Dtmuv、edsv和h9亚型aiv的三重荧光定量pcr检测引物、试剂盒及方法
Dtmuv、edsv和h9亚型aiv的三重荧光定量pcr检测引物、试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子检测领域，具体涉及一种鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和 H9亚型禽流感病毒的三重荧光定量PCR检测引物、试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 鸭坦布苏病毒病（Duck Tembusu Virus Disease)是由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu Virus，DTMUV)引起的一种急性传染病。该病可导致蛋鸭，种鶴在短时间内出现 明显的产蛋下降症状，且病程可长达数周。近来，也有蛋鸡和肉鸭感染的报道。该病病原 属于黄病毒科（Flaviviridae)，黄病毒属（Flavivirus)，坦布苏病毒（Tembusu virus)。 尽管该病死亡率不高，但病程长，潜在危害巨大。鸭坦布苏病毒基因组长约11 kb，顺序为 5' -C-prM-E-NSl-NS2A-NS2B-NS3 -NS4A-NS4B-NS5-3'，其中 NS5 非常保守。
[0003] 产蛋下降综合征（Egg Drop Syndrome，EDS)是由禽腺病毒引起的，导致种蛋禽 产蛋量下降的一种传染病。该病毒仅有一个血清型，主要引起种鸡的产蛋性能下降，同时其 的自然宿主还包括鸭和鹅，并且也有引起鸭产蛋下降，蛋壳变粗糙、软化和变薄的报道。该 病能够垂直传播，因此准确检测种禽的带毒及发病情况有助于减少由此带来的经济损失。
[0004] H9亚型禽流感病毒（H9 Subtype AIV)通常可由禽类携带，大部分野鸟感染后一般 不出席临床症状，但可导致鸭产蛋下降，而鸡则可以表现出呼吸道、消化道、泌尿生殖器官 的病变(通常表现为产蛋下降)。
[0005] 多重荧光定量PCR技术是在荧光定量PCR基础上发展起来的一个新技术，它强调 在同一个反应体系里同时扩增多个靶标。到目前为止，尚无报道有同时检测鸭坦布苏病毒、 产蛋下降综合征病毒和H9亚型禽流感病毒的试剂盒。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的在于提供一种鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和H9亚型 禽流感病毒的三重荧光定量PCR检测引物。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供一种鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和H9亚 型禽流感病毒的三重荧光定量PCR检测试剂盒。
[0008] 本发明的另一个目的在于提供一种鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和H9亚 型禽流感病毒的三重荧光定量PCR检测方法。
[0009] 本发明所采取的技术方案是： 一种鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和H9亚型禽流感病毒三重荧光定量PCR检测 引物组合物，所述的检测引物如下所示： 针对鸭坦布苏病毒的引物： DTMUV - U :5' -GCTTCAGCTGTCTGGGGATGCAGAAC-3'， DTMUV -L:5' -AGCATAAGTTGCCTTGGGATTATGAG-3' ； 针对产蛋下降综合征病毒的引物： EDS-U :5' -AGGTGTCTGATATTGGAGTG-3'， EDS-L :5' -TGGATGAAACGCTTTATAAG-3' ； 针对H9亚型禽流感病毒的引物： H9-U :3' -GCCATAGCTGGATTCATAGA-5'， H9-L -AACTCTGCATTRTATGCCCA-SiO
[0010] 一种鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和H9亚型禽流感病毒三重荧光定量PCR 检测试剂盒，其含有分别针对鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒、H9亚型禽流感病毒的检 测引物；所述针对鸭坦布苏病毒的检测引物是根据鸭坦布苏病毒的E基因序列设计的；所 述针对所述针对产蛋下降综合征病毒的检测引物是根据产蛋下降综合征病毒的五邻体基 因序列设计的；所述针对H9亚型禽流感病毒的检测引物是根据H9亚型禽流感病毒的HA基 因序列设计的。
[0011] 作为优选的，所述检测引物的核苷酸序列如下所示： 针对鸭坦布苏病毒的引物： DTMUV - U :5' -GCTTCAGCTGTCTGGGGATGCAGAAC-3'， DTMUV -L:5' -AGCATAAGTTGCCTTGGGATTATGAG-3' ； 针对产蛋下降综合征病毒的引物： EDS-U :5' -AGGTGTCTGATATTGGAGTG-3'， EDS-L :5' -TGGATGAAACGCTTTATAAG-3' ； 针对H9亚型禽流感病毒的引物： H9-U :3' -GCCATAGCTGGATTCATAGA-5'， H9-L -AACTCTGCATTRTATGCCCA-SiO
[0012] 所述试剂盒中还含有一步法SYBR RT-PCR缓冲液及DNA聚合酶。
[0013] 一种鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和H9亚型禽流感病毒三重荧光定量PCR 检测方法，包括如下步骤： (1) 分别设计针对鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒、H9亚型禽流感病毒的检测引 物； (2) 配置实时荧光PCR反应体系，三种病毒检测引物的终浓度均为20pmol，每种DNA模 板量为1 μ L，进行PCR反应； (3) 在每个延伸时连续采集荧光信号，根据熔解曲线来判断样品中是否含有鸭坦布苏 病毒、产蛋下降综合征病毒或Η9亚型禽流感病毒。
[0014] 所述针对鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒、Η9亚型禽流感病毒的检测引物如 下所示： 针对鸭坦布苏病毒的引物： DTMUV - U :5' -GCTTCAGCTGTCTGGGGATGCAGAAC-3'， DTMUV -L:5' -AGCATAAGTTGCCTTGGGATTATGAG-3' ； 针对产蛋下降综合征病毒的引物： EDS-U :5' -AGGTGTCTGATATTGGAGTG-3'， EDS-L :5' -TGGATGAAACGCTTTATAAG-3' ； 针对H9亚型禽流感病毒的引物： H9-U :3' -GCCATAGCTGGATTCATAGA-5'， H9-L -AACTCTGCATTRTATGCCCA-SiO
[0015] 所述实时荧光PCR反应体系的组成为：
实时荧光 PCR 反应程序为：42°C 5min;95°C 10sec;95°C 5sec，55°C10sec，72°C 10sec，45cycles，在每个延伸时采集荧光信号；再进行95°C 180sec，40°C 240sec，95°C Isec的融解曲线分析程序，连续采集荧光信号。
[0016] 本发明的有益效果是： 本发明的检测引物及试剂盒可以同时检测EDSV、H9 AIV和DTMUV，且不与鸭瘟病毒、鹅 细小病毒、番鸭细小病毒和大肠杆菌基因组DNA以及鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型、番 鸭呼肠孤病毒和新城疫病毒的RNA发生交叉反应；敏感性试验表明，该方法对EDSV、H9 AIV 和DTMUV核酸的检测下限分别为8. 0、4. 8和1. 3个拷贝，该方法比常规PCR方法敏感10倍； 该方法重复性良好，对不同批次的样品扩增效果良好。通过标准曲线的建立以及临床样品 的检测表明，该方法可以用于EDSV、H9 AIV和DTMUV的定性和定量检测。
【附图说明】
[0017] 图1为DTMUV、H9 AIV和EDSV核酸PCR扩增电泳图； 图2为EDSV核酸荧光PCR扩增后融解曲线； 图3为H9 AIV核酸荧光PCR扩增后融解曲线； 图4为DTMUV核酸荧光PCR扩增后融解曲线； 图5为EDSV和H9 AIV核酸荧光PCR扩增后融解曲线分析； 图6为EDSV和DTMUV核酸荧光PCR扩增后融解曲线分析； 图7为H9AIV和DTMUV核酸荧光PCR扩增后融解曲线分析； 图8为EDSV、H9AIV和DTMUV核酸荧光PCR扩增后融解曲线分析； 图9为三重荧光PCR方法扩增曲线的特异性； 图10为三重荧光PCR方法扩增产物融解曲线的特异性； 图11为荧光PCR与常规PCR扩增8. OX IO4~8. OX KT1拷贝pEDSV核酸检测下限电 泳图(左边为荧光PCR产物电泳图，右边为常规PCR产物电泳图）； 图12为荧光PCR与常规PCR扩增4. 8 X IO4~4. 8 X KT1拷贝pH9核酸检测下限电泳 图(左边为荧光PCR产物电泳图，右边为常规PCR产物电泳图）； 图13为荧光PCR与常规PCR扩增1.3 X IO5~1.3 X 10°拷贝pDTMUV核酸检测下限电 泳图(左边为荧光PCR产物电泳图，右边为常规PCR产物电泳图）； 图14为pEDS质粒8. 0 X IO5~8. 0拷贝的荧光PCR扩增曲线； 图15为pH9质粒4. 8 X 105~4. 8拷贝的荧光PCR扩增曲线； 图16为pDTMUV质粒1.3 X 106~1. 3 X IO1拷贝的荧光PCR扩增曲线。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0019] 1材料和方法 I. 1病毒鸭坦布苏病毒JM株、产蛋下降综合征病毒和H9亚型禽流感病毒由本研宄室 保存。
[0020] L 2试剂 One St印 SYBR PrimeScript RT-PCR Kit II、DNA分子量标准、pMD18-T 载体、Takara MiniBEST DNA/RNA提取试剂盒，胶回收试剂盒购自大连宝生物工程有限公 司，DH5 α感受态购自天根公司，其它试剂均为分析纯。
[0021] 1. 3引物设计与合成下载GenBank中鸭坦布苏病毒全基因序列、产蛋下降综合征 病毒和Η9亚型禽流感病毒基因序列，利用Oligo 6. 0设计针对它们保守区域的特异性引 物。引物由Invitrogen公司合成，序列见表1。
[0022] 表1三重PCR特异性引物
1.4病毒核酸扩增及标准品构建根据Takara MiniBEST DNA/RNA试剂盒说明书分别提 取鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和Η9亚型禽流感病毒的核酸，利用这三种病毒特异 性引物分别对基因序列进行扩增。PCR反应体系见表2。PCR反应条件为：42°C 10min，94°C 5min;94°C 30sec，55°C30sec，72°C 30sec，30cycles;72°C lOmin。经 1%琼脂糖凝胶电泳， 胶回收，与PMD18-T载体连接，转化DH5 α后，PCR鉴定为阳性的菌液，由Invitrogen公司进 行序列测定。所获得的阳性质粒分别命名为pDTMUV、pEDS和ρΗ9,并测定质粒的浓度。
[0023] 表2 PCR扩增DTMUV、EDSV和Η9 AIV核酸的反应体系
1.5三重荧光PCR方法的建立将DTMUV、EDSV和H9 AIV的上下游引物(每条引物的浓 度均为10 μΜ)分别等体积混合后，在25 yL PCR反应体系内，三种病毒检测引物(上下游混 合物）的终浓度均为20pmol，每种病毒核酸量均为1 μ L (反应体系见表3)，然后按照如下 条件进行反应：42°C 5min;95°C 10sec;95°C 586。，55。〇1〇86。，72。〇 10sec，45cycles (在 每个延伸时采集荧光信号);再进行95°C 180sec，40°C 240sec，95°C Isec的融解曲线分析 程序(连续采集荧光信号)。确定该反应体系下能否扩增出这3种病毒的核酸。
[0024] 表3三重荧光PCR扩增DTMUV、EDSV和H9 AIV核酸的反应体系 ................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................... .........................................................................................................................................................................................................................................................................................................
1.6引物浓度的优化 将每种病毒特异性上下游引物（10 μ Μ)等体积混合后，按照0. 4 μ L、0. 8 μ L和I. 6 μ L 共3个加样体积，即4pmol、8pmol和16pmol这三种不同含量进行组合，确定最佳引物含量。 随后在引物含量最佳的条件下，对单个病毒核酸以及不同组合的核酸进行单一或者多重检 测，以验证引物的效果。
[0025] 1. 7特异性 将本实验室保存的鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒和大肠杆菌基因组DNA，以及 鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型、番鸭呼肠孤病毒和新城疫病毒RNA进行多重荧光PCR反 应，以验证所建立方法是否与这些病毒的核酸之间存在交叉反应。
[0026] 1. 8敏感性和重复性 提取1. 4中构建好的pDTMUV、pEDS和pH9质粒，经DNA浓度测定后，按照质粒拷贝数计 算公式。即，拷贝数（copies/gL)=6.02 X IO23 (copies/mol)X 质粒浓度（g/pL)/ (碱基 数）X660 (g/mol)。随后，将质粒分别用超纯水10倍倍比稀释，即从KT1 一直稀释到KT11 后，取KT6-KT11这6个梯度的质粒进行敏感性试验。随后，取KT5-KT ici这6个梯度的质粒 进行3个重复，确定方法的重复性。同时，利用单个引物进行常规PCR扩增，比较三重定量 PCR方法与常规PCR方法的敏感性差异。
[0027] 1. 9临床样品检测 将本研宄室保存的40份DTMUV泄殖腔拭子和2份EDSV、H9 AIV阳性病料的核酸，进行 三重荧光PCR验证。
[0028] 2 结果 2. I DTMUV、H9 AIV和 EDSV的扩增 经PCR扩增、1%琼脂糖凝胶电泳及DNA序列测定，证实所使用的引物能够特异性扩增各 自对应的病毒核酸(如图1所示)。
[0029] 2. 2三重荧光PCR方法的建立 经荧光PCR反应及融解曲线分析，可以发现该方法能够扩增EDSV、H9 AIV和DTMUV的 核酸，融解曲线分析显示所扩增产物的Tm值分别接近81°C、84°C和87°C (图2,图3,图4)。 经10份样品重复验证，并按照Tm平均值±3倍标准差来确定三种产物的Tm值范围，结果 显示 EDSV、H9 AIV和 DTMUV扩增产物 Tm值范围分别为：81. 2±0. 5,83. 8±0. 4,86. 9±0. 5。
[0030] 2. 3引物最佳浓度筛选 在4pmol、8pmol和16pmol这三种不同引物含量的排列组合下，最终确定DTMUV最佳引 物含量为4pmol，EDSV最佳引物含量为8pmol，H9 AIV最佳引物含量为16pmol。在此情况 下，可以检测出任意两种或者3种病毒核酸的混合样品（图5,图6,图7,图8)。经1%琼脂 糖凝胶电泳证实，所有融解曲线分析结果与电泳结果完全一致。
[0031] 2. 4三重荧光PCR方法的特异性 经三重荧光PCR验证，鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒和大肠杆菌基因组DNA，以 及鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型、番鸭呼肠孤病毒和新城疫病毒RNA不与EDSV、H9 AIV 和DTMUV特异性引物发生交叉反应，即不出现明显的S型扩增曲线（图9);同时融解曲线分 析显示，EDSV、H9 AIV和DTMUV分别在81°C、84°C和87°C左右出现明显的融解峰（图10)。 因此综合扩增曲线和融解曲线的结果确定，三重荧光PCR方法的特异性良好。
[0032] 2. 5三重荧光PCR方法的敏感性和重复性 经DNA浓度测定，pEDS质粒浓度为247ng/^L，pH9质粒浓度为156ng/^L，pDTMUV 质粒浓度为425ng/^L，经计算确定这三个质粒的拷贝数分别为8. O X KTcopies/^L、 4. SXlO'opies/^Ul· 3X10ncopies/^L。通过三重荧光PCR方法与常规PCR方法对上 述质粒KT5-KT ici稀释度后的核酸进行检测下限比较发现，本研宄所建立的三重荧光PCR 方法对EDSV核酸的检测下限为8.0个拷贝（图11)，对H9 AIV核酸的检测下限为4. 8个 拷贝（图12)，对DTMUV核酸的检测下限为1.3个拷贝（图13)，这比常规PCR方法敏感10 倍。取KT5-KTici这6个稀释度的质粒进行3重复PCR反应并建立标准曲线后，结果显示， 图 14 中 8. 0X105~8. 0 拷贝的 pEDS 质粒平均 Cq值分别为 15. 12±0. 11、18. 17±0. 14、 21. 42±0· 12、24· 63±0· 08、28· 15±0· 34 和 31. 64±0· 27。图 15 中 4. 8X 105~4· 8 拷贝 的 PH9 质粒平均 Cq 值（或称 Ct 值）分别为：15. 94±0. 24、19. 30±0. 21、22. 86±0. 20、 26. 62±0· 76、29· 95±0· 10 和 33. 84±0· 60 ;图 16 中 I. 3X 106~1· 3X101 拷贝的 pDTMUV 质 粒平均 Cq 值分别为：13· 35±0· 19、16· 65±0· 10、20· 13±0· 04、23· 55±0· 11、26· 90±0· 14 和30. 80±0. 41 ;通过线形回归证实，标准曲线的扩增效率分别为2. 08,1. 87和2. 03 ;R2分 别为0. 99,0. 98和1. 00 ;线形回归方程的斜率分别为-3. 14,-3. 68和-3. 26, Y轴的截距分 别为 37. 13, 36. 55 和 36. 87。
[0033] 2. 6临床样品检测 40份DTMUV泄殖腔拭子经过三重荧光PCR检测及融解曲线分析后发现，阳性样品数为 31份，阴性样品数为9份；常规PCR检测及电泳结果显示阳性样品数为26份，阴性样品数 为14份。2份EDSV、H9 AIV阳性病料的核酸与常规PCR符合率为100%。
[0034] 以上实验表明：本发明的检测引物及试剂盒可以同时检测EDSV、H9 AIV和DTMUV， 且不与鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒和大肠杆菌基因组DNA以及鸭甲肝病毒1型、 鸭甲肝病毒3型、番鸭呼肠孤病毒和新城疫病毒的RNA发生交叉反应；敏感性试验表明，该 方法对EDSV、H9 AIV和DTMUV核酸的检测下限分别为8. 0、4. 8和1. 3个拷贝，该方法比常 规PCR方法敏感10倍；该方法重复性良好，对不同批次的样品扩增效果良好。通过标准曲 线的建立以及临床样品的检测表明，该方法可以用于EDSV、H9 AIV和DTMUV的定性和定量 检测。
【主权项】
1. 一种鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和H9亚型禽流感病毒三重荧光定量PCR检 测引物组合物，所述的检测引物如下所示： 针对鸭坦布苏病毒的引物： DTMUV - U :5' -GCTTCAGCTGTCTGGGGATGCAGAAC-3'， DTMUV -L:5' -AGCATAAGTTGCCTTGGGATTATGAG-3' ； 针对产蛋下降综合征病毒的引物： EDS-U :5' -AGGTGTCTGATATTGGAGTG-3'， EDS-L :5' -TGGATGAAACGCTTTATAAG-3' ； 针对H9亚型禽流感病毒的引物： H9-U :3' -GCCATAGCTGGATTCATAGA-5'， H9-L -AACTCTGCATTRTATGCCCA-SiO2. -种鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和H9亚型禽流感病毒三重荧光定量PCR检 测试剂盒，其含有分别针对鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒、H9亚型禽流感病毒的检测 引物；所述针对鸭坦布苏病毒的检测引物是根据鸭坦布苏病毒的E基因序列设计的；所述 针对所述针对产蛋下降综合征病毒的检测引物是根据产蛋下降综合征病毒的五邻体基因 序列设计的；所述针对H9亚型禽流感病毒的检测引物是根据H9亚型禽流感病毒的HA基因 序列设计的。3. 根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测引物的核苷酸序列如下 所示： 针对鸭坦布苏病毒的引物： DTMUV - U :5' -GCTTCAGCTGTCTGGGGATGCAGAAC-3'， DTMUV -L:5' -AGCATAAGTTGCCTTGGGATTATGAG-3' ； 针对产蛋下降综合征病毒的引物： EDS-U :5' -AGGTGTCTGATATTGGAGTG-3'， EDS-L :5' -TGGATGAAACGCTTTATAAG-3' ； 针对H9亚型禽流感病毒的引物： H9-U :3' -GCCATAGCTGGATTCATAGA-5'， H9-L -AACTCTGCATTRTATGCCCA-SiO4. 根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有一步法SYBR RT-PCR缓冲液及DNA聚合酶。5. -种鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和H9亚型禽流感病毒三重荧光定量PCR检 测方法，包括如下步骤： (1) 分别设计针对鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒、H9亚型禽流感病毒的检测引 物； (2) 配置实时荧光PCR反应体系，三种病毒检测引物的终浓度均为20pmol，每种DNA模 板量为1 μ L，进行PCR反应； (3) 在每个延伸时连续采集荧光信号，根据熔解曲线来判断样品中是否含有鸭坦布苏 病毒、产蛋下降综合征病毒或Η9亚型禽流感病毒。6. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述针对鸭坦布苏病毒、产蛋下降综 合征病毒、H9亚型禽流感病毒的检测引物如下所示： 针对鸭坦布苏病毒的引物： DTMUV - U :5' -GCTTCAGCTGTCTGGGGATGCAGAAC-3'， DTMUV -L:5' -AGCATAAGTTGCCTTGGGATTATGAG-3' ； 针对产蛋下降综合征病毒的引物： EDS-U :5' -AGGTGTCTGATATTGGAGTG-3'， EDS-L :5' -TGGATGAAACGCTTTATAAG-3' ； 针对H9亚型禽流感病毒的引物： H9-U :3' -GCCATAGCTGGATTCATAGA-5'， H9-L -AACTCTGCATTRTATGCCCA-SiO7. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述实时荧光PCR反应体系的组成 为：8. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，实时荧光PCR反应程序为：42°C 5min;95°C 10sec;95°C 586(3,55。〇1〇86(3,72。〇 10sec，45cycles，在每个延伸时米集焚光 信号；再进行95°C 180sec，40°C 240sec，95°C Isec的融解曲线分析程序，连续采集荧光 信号。
【专利摘要】本发明公开了一种鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和H9亚型禽流感病毒的三重荧光定量PCR检测引物、试剂盒及方法。所述针对鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒、H9亚型禽流感病毒的检测引物分别如SEQ ID NO.1-6所示。本发明的检测引物及试剂盒可以同时检测EDSV、H9 AIV和DTMUV，且不与鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒和大肠杆菌基因组DNA以及鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型、番鸭呼肠孤病毒和新城疫病毒的RNA发生交叉反应，对EDSV、H9 AIV和DTMUV核酸的检测下限分别为8.0、4.8和1.3个拷贝，可以用于EDSV、H9 AIV和DTMUV的定性和定量检测。
【IPC分类】C12R1/93, C12Q1/68, C12N15/11, C12Q1/70
【公开号】CN104894292
【申请号】CN201510124338
【发明人】孙敏华, 董嘉文, 李林林, 袁建丰, 邝瑞欢, 张建峰, 刘志成, 张春红
【申请人】广东省农业科学院动物卫生研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年3月19日
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子检测领域，具体涉及一种鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和 H9亚型禽流感病毒的三重荧光定量PCR检测引物、试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 鸭坦布苏病毒病（Duck Tembusu Virus Disease)是由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu Virus，DTMUV)引起的一种急性传染病。该病可导致蛋鸭，种鶴在短时间内出现 明显的产蛋下降症状，且病程可长达数周。近来，也有蛋鸡和肉鸭感染的报道。该病病原 属于黄病毒科（Flaviviridae)，黄病毒属（Flavivirus)，坦布苏病毒（Tembusu virus)。 尽管该病死亡率不高，但病程长，潜在危害巨大。鸭坦布苏病毒基因组长约11 kb，顺序为 5' -C-prM-E-NSl-NS2A-NS2B-NS3 -NS4A-NS4B-NS5-3'，其中 NS5 非常保守。
[0003] 产蛋下降综合征（Egg Drop Syndrome，EDS)是由禽腺病毒引起的，导致种蛋禽 产蛋量下降的一种传染病。该病毒仅有一个血清型，主要引起种鸡的产蛋性能下降，同时其 的自然宿主还包括鸭和鹅，并且也有引起鸭产蛋下降，蛋壳变粗糙、软化和变薄的报道。该 病能够垂直传播，因此准确检测种禽的带毒及发病情况有助于减少由此带来的经济损失。
[0004] H9亚型禽流感病毒（H9 Subtype AIV)通常可由禽类携带，大部分野鸟感染后一般 不出席临床症状，但可导致鸭产蛋下降，而鸡则可以表现出呼吸道、消化道、泌尿生殖器官 的病变(通常表现为产蛋下降)。
[0005] 多重荧光定量PCR技术是在荧光定量PCR基础上发展起来的一个新技术，它强调 在同一个反应体系里同时扩增多个靶标。到目前为止，尚无报道有同时检测鸭坦布苏病毒、 产蛋下降综合征病毒和H9亚型禽流感病毒的试剂盒。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的在于提供一种鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和H9亚型 禽流感病毒的三重荧光定量PCR检测引物。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供一种鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和H9亚 型禽流感病毒的三重荧光定量PCR检测试剂盒。
[0008] 本发明的另一个目的在于提供一种鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和H9亚 型禽流感病毒的三重荧光定量PCR检测方法。
[0009] 本发明所采取的技术方案是： 一种鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和H9亚型禽流感病毒三重荧光定量PCR检测 引物组合物，所述的检测引物如下所示： 针对鸭坦布苏病毒的引物： DTMUV - U :5' -GCTTCAGCTGTCTGGGGATGCAGAAC-3'， DTMUV -L:5' -AGCATAAGTTGCCTTGGGATTATGAG-3' ； 针对产蛋下降综合征病毒的引物： EDS-U :5' -AGGTGTCTGATATTGGAGTG-3'， EDS-L :5' -TGGATGAAACGCTTTATAAG-3' ； 针对H9亚型禽流感病毒的引物： H9-U :3' -GCCATAGCTGGATTCATAGA-5'， H9-L -AACTCTGCATTRTATGCCCA-SiO
[0010] 一种鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和H9亚型禽流感病毒三重荧光定量PCR 检测试剂盒，其含有分别针对鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒、H9亚型禽流感病毒的检 测引物；所述针对鸭坦布苏病毒的检测引物是根据鸭坦布苏病毒的E基因序列设计的；所 述针对所述针对产蛋下降综合征病毒的检测引物是根据产蛋下降综合征病毒的五邻体基 因序列设计的；所述针对H9亚型禽流感病毒的检测引物是根据H9亚型禽流感病毒的HA基 因序列设计的。
[0011] 作为优选的，所述检测引物的核苷酸序列如下所示： 针对鸭坦布苏病毒的引物： DTMUV - U :5' -GCTTCAGCTGTCTGGGGATGCAGAAC-3'， DTMUV -L:5' -AGCATAAGTTGCCTTGGGATTATGAG-3' ； 针对产蛋下降综合征病毒的引物： EDS-U :5' -AGGTGTCTGATATTGGAGTG-3'， EDS-L :5' -TGGATGAAACGCTTTATAAG-3' ； 针对H9亚型禽流感病毒的引物： H9-U :3' -GCCATAGCTGGATTCATAGA-5'， H9-L -AACTCTGCATTRTATGCCCA-SiO
[0012] 所述试剂盒中还含有一步法SYBR RT-PCR缓冲液及DNA聚合酶。
[0013] 一种鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和H9亚型禽流感病毒三重荧光定量PCR 检测方法，包括如下步骤： (1) 分别设计针对鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒、H9亚型禽流感病毒的检测引 物； (2) 配置实时荧光PCR反应体系，三种病毒检测引物的终浓度均为20pmol，每种DNA模 板量为1 μ L，进行PCR反应； (3) 在每个延伸时连续采集荧光信号，根据熔解曲线来判断样品中是否含有鸭坦布苏 病毒、产蛋下降综合征病毒或Η9亚型禽流感病毒。
[0014] 所述针对鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒、Η9亚型禽流感病毒的检测引物如 下所示： 针对鸭坦布苏病毒的引物： DTMUV - U :5' -GCTTCAGCTGTCTGGGGATGCAGAAC-3'， DTMUV -L:5' -AGCATAAGTTGCCTTGGGATTATGAG-3' ； 针对产蛋下降综合征病毒的引物： EDS-U :5' -AGGTGTCTGATATTGGAGTG-3'， EDS-L :5' -TGGATGAAACGCTTTATAAG-3' ； 针对H9亚型禽流感病毒的引物： H9-U :3' -GCCATAGCTGGATTCATAGA-5'， H9-L -AACTCTGCATTRTATGCCCA-SiO
[0015] 所述实时荧光PCR反应体系的组成为：
实时荧光 PCR 反应程序为：42°C 5min;95°C 10sec;95°C 5sec，55°C10sec，72°C 10sec，45cycles，在每个延伸时采集荧光信号；再进行95°C 180sec，40°C 240sec，95°C Isec的融解曲线分析程序，连续采集荧光信号。
[0016] 本发明的有益效果是： 本发明的检测引物及试剂盒可以同时检测EDSV、H9 AIV和DTMUV，且不与鸭瘟病毒、鹅 细小病毒、番鸭细小病毒和大肠杆菌基因组DNA以及鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型、番 鸭呼肠孤病毒和新城疫病毒的RNA发生交叉反应；敏感性试验表明，该方法对EDSV、H9 AIV 和DTMUV核酸的检测下限分别为8. 0、4. 8和1. 3个拷贝，该方法比常规PCR方法敏感10倍； 该方法重复性良好，对不同批次的样品扩增效果良好。通过标准曲线的建立以及临床样品 的检测表明，该方法可以用于EDSV、H9 AIV和DTMUV的定性和定量检测。
【附图说明】
[0017] 图1为DTMUV、H9 AIV和EDSV核酸PCR扩增电泳图； 图2为EDSV核酸荧光PCR扩增后融解曲线； 图3为H9 AIV核酸荧光PCR扩增后融解曲线； 图4为DTMUV核酸荧光PCR扩增后融解曲线； 图5为EDSV和H9 AIV核酸荧光PCR扩增后融解曲线分析； 图6为EDSV和DTMUV核酸荧光PCR扩增后融解曲线分析； 图7为H9AIV和DTMUV核酸荧光PCR扩增后融解曲线分析； 图8为EDSV、H9AIV和DTMUV核酸荧光PCR扩增后融解曲线分析； 图9为三重荧光PCR方法扩增曲线的特异性； 图10为三重荧光PCR方法扩增产物融解曲线的特异性； 图11为荧光PCR与常规PCR扩增8. OX IO4~8. OX KT1拷贝pEDSV核酸检测下限电 泳图(左边为荧光PCR产物电泳图，右边为常规PCR产物电泳图）； 图12为荧光PCR与常规PCR扩增4. 8 X IO4~4. 8 X KT1拷贝pH9核酸检测下限电泳 图(左边为荧光PCR产物电泳图，右边为常规PCR产物电泳图）； 图13为荧光PCR与常规PCR扩增1.3 X IO5~1.3 X 10°拷贝pDTMUV核酸检测下限电 泳图(左边为荧光PCR产物电泳图，右边为常规PCR产物电泳图）； 图14为pEDS质粒8. 0 X IO5~8. 0拷贝的荧光PCR扩增曲线； 图15为pH9质粒4. 8 X 105~4. 8拷贝的荧光PCR扩增曲线； 图16为pDTMUV质粒1.3 X 106~1. 3 X IO1拷贝的荧光PCR扩增曲线。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0019] 1材料和方法 I. 1病毒鸭坦布苏病毒JM株、产蛋下降综合征病毒和H9亚型禽流感病毒由本研宄室 保存。
[0020] L 2试剂 One St印 SYBR PrimeScript RT-PCR Kit II、DNA分子量标准、pMD18-T 载体、Takara MiniBEST DNA/RNA提取试剂盒，胶回收试剂盒购自大连宝生物工程有限公 司，DH5 α感受态购自天根公司，其它试剂均为分析纯。
[0021] 1. 3引物设计与合成下载GenBank中鸭坦布苏病毒全基因序列、产蛋下降综合征 病毒和Η9亚型禽流感病毒基因序列，利用Oligo 6. 0设计针对它们保守区域的特异性引 物。引物由Invitrogen公司合成，序列见表1。
[0022] 表1三重PCR特异性引物
1.4病毒核酸扩增及标准品构建根据Takara MiniBEST DNA/RNA试剂盒说明书分别提 取鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和Η9亚型禽流感病毒的核酸，利用这三种病毒特异 性引物分别对基因序列进行扩增。PCR反应体系见表2。PCR反应条件为：42°C 10min，94°C 5min;94°C 30sec，55°C30sec，72°C 30sec，30cycles;72°C lOmin。经 1%琼脂糖凝胶电泳， 胶回收，与PMD18-T载体连接，转化DH5 α后，PCR鉴定为阳性的菌液，由Invitrogen公司进 行序列测定。所获得的阳性质粒分别命名为pDTMUV、pEDS和ρΗ9,并测定质粒的浓度。
[0023] 表2 PCR扩增DTMUV、EDSV和Η9 AIV核酸的反应体系
1.5三重荧光PCR方法的建立将DTMUV、EDSV和H9 AIV的上下游引物(每条引物的浓 度均为10 μΜ)分别等体积混合后，在25 yL PCR反应体系内，三种病毒检测引物(上下游混 合物）的终浓度均为20pmol，每种病毒核酸量均为1 μ L (反应体系见表3)，然后按照如下 条件进行反应：42°C 5min;95°C 10sec;95°C 586。，55。〇1〇86。，72。〇 10sec，45cycles (在 每个延伸时采集荧光信号);再进行95°C 180sec，40°C 240sec，95°C Isec的融解曲线分析 程序(连续采集荧光信号)。确定该反应体系下能否扩增出这3种病毒的核酸。
[0024] 表3三重荧光PCR扩增DTMUV、EDSV和H9 AIV核酸的反应体系 ................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................... .........................................................................................................................................................................................................................................................................................................
1.6引物浓度的优化 将每种病毒特异性上下游引物（10 μ Μ)等体积混合后，按照0. 4 μ L、0. 8 μ L和I. 6 μ L 共3个加样体积，即4pmol、8pmol和16pmol这三种不同含量进行组合，确定最佳引物含量。 随后在引物含量最佳的条件下，对单个病毒核酸以及不同组合的核酸进行单一或者多重检 测，以验证引物的效果。
[0025] 1. 7特异性 将本实验室保存的鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒和大肠杆菌基因组DNA，以及 鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型、番鸭呼肠孤病毒和新城疫病毒RNA进行多重荧光PCR反 应，以验证所建立方法是否与这些病毒的核酸之间存在交叉反应。
[0026] 1. 8敏感性和重复性 提取1. 4中构建好的pDTMUV、pEDS和pH9质粒，经DNA浓度测定后，按照质粒拷贝数计 算公式。即，拷贝数（copies/gL)=6.02 X IO23 (copies/mol)X 质粒浓度（g/pL)/ (碱基 数）X660 (g/mol)。随后，将质粒分别用超纯水10倍倍比稀释，即从KT1 一直稀释到KT11 后，取KT6-KT11这6个梯度的质粒进行敏感性试验。随后，取KT5-KT ici这6个梯度的质粒 进行3个重复，确定方法的重复性。同时，利用单个引物进行常规PCR扩增，比较三重定量 PCR方法与常规PCR方法的敏感性差异。
[0027] 1. 9临床样品检测 将本研宄室保存的40份DTMUV泄殖腔拭子和2份EDSV、H9 AIV阳性病料的核酸，进行 三重荧光PCR验证。
[0028] 2 结果 2. I DTMUV、H9 AIV和 EDSV的扩增 经PCR扩增、1%琼脂糖凝胶电泳及DNA序列测定，证实所使用的引物能够特异性扩增各 自对应的病毒核酸(如图1所示)。
[0029] 2. 2三重荧光PCR方法的建立 经荧光PCR反应及融解曲线分析，可以发现该方法能够扩增EDSV、H9 AIV和DTMUV的 核酸，融解曲线分析显示所扩增产物的Tm值分别接近81°C、84°C和87°C (图2,图3,图4)。 经10份样品重复验证，并按照Tm平均值±3倍标准差来确定三种产物的Tm值范围，结果 显示 EDSV、H9 AIV和 DTMUV扩增产物 Tm值范围分别为：81. 2±0. 5,83. 8±0. 4,86. 9±0. 5。
[0030] 2. 3引物最佳浓度筛选 在4pmol、8pmol和16pmol这三种不同引物含量的排列组合下，最终确定DTMUV最佳引 物含量为4pmol，EDSV最佳引物含量为8pmol，H9 AIV最佳引物含量为16pmol。在此情况 下，可以检测出任意两种或者3种病毒核酸的混合样品（图5,图6,图7,图8)。经1%琼脂 糖凝胶电泳证实，所有融解曲线分析结果与电泳结果完全一致。
[0031] 2. 4三重荧光PCR方法的特异性 经三重荧光PCR验证，鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒和大肠杆菌基因组DNA，以 及鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型、番鸭呼肠孤病毒和新城疫病毒RNA不与EDSV、H9 AIV 和DTMUV特异性引物发生交叉反应，即不出现明显的S型扩增曲线（图9);同时融解曲线分 析显示，EDSV、H9 AIV和DTMUV分别在81°C、84°C和87°C左右出现明显的融解峰（图10)。 因此综合扩增曲线和融解曲线的结果确定，三重荧光PCR方法的特异性良好。
[0032] 2. 5三重荧光PCR方法的敏感性和重复性 经DNA浓度测定，pEDS质粒浓度为247ng/^L，pH9质粒浓度为156ng/^L，pDTMUV 质粒浓度为425ng/^L，经计算确定这三个质粒的拷贝数分别为8. O X KTcopies/^L、 4. SXlO'opies/^Ul· 3X10ncopies/^L。通过三重荧光PCR方法与常规PCR方法对上 述质粒KT5-KT ici稀释度后的核酸进行检测下限比较发现，本研宄所建立的三重荧光PCR 方法对EDSV核酸的检测下限为8.0个拷贝（图11)，对H9 AIV核酸的检测下限为4. 8个 拷贝（图12)，对DTMUV核酸的检测下限为1.3个拷贝（图13)，这比常规PCR方法敏感10 倍。取KT5-KTici这6个稀释度的质粒进行3重复PCR反应并建立标准曲线后，结果显示， 图 14 中 8. 0X105~8. 0 拷贝的 pEDS 质粒平均 Cq值分别为 15. 12±0. 11、18. 17±0. 14、 21. 42±0· 12、24· 63±0· 08、28· 15±0· 34 和 31. 64±0· 27。图 15 中 4. 8X 105~4· 8 拷贝 的 PH9 质粒平均 Cq 值（或称 Ct 值）分别为：15. 94±0. 24、19. 30±0. 21、22. 86±0. 20、 26. 62±0· 76、29· 95±0· 10 和 33. 84±0· 60 ;图 16 中 I. 3X 106~1· 3X101 拷贝的 pDTMUV 质 粒平均 Cq 值分别为：13· 35±0· 19、16· 65±0· 10、20· 13±0· 04、23· 55±0· 11、26· 90±0· 14 和30. 80±0. 41 ;通过线形回归证实，标准曲线的扩增效率分别为2. 08,1. 87和2. 03 ;R2分 别为0. 99,0. 98和1. 00 ;线形回归方程的斜率分别为-3. 14,-3. 68和-3. 26, Y轴的截距分 别为 37. 13, 36. 55 和 36. 87。
[0033] 2. 6临床样品检测 40份DTMUV泄殖腔拭子经过三重荧光PCR检测及融解曲线分析后发现，阳性样品数为 31份，阴性样品数为9份；常规PCR检测及电泳结果显示阳性样品数为26份，阴性样品数 为14份。2份EDSV、H9 AIV阳性病料的核酸与常规PCR符合率为100%。
[0034] 以上实验表明：本发明的检测引物及试剂盒可以同时检测EDSV、H9 AIV和DTMUV， 且不与鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒和大肠杆菌基因组DNA以及鸭甲肝病毒1型、 鸭甲肝病毒3型、番鸭呼肠孤病毒和新城疫病毒的RNA发生交叉反应；敏感性试验表明，该 方法对EDSV、H9 AIV和DTMUV核酸的检测下限分别为8. 0、4. 8和1. 3个拷贝，该方法比常 规PCR方法敏感10倍；该方法重复性良好，对不同批次的样品扩增效果良好。通过标准曲 线的建立以及临床样品的检测表明，该方法可以用于EDSV、H9 AIV和DTMUV的定性和定量 检测。
【主权项】
1. 一种鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和H9亚型禽流感病毒三重荧光定量PCR检 测引物组合物，所述的检测引物如下所示： 针对鸭坦布苏病毒的引物： DTMUV - U :5' -GCTTCAGCTGTCTGGGGATGCAGAAC-3'， DTMUV -L:5' -AGCATAAGTTGCCTTGGGATTATGAG-3' ； 针对产蛋下降综合征病毒的引物： EDS-U :5' -AGGTGTCTGATATTGGAGTG-3'， EDS-L :5' -TGGATGAAACGCTTTATAAG-3' ； 针对H9亚型禽流感病毒的引物： H9-U :3' -GCCATAGCTGGATTCATAGA-5'， H9-L -AACTCTGCATTRTATGCCCA-SiO2. -种鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和H9亚型禽流感病毒三重荧光定量PCR检 测试剂盒，其含有分别针对鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒、H9亚型禽流感病毒的检测 引物；所述针对鸭坦布苏病毒的检测引物是根据鸭坦布苏病毒的E基因序列设计的；所述 针对所述针对产蛋下降综合征病毒的检测引物是根据产蛋下降综合征病毒的五邻体基因 序列设计的；所述针对H9亚型禽流感病毒的检测引物是根据H9亚型禽流感病毒的HA基因 序列设计的。3. 根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测引物的核苷酸序列如下 所示： 针对鸭坦布苏病毒的引物： DTMUV - U :5' -GCTTCAGCTGTCTGGGGATGCAGAAC-3'， DTMUV -L:5' -AGCATAAGTTGCCTTGGGATTATGAG-3' ； 针对产蛋下降综合征病毒的引物： EDS-U :5' -AGGTGTCTGATATTGGAGTG-3'， EDS-L :5' -TGGATGAAACGCTTTATAAG-3' ； 针对H9亚型禽流感病毒的引物： H9-U :3' -GCCATAGCTGGATTCATAGA-5'， H9-L -AACTCTGCATTRTATGCCCA-SiO4. 根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有一步法SYBR RT-PCR缓冲液及DNA聚合酶。5. -种鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和H9亚型禽流感病毒三重荧光定量PCR检 测方法，包括如下步骤： (1) 分别设计针对鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒、H9亚型禽流感病毒的检测引 物； (2) 配置实时荧光PCR反应体系，三种病毒检测引物的终浓度均为20pmol，每种DNA模 板量为1 μ L，进行PCR反应； (3) 在每个延伸时连续采集荧光信号，根据熔解曲线来判断样品中是否含有鸭坦布苏 病毒、产蛋下降综合征病毒或Η9亚型禽流感病毒。6. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述针对鸭坦布苏病毒、产蛋下降综 合征病毒、H9亚型禽流感病毒的检测引物如下所示： 针对鸭坦布苏病毒的引物： DTMUV - U :5' -GCTTCAGCTGTCTGGGGATGCAGAAC-3'， DTMUV -L:5' -AGCATAAGTTGCCTTGGGATTATGAG-3' ； 针对产蛋下降综合征病毒的引物： EDS-U :5' -AGGTGTCTGATATTGGAGTG-3'， EDS-L :5' -TGGATGAAACGCTTTATAAG-3' ； 针对H9亚型禽流感病毒的引物： H9-U :3' -GCCATAGCTGGATTCATAGA-5'， H9-L -AACTCTGCATTRTATGCCCA-SiO7. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述实时荧光PCR反应体系的组成 为：8. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，实时荧光PCR反应程序为：42°C 5min;95°C 10sec;95°C 586(3,55。〇1〇86(3,72。〇 10sec，45cycles，在每个延伸时米集焚光 信号；再进行95°C 180sec，40°C 240sec，95°C Isec的融解曲线分析程序，连续采集荧光 信号。
【专利摘要】本发明公开了一种鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和H9亚型禽流感病毒的三重荧光定量PCR检测引物、试剂盒及方法。所述针对鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒、H9亚型禽流感病毒的检测引物分别如SEQ ID NO.1-6所示。本发明的检测引物及试剂盒可以同时检测EDSV、H9 AIV和DTMUV，且不与鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒和大肠杆菌基因组DNA以及鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型、番鸭呼肠孤病毒和新城疫病毒的RNA发生交叉反应，对EDSV、H9 AIV和DTMUV核酸的检测下限分别为8.0、4.8和1.3个拷贝，可以用于EDSV、H9 AIV和DTMUV的定性和定量检测。
【IPC分类】C12R1/93, C12Q1/68, C12N15/11, C12Q1/70
【公开号】CN104894292
【申请号】CN201510124338
【发明人】孙敏华, 董嘉文, 李林林, 袁建丰, 邝瑞欢, 张建峰, 刘志成, 张春红
【申请人】广东省农业科学院动物卫生研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年3月19日
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