一对用于选育高千粒重小麦品种的功能标记的制作方法
一对用于选育高千粒重小麦品种的功能标记的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子育种领域，具体涉及一种用于选育高千粒重的小麦品种的功能标 记以及该标记在分子育种中的应用。
【背景技术】
[0002] 小麦是世界上最重要的粮食作物之一，随着人口的增长、耕地面积的减少以及粮 食生产成本的不断提高，高产、超高产育种将是我国小麦育种的永恒主题。穗数、穗粒数和 千粒重是小麦产量构成的三要素，其中千粒重的遗传力相对较高，属于主效基因调控加微 效基因修饰的数量性状，已报道的很多功能基因最终都对千粒重具有不同的贡献，因此千 粒重的调控网络较为复杂，剖析粒重的调控机理，研宄相关基因及其之间的互作效应，对高 产小麦新品种的选育具有重要参考价值。
[0003] bHLH转录因子是植物中的第二大类转录因子，在调控植物的生长发育和响应非生 物胁迫中发挥着重要的作用。前人研宄证明bHLH转录因子家族参与可溶性糖的分配、GA合 成和分解以及ABA信号途径。在小麦灌浆期间，可溶性糖的分配情况会影响到籽粒的灌浆 充实程度，最终会影响到小麦的籽粒大小和粒重。
[0004] PTFl基因是一个具有bHLH结构域的转录因子。OsPTFl最早在水稻中被克隆，其对 磷胁迫表现出耐受性，在过表达OsPTFl的转基因水稻中，磷利用的效率得到显著提高。在 磷缺乏的水培条件下，转基因植株的分蘖能力、根茎生物量、植株的磷含量都比野生型植株 高30%左右。在水培和大田试验中，低磷水平下的转基因植株的分蘖数、单穗重和磷含量 也同样比野生型高大约20%左右。张举仁等研宄同样表明，在玉米中过表达ZmPTFl有利 于植株的根部发育、生物量的增加、植株的分蘖能力的增强及籽粒变大。通过生物量试验以 及高效液相色谱分析了可溶性糖的组分，还发现玉米的碳代谢途径受到ZmPTFl表达水平 和磷浓度影响。过表达ZmPTFl增加蔗糖合成过程中的果糖-1，6-二磷酸盐酶和蔗糖磷酸 盐合酶在叶片中的表达。相反，过表达ZmPTFl会降低涉及蔗糖分解代谢过程中的基因在根 部的表达。因而，ZmPTFl通过调控果糖-1，6-二磷酸盐酶，蔗糖磷酸盐合酶（SPSl)JM^ 酶（Ivrl和Ivr2b)以及蔗糖合酶（SUSl、SUS2和ShlB)等在低磷酸盐情况下的表达，从而 参与了糖分配。高剑瑞等利用玉米Affymetrix表达谱基因芯片对玉米自交系A318正常和 穗发芽籽粒胚中进行了基因差异表达分析，结果表明，ZmPTFl基因在穗发芽的玉米胚中下 调表达。然而，小麦中有关PTFl基因的相关研宄还未见报道。
[0005] 随着分子生物学技术的迅速发展，分子标记辅助选择（MAS)被广泛应用于分子育 种中，由于其不受环境和育种世代的影响，可以进行早代选择和预测，大大缩短了小麦育种 年限。功能标记是一类基于基因特定序列开发的标记，与目标基因共分离，大大提高了选择 的准确性。因此功能标记的开发为小麦分子辅助标记育种提供了依据。
[0006] 由于小麦是异源六倍体，其基因组比较复杂，与粒重有关的功能基因鉴定的较少。 已克隆的功能基因主要位于2A，前者是从水稻中同源克隆的控制粒宽和粒重的主效基因 TaGW2,后者是与小麦粒重相关的细胞壁转化酶基因 TaCWI。因此，寻求一种基于小麦粒重相 关基因序列的实用性功能标记，将为利用分子手段选育高产小麦新品种提供支撑。
【发明内容】
[0007] 为了克服上述技术缺陷，本发明的一个目的是提供了一对用于选育高千粒重小麦 品种的功能标记，以辅助小麦高产分子育种。
[0008] 为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
[0009] 本发明的一个优选方面提供了一对用于选育高千粒重小麦品种的功能标记，该标 记位于小麦7B染色体上，其核酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示。 [0010] 本发明的另一个优选方面提供了一种获得上述功能标记的方法，包括如下步骤： DNCBI上搜索小麦的EST序列，电子克隆包括一部分5 'UTR和3' UTR的TaPTFl基因序 列；
[0011] 2)以该电子组装的序列为模板，在小麦CDNA中PCR扩增获得包括ORF在内的 2012bp，在小麦基因组DNA中进行PCR扩增，获得TaPTFl-B基因的全长；
[0012] 3)以此获得的基因组序列为模板，设计一对具有多态性的分子标记。
[0013] 进一步的，上述步骤2)中在小麦cDNA中PCR扩增获得包括ORF在内的2012bp的 核酸序列为如序列表中的SEQ ID NO. 4所示。
[0014] 更进一步的，上述步骤2)中获得的TaPTFl-B基因的核酸序列为如序列表中的SEQ ID NO. 3 所示。
[0015] 本发明还提供了上述的功能标记在小麦育种中的应用。
[0016] 本发明一个优选的方面，上述的应用是利用其判断植株是否含有增加千粒重效应 的基因位点，具体步骤为：
[0017] 利用其扩增目标植株的叶片DNA，电泳检测扩增片段以检测是否为具有较高千粒 重的品种；
[0018] 评判标准为：具有$父尚千粒重的品种扩增出如序列表中SEQ ID NO. 5所不的 438bp的目标条带，具有较低千粒重的品种扩增出如序列表中SEQ ID NO. 6所示的422bp的 目标条带。
[0019] 本发明通过克隆了一个控制粒重主效基因的部分片段：TaPTFl-B，并开发了一对 基于这个特定的基因序列的功能标记。该位点是前人未曾报道过的存在主效基因的位点。 由于该功能标记是基于这个特定的基因序列设计的，是与该基因共分离的，相对一般SSR 分子标记，有助于提高育种选择的目标性和针对性大大提高了选择的准确性，可应用于小 麦育种领域。加上不受环境等其他外界因素的影响，可在发育早期筛选小麦品种，节约了生 产成本，加快育种进程。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明的技术流程图；
[0021] 图2为本发明的功能标记扩增的12个不同品种的小麦的电泳结果图；其中1为分 子标记物；2为京411扩增结果；3为红芒春21扩增结果；4为烟农15扩增结果；5为新麦 19扩增结果；6为太空6号扩增结果；7为安农1116扩增结果；8为安农0942-13扩增结果； 9为新麦13扩增结果；10为绵麦37扩增结果；11为白火麦扩增结果；12为中麦1139扩增 结果；13为02Y151扩增结果；以及
[0022] 图3为利用中国春-缺体四体系对目标基因进行染色体定位图；其中，泳道1为分 子标记物；泳道2为京411扩增结果；泳道3为红芒春21扩增结果；泳道4为中国春（CS)扩 增结果；泳道 5-10 分别为 CS N7A-T7D、CS N7A-T7B、CS N7B-T7A、CS N7B-T7D、CS N7D-T7A、 CS N7D-T7B的扩增结果。
【具体实施方式】
[0023] 以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本 发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
[0024] 本发明通过利用NCBI上的TaPTFl基因的序列（Genebank :DQ979392. 1)，在NCBI 上搜索小麦的EST序列，电子克隆了包括一部分5 'UTR和3' UTR的TaPTFl基因序列。以 该电子组装的序列为模板，在小麦cDNA中PCR扩增获得包括ORF在内的2012bp (序列表中 SEQ ID NO. 4)，在小麦基因组DNA中进行PCR扩增，获得TaPTFl-B基因的全长3097bp (序 列表中SEQ ID NO. 4)。另外，以此获得的基因组序列为模板，利用Primer Premier 5. 0软 件设计了一对在京411和红芒春21间具有多态性的Indel，在重组自交系群体（RILs)和自 然群体中分析其对表型的作用，最终开发了一对与小麦粒重紧密相关的功能标记，该功能 标记的脱氧核糖核苷酸序列为：
[0025] 上游引物序列：5 'GAGTACACGGGCATTCTA 3'（如序列表中 SEQ ID NO. 1)
[0026] 下游引物序列：5 'TTCCCTGTTGGTTGTCATTC 3'（如序列表中 SEQ ID NO. 2)
[0027] 通过小麦非整倍体材料的染色体定位，该基因被定位于小麦7B染色体上。本发明 获得上述功能标记具体技术流程如图1。
[0028] 用如下具体的实施方式展现本发明：
[0029] 实施例1 :小麦TaPTFl-B基因的克隆
[0030] TaPTFl-B基因的获得是通过电子克隆结合常规PCR的方法进行的。根据NCBI上 小麦TaPTFl基因的序列（Genebank :DQ979392. 1)搜索小麦ESTs数据库，将筛选得到的EST 序列（CJ904603，CJ916459. 1，FF580499. 1)进行电子拼接，获得TaPTFl基因序列。以该拼接 的cDNA序列为模板，利用Primer Premier5. 0软件设计引物对Rl，R2, R3, G1，用于TaPTFl 基因 cDNA获得，引物对Gl同时也用于基因组DNA的获得，具体核酸序列见表1。PCR反应 分别以小麦cDNA和基因组DNA为模板，在BIO-RAD My Cycler LOPCR仪上进行，IOul反应 体系，具体的反应体系和PCR扩增条件如下：
[0031] PCR扩增条件： 94°C预变性 5 min 94。。变性 50 s 54V退火 50 s 36个循环 72。。延伸 3min- 72。。延伸 IOmin 4°C保存
[0032] PCR扩增后，1. 5%琼脂糖凝胶电泳，然后在紫外灯下进行切胶回收，最后TA克隆 测序，测序由上海生工测序公司完成。
[0033] 表1用于扩增小麦7B染色体上TaPTFl-B基因的引物序列
[0034]
[0036] 实施例2 :小麦TaPTFl-B基因功能标记的开发
[0037] 以通过PCR方法获得的小麦TaPTFl-B基因序列（序列表中SEQ ID NO. 3)为模板， 利用Primer Premier 5. 0软件设计了一对在京411和红芒春21两个品种间具有多态性的 Indel引物，并在千粒重差异显著的小麦品种间进行筛选，在由京411和红芒春21构建的重 组自交系群体（RILs)和125份种质资源组成的自然群体中分析其对表型的作用。该引物 序列如下：
[0038] 上游引物序列：5 'GAGTACACGGGCATTCTA 3'（如序列表中 SEQ ID NO. 1)
[0039] 下游引物序列：5 'TTCCCTGTTGGTTGTCATTC 3'（如序列表中 SEQ ID NO. 2)
[0040] 实施例3 :小麦TaPTFl-B基因不同等位类型与粒重的相关性
[0041] 一、小麦籽粒千粒重的测定
[0042] 随机取1000粒完整小麦籽粒，两次重复，用千分之一的天平称重，两次平均值记 为最终的千粒重值。
[0043] 二、SDS-Tris饱和酚法抽提小麦叶片基因组DNA
[0044] (1)分别取12个不同品种的小麦（京411 ;红芒春21 ;烟农15 ;新麦19 ;太空6 号；安农1116 ;安农0942-13 ;新麦13 ;绵麦37 ;白火麦冲麦1139 ;02Y151 ;)的2g新鲜幼 嫩叶片，液氮研磨成细粉后置于2ml灭菌离心管中。
[0045] (2)加入 I. 2ml DNA 提取缓冲液（2OOmM Tris-cl, pH8· 0, 25OmM NaCl, 25禮 EDTA，pH8. 0, 0. 5% SDS，2% β -ME混合均匀，β -ME临用前新鲜加入）。
[0046] (3) 55°C水浴45min，期间间歇振荡以充分提取。
[0047] (4)室温下，12000rpm，lOmin。
[0048] (5)转移上清液至新的2ml灭菌离心管中，加入预冷的等体积Tris饱和酷/氯仿 异/戊醇（体积比为25 :24 :1)，于冰上颠倒混匀15min，期间间歇振荡。
[0049] (6)室温下，12000rpm，lOmin。
[0050] (7)转移上清液至新的2ml灭菌离心管中，重复步骤（5)，（6)，以充分除去蛋白。
[0051] (8)转移上清液至新的I. 5ml灭菌离心管中，加入0. 6倍异丙醇（300 μ 1)和1/10 倍体积（50 μ I) NaAc (ρΗ5. 2)，充分混合混匀后冰上静置17min。
[0052] (9)出现白色絮状 DNA 沉淀，4°C，10000rpm，10min。
[0053] (10)弃上清，加入预冷的70%乙醇漂洗2遍，然后用无水乙醇漂洗1遍，室温晾 干，加入100μl其中含2μll0mg/mlRNase酶的lXTE缓冲液（或双蒸水）过夜溶解，10 倍稀释备用。
[0054] (11)用1 %琼脂糖分别检测提取的12种小麦基因组DNA的质量以及浓度。
[0055] 三、目标产物的扩增
[0056] PCR反应体系：
[0057] 终浓度 l〇xbuffer ( 25 mM Mg2+ ) lx I ΟμL dNTP(2.5mM) 0.2 mM 0,8μ1 Taq(5U/fil) 0.6 U 0.!2μ1 上游引物（ΙΟμΜ) 0.2μΜ 0·2μ1 下游引物（ΙΟμΜ) 0.2μΜ 0·2μ1 DNA !OOng ddH20 加至终体积1 〇μ1
[0058] PCR扩增条件参见实施例1。
[0059] PCR完成后，加变性双指示剂（DNA loading buffer)在PCR仪上95°C变性lOmin， 然后立即置于冰上，待降至室温后，在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后银染显色，结 果见图2。从图2中可见，12种不同品种的小麦扩增的条带集中在两个位置，具有较高千粒 重的品种扩增出438bp (如序列表中SEQ IDN0. 5)的目标条带，而具有较低千粒重的品种扩 增出422bp (序列表中SEQ IDN0. 6)的目标条带。
[0060] 四、TaPTFl-B基因中国春缺体四体的定位
[0061] 利用小麦缺体-四体材料对该基因进行染色体定位，用该标记在缺7A分别以7B 和7D替代的缺体小麦、缺7B分别以7A和7D替代的缺体小麦以及缺7D分别以7A和7B替 代的缺体小麦中进行检测，发现在缺7B分别以7A和7D替代的缺体小麦中检测不到该基 因，结果该基因被定位于小麦7B染色体上，如下图3所示。
[0062] 五、不同千粒重品种中的基因型分析及与千粒重的相关性
[0063] 利用京411/红芒春21重组自交系群体（京411千粒重37. 02g ;红芒春21千粒 重19. 14g，共174个家系）和125份种质资源组成的自然群体，分别对不同基因型的千粒重 进行方差分析和TaPTFl-B基因的等位变异与千粒重的相关性分析，结果见表2 :
[0064] 表2不同群体中两种基因型间的千粒重差异显著性分析
[0065]
注：**为P〈0. 01，达到极显著水平；A基因型为438bp带型；B基因型为422bp带型
[0067] 从表2中可见，A基因型（438bp)的千粒重显著高于B基因型（422bp)的千粒重。 可见，通过本发明得到的该对功能标记在两个群体中与千粒重的相关性均达到了极显著水 平。
【主权项】
1. 一对用于选育高千粒重小麦品种的功能标记，其特征在于，该标记位于小麦7B染色 体上，其核酸序列如序列表中的SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示。2. -种获得权利要求1所述的功能标记的方法，其特征在于，包括如下步骤：I)NCBI上 搜索小麦的EST序列，电子克隆包括一部分5 'UTR和3'UTR的TaPTFl基因序列； 2) 以该电子组装的序列为模板，在小麦cDNA中PCR扩增获得包括ORF在内的2012bp， 在小麦基因组DNA中进行PCR扩增，获得TaPTFl-B基因的全长； 3) 以此获得的基因组序列为模板，设计一对具有多态性的分子标记。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中在小麦cDNA中PCR扩增获得包 括ORF在内的2012bp的核酸序列为如序列表中的SEQIDNO. 4所示。4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中获得的TaPTFl-B基因的核酸序 列为如序列表中的SEQIDNO. 3所示。5. 权利要求1所述的功能标记在小麦育种中的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，利用其判断植株是否含有增加千粒重效 应的基因位点，具体步骤为： 利用上述功能标记扩增目标植株的叶片DNA，电泳检测扩增片段以检测是否为具有较 尚千粒重的品种； 评判标准为：具有较高千粒重的品种扩增出如序列表中SEQIDNO. 5所示的438bp的 目标条带，具有较低千粒重的品种扩增出如序列表中SEQIDNO. 6所示的422bp的目标条 带。
【专利摘要】本发明提供了一对用于选育高千粒重小麦品种的功能标记，该标记位于小麦7B染色体上，其核酸序列如序列表中的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。该位点是前人未曾报道过的存在主效基因的位点，由于该功能标记是基于这个特定的基因序列设计的，是与该基因共分离的，相对一般SSR分子标记，有助于提高育种选择的目标性和针对性，大大提高了选择的准确性，可应用于小麦育种领域。将该分子标记用于小麦育种不受环境等其他外界因素的影响，可在发育早期筛选小麦品种，节约了生产成本，加快育种进程。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68, C12N15/10
【公开号】CN104894286
【申请号】CN201510374544
【发明人】朱晓峰, 常成, 张海萍, 卢杰, 刘鹏, 邵辉, 马刚, 司红起, 马传喜
【申请人】安徽农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月29日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子育种领域，具体涉及一种用于选育高千粒重的小麦品种的功能标 记以及该标记在分子育种中的应用。
【背景技术】
[0002] 小麦是世界上最重要的粮食作物之一，随着人口的增长、耕地面积的减少以及粮 食生产成本的不断提高，高产、超高产育种将是我国小麦育种的永恒主题。穗数、穗粒数和 千粒重是小麦产量构成的三要素，其中千粒重的遗传力相对较高，属于主效基因调控加微 效基因修饰的数量性状，已报道的很多功能基因最终都对千粒重具有不同的贡献，因此千 粒重的调控网络较为复杂，剖析粒重的调控机理，研宄相关基因及其之间的互作效应，对高 产小麦新品种的选育具有重要参考价值。
[0003] bHLH转录因子是植物中的第二大类转录因子，在调控植物的生长发育和响应非生 物胁迫中发挥着重要的作用。前人研宄证明bHLH转录因子家族参与可溶性糖的分配、GA合 成和分解以及ABA信号途径。在小麦灌浆期间，可溶性糖的分配情况会影响到籽粒的灌浆 充实程度，最终会影响到小麦的籽粒大小和粒重。
[0004] PTFl基因是一个具有bHLH结构域的转录因子。OsPTFl最早在水稻中被克隆，其对 磷胁迫表现出耐受性，在过表达OsPTFl的转基因水稻中，磷利用的效率得到显著提高。在 磷缺乏的水培条件下，转基因植株的分蘖能力、根茎生物量、植株的磷含量都比野生型植株 高30%左右。在水培和大田试验中，低磷水平下的转基因植株的分蘖数、单穗重和磷含量 也同样比野生型高大约20%左右。张举仁等研宄同样表明，在玉米中过表达ZmPTFl有利 于植株的根部发育、生物量的增加、植株的分蘖能力的增强及籽粒变大。通过生物量试验以 及高效液相色谱分析了可溶性糖的组分，还发现玉米的碳代谢途径受到ZmPTFl表达水平 和磷浓度影响。过表达ZmPTFl增加蔗糖合成过程中的果糖-1，6-二磷酸盐酶和蔗糖磷酸 盐合酶在叶片中的表达。相反，过表达ZmPTFl会降低涉及蔗糖分解代谢过程中的基因在根 部的表达。因而，ZmPTFl通过调控果糖-1，6-二磷酸盐酶，蔗糖磷酸盐合酶（SPSl)JM^ 酶（Ivrl和Ivr2b)以及蔗糖合酶（SUSl、SUS2和ShlB)等在低磷酸盐情况下的表达，从而 参与了糖分配。高剑瑞等利用玉米Affymetrix表达谱基因芯片对玉米自交系A318正常和 穗发芽籽粒胚中进行了基因差异表达分析，结果表明，ZmPTFl基因在穗发芽的玉米胚中下 调表达。然而，小麦中有关PTFl基因的相关研宄还未见报道。
[0005] 随着分子生物学技术的迅速发展，分子标记辅助选择（MAS)被广泛应用于分子育 种中，由于其不受环境和育种世代的影响，可以进行早代选择和预测，大大缩短了小麦育种 年限。功能标记是一类基于基因特定序列开发的标记，与目标基因共分离，大大提高了选择 的准确性。因此功能标记的开发为小麦分子辅助标记育种提供了依据。
[0006] 由于小麦是异源六倍体，其基因组比较复杂，与粒重有关的功能基因鉴定的较少。 已克隆的功能基因主要位于2A，前者是从水稻中同源克隆的控制粒宽和粒重的主效基因 TaGW2,后者是与小麦粒重相关的细胞壁转化酶基因 TaCWI。因此，寻求一种基于小麦粒重相 关基因序列的实用性功能标记，将为利用分子手段选育高产小麦新品种提供支撑。
【发明内容】
[0007] 为了克服上述技术缺陷，本发明的一个目的是提供了一对用于选育高千粒重小麦 品种的功能标记，以辅助小麦高产分子育种。
[0008] 为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
[0009] 本发明的一个优选方面提供了一对用于选育高千粒重小麦品种的功能标记，该标 记位于小麦7B染色体上，其核酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示。 [0010] 本发明的另一个优选方面提供了一种获得上述功能标记的方法，包括如下步骤： DNCBI上搜索小麦的EST序列，电子克隆包括一部分5 'UTR和3' UTR的TaPTFl基因序 列；
[0011] 2)以该电子组装的序列为模板，在小麦CDNA中PCR扩增获得包括ORF在内的 2012bp，在小麦基因组DNA中进行PCR扩增，获得TaPTFl-B基因的全长；
[0012] 3)以此获得的基因组序列为模板，设计一对具有多态性的分子标记。
[0013] 进一步的，上述步骤2)中在小麦cDNA中PCR扩增获得包括ORF在内的2012bp的 核酸序列为如序列表中的SEQ ID NO. 4所示。
[0014] 更进一步的，上述步骤2)中获得的TaPTFl-B基因的核酸序列为如序列表中的SEQ ID NO. 3 所示。
[0015] 本发明还提供了上述的功能标记在小麦育种中的应用。
[0016] 本发明一个优选的方面，上述的应用是利用其判断植株是否含有增加千粒重效应 的基因位点，具体步骤为：
[0017] 利用其扩增目标植株的叶片DNA，电泳检测扩增片段以检测是否为具有较高千粒 重的品种；
[0018] 评判标准为：具有$父尚千粒重的品种扩增出如序列表中SEQ ID NO. 5所不的 438bp的目标条带，具有较低千粒重的品种扩增出如序列表中SEQ ID NO. 6所示的422bp的 目标条带。
[0019] 本发明通过克隆了一个控制粒重主效基因的部分片段：TaPTFl-B，并开发了一对 基于这个特定的基因序列的功能标记。该位点是前人未曾报道过的存在主效基因的位点。 由于该功能标记是基于这个特定的基因序列设计的，是与该基因共分离的，相对一般SSR 分子标记，有助于提高育种选择的目标性和针对性大大提高了选择的准确性，可应用于小 麦育种领域。加上不受环境等其他外界因素的影响，可在发育早期筛选小麦品种，节约了生 产成本，加快育种进程。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明的技术流程图；
[0021] 图2为本发明的功能标记扩增的12个不同品种的小麦的电泳结果图；其中1为分 子标记物；2为京411扩增结果；3为红芒春21扩增结果；4为烟农15扩增结果；5为新麦 19扩增结果；6为太空6号扩增结果；7为安农1116扩增结果；8为安农0942-13扩增结果； 9为新麦13扩增结果；10为绵麦37扩增结果；11为白火麦扩增结果；12为中麦1139扩增 结果；13为02Y151扩增结果；以及
[0022] 图3为利用中国春-缺体四体系对目标基因进行染色体定位图；其中，泳道1为分 子标记物；泳道2为京411扩增结果；泳道3为红芒春21扩增结果；泳道4为中国春（CS)扩 增结果；泳道 5-10 分别为 CS N7A-T7D、CS N7A-T7B、CS N7B-T7A、CS N7B-T7D、CS N7D-T7A、 CS N7D-T7B的扩增结果。
【具体实施方式】
[0023] 以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本 发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
[0024] 本发明通过利用NCBI上的TaPTFl基因的序列（Genebank :DQ979392. 1)，在NCBI 上搜索小麦的EST序列，电子克隆了包括一部分5 'UTR和3' UTR的TaPTFl基因序列。以 该电子组装的序列为模板，在小麦cDNA中PCR扩增获得包括ORF在内的2012bp (序列表中 SEQ ID NO. 4)，在小麦基因组DNA中进行PCR扩增，获得TaPTFl-B基因的全长3097bp (序 列表中SEQ ID NO. 4)。另外，以此获得的基因组序列为模板，利用Primer Premier 5. 0软 件设计了一对在京411和红芒春21间具有多态性的Indel，在重组自交系群体（RILs)和自 然群体中分析其对表型的作用，最终开发了一对与小麦粒重紧密相关的功能标记，该功能 标记的脱氧核糖核苷酸序列为：
[0025] 上游引物序列：5 'GAGTACACGGGCATTCTA 3'（如序列表中 SEQ ID NO. 1)
[0026] 下游引物序列：5 'TTCCCTGTTGGTTGTCATTC 3'（如序列表中 SEQ ID NO. 2)
[0027] 通过小麦非整倍体材料的染色体定位，该基因被定位于小麦7B染色体上。本发明 获得上述功能标记具体技术流程如图1。
[0028] 用如下具体的实施方式展现本发明：
[0029] 实施例1 :小麦TaPTFl-B基因的克隆
[0030] TaPTFl-B基因的获得是通过电子克隆结合常规PCR的方法进行的。根据NCBI上 小麦TaPTFl基因的序列（Genebank :DQ979392. 1)搜索小麦ESTs数据库，将筛选得到的EST 序列（CJ904603，CJ916459. 1，FF580499. 1)进行电子拼接，获得TaPTFl基因序列。以该拼接 的cDNA序列为模板，利用Primer Premier5. 0软件设计引物对Rl，R2, R3, G1，用于TaPTFl 基因 cDNA获得，引物对Gl同时也用于基因组DNA的获得，具体核酸序列见表1。PCR反应 分别以小麦cDNA和基因组DNA为模板，在BIO-RAD My Cycler LOPCR仪上进行，IOul反应 体系，具体的反应体系和PCR扩增条件如下：
[0031] PCR扩增条件： 94°C预变性 5 min 94。。变性 50 s 54V退火 50 s 36个循环 72。。延伸 3min- 72。。延伸 IOmin 4°C保存
[0032] PCR扩增后，1. 5%琼脂糖凝胶电泳，然后在紫外灯下进行切胶回收，最后TA克隆 测序，测序由上海生工测序公司完成。
[0033] 表1用于扩增小麦7B染色体上TaPTFl-B基因的引物序列
[0034]
[0036] 实施例2 :小麦TaPTFl-B基因功能标记的开发
[0037] 以通过PCR方法获得的小麦TaPTFl-B基因序列（序列表中SEQ ID NO. 3)为模板， 利用Primer Premier 5. 0软件设计了一对在京411和红芒春21两个品种间具有多态性的 Indel引物，并在千粒重差异显著的小麦品种间进行筛选，在由京411和红芒春21构建的重 组自交系群体（RILs)和125份种质资源组成的自然群体中分析其对表型的作用。该引物 序列如下：
[0038] 上游引物序列：5 'GAGTACACGGGCATTCTA 3'（如序列表中 SEQ ID NO. 1)
[0039] 下游引物序列：5 'TTCCCTGTTGGTTGTCATTC 3'（如序列表中 SEQ ID NO. 2)
[0040] 实施例3 :小麦TaPTFl-B基因不同等位类型与粒重的相关性
[0041] 一、小麦籽粒千粒重的测定
[0042] 随机取1000粒完整小麦籽粒，两次重复，用千分之一的天平称重，两次平均值记 为最终的千粒重值。
[0043] 二、SDS-Tris饱和酚法抽提小麦叶片基因组DNA
[0044] (1)分别取12个不同品种的小麦（京411 ;红芒春21 ;烟农15 ;新麦19 ;太空6 号；安农1116 ;安农0942-13 ;新麦13 ;绵麦37 ;白火麦冲麦1139 ;02Y151 ;)的2g新鲜幼 嫩叶片，液氮研磨成细粉后置于2ml灭菌离心管中。
[0045] (2)加入 I. 2ml DNA 提取缓冲液（2OOmM Tris-cl, pH8· 0, 25OmM NaCl, 25禮 EDTA，pH8. 0, 0. 5% SDS，2% β -ME混合均匀，β -ME临用前新鲜加入）。
[0046] (3) 55°C水浴45min，期间间歇振荡以充分提取。
[0047] (4)室温下，12000rpm，lOmin。
[0048] (5)转移上清液至新的2ml灭菌离心管中，加入预冷的等体积Tris饱和酷/氯仿 异/戊醇（体积比为25 :24 :1)，于冰上颠倒混匀15min，期间间歇振荡。
[0049] (6)室温下，12000rpm，lOmin。
[0050] (7)转移上清液至新的2ml灭菌离心管中，重复步骤（5)，（6)，以充分除去蛋白。
[0051] (8)转移上清液至新的I. 5ml灭菌离心管中，加入0. 6倍异丙醇（300 μ 1)和1/10 倍体积（50 μ I) NaAc (ρΗ5. 2)，充分混合混匀后冰上静置17min。
[0052] (9)出现白色絮状 DNA 沉淀，4°C，10000rpm，10min。
[0053] (10)弃上清，加入预冷的70%乙醇漂洗2遍，然后用无水乙醇漂洗1遍，室温晾 干，加入100μl其中含2μll0mg/mlRNase酶的lXTE缓冲液（或双蒸水）过夜溶解，10 倍稀释备用。
[0054] (11)用1 %琼脂糖分别检测提取的12种小麦基因组DNA的质量以及浓度。
[0055] 三、目标产物的扩增
[0056] PCR反应体系：
[0057] 终浓度 l〇xbuffer ( 25 mM Mg2+ ) lx I ΟμL dNTP(2.5mM) 0.2 mM 0,8μ1 Taq(5U/fil) 0.6 U 0.!2μ1 上游引物（ΙΟμΜ) 0.2μΜ 0·2μ1 下游引物（ΙΟμΜ) 0.2μΜ 0·2μ1 DNA !OOng ddH20 加至终体积1 〇μ1
[0058] PCR扩增条件参见实施例1。
[0059] PCR完成后，加变性双指示剂（DNA loading buffer)在PCR仪上95°C变性lOmin， 然后立即置于冰上，待降至室温后，在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后银染显色，结 果见图2。从图2中可见，12种不同品种的小麦扩增的条带集中在两个位置，具有较高千粒 重的品种扩增出438bp (如序列表中SEQ IDN0. 5)的目标条带，而具有较低千粒重的品种扩 增出422bp (序列表中SEQ IDN0. 6)的目标条带。
[0060] 四、TaPTFl-B基因中国春缺体四体的定位
[0061] 利用小麦缺体-四体材料对该基因进行染色体定位，用该标记在缺7A分别以7B 和7D替代的缺体小麦、缺7B分别以7A和7D替代的缺体小麦以及缺7D分别以7A和7B替 代的缺体小麦中进行检测，发现在缺7B分别以7A和7D替代的缺体小麦中检测不到该基 因，结果该基因被定位于小麦7B染色体上，如下图3所示。
[0062] 五、不同千粒重品种中的基因型分析及与千粒重的相关性
[0063] 利用京411/红芒春21重组自交系群体（京411千粒重37. 02g ;红芒春21千粒 重19. 14g，共174个家系）和125份种质资源组成的自然群体，分别对不同基因型的千粒重 进行方差分析和TaPTFl-B基因的等位变异与千粒重的相关性分析，结果见表2 :
[0064] 表2不同群体中两种基因型间的千粒重差异显著性分析
[0065]
注：**为P〈0. 01，达到极显著水平；A基因型为438bp带型；B基因型为422bp带型
[0067] 从表2中可见，A基因型（438bp)的千粒重显著高于B基因型（422bp)的千粒重。 可见，通过本发明得到的该对功能标记在两个群体中与千粒重的相关性均达到了极显著水 平。
【主权项】
1. 一对用于选育高千粒重小麦品种的功能标记，其特征在于，该标记位于小麦7B染色 体上，其核酸序列如序列表中的SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示。2. -种获得权利要求1所述的功能标记的方法，其特征在于，包括如下步骤：I)NCBI上 搜索小麦的EST序列，电子克隆包括一部分5 'UTR和3'UTR的TaPTFl基因序列； 2) 以该电子组装的序列为模板，在小麦cDNA中PCR扩增获得包括ORF在内的2012bp， 在小麦基因组DNA中进行PCR扩增，获得TaPTFl-B基因的全长； 3) 以此获得的基因组序列为模板，设计一对具有多态性的分子标记。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中在小麦cDNA中PCR扩增获得包 括ORF在内的2012bp的核酸序列为如序列表中的SEQIDNO. 4所示。4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中获得的TaPTFl-B基因的核酸序 列为如序列表中的SEQIDNO. 3所示。5. 权利要求1所述的功能标记在小麦育种中的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，利用其判断植株是否含有增加千粒重效 应的基因位点，具体步骤为： 利用上述功能标记扩增目标植株的叶片DNA，电泳检测扩增片段以检测是否为具有较 尚千粒重的品种； 评判标准为：具有较高千粒重的品种扩增出如序列表中SEQIDNO. 5所示的438bp的 目标条带，具有较低千粒重的品种扩增出如序列表中SEQIDNO. 6所示的422bp的目标条 带。
【专利摘要】本发明提供了一对用于选育高千粒重小麦品种的功能标记，该标记位于小麦7B染色体上，其核酸序列如序列表中的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。该位点是前人未曾报道过的存在主效基因的位点，由于该功能标记是基于这个特定的基因序列设计的，是与该基因共分离的，相对一般SSR分子标记，有助于提高育种选择的目标性和针对性，大大提高了选择的准确性，可应用于小麦育种领域。将该分子标记用于小麦育种不受环境等其他外界因素的影响，可在发育早期筛选小麦品种，节约了生产成本，加快育种进程。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68, C12N15/10
【公开号】CN104894286
【申请号】CN201510374544
【发明人】朱晓峰, 常成, 张海萍, 卢杰, 刘鹏, 邵辉, 马刚, 司红起, 马传喜
【申请人】安徽农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月29日
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