一种石斛dna指纹图谱及其专用引物和建立方法
一种石斛dna指纹图谱及其专用引物和建立方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物DNA指纹图谱技术领域，具体涉及一种石斛DNA指纹图谱及其专 用引物和建立方法。
【背景技术】
[0002] 石斛属（Dendrobium)是兰科中最大的一个属。我国目前广泛种植的石斛属植物 有金釵石斛、霍山石斛、铁皮石斛等。尤其是铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo)由于具有益胃生津、滋阴清热等功效（中国药典（2010年）），种植面积在我国发展很 快。生产上多以味甘、质重、柔韧、粘性强等外观形态来评价铁皮石斛的质量。目前铁皮石斛 价格昂贵，市场上铁皮石斛品种繁多，不同品种间茎叶颜色存在差异，多糖含量、甘露糖含 量、生物碱等功能成分含量高低不一，抗病性也存在较大差异。仅仅通过外观形态鉴别，很 容易以次充好，消费者往往很难鉴别。因此，准确鉴别石斛品种真伪对其生产有重大意义。 另外，对种植者来说选择一种优良品种，有助于获得较高的经济效益。
[0003] G. Li 等在《Theoretical and Applied Genetics》（《理论与应用遗传学》）2001 年第 103 期 455-461 页发表了题为《Sequence-related amplified polymorphism(SRAP)，a new marker system based on a simple PCR reaction:its application to mapping and gene tagging in Brassica》（相关序列扩增多态性，一种新的基于PCR的标记系统及其在 芸薹属作图和基因标签法上的应用）一文。文中评述SRAP是一种新型的基于PCR的标记 系统，它的正向引物含有一段14个碱基的核心序列，5'端前10个碱基是无任何碱基特异构 成的填充序列，接着为CCGG序列，该序列可特异结合开放阅读框（ORF)区域中的外显子，其 后为3'端的3个选择性碱基；反向引物与正向引物的碱基组成不同在于填充序列后为AATT 序列，该序列可特异结合启动子和内含子区域，其扩增产物多位于外显子区域。SRAP技术由 于具有简便、可靠、易于分离条带和测序等优点，已成功用于甘蓝、西萌芦、茄子等蔬菜和棉 花等作物品种鉴定、DNA指纹图谱构建。然而还未见该技术在石斛指纹图谱建立中的应用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是，提供一种石斛NDA指纹图谱及其专用引物和建立方法。
[0005] 本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
[0006] -种获取石斛DNA指纹图谱的专用引物，其核苷酸序列如序列表所示，所述专用 引物选自以下引物对中的一对或多对：SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 7 ;SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 8 ; SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 5 ; SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 6 ;SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 8 ;SEQ ID NO. 4 和 SEQ ID NO. 5。所述 SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 8 分别对应序列表 中的序列1-序列8。
[0007] 进一步地，一种获取石斛DNA指纹图谱的专用引物，所述专用引物由序列表中的 以下 6 对引物组成：SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 7 ;SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 8 ;SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 5 ; SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 6 ; SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 8 ; SEQ ID NO. 4 和 SEQ ID NO. 5。
[0008] 具体地，所述专用引物由以下6对引物（引物序列均为5' -3'）组成：
[0009] (I)TGAGTCCAAACCGGATA 和 GACTGCGTACGAATTCAA ;
[0010] (2)TGAGTCCAAACCGGATA 和 GACTGCGTACGAATTCAG ;
[0011] (3)TGAGTCCAAACCGGAAT 和 GACTGCGTACGAATTGAC ;
[0012] (4)TGAGTCCAAACCGGAAT 和 GACTGCGTACGAATTAAC ;
[0013] (5)TGAGTCCTTTCCGGTGC 和 GACTGCGTACGAATTCAG ;
[0014] (6)TGAGTCCAAACCGGTAG 和 GACTGCGTACGAATTGAC。
[0015] 优选地，所述专用引物获取DNA指纹图谱的石斛品种为霍山石斛和铁皮石斛。
[0016] 本发明还提供一种石斛DNA指纹图谱的建立方法，该方法包括如下步骤：
[0017] 步骤1，提取石斛材料的基因组DNA作为模板，用权利要求1-2中任一所述专用引 物进行SRAP-PCR扩增；
[0018] 步骤2,将前述步骤中得到的SRAP-PCR扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳， 用银染显示DNA条带，获得石斛DNA指纹图谱。
[0019] 本发明还提供了利用上述指纹图谱建立方法获得的石斛DNA指纹图谱。所述石斛 DNA指纹图谱由"0"和"1"组成的一串有序数字表示，具体为：01100000000,01000000000， 00000110101，00000100101，00010111001，10010011000,00010110001，00001101100， 00000100001,00010101100,00010110000,00000101101，00001110100,00000101100， 00010110100,00000100000,00010100000,00010100010 及 00000001000。其中数字" 1"表示 图谱中确定位置上存在扩增条带，"0"表示图谱中该位置上没有扩增条带存在。转换成了数 码形式，便于计算机识别和分析。上述19串数字分别对应2种霍山石斛和17种铁皮石斛的 DNA指纹图谱。其中，每串有序数字具有11个数位，从第1数位到第11数位对应的引物对 以及特征条带为：第1数位表示ME8和M14引物对，特征条带为180bp ;第2数位表示ME8 和EM14引物对，特征条带为190bp ;第3数位表示ME8和EM14引物对，特征条带为240bp ; 第4数位表示ME9和EM3引物对，特征条带为250bp ;第5数位表示ME9和EM3引物对，特 征条带为260bp ;第6数位表示MEl和EM7引物对，特征条带为220bp ;第7数位表示MEl和 EM7引物对，特征条带为HObp ;第8数位表示MEl和EM14引物对，特征条带为170bp ;第9 数位表示MEl和HM14引物对，特征条带为250bp ;第10数位表示ME3和HM3引物对，特征 条带为150bp ;第11数位表示ME3和EM5引物对，特征条带为150bp。
[0020] 本发明还提供了所述任一专用引物在获取石斛DNA指纹图谱中的应用。
[0021] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0022] 1、本发明利用SRAP分子标记来鉴定石斛品种，通过构建基于每个石斛品种的 SRAP分子标记指纹图谱，为种植者提供参考。能从遗传本质上对石斛品系进行种质鉴定，准 确、可靠。
[0023] 2、当石斛指纹图谱一旦建立以后，在对某个未知样品进行真实检测时，几个小时 就可以知道该石斛DNA指纹，因此可以迅速判断出石斛品种的真实性。
[0024] 3、采用该发明，构建该DNA指纹图谱所用的样品可以根据需要不断增加，并对指 纹进行实时更新。
[0025] 4、本发明采用表的形式来说明DNA指纹图谱，并将其转换成了数码形式，便于计 算机识别和分析。
【附图说明】
[0026] 图1为本发明实施例中引物对ME8和EM14在20份石斛材料中的电泳图。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料 如未特别说明，均为商业化产品。
[0028] 实施例1
[0029] 本实施例采用收集到的20份具有广泛代表性的石斛品系为供试材料，用组培苗 提取DNA，进行SRAP分析，建立与之相对应的指纹图谱。得到的指纹图谱再用于对这20种 石斛品种进行鉴定，并为其它石斛的种质鉴定提供一条可供借鉴的有效方法。建立石斛DNA 指纹图谱的具体操作如下：
[0030] 1、选用代表性石斛品种
[0031 ] 本实施例采用表2所示20份石斛品种，其中金釵石斛（Dendrobium nobiIe Lindl.)1 份，霍山石斛（Dendrobium huoshanense)1 份，铁皮石斛（Dendrobium officinale) 18份， 选材以生产中广泛种植的石斛品系，参见表1。本实施例以20份石斛的 叶片提取DNA，建立了这20份石斛品系的DNA指纹图谱。这些石斛材料具有较好的代表性。 [0032] 表1 :石斛种质及其来源
[0035] 2、石斛品系的DNA提取及纯化
[0036] 取石斛幼苗两三片，以Doyle等人提出的CTAB法提取 DNA(Focus, 1990, 12:13-15)，所得产物用 TE缓冲液（IOmM Tris-HCl，0.1 mM EDTA)保存。然 后用NanoUV-3000超微量紫外分光光度计测定其浓度，稀释至20ng · μΓ1，于-20°C下保存 备用。
[0037] 3、SRAP-PCR扩增及电泳检测
[0038] 采用1(^1^反应体系，其中包括]\%(：122.0臟〇14-1，(1阶1 3各为0.2臟〇1*171，引物 0· 50 μL?ο? · Γ1，模板 DNA 50ng，Taq DNA 聚合酶 1U。
[0039] PCR扩增程序为：94°C预变性3min ;94°C变性lmin，35°C复性lmin，72°C延伸 lmin，5 个循环；94°C变性 lmin，55°C复性 lmin，72°C延伸 2min，35 个循环；72°C延伸 7min。
[0040] 电泳步骤如下：扩增产物加5 μ L上样缓冲液，94°C变性5min。然后迅速将其置于 冰上冷却。采用4%变性聚丙烯酰胺凝胶，0. 5XTBE缓冲液，50W恒功率电泳约I. 5h，银染 检测电泳结果。选择有代表性的多态性SRAP扩增条带构建供试材料的指纹图谱。
[0041] 4、构建DNA指纹图谱
[0042] 构建指纹图谱时，本着用最少引物、最少条带，又要把所有供试样品区分开来的原 贝丨J，本实施例从110对SRAP引物中筛选出MEl和EM7 ;ME1和EM14 ;ME3和EM3 ;ME3和EM5 ; ME8和EM14 ;ME9和EM3这6对专用引物组合。引物序列参见表2。
[0043] 表2 :石斛DNA指纹图谱的引物序列
[0044]
[0045] 上述6对引物共扩增出127个条带，从中选取其中11条稳定性和重复性良好、多 态性高的条带，用于构建这20个石斛材料的DNA指纹图谱。参见图1，该图为引物组合ME8 和EM14引物对在20份石斛材料中的电泳图。其中，a表示特征条带为180bp ;b表示特征 条带为190bp。c表示特征条带为240bp;采用的引物对为ME8和EM14。电泳图中M泳道代 表1OObp marker，泳道1-20的标号分别对应编号SH-I到SH-20的石斛材料。
[0046] 根据每条引物呈现的条带信息建立指纹图谱。根据这11条扩增条带的有无，绘制 出所有20个材料的DNA指纹图谱。在该图谱中，每个材料都具有其特异的DNA指纹。为了 描述方便，设定用" 1"表示图谱中某个位置上有扩增条带存在，用"〇"表示在该位置上没有 扩增条带存在。最终，每个材料都拥有了有" 1"和"〇"组成的一串短数字。
[0047] 如表3所示，本实施例中20份石斛材料的DNA指纹图谱中，左栏为石斛品系，右栏 为相对应的有11个数字串。
[0048] 表3 :20个石斛材料的DNA指纹
[0051] 上述表3中a表示ME8和EM14引物对，特征条带为180bp。b表示ME8和EM14引 物对，特征条带为190bp。c表示ME8和EM14引物对，特征条带为240bp。d表示ME9和EM3 引物对，特征条带为250bp。e表示ME9和EM3引物对，特征条带为260bp。f表示MEl和 EM7引物对，特征条带为220bp。g表示MEl和EM7引物对，特征条带为140bp。h表示MEl 和EM14引物对，特征条带为170bp。i表示MEl和EM14引物对，特征条带为250bp。j表示 ME3和EM3引物对，特征条带为150bp。k表示ME3和EM5引物对，特征条带为150bp。
[0052] 实施例2
[0053] 本发明石斛DNA指纹图谱用于石斛的种质鉴定
[0054] 假设供试材料中SH是生产上应用的优良品种，现有一批石斛不能确定是否是真 正的石斛SH-15。可按照如下方法对它的DNA指纹进行鉴定。
[0055] 石斛标准DNA指纹图谱建立以后，要对某个样品进行真伪性鉴定时，提取待测样 品DNA，用提取的DNA为模板，用MEl和EM7 ;ME1和EM14 ;ME3和EM3 ;ME3和EM5 ;ME8和 EM14 ;ME9和EM3这6对引物对其进行SRAP-PCR扩增，扩增产物在4 %变性聚丙烯酰胺凝胶 上电泳，银染，绘制出该待测样品的DNA指纹图谱，与标准DNA指纹图谱进行比对，就可以知 道该品种是否是真正的石斛SH-15。
[0056] 结果表明它的DNA指纹是00000101100,这与SH-15的标准指纹是一致的，因此所 检测的石斛品种是SH-15。如果待测样品的指纹不是00000101100,那么该材料就不是真正 的 SH-15。
[0057] 上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领 域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任 何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
【主权项】
1. 一种获取石斛DNA指纹图谱的专用引物，其特征在于，所述专用引物选自以下引物 对中的一对或多对：SEQIDNO. 1 和SEQIDNO. 7;SEQIDNO. 1 和SEQIDNO. 8;SEQID NO. 2 和SEQIDNO. 5 ;SEQIDNO. 2 和SEQIDNO. 6 ;SEQIDNO. 3 和SEQIDNO. 8 ;SEQID NO. 4 和SEQIDNO. 5。2. 如权利要求1所述的一种获取石斛DNA指纹图谱的专用引物，其特征在于，所述专 用引物由序列表中的以下6对引物组成：SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 7;SEQIDNO. 1和SEQ IDNO. 8 ;SEQIDNO. 2 和SEQIDNO. 5 ;SEQIDNO. 2 和SEQIDNO. 6;SEQIDNO. 3 和SEQ IDNO. 8 ;SEQIDNO. 4 和SEQIDNO. 5。3. 如权利要求1或2所述的一种获取石斛DNA指纹图谱的专用引物，其特征在于，所述 专用引物获取DNA指纹图谱的石斛品种为霍山石斛和铁皮石斛。4. 一种石斛DNA指纹图谱的建立方法，该方法包括如下步骤： 步骤1，提取石斛材料的基因组DNA作为模板，用权利要求1-2中任一所述专用引物进 行SRAP-PCR扩增； 步骤2,将前述步骤中得到的SRAP-PCR扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用银 染显示DNA条带，获得石斛DNA指纹图谱。5. -种石斛DNA指纹图谱，该指纹图谱由权利要求4所述的方法建立获得。6. 权利要求5所述的一种石斛DNA指纹图谱，该指纹图谱为：01100000000， 01000000000,00000110101，00000100101，00010111001，10010011000,00010110001， 00001101100,00000100001，00010101100,00010110000,00000101101，00001110100， 00000101100,00010110100,00000100000,00010100000,00010100010,00000001000 ;其中 数字"1"表示图谱中确定位置上存在扩增条带，"0"表示图谱中该位置上没有扩增条带存 在。7. 权利要求1或2所述的任一专用引物在获取石斛DNA指纹图谱中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种石斛DNA指纹图谱及其专用引物和建立方法。所述专用引物其核苷酸序列如序列表所示，所述专用引物选自以下引物对中的一对或多对：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.7；SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。采用石斛材料的基因组DNA作为模板，用上述任一专用引物进行SRAP-PCR扩增；将得到的SRAP-PCR扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用银染显示DNA条带，获得石斛DNA指纹图谱。本发明创建了石斛DNA指纹图谱，能从遗传本质上对石斛品系进行种质鉴定，准确、可靠。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104894288
【申请号】CN201510381643
【发明人】李怀志, 刘士辉, 姚永康, 孙文华, 金静, 郭飞, 孙洪助, 刘青海
【申请人】上海孙桥现代农业联合发展有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年7月2日
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物DNA指纹图谱技术领域，具体涉及一种石斛DNA指纹图谱及其专 用引物和建立方法。
【背景技术】
[0002] 石斛属（Dendrobium)是兰科中最大的一个属。我国目前广泛种植的石斛属植物 有金釵石斛、霍山石斛、铁皮石斛等。尤其是铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo)由于具有益胃生津、滋阴清热等功效（中国药典（2010年）），种植面积在我国发展很 快。生产上多以味甘、质重、柔韧、粘性强等外观形态来评价铁皮石斛的质量。目前铁皮石斛 价格昂贵，市场上铁皮石斛品种繁多，不同品种间茎叶颜色存在差异，多糖含量、甘露糖含 量、生物碱等功能成分含量高低不一，抗病性也存在较大差异。仅仅通过外观形态鉴别，很 容易以次充好，消费者往往很难鉴别。因此，准确鉴别石斛品种真伪对其生产有重大意义。 另外，对种植者来说选择一种优良品种，有助于获得较高的经济效益。
[0003] G. Li 等在《Theoretical and Applied Genetics》（《理论与应用遗传学》）2001 年第 103 期 455-461 页发表了题为《Sequence-related amplified polymorphism(SRAP)，a new marker system based on a simple PCR reaction:its application to mapping and gene tagging in Brassica》（相关序列扩增多态性，一种新的基于PCR的标记系统及其在 芸薹属作图和基因标签法上的应用）一文。文中评述SRAP是一种新型的基于PCR的标记 系统，它的正向引物含有一段14个碱基的核心序列，5'端前10个碱基是无任何碱基特异构 成的填充序列，接着为CCGG序列，该序列可特异结合开放阅读框（ORF)区域中的外显子，其 后为3'端的3个选择性碱基；反向引物与正向引物的碱基组成不同在于填充序列后为AATT 序列，该序列可特异结合启动子和内含子区域，其扩增产物多位于外显子区域。SRAP技术由 于具有简便、可靠、易于分离条带和测序等优点，已成功用于甘蓝、西萌芦、茄子等蔬菜和棉 花等作物品种鉴定、DNA指纹图谱构建。然而还未见该技术在石斛指纹图谱建立中的应用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是，提供一种石斛NDA指纹图谱及其专用引物和建立方法。
[0005] 本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
[0006] -种获取石斛DNA指纹图谱的专用引物，其核苷酸序列如序列表所示，所述专用 引物选自以下引物对中的一对或多对：SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 7 ;SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 8 ; SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 5 ; SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 6 ;SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 8 ;SEQ ID NO. 4 和 SEQ ID NO. 5。所述 SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 8 分别对应序列表 中的序列1-序列8。
[0007] 进一步地，一种获取石斛DNA指纹图谱的专用引物，所述专用引物由序列表中的 以下 6 对引物组成：SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 7 ;SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 8 ;SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 5 ; SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 6 ; SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 8 ; SEQ ID NO. 4 和 SEQ ID NO. 5。
[0008] 具体地，所述专用引物由以下6对引物（引物序列均为5' -3'）组成：
[0009] (I)TGAGTCCAAACCGGATA 和 GACTGCGTACGAATTCAA ;
[0010] (2)TGAGTCCAAACCGGATA 和 GACTGCGTACGAATTCAG ;
[0011] (3)TGAGTCCAAACCGGAAT 和 GACTGCGTACGAATTGAC ;
[0012] (4)TGAGTCCAAACCGGAAT 和 GACTGCGTACGAATTAAC ;
[0013] (5)TGAGTCCTTTCCGGTGC 和 GACTGCGTACGAATTCAG ;
[0014] (6)TGAGTCCAAACCGGTAG 和 GACTGCGTACGAATTGAC。
[0015] 优选地，所述专用引物获取DNA指纹图谱的石斛品种为霍山石斛和铁皮石斛。
[0016] 本发明还提供一种石斛DNA指纹图谱的建立方法，该方法包括如下步骤：
[0017] 步骤1，提取石斛材料的基因组DNA作为模板，用权利要求1-2中任一所述专用引 物进行SRAP-PCR扩增；
[0018] 步骤2,将前述步骤中得到的SRAP-PCR扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳， 用银染显示DNA条带，获得石斛DNA指纹图谱。
[0019] 本发明还提供了利用上述指纹图谱建立方法获得的石斛DNA指纹图谱。所述石斛 DNA指纹图谱由"0"和"1"组成的一串有序数字表示，具体为：01100000000,01000000000， 00000110101，00000100101，00010111001，10010011000,00010110001，00001101100， 00000100001,00010101100,00010110000,00000101101，00001110100,00000101100， 00010110100,00000100000,00010100000,00010100010 及 00000001000。其中数字" 1"表示 图谱中确定位置上存在扩增条带，"0"表示图谱中该位置上没有扩增条带存在。转换成了数 码形式，便于计算机识别和分析。上述19串数字分别对应2种霍山石斛和17种铁皮石斛的 DNA指纹图谱。其中，每串有序数字具有11个数位，从第1数位到第11数位对应的引物对 以及特征条带为：第1数位表示ME8和M14引物对，特征条带为180bp ;第2数位表示ME8 和EM14引物对，特征条带为190bp ;第3数位表示ME8和EM14引物对，特征条带为240bp ; 第4数位表示ME9和EM3引物对，特征条带为250bp ;第5数位表示ME9和EM3引物对，特 征条带为260bp ;第6数位表示MEl和EM7引物对，特征条带为220bp ;第7数位表示MEl和 EM7引物对，特征条带为HObp ;第8数位表示MEl和EM14引物对，特征条带为170bp ;第9 数位表示MEl和HM14引物对，特征条带为250bp ;第10数位表示ME3和HM3引物对，特征 条带为150bp ;第11数位表示ME3和EM5引物对，特征条带为150bp。
[0020] 本发明还提供了所述任一专用引物在获取石斛DNA指纹图谱中的应用。
[0021] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0022] 1、本发明利用SRAP分子标记来鉴定石斛品种，通过构建基于每个石斛品种的 SRAP分子标记指纹图谱，为种植者提供参考。能从遗传本质上对石斛品系进行种质鉴定，准 确、可靠。
[0023] 2、当石斛指纹图谱一旦建立以后，在对某个未知样品进行真实检测时，几个小时 就可以知道该石斛DNA指纹，因此可以迅速判断出石斛品种的真实性。
[0024] 3、采用该发明，构建该DNA指纹图谱所用的样品可以根据需要不断增加，并对指 纹进行实时更新。
[0025] 4、本发明采用表的形式来说明DNA指纹图谱，并将其转换成了数码形式，便于计 算机识别和分析。
【附图说明】
[0026] 图1为本发明实施例中引物对ME8和EM14在20份石斛材料中的电泳图。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料 如未特别说明，均为商业化产品。
[0028] 实施例1
[0029] 本实施例采用收集到的20份具有广泛代表性的石斛品系为供试材料，用组培苗 提取DNA，进行SRAP分析，建立与之相对应的指纹图谱。得到的指纹图谱再用于对这20种 石斛品种进行鉴定，并为其它石斛的种质鉴定提供一条可供借鉴的有效方法。建立石斛DNA 指纹图谱的具体操作如下：
[0030] 1、选用代表性石斛品种
[0031 ] 本实施例采用表2所示20份石斛品种，其中金釵石斛（Dendrobium nobiIe Lindl.)1 份，霍山石斛（Dendrobium huoshanense)1 份，铁皮石斛（Dendrobium officinale) 18份， 选材以生产中广泛种植的石斛品系，参见表1。本实施例以20份石斛的 叶片提取DNA，建立了这20份石斛品系的DNA指纹图谱。这些石斛材料具有较好的代表性。 [0032] 表1 :石斛种质及其来源
[0035] 2、石斛品系的DNA提取及纯化
[0036] 取石斛幼苗两三片，以Doyle等人提出的CTAB法提取 DNA(Focus, 1990, 12:13-15)，所得产物用 TE缓冲液（IOmM Tris-HCl，0.1 mM EDTA)保存。然 后用NanoUV-3000超微量紫外分光光度计测定其浓度，稀释至20ng · μΓ1，于-20°C下保存 备用。
[0037] 3、SRAP-PCR扩增及电泳检测
[0038] 采用1(^1^反应体系，其中包括]\%(：122.0臟〇14-1，(1阶1 3各为0.2臟〇1*171，引物 0· 50 μL?ο? · Γ1，模板 DNA 50ng，Taq DNA 聚合酶 1U。
[0039] PCR扩增程序为：94°C预变性3min ;94°C变性lmin，35°C复性lmin，72°C延伸 lmin，5 个循环；94°C变性 lmin，55°C复性 lmin，72°C延伸 2min，35 个循环；72°C延伸 7min。
[0040] 电泳步骤如下：扩增产物加5 μ L上样缓冲液，94°C变性5min。然后迅速将其置于 冰上冷却。采用4%变性聚丙烯酰胺凝胶，0. 5XTBE缓冲液，50W恒功率电泳约I. 5h，银染 检测电泳结果。选择有代表性的多态性SRAP扩增条带构建供试材料的指纹图谱。
[0041] 4、构建DNA指纹图谱
[0042] 构建指纹图谱时，本着用最少引物、最少条带，又要把所有供试样品区分开来的原 贝丨J，本实施例从110对SRAP引物中筛选出MEl和EM7 ;ME1和EM14 ;ME3和EM3 ;ME3和EM5 ; ME8和EM14 ;ME9和EM3这6对专用引物组合。引物序列参见表2。
[0043] 表2 :石斛DNA指纹图谱的引物序列
[0044]
[0045] 上述6对引物共扩增出127个条带，从中选取其中11条稳定性和重复性良好、多 态性高的条带，用于构建这20个石斛材料的DNA指纹图谱。参见图1，该图为引物组合ME8 和EM14引物对在20份石斛材料中的电泳图。其中，a表示特征条带为180bp ;b表示特征 条带为190bp。c表示特征条带为240bp;采用的引物对为ME8和EM14。电泳图中M泳道代 表1OObp marker，泳道1-20的标号分别对应编号SH-I到SH-20的石斛材料。
[0046] 根据每条引物呈现的条带信息建立指纹图谱。根据这11条扩增条带的有无，绘制 出所有20个材料的DNA指纹图谱。在该图谱中，每个材料都具有其特异的DNA指纹。为了 描述方便，设定用" 1"表示图谱中某个位置上有扩增条带存在，用"〇"表示在该位置上没有 扩增条带存在。最终，每个材料都拥有了有" 1"和"〇"组成的一串短数字。
[0047] 如表3所示，本实施例中20份石斛材料的DNA指纹图谱中，左栏为石斛品系，右栏 为相对应的有11个数字串。
[0048] 表3 :20个石斛材料的DNA指纹
[0051] 上述表3中a表示ME8和EM14引物对，特征条带为180bp。b表示ME8和EM14引 物对，特征条带为190bp。c表示ME8和EM14引物对，特征条带为240bp。d表示ME9和EM3 引物对，特征条带为250bp。e表示ME9和EM3引物对，特征条带为260bp。f表示MEl和 EM7引物对，特征条带为220bp。g表示MEl和EM7引物对，特征条带为140bp。h表示MEl 和EM14引物对，特征条带为170bp。i表示MEl和EM14引物对，特征条带为250bp。j表示 ME3和EM3引物对，特征条带为150bp。k表示ME3和EM5引物对，特征条带为150bp。
[0052] 实施例2
[0053] 本发明石斛DNA指纹图谱用于石斛的种质鉴定
[0054] 假设供试材料中SH是生产上应用的优良品种，现有一批石斛不能确定是否是真 正的石斛SH-15。可按照如下方法对它的DNA指纹进行鉴定。
[0055] 石斛标准DNA指纹图谱建立以后，要对某个样品进行真伪性鉴定时，提取待测样 品DNA，用提取的DNA为模板，用MEl和EM7 ;ME1和EM14 ;ME3和EM3 ;ME3和EM5 ;ME8和 EM14 ;ME9和EM3这6对引物对其进行SRAP-PCR扩增，扩增产物在4 %变性聚丙烯酰胺凝胶 上电泳，银染，绘制出该待测样品的DNA指纹图谱，与标准DNA指纹图谱进行比对，就可以知 道该品种是否是真正的石斛SH-15。
[0056] 结果表明它的DNA指纹是00000101100,这与SH-15的标准指纹是一致的，因此所 检测的石斛品种是SH-15。如果待测样品的指纹不是00000101100,那么该材料就不是真正 的 SH-15。
[0057] 上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领 域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任 何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
【主权项】
1. 一种获取石斛DNA指纹图谱的专用引物，其特征在于，所述专用引物选自以下引物 对中的一对或多对：SEQIDNO. 1 和SEQIDNO. 7;SEQIDNO. 1 和SEQIDNO. 8;SEQID NO. 2 和SEQIDNO. 5 ;SEQIDNO. 2 和SEQIDNO. 6 ;SEQIDNO. 3 和SEQIDNO. 8 ;SEQID NO. 4 和SEQIDNO. 5。2. 如权利要求1所述的一种获取石斛DNA指纹图谱的专用引物，其特征在于，所述专 用引物由序列表中的以下6对引物组成：SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 7;SEQIDNO. 1和SEQ IDNO. 8 ;SEQIDNO. 2 和SEQIDNO. 5 ;SEQIDNO. 2 和SEQIDNO. 6;SEQIDNO. 3 和SEQ IDNO. 8 ;SEQIDNO. 4 和SEQIDNO. 5。3. 如权利要求1或2所述的一种获取石斛DNA指纹图谱的专用引物，其特征在于，所述 专用引物获取DNA指纹图谱的石斛品种为霍山石斛和铁皮石斛。4. 一种石斛DNA指纹图谱的建立方法，该方法包括如下步骤： 步骤1，提取石斛材料的基因组DNA作为模板，用权利要求1-2中任一所述专用引物进 行SRAP-PCR扩增； 步骤2,将前述步骤中得到的SRAP-PCR扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用银 染显示DNA条带，获得石斛DNA指纹图谱。5. -种石斛DNA指纹图谱，该指纹图谱由权利要求4所述的方法建立获得。6. 权利要求5所述的一种石斛DNA指纹图谱，该指纹图谱为：01100000000， 01000000000,00000110101，00000100101，00010111001，10010011000,00010110001， 00001101100,00000100001，00010101100,00010110000,00000101101，00001110100， 00000101100,00010110100,00000100000,00010100000,00010100010,00000001000 ;其中 数字"1"表示图谱中确定位置上存在扩增条带，"0"表示图谱中该位置上没有扩增条带存 在。7. 权利要求1或2所述的任一专用引物在获取石斛DNA指纹图谱中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种石斛DNA指纹图谱及其专用引物和建立方法。所述专用引物其核苷酸序列如序列表所示，所述专用引物选自以下引物对中的一对或多对：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.7；SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。采用石斛材料的基因组DNA作为模板，用上述任一专用引物进行SRAP-PCR扩增；将得到的SRAP-PCR扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用银染显示DNA条带，获得石斛DNA指纹图谱。本发明创建了石斛DNA指纹图谱，能从遗传本质上对石斛品系进行种质鉴定，准确、可靠。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104894288
【申请号】CN201510381643
【发明人】李怀志, 刘士辉, 姚永康, 孙文华, 金静, 郭飞, 孙洪助, 刘青海
【申请人】上海孙桥现代农业联合发展有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年7月2日
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