ~30s，54°C~64°C退火 IOs ~30s，72°C IOs ~30s，共进行 35~45个循环； (3) 72°C延伸 IOs ~30s。6. 根据权利要求5所述检测转基因大豆M0N87708的方法，其特征在于步骤C中所述高 分辨率熔解曲线分析，按以下步骤进行： (1) 92°C~96°C变性 Imin ; (2) 40 °C 复性 Imin ; (3) 然后初始熔解温度60°C~65°C，开始程序升温熔解至90°C~95°C，并在熔解过程 中实时检测荧光信号，15~25次/秒。7. 根据权利要求6所述检测转基因大豆M0N87708的方法，其特征在于步骤A中所述提 取样品DNA的具体步骤如下： 称取Ig食品样品，加入到50mL的离心管中；加入5mL CTAB提取液和20 μ L蛋白酶K 溶液，充分混匀；65°C孵育30min，不时振荡；吸水性大的食品样品，加入CTAB提取液的量 应根据液面是否能盖住样品并多出少许而定；65°C过夜后，8000r/min室温离心10min，取 Iml上清液入2ml离心管中；加入700 μ L氯仿后用力振荡，13000g离心10min，转移上清液 600 μ L到新的2ml离心管中；加入2倍体积的CTAB沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min， 13000 Xg离心10min，弃去上清，加入350 μ L NaCl溶液将沉淀进行悬浮，再加入350 μ L氯 仿，涡旋振荡进行混匀，13000g离心10min，转移上清后加入0. 8倍体积的异丙醇用来沉淀 核酸，室温放置20min，13000g离心10min，弃去上清，加入500 μ L 70%乙醇溶液洗涤沉淀， 溶解于50 μ L TE溶液中。
【专利摘要】本发明公开了检测转基因大豆MON87708的引物、试剂盒和方法，引物：LectinF：TCTGTCGTTGTGGTGCTA；LectinR：CTGCGAGATTTGCTATGT；MON87708F：GTCAAGGAGGACAAGGTCG；MON87708R：CCAATGCCATAATACTCAAAC。试剂盒：HRM反应预混液10μL；引物0.2-3.4μL；DNA模版1μL；水补齐至20μL。检测方法：提取样品DNA；利用试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增；扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。目的提供一种检测转基因大豆MON87708及内源基因Lectin的引物、试剂盒及方法，试剂盒组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确；该方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104894281
【申请号】CN201510362478
【发明人】蔡先全, 岳巧云, 单振菊, 李蓉, 柏建山, 邱德义, 吴坚明, 周思渝
【申请人】蔡先全
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月25日
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