检测转基因玉米cbh351的引物、试剂盒和方法
检测转基因玉米cbh351的引物、试剂盒和方法
【技术领域】
[0001] 本发明设计一种检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的双重荧光PCR 检测试剂盒，本发明还涉及一种采用上述试剂盒检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的方法。
【背景技术】
[0002] 玉米是世界上最重要的粮食作物之一，在世界农业生产中占有重要位置。农业转 基因生物技术产业化的发展既是综合国力和竞争力的标志，又是国家科技竞争优势的重要 标志。农业转基因生物的推广应用，降低了生产成本，减轻了环境污染，提高了产品价格竞 争力。转基因作物使产量增加，农药使用量减少，形成了巨大经济和生态效益。国际上对转 基因生物安全性的争论已经不是纯粹的科学技术问题，包含政治、经济、伦理等诸多方面。 很多国家将他们研宄的转基因物种拿到发展中国家中进行试验研宄。在转基因产品的销 售过程中，经营者与消费者之间缺乏公平，消费者经常是在不知情或者是被动的情况下就 进行了消费。由此，我们需要对食品及饲料中转基因玉米的品系进行鉴定。为了加强对转 基因玉米特别是进口转基因玉米的品系鉴定，根据欧盟转基因品系准入相关文献，建立食 品和饲料中转基因玉米品系检测方法。CBH351Starlink ?玉米Z. mays是Aventis Crop Science即formerly AgrEvo公司运用现代生物技术手段开发的一种转基因玉米品系。其 导入的来自苏云杆菌Bt基因可产生一种蛋白质Cry9C，具有杀虫活性，能够有效控制欧洲 钻心螟虫。
[0003] 针对玉米中Zein基因和CBH351基因，研宄人员已开展了常规PCR和荧光PCR方 法研宄。目前，我国出入境检验检疫行业标准SN/T1196-2003《玉米种转基因成分定性PCR 检测方法》中规定了对玉米M0N810、Btll、Evebtl76、T14/T25、CBH351、GA21品系中转基因 成分的定性检测。此外，农业部953号公告-2-2007《转基因植物及其产品成分检测抗虫玉 米CBH351及其衍生品种定性PCR方法》标准规定了转基因抗虫玉米CBH351CBH351及其衍 生品种的检测。这些基因的检测方法大都采用常规PCR方法和荧光PCR方法。
[0004] 但常规PCR方法需要PCR扩增后进行电泳，不仅操作繁琐，而且容易引起污染，还 需要使用可能致癌的荧光燃料。而探针法荧光PCR方法虽然灵敏准确，但TaqMan探针的线 性结构导致了较高的背景荧光，如果荧光基团和淬灭基团的距离太近，在PCR扩增过程中， 探针在它们之间降解的可能性将大为降低，从而起不到探针的作用。相反，如果荧光基团和 淬灭基团分别置于探针两端，荧光背景信号加强，影响其检测的灵敏度。另外其合成成本较 高，而且试剂有效期短，很容易降解，因而，不能在基层得到广泛的应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种用于检测转基因抗虫 玉米CBH351及内源基因 Zein的引物；
[0006] 本发明的另一个目的是提供一种包括上述引物且组分和配比合理，使用方便，检 测快捷，准确，适用于双重荧光PCR检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的试剂 盒；
[0007] 本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测转基因抗虫玉米CBH351及内 源基因 Zein，该方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
[0008] 为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
[0009] 一种检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的引物，其特征在于该引物的 序列分别为：
[0010] 上游引物 ZeinF :TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0011] 下游引物 ZeinR :GTAATAGGGCTGATGATTG
[0012] 上游引物 CBH351F :TATGTTACTAGATCGCAGAT
[0013] 下游引物 CBH35IR :AAGGTCCAATAGTGTATGT。
[0014] 一种检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein及内源基因 Zein的试剂盒，其 特征在于该试剂盒中20 μ L反应体系包括以下组分：
[0015] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物Zein F 0.05- 0.8 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZeinR 0 05- 0.8 μ L 终浓度 0.5 pmol/L 的上游引物 CBH351F 0.05- 0.9 μ L 终浓度 0.5 pmol/L 的下游引物 CBH351R 0.05- 0.9 μ L DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L;
[0016] 其中所述上游引物ZeinF的序列：TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0017] 所述下游引物 ZeinR 的序列：GTAATAGGGCTGATGATTG
[0018] 所述上游引物 CBH351F 的序列：TATGTTACTAGATCGCAGAT
[0019] 所述下游引物 CBH351R 的序列：AAGGTCCAATAGTGTATGT。
[0020] 如上所述的一种检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的试剂盒，其特征 在于该试剂盒中20 μ L反应体系包括以下组分：
[0021] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZeinF 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZeinR 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物CBH351 F 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物CBH351R 0.5 μ L DNA模版 I UL 水 补齐至20 μ L。
[0022] 一种检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的方法，其特征在于包括以下 步骤：
[0023] A、提取样品DNA ;
[0024] Β、利用如权利要求2或3所述的试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增；
[0025] C、扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。
[0026] 如上所述检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的方法，其特征在于步骤 B中PCR扩增的反应程序按以下步骤进行：
[0027] (1)92°C ~96°C预变性 30s ;
[0028] (2)92。〇~95。〇变性1〇8~3〇8,54。〇~64。〇退火1〇8~3〇8,72。〇1〇8~3〇8，共 进行35~45个循环；
[0029] (3) 72°C延伸 IOs ~30s。
[0030] 如上所述检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的方法，其特征在于步骤 C中所述高分辨率熔解曲线分析，按以下步骤进行：
[0031] (1)92°C ~96°C 变性 Imin ;
[0032] (2) 40 °C 复性 Imin ;
[0033] (3)然后初始熔解温度60°C~65°C，开始程序升温熔解至90°C~95°C，并在熔解 过程中实时检测荧光信号，15~25次/秒。
[0034] 如上所述检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的方法，其特征在于步骤 A中所述提取样品DNA的具体步骤如下：
[0035] 称取Ig样品，加入到50mL的离心管中；加入5mL CTAB提取液和20 μ L蛋白酶K 溶液，充分混匀。65°C孵育30min，不时振荡；吸水性大的食品样品，加入CTAB提取液的量 应根据液面是否能盖住样品并多出少许而定；65°C过夜后，8000r/min室温离心10min，取 Iml上清液入2ml离心管中；加入700 μ L氯仿后用力振荡，13000g离心10min，转移上清液 600 μ L到新的2ml离心管中；加入2倍体积的CTAB沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min， 13000 Xg离心10min，弃去上清，加入350 μ L NaCl溶液将沉淀进行悬浮，再加入350 μ L氯 仿，涡旋振荡进行混匀，13000g离心10min，转移上清后加入0. 8倍体积的异丙醇用来沉淀 核酸，室温放置20min，13000g离心10min，弃去上清，加入500 μ L 70%乙醇溶液洗涤沉淀， 溶解于50 μ L TE溶液中。
[0036] 本发明中标准品模板的制备：
[0037] 以常规PCR方法扩增目的基因。PCR产物经1 %凝胶电泳分析，采用PCR产物回收 试剂盒对PCR产物进行回收，将纯化后的PCR产物与载体pMD18-T连接，将连接产物转化至 感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选单菌落至含抗生素的液体培养基，过夜培养，提取质粒， 以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测序鉴定。提取验证正确 的阳性重组质粒，并测定其浓度，将其10倍倍比稀释。
[0038] 本发明中敏感性和特异性试验：
[0039] 采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行 Blast比较时，序列均与Genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的阳性质粒模板DNA加 入前述反应体系，采用〇. 1%标准品对其进行灵敏性实验。结果能达到〇. 1%的检测阈值， 重复试验显示检测样品过程中具有很好重复性。稀释模板浓度对数值和Cp值之间也呈良 好的线性关系R 2多〇. 95。说明该方法具有较好的精确度和良好的稳定性。
[0040] 本发明与现有技术相比，具有以下优点：
[0041] 1)本发明试剂盒组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于荧光PCR检 测玉米Zein基因和CBH351基因；
[0042] 2)本发明检测方法简化了检测流程，大大缩短了检测周期，检测时间比传统培养 分析方法缩短两天左右；
[0043] 3)本发明检测方法整个过程，PCR产物无需再转入其它分析装置，实现闭管操作， 避免交叉 污染，而且可同时完成定量分析。
[0044] 4)采用本发明检测方法在同一反应体系即可实现同时检测玉米Zein基因和 CBH351基因，操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
【附图说明】
[0045] 图1为仅有玉米Zein基因检出的扩增曲线图；
[0046] 图2为仅有玉米Zein基因检出的HRM分析图；
[0047] 图3为仅有CBH351检出的扩增曲线图；
[0048] 图4为仅有CBH351检出的的HRM分析图；
[0049] 图5为玉米Zein基因和CBH351基因同时检出的扩增曲线图；
[0050] 图6为玉米Zein基因和CBH351基因同时检出的HRM分析图；
【具体实施方式】
[0051] 下面结合【具体实施方式】对本发明做进一步描述：
[0052] 实施例1
[0053] 本发明检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的引物，其中该引物的序列 分别为：
[0054] 上游引物 ZeinF :TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0055] 下游引物 ZeinR :GTAATAGGGCTGATGATTG
[0056] 上游引物 CBH35IF :TATGTTACTAGATCGCAGAT
[0057] 下游引物 CBH351R :AAGGTCCAATAGTGTATGT。
[0058] 实施例2
[0059] 本发明一种检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的试剂盒，其中该试剂 盒中20 μ L反应体系包括以下组分：
[0060] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZeinF 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZeinR 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物CBH351 F 0.5 U L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物CBH351R 0.5 μ L DNA模版 IpL 水 补齐至20 μ L。
[0061] 其中引物序列如下：
[0062] 上游引物 ZeinF :TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0063] 下游引物 ZeinR :GTAATAGGGCTGATGATTG
[0064] 上游引物 CBH351F :TATGTTACTAGATCGCAGAT
[0065] 下游引物 CBH351R :AAGGTCCAATAGTGTATGT。
[0066] 实施例3
[0067] 本发明检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的试剂盒，其中20. 0 yL反 应体系由以下组分组成：
[0068] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZEIN F 0.05 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZEIN R 0.05 μ L
[0069] 终浓度0.5 pmol/L的上游引物CBH351 F 0.05 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物CBH351 R 0.05 μ L DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L。
[0070] 其中：
[0071] 其中引物序列如下：
[0072] 上游引物 ZeinF :TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0073] 下游引物 ZeinR :GTAATAGGGCTGATGATTG
[0074] 上游引物 CBH351F :TATGTTACTAGATCGCAGAT
[0075] 下游引物 CBH351R :AAGGTCCAATAGTGTATGT。
[0076] 实施例4
[0077] 本发明试剂盒中制备20 μ L反应体系由以下组分组成：
[0078] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZEINF 0 8 PL 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZEIN R 0.8 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物CBH351 F 0.9 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物CBH351 R 0.9 μ L DNA模版 I UL 水 补齐市20 μ L。
[0079] 其中引物序列如下：
[0080] 上游引物 ZeinF :TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0081] 下游引物 ZeinR :GTAATAGGGCTGATGATTG
[0082] 上游引物 CBH351F :TATGTTACTAGATCGCAGAT
[0083] 下游引物 CBH351R :AAGGTCCAATAGTGTATGT。
[0084] 实施例5
[0085] 本发明试剂盒中制备20 μ L反应体系由以下组分组成：
[0086] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZEIN F 0.05 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZEIN R 0.05 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物CBH351 F 0.9 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物CBH351 R 0 9 UL DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L。
[0087] 其中引物序列如下：
[0088] 上游引物 ZeinF :TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0089] 下游引物 ZeinR :GTAATAGGGCTGATGATTG
[0090] 上游引物 CBH351F :TATGTTACTAGATCGCAGAT
[0091] 下游引物 CBH35IR :AAGGTCCAATAGTGTATGT。
[0092] 实施例6
[0093] 本发明试剂盒中制备20 μ L反应体系由以下组分组成：
[0094] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZEIN F OSuL 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZEIN R 0.8 μ L 终浓度0.5 pmo]/L的上游引物CBH351 F 0.05 μ L
[0095] 终浓度0.5 pmol/L的下游引物CBH351 R 0.05 μ L DNA模版 I PL 水 补齐生20 μ L。
[0096] 其中引物序列如下：
[0097] 上游引物 ZeinF :TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0098] 下游引物 ZeinR :GTAATAGGGCTGATGATTG
[0099] 上游引物 CBH351F :TATGTTACTAGATCGCAGAT
[0100] 下游引物 CBH351R :AAGGTCCAATAGTGTATGT。
[0101] 实施例7
[0102] 本发明试剂盒中制备20 μ L反应体系由以下组分组成：
[0103] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZEIN F 0 6 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZEIN R 0.6 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物CBH351 F 0 7 UL 终浓度0.5 pmol/L的下游引物CBH351 R 0 7 PL DNA模版 IpL 水 补齐至20 μ L。
[0104] 其中引物序列如下：
[0105] 上游引物 ZeinF :TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0106] 下游引物 ZeinR :GTAATAGGGCTGATGATTG
[0107] 上游引物 CBH351F :TATGTTACTAGATCGCAGAT
[0108] 下游引物 CBH351R :AAGGTCCAATAGTGTATGT。
[0109] 实施例8
[0110] 本发明检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein用的方法，
[0111] 包括以下步骤：
[0112] A、提取样品DNA ;
[0113] B、对步骤A中的样品DNA进行荧光PCR扩增，其中反应体系由以下组分组成：
[0114] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZeinF 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZeinR 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物CBH351 F 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物CBH351R 0.5 μι DNA模版 IaL 水 补齐至20 μ L。
[0115] 其中引物序列如下：
[0116] 上游引物 ZeinF :TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0117] 下游引物 ZeinR :GTAATAGGGCTGATGATTG
[0118] 上游引物 CBH35IF :TATGTTACTAGATCGCAGAT
[0119] 下游引物 CBH351R :AAGGTCCAATAGTGTATGT。
[0120] 所述的荧光PCR扩增按以下步骤进行：
[0121] (1)92°C~96°C预变性 30s ;
[0122] (2) 92°C~96°C变性5s~10s，55°C~65°C退火20s~40s，共进行35~45个循 环。
[0123] C、对扩增后的产物进行HRM分析后判定结果。
[0124] 其中对PCR扩增产物进行HRM分析，按以下步骤进行：
[0125] (1)92°C ~96°C 变性 Imin ;
[0126] (2) 40 °C 复性 Imin ;
[0127] (3)然后初始熔解温度60°C~65°C，开始程序升温熔解至92°C~96°C，并在熔解 过程中实时检测荧光信号，15~25次/ 秒。
[0128] 实施例4
[0129] 称取Ig样品，可根据样品的DNA含量，调整样品量，加入到50mL的离心管中；加入 5mL CTAB提取液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混匀。65°C孵育30min，不时振荡；吸水性大 的食品样品，加入CTAB提取液的量应根据液面是否能盖住样品并多出少许而定；65°C过夜 后，8000r/min室温离心10min，取Iml上清液入2ml离心管中；加入700 μ L氯仿后用力振 荡，13000g离心10min，转移上清液600 μ L到新的2ml离心管中；加入2倍体积的CTAB沉 淀溶液颠倒数次后室温静置60min，13000 X g离心10min，弃去上清，加入350 μ L NaCl溶液 将沉淀进行悬浮，再加入350 μ L氯仿，涡旋振荡进行混匀，13000g离心10min，转移上清后 加入0. 8倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20min，13000g离心10min，弃去上清，加 入500 μ L 70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于50 μ L TE溶液中。然后取1.0 μ L提取物加入到 以下反应体系，
[0130] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZeinF 0.5 μ L
[0131] 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZeinR 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物CBH351 F 0.5 U L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物CBH351R 0.5 μ L DNA模版 IyL 水 补齐至20 μ L。
[0132] 其中引物序列如下：
[0133] 上游引物 ZeinF :TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0134] 下游引物 ZeinR :GTAATAGGGCTGATGATTG
[0135] 上游引物 CBH35IF :TATGTTACTAGATCGCAGAT
[0136] 下游引物 CBH351R :AAGGTCCAATAGTGTATGT。
[0137] 进行荧光PCR扩增，按以下步骤进行：
[0138] (1)92°C~96°C预变性 30s ;
[0139] (2) 92°C~96°C变性5s~10s，55°C~65°C退火20s~40s，共进行35~45个循 环。
[0140] A、对扩增后的产物进行HRM分析后判定结果。
[0141] 对PCR扩增产物进行HRM分析，按以下步骤进行：
[0142] (1)92°C ~96°C 变性 Imin ;
[0143] (2) 40 °C 复性 Imin ;
[0144] (3)然后初始熔解温度60°C~65°C，开始程序升温熔解至92°C~96°C，并在熔解 过程中实时检测荧光信号，15~25次/秒。
[0145] 本发明中标准DNA模版的制备：
[0146] 以常规PCR方法扩增耐药基因目的基因 ZEIN和CBH351。PCR产物经1 %凝胶电泳 分析，采用PCR产物回收试剂盒对PCR产物进行回收，将纯化后的PCR产物与载体pMD18-T 连接，将连接产物转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选单菌落至含抗生素的液体培养 基，过夜培养，提取质粒，以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测 序鉴定。提取验证正确的阳性重组质粒，并测定其浓度，将其10倍倍比稀释。
[0147] 结果分析
[0148] 如果样品荧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值〈35,而且熔解曲线有一个特异性波 峰，Tm值为88. 23±0. 15°C，可判为玉米Zein基因检出。
[0149] 如果样品荧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值〈35,熔解曲线有一个特异性波峰， Tm 值为 81.82±0. 15°C，可判为 CBH351 检出。
[0150] 如果样品荧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值〈35,而且有两个波峰，Tm值分别为 82·51±0· 15°C和87·43±0· 15°C，可判为玉米Zein基因和CBH351均检出。
[0151] 如果样品荧光PCR扩增曲线明显，35〈Ct值〈40,重复一次，如果仍有明显上升曲 线，则至少有一个目的基因为检出，同时根据前述熔解曲线分析图波峰发生情况和Tm值进 行相应判断。
[0152] 如果样品荧光PCR扩增曲线明显Ct值>40,或无明显扩增曲线和Tm值，判为玉米 Zein基因和CBH351均检测阴性。
[0153] 本发明中敏感性和特异性试验：
[0154] 采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行 Blast比较时，序列均与Genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的阳性质粒模板DNA加 入前述反应体系，采用〇. 1%标准品对其进行灵敏性实验。结果能达到〇. 1%的检测阈值， 重复试验显示检测样品过程中具有很好重复性。稀释模板浓度对数值和Cp值之间也呈良 好的线性关系R 2多〇. 95。说明该方法具有较好的精确度和良好的稳定性。
[0155] 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技 术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明 本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些 变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及 其等效物界定。
【主权项】
1. 一种检测转基因玉米CBH351的引物，其特征在于该引物的序列分别为： 上游引物 ZeinF :TTATGCTCCTTGGTCTTT 下游引物 ZeinR :GTAATAGGGCTGATGATTG 上游引物 CBH351F :TATGTTACTAGATCGCAGAT 下游引物 CBH351R :AAGGTCCAATAGTGTATGT。2. -种检测转基因玉米CBH351的试剂盒，其特征在于该试剂盒中20 μ L反应体系包括 以下组分：其中所述上游引物ZeinF的序列：TTATGCTCCTTGGTCTTT 所述下游引物ZeinR的序列：GTAATAGGGCTGATGATTG 所述上游引物 CBH351F 的序列：TATGTTACTAGATCGCAGAT 所述下游引物 CBH351R 的序列：AAGGTCCAATAGTGTATGT。3. 根据权利要求2所述的一种检测转基因玉米CBH351的试剂盒，其特征在于该试剂盒 中20 μ L反应体系包括以下组分：4. 一种检测转基因玉米CBH351的方法，其特征在于包括以下步骤： A、提取样品DNA ; B、 利用如权利要求2或3所述的试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增； C、 扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。5. 根据权利要求4所述一种检测转基因玉米CBH351的方法，其特征在于步骤B中PCR 扩增的反应程序按以下步骤进行： (1) 92°C ~96°C预变性 30s ; (2) 92°C~95°C变性 IOs ~30s，54°C~64°C退火 IOs ~30s，72°C IOs ~30s，共进行 35~45个循环； (3) 72°C延伸 IOs ~30s。6. 根据权利要求5所述一种检测转基因玉米CBH351的方法，其特征在于步骤C中所述 高分辨率熔解曲线分析，按以下步骤进行： (1) 92°C~96°C变性 Imin ; (2) 40 °C 复性 Imin ; (3) 然后初始熔解温度60°C~65°C，开始程序升温熔解至90°C~95°C，并在熔解过程 中实时检测荧光信号，15~25次/秒。7. 根据权利要求6所述一种检测转基因玉米CBH351的方法，其特征在于步骤A中所述 提取样品DNA的具体步骤如下： 称取Ig样品，加入到50mL的离心管中；加入5mL CTAB提取液和20 μ L蛋白酶K溶液， 充分混匀。65°C孵育30min，不时振荡；吸水性大的样品，加入CTAB提取液的量应根据液面 是否能盖住样品并多出少许而定；65°C过夜后，8000r/min室温离心10min，取Iml上清液 入2ml离心管中；加入700 μ L氯仿后用力振荡，13000g离心10min，转移上清液600 μ L到 新的2ml离心管中；加入2倍体积的CTAB沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min，13000Xg 离心10min，弃去上清，加入350 μ L NaCl溶液将沉淀进行悬浮，再加入350 μ L氯仿，涡旋 振荡进行混勾，13000g离心10min，转移上清后加入0. 8倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室 温放置20min，13000g离心10min，弃去上清，加入500 μ L 70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于 50 μ L TE溶液中。
【专利摘要】本发明公开了检测转基因玉米CBH351的引物、试剂盒和方法，引物：ZeinF：TTATGCTCCTTGGTCTTT；下游引物ZeinR：GTAATAGGGCTGATGATTG；上游引物CBH351F：TATGTTACTAGATCGCAGAT；下游引物CBH351R：AAGGTCCAATAGTGTATGT。试剂盒：HRM反应预混液10μL；引物0.2-3.4μL；DNA模版1μL；水补齐至20μL。检测方法：提取样品DNA；利用试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增；扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。目的是提供一种用于检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因Zein的引物、试剂盒及方法，试剂盒：组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确；方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894282
【申请号】CN201510362507
【发明人】蔡先全, 李蓉, 柏建山, 邱德义, 单振菊, 周思渝, 吴坚明, 萧绮倩, 邱霞
【申请人】蔡先全
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月25日
【技术领域】
[0001] 本发明设计一种检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的双重荧光PCR 检测试剂盒，本发明还涉及一种采用上述试剂盒检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的方法。
【背景技术】
[0002] 玉米是世界上最重要的粮食作物之一，在世界农业生产中占有重要位置。农业转 基因生物技术产业化的发展既是综合国力和竞争力的标志，又是国家科技竞争优势的重要 标志。农业转基因生物的推广应用，降低了生产成本，减轻了环境污染，提高了产品价格竞 争力。转基因作物使产量增加，农药使用量减少，形成了巨大经济和生态效益。国际上对转 基因生物安全性的争论已经不是纯粹的科学技术问题，包含政治、经济、伦理等诸多方面。 很多国家将他们研宄的转基因物种拿到发展中国家中进行试验研宄。在转基因产品的销 售过程中，经营者与消费者之间缺乏公平，消费者经常是在不知情或者是被动的情况下就 进行了消费。由此，我们需要对食品及饲料中转基因玉米的品系进行鉴定。为了加强对转 基因玉米特别是进口转基因玉米的品系鉴定，根据欧盟转基因品系准入相关文献，建立食 品和饲料中转基因玉米品系检测方法。CBH351Starlink ?玉米Z. mays是Aventis Crop Science即formerly AgrEvo公司运用现代生物技术手段开发的一种转基因玉米品系。其 导入的来自苏云杆菌Bt基因可产生一种蛋白质Cry9C，具有杀虫活性，能够有效控制欧洲 钻心螟虫。
[0003] 针对玉米中Zein基因和CBH351基因，研宄人员已开展了常规PCR和荧光PCR方 法研宄。目前，我国出入境检验检疫行业标准SN/T1196-2003《玉米种转基因成分定性PCR 检测方法》中规定了对玉米M0N810、Btll、Evebtl76、T14/T25、CBH351、GA21品系中转基因 成分的定性检测。此外，农业部953号公告-2-2007《转基因植物及其产品成分检测抗虫玉 米CBH351及其衍生品种定性PCR方法》标准规定了转基因抗虫玉米CBH351CBH351及其衍 生品种的检测。这些基因的检测方法大都采用常规PCR方法和荧光PCR方法。
[0004] 但常规PCR方法需要PCR扩增后进行电泳，不仅操作繁琐，而且容易引起污染，还 需要使用可能致癌的荧光燃料。而探针法荧光PCR方法虽然灵敏准确，但TaqMan探针的线 性结构导致了较高的背景荧光，如果荧光基团和淬灭基团的距离太近，在PCR扩增过程中， 探针在它们之间降解的可能性将大为降低，从而起不到探针的作用。相反，如果荧光基团和 淬灭基团分别置于探针两端，荧光背景信号加强，影响其检测的灵敏度。另外其合成成本较 高，而且试剂有效期短，很容易降解，因而，不能在基层得到广泛的应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种用于检测转基因抗虫 玉米CBH351及内源基因 Zein的引物；
[0006] 本发明的另一个目的是提供一种包括上述引物且组分和配比合理，使用方便，检 测快捷，准确，适用于双重荧光PCR检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的试剂 盒；
[0007] 本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测转基因抗虫玉米CBH351及内 源基因 Zein，该方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
[0008] 为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
[0009] 一种检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的引物，其特征在于该引物的 序列分别为：
[0010] 上游引物 ZeinF :TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0011] 下游引物 ZeinR :GTAATAGGGCTGATGATTG
[0012] 上游引物 CBH351F :TATGTTACTAGATCGCAGAT
[0013] 下游引物 CBH35IR :AAGGTCCAATAGTGTATGT。
[0014] 一种检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein及内源基因 Zein的试剂盒，其 特征在于该试剂盒中20 μ L反应体系包括以下组分：
[0015] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物Zein F 0.05- 0.8 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZeinR 0 05- 0.8 μ L 终浓度 0.5 pmol/L 的上游引物 CBH351F 0.05- 0.9 μ L 终浓度 0.5 pmol/L 的下游引物 CBH351R 0.05- 0.9 μ L DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L;
[0016] 其中所述上游引物ZeinF的序列：TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0017] 所述下游引物 ZeinR 的序列：GTAATAGGGCTGATGATTG
[0018] 所述上游引物 CBH351F 的序列：TATGTTACTAGATCGCAGAT
[0019] 所述下游引物 CBH351R 的序列：AAGGTCCAATAGTGTATGT。
[0020] 如上所述的一种检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的试剂盒，其特征 在于该试剂盒中20 μ L反应体系包括以下组分：
[0021] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZeinF 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZeinR 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物CBH351 F 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物CBH351R 0.5 μ L DNA模版 I UL 水 补齐至20 μ L。
[0022] 一种检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的方法，其特征在于包括以下 步骤：
[0023] A、提取样品DNA ;
[0024] Β、利用如权利要求2或3所述的试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增；
[0025] C、扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。
[0026] 如上所述检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的方法，其特征在于步骤 B中PCR扩增的反应程序按以下步骤进行：
[0027] (1)92°C ~96°C预变性 30s ;
[0028] (2)92。〇~95。〇变性1〇8~3〇8,54。〇~64。〇退火1〇8~3〇8,72。〇1〇8~3〇8，共 进行35~45个循环；
[0029] (3) 72°C延伸 IOs ~30s。
[0030] 如上所述检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的方法，其特征在于步骤 C中所述高分辨率熔解曲线分析，按以下步骤进行：
[0031] (1)92°C ~96°C 变性 Imin ;
[0032] (2) 40 °C 复性 Imin ;
[0033] (3)然后初始熔解温度60°C~65°C，开始程序升温熔解至90°C~95°C，并在熔解 过程中实时检测荧光信号，15~25次/秒。
[0034] 如上所述检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的方法，其特征在于步骤 A中所述提取样品DNA的具体步骤如下：
[0035] 称取Ig样品，加入到50mL的离心管中；加入5mL CTAB提取液和20 μ L蛋白酶K 溶液，充分混匀。65°C孵育30min，不时振荡；吸水性大的食品样品，加入CTAB提取液的量 应根据液面是否能盖住样品并多出少许而定；65°C过夜后，8000r/min室温离心10min，取 Iml上清液入2ml离心管中；加入700 μ L氯仿后用力振荡，13000g离心10min，转移上清液 600 μ L到新的2ml离心管中；加入2倍体积的CTAB沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min， 13000 Xg离心10min，弃去上清，加入350 μ L NaCl溶液将沉淀进行悬浮，再加入350 μ L氯 仿，涡旋振荡进行混匀，13000g离心10min，转移上清后加入0. 8倍体积的异丙醇用来沉淀 核酸，室温放置20min，13000g离心10min，弃去上清，加入500 μ L 70%乙醇溶液洗涤沉淀， 溶解于50 μ L TE溶液中。
[0036] 本发明中标准品模板的制备：
[0037] 以常规PCR方法扩增目的基因。PCR产物经1 %凝胶电泳分析，采用PCR产物回收 试剂盒对PCR产物进行回收，将纯化后的PCR产物与载体pMD18-T连接，将连接产物转化至 感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选单菌落至含抗生素的液体培养基，过夜培养，提取质粒， 以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测序鉴定。提取验证正确 的阳性重组质粒，并测定其浓度，将其10倍倍比稀释。
[0038] 本发明中敏感性和特异性试验：
[0039] 采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行 Blast比较时，序列均与Genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的阳性质粒模板DNA加 入前述反应体系，采用〇. 1%标准品对其进行灵敏性实验。结果能达到〇. 1%的检测阈值， 重复试验显示检测样品过程中具有很好重复性。稀释模板浓度对数值和Cp值之间也呈良 好的线性关系R 2多〇. 95。说明该方法具有较好的精确度和良好的稳定性。
[0040] 本发明与现有技术相比，具有以下优点：
[0041] 1)本发明试剂盒组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于荧光PCR检 测玉米Zein基因和CBH351基因；
[0042] 2)本发明检测方法简化了检测流程，大大缩短了检测周期，检测时间比传统培养 分析方法缩短两天左右；
[0043] 3)本发明检测方法整个过程，PCR产物无需再转入其它分析装置，实现闭管操作， 避免交叉 污染，而且可同时完成定量分析。
[0044] 4)采用本发明检测方法在同一反应体系即可实现同时检测玉米Zein基因和 CBH351基因，操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
【附图说明】
[0045] 图1为仅有玉米Zein基因检出的扩增曲线图；
[0046] 图2为仅有玉米Zein基因检出的HRM分析图；
[0047] 图3为仅有CBH351检出的扩增曲线图；
[0048] 图4为仅有CBH351检出的的HRM分析图；
[0049] 图5为玉米Zein基因和CBH351基因同时检出的扩增曲线图；
[0050] 图6为玉米Zein基因和CBH351基因同时检出的HRM分析图；
【具体实施方式】
[0051] 下面结合【具体实施方式】对本发明做进一步描述：
[0052] 实施例1
[0053] 本发明检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的引物，其中该引物的序列 分别为：
[0054] 上游引物 ZeinF :TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0055] 下游引物 ZeinR :GTAATAGGGCTGATGATTG
[0056] 上游引物 CBH35IF :TATGTTACTAGATCGCAGAT
[0057] 下游引物 CBH351R :AAGGTCCAATAGTGTATGT。
[0058] 实施例2
[0059] 本发明一种检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的试剂盒，其中该试剂 盒中20 μ L反应体系包括以下组分：
[0060] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZeinF 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZeinR 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物CBH351 F 0.5 U L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物CBH351R 0.5 μ L DNA模版 IpL 水 补齐至20 μ L。
[0061] 其中引物序列如下：
[0062] 上游引物 ZeinF :TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0063] 下游引物 ZeinR :GTAATAGGGCTGATGATTG
[0064] 上游引物 CBH351F :TATGTTACTAGATCGCAGAT
[0065] 下游引物 CBH351R :AAGGTCCAATAGTGTATGT。
[0066] 实施例3
[0067] 本发明检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的试剂盒，其中20. 0 yL反 应体系由以下组分组成：
[0068] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZEIN F 0.05 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZEIN R 0.05 μ L
[0069] 终浓度0.5 pmol/L的上游引物CBH351 F 0.05 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物CBH351 R 0.05 μ L DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L。
[0070] 其中：
[0071] 其中引物序列如下：
[0072] 上游引物 ZeinF :TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0073] 下游引物 ZeinR :GTAATAGGGCTGATGATTG
[0074] 上游引物 CBH351F :TATGTTACTAGATCGCAGAT
[0075] 下游引物 CBH351R :AAGGTCCAATAGTGTATGT。
[0076] 实施例4
[0077] 本发明试剂盒中制备20 μ L反应体系由以下组分组成：
[0078] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZEINF 0 8 PL 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZEIN R 0.8 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物CBH351 F 0.9 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物CBH351 R 0.9 μ L DNA模版 I UL 水 补齐市20 μ L。
[0079] 其中引物序列如下：
[0080] 上游引物 ZeinF :TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0081] 下游引物 ZeinR :GTAATAGGGCTGATGATTG
[0082] 上游引物 CBH351F :TATGTTACTAGATCGCAGAT
[0083] 下游引物 CBH351R :AAGGTCCAATAGTGTATGT。
[0084] 实施例5
[0085] 本发明试剂盒中制备20 μ L反应体系由以下组分组成：
[0086] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZEIN F 0.05 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZEIN R 0.05 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物CBH351 F 0.9 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物CBH351 R 0 9 UL DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L。
[0087] 其中引物序列如下：
[0088] 上游引物 ZeinF :TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0089] 下游引物 ZeinR :GTAATAGGGCTGATGATTG
[0090] 上游引物 CBH351F :TATGTTACTAGATCGCAGAT
[0091] 下游引物 CBH35IR :AAGGTCCAATAGTGTATGT。
[0092] 实施例6
[0093] 本发明试剂盒中制备20 μ L反应体系由以下组分组成：
[0094] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZEIN F OSuL 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZEIN R 0.8 μ L 终浓度0.5 pmo]/L的上游引物CBH351 F 0.05 μ L
[0095] 终浓度0.5 pmol/L的下游引物CBH351 R 0.05 μ L DNA模版 I PL 水 补齐生20 μ L。
[0096] 其中引物序列如下：
[0097] 上游引物 ZeinF :TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0098] 下游引物 ZeinR :GTAATAGGGCTGATGATTG
[0099] 上游引物 CBH351F :TATGTTACTAGATCGCAGAT
[0100] 下游引物 CBH351R :AAGGTCCAATAGTGTATGT。
[0101] 实施例7
[0102] 本发明试剂盒中制备20 μ L反应体系由以下组分组成：
[0103] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZEIN F 0 6 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZEIN R 0.6 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物CBH351 F 0 7 UL 终浓度0.5 pmol/L的下游引物CBH351 R 0 7 PL DNA模版 IpL 水 补齐至20 μ L。
[0104] 其中引物序列如下：
[0105] 上游引物 ZeinF :TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0106] 下游引物 ZeinR :GTAATAGGGCTGATGATTG
[0107] 上游引物 CBH351F :TATGTTACTAGATCGCAGAT
[0108] 下游引物 CBH351R :AAGGTCCAATAGTGTATGT。
[0109] 实施例8
[0110] 本发明检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein用的方法，
[0111] 包括以下步骤：
[0112] A、提取样品DNA ;
[0113] B、对步骤A中的样品DNA进行荧光PCR扩增，其中反应体系由以下组分组成：
[0114] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZeinF 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZeinR 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物CBH351 F 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物CBH351R 0.5 μι DNA模版 IaL 水 补齐至20 μ L。
[0115] 其中引物序列如下：
[0116] 上游引物 ZeinF :TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0117] 下游引物 ZeinR :GTAATAGGGCTGATGATTG
[0118] 上游引物 CBH35IF :TATGTTACTAGATCGCAGAT
[0119] 下游引物 CBH351R :AAGGTCCAATAGTGTATGT。
[0120] 所述的荧光PCR扩增按以下步骤进行：
[0121] (1)92°C~96°C预变性 30s ;
[0122] (2) 92°C~96°C变性5s~10s，55°C~65°C退火20s~40s，共进行35~45个循 环。
[0123] C、对扩增后的产物进行HRM分析后判定结果。
[0124] 其中对PCR扩增产物进行HRM分析，按以下步骤进行：
[0125] (1)92°C ~96°C 变性 Imin ;
[0126] (2) 40 °C 复性 Imin ;
[0127] (3)然后初始熔解温度60°C~65°C，开始程序升温熔解至92°C~96°C，并在熔解 过程中实时检测荧光信号，15~25次/ 秒。
[0128] 实施例4
[0129] 称取Ig样品，可根据样品的DNA含量，调整样品量，加入到50mL的离心管中；加入 5mL CTAB提取液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混匀。65°C孵育30min，不时振荡；吸水性大 的食品样品，加入CTAB提取液的量应根据液面是否能盖住样品并多出少许而定；65°C过夜 后，8000r/min室温离心10min，取Iml上清液入2ml离心管中；加入700 μ L氯仿后用力振 荡，13000g离心10min，转移上清液600 μ L到新的2ml离心管中；加入2倍体积的CTAB沉 淀溶液颠倒数次后室温静置60min，13000 X g离心10min，弃去上清，加入350 μ L NaCl溶液 将沉淀进行悬浮，再加入350 μ L氯仿，涡旋振荡进行混匀，13000g离心10min，转移上清后 加入0. 8倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20min，13000g离心10min，弃去上清，加 入500 μ L 70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于50 μ L TE溶液中。然后取1.0 μ L提取物加入到 以下反应体系，
[0130] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZeinF 0.5 μ L
[0131] 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZeinR 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物CBH351 F 0.5 U L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物CBH351R 0.5 μ L DNA模版 IyL 水 补齐至20 μ L。
[0132] 其中引物序列如下：
[0133] 上游引物 ZeinF :TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0134] 下游引物 ZeinR :GTAATAGGGCTGATGATTG
[0135] 上游引物 CBH35IF :TATGTTACTAGATCGCAGAT
[0136] 下游引物 CBH351R :AAGGTCCAATAGTGTATGT。
[0137] 进行荧光PCR扩增，按以下步骤进行：
[0138] (1)92°C~96°C预变性 30s ;
[0139] (2) 92°C~96°C变性5s~10s，55°C~65°C退火20s~40s，共进行35~45个循 环。
[0140] A、对扩增后的产物进行HRM分析后判定结果。
[0141] 对PCR扩增产物进行HRM分析，按以下步骤进行：
[0142] (1)92°C ~96°C 变性 Imin ;
[0143] (2) 40 °C 复性 Imin ;
[0144] (3)然后初始熔解温度60°C~65°C，开始程序升温熔解至92°C~96°C，并在熔解 过程中实时检测荧光信号，15~25次/秒。
[0145] 本发明中标准DNA模版的制备：
[0146] 以常规PCR方法扩增耐药基因目的基因 ZEIN和CBH351。PCR产物经1 %凝胶电泳 分析，采用PCR产物回收试剂盒对PCR产物进行回收，将纯化后的PCR产物与载体pMD18-T 连接，将连接产物转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选单菌落至含抗生素的液体培养 基，过夜培养，提取质粒，以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测 序鉴定。提取验证正确的阳性重组质粒，并测定其浓度，将其10倍倍比稀释。
[0147] 结果分析
[0148] 如果样品荧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值〈35,而且熔解曲线有一个特异性波 峰，Tm值为88. 23±0. 15°C，可判为玉米Zein基因检出。
[0149] 如果样品荧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值〈35,熔解曲线有一个特异性波峰， Tm 值为 81.82±0. 15°C，可判为 CBH351 检出。
[0150] 如果样品荧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值〈35,而且有两个波峰，Tm值分别为 82·51±0· 15°C和87·43±0· 15°C，可判为玉米Zein基因和CBH351均检出。
[0151] 如果样品荧光PCR扩增曲线明显，35〈Ct值〈40,重复一次，如果仍有明显上升曲 线，则至少有一个目的基因为检出，同时根据前述熔解曲线分析图波峰发生情况和Tm值进 行相应判断。
[0152] 如果样品荧光PCR扩增曲线明显Ct值>40,或无明显扩增曲线和Tm值，判为玉米 Zein基因和CBH351均检测阴性。
[0153] 本发明中敏感性和特异性试验：
[0154] 采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行 Blast比较时，序列均与Genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的阳性质粒模板DNA加 入前述反应体系，采用〇. 1%标准品对其进行灵敏性实验。结果能达到〇. 1%的检测阈值， 重复试验显示检测样品过程中具有很好重复性。稀释模板浓度对数值和Cp值之间也呈良 好的线性关系R 2多〇. 95。说明该方法具有较好的精确度和良好的稳定性。
[0155] 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技 术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明 本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些 变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及 其等效物界定。
【主权项】
1. 一种检测转基因玉米CBH351的引物，其特征在于该引物的序列分别为： 上游引物 ZeinF :TTATGCTCCTTGGTCTTT 下游引物 ZeinR :GTAATAGGGCTGATGATTG 上游引物 CBH351F :TATGTTACTAGATCGCAGAT 下游引物 CBH351R :AAGGTCCAATAGTGTATGT。2. -种检测转基因玉米CBH351的试剂盒，其特征在于该试剂盒中20 μ L反应体系包括 以下组分：其中所述上游引物ZeinF的序列：TTATGCTCCTTGGTCTTT 所述下游引物ZeinR的序列：GTAATAGGGCTGATGATTG 所述上游引物 CBH351F 的序列：TATGTTACTAGATCGCAGAT 所述下游引物 CBH351R 的序列：AAGGTCCAATAGTGTATGT。3. 根据权利要求2所述的一种检测转基因玉米CBH351的试剂盒，其特征在于该试剂盒 中20 μ L反应体系包括以下组分：4. 一种检测转基因玉米CBH351的方法，其特征在于包括以下步骤： A、提取样品DNA ; B、 利用如权利要求2或3所述的试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增； C、 扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。5. 根据权利要求4所述一种检测转基因玉米CBH351的方法，其特征在于步骤B中PCR 扩增的反应程序按以下步骤进行： (1) 92°C ~96°C预变性 30s ; (2) 92°C~95°C变性 IOs ~30s，54°C~64°C退火 IOs ~30s，72°C IOs ~30s，共进行 35~45个循环； (3) 72°C延伸 IOs ~30s。6. 根据权利要求5所述一种检测转基因玉米CBH351的方法，其特征在于步骤C中所述 高分辨率熔解曲线分析，按以下步骤进行： (1) 92°C~96°C变性 Imin ; (2) 40 °C 复性 Imin ; (3) 然后初始熔解温度60°C~65°C，开始程序升温熔解至90°C~95°C，并在熔解过程 中实时检测荧光信号，15~25次/秒。7. 根据权利要求6所述一种检测转基因玉米CBH351的方法，其特征在于步骤A中所述 提取样品DNA的具体步骤如下： 称取Ig样品，加入到50mL的离心管中；加入5mL CTAB提取液和20 μ L蛋白酶K溶液， 充分混匀。65°C孵育30min，不时振荡；吸水性大的样品，加入CTAB提取液的量应根据液面 是否能盖住样品并多出少许而定；65°C过夜后，8000r/min室温离心10min，取Iml上清液 入2ml离心管中；加入700 μ L氯仿后用力振荡，13000g离心10min，转移上清液600 μ L到 新的2ml离心管中；加入2倍体积的CTAB沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min，13000Xg 离心10min，弃去上清，加入350 μ L NaCl溶液将沉淀进行悬浮，再加入350 μ L氯仿，涡旋 振荡进行混勾，13000g离心10min，转移上清后加入0. 8倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室 温放置20min，13000g离心10min，弃去上清，加入500 μ L 70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于 50 μ L TE溶液中。
【专利摘要】本发明公开了检测转基因玉米CBH351的引物、试剂盒和方法，引物：ZeinF：TTATGCTCCTTGGTCTTT；下游引物ZeinR：GTAATAGGGCTGATGATTG；上游引物CBH351F：TATGTTACTAGATCGCAGAT；下游引物CBH351R：AAGGTCCAATAGTGTATGT。试剂盒：HRM反应预混液10μL；引物0.2-3.4μL；DNA模版1μL；水补齐至20μL。检测方法：提取样品DNA；利用试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增；扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。目的是提供一种用于检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因Zein的引物、试剂盒及方法，试剂盒：组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确；方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894282
【申请号】CN201510362507
【发明人】蔡先全, 李蓉, 柏建山, 邱德义, 单振菊, 周思渝, 吴坚明, 萧绮倩, 邱霞
【申请人】蔡先全
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月25日
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