一种2型猪圆环病毒等温pcr现场快速检测试剂盒的制作方法
一种2型猪圆环病毒等温pcr现场快速检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，涉及一种2型猪圆环病毒等温PCR现场快速检测 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒（porcine circovirus, PCV)是一种环状、无囊膜的单股DNA病毒， 它包括猪1型圆环病毒（PCV-I)和猪2型圆环病毒（PCV-2)两个基因型。猪群普遍存 在PCV-1，但PCV-I不具有致病性，而PCV-2的感染能够导致断奶仔猪多系统衰竭综合征 (Postweaning Multisystemic wasting syndrome, PMWS)、怀孕母猪繁殖障碍、猪皮炎肾 病综合征（Porcine dermatitis and nephropathy syndrome, F1DNS)、猪呼吸道病综合征 (Porcine respiratory disease complex, PRDC)和仔猪的 A2 型先天性震颤（Congenital tremors, CT)等多种疾病。
[0003] 断奶仔猪多系统呼吸衰竭综合征（PMWS)主要影响6-8周龄的猪群，多发于保育 后期和转肥育舍的前期阶段，主要症状为生长发育不良，皮肤与可视性黏膜苍白或黄疸、贫 血，呼吸困难、皮肤苍白、消瘦、腹泻、体表淋巴结，特别是腹股沟淋巴结肿大，偶有咳嗽和中 枢神经系统紊乱等症状，死亡率约为8%~35%。此外，PMWS常与繁殖与呼吸障碍综合征 病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌等病原发生混 合感染，而使PMWS的症状更加复杂化；猪皮炎肾病综合征（PDNS)是一种免疫介导的血管疾 病，其主要病变在皮肤和肾脏。该病通常发生于8~18周龄的猪群发病率为0. 15%~2%， 有时达到7%。临床症状主要为会阴部、四肢、胸腹部及耳朵等处皮肤发生圆形或不规则的 隆起，呈红色或紫色，中央为黑色的斑块，这些斑块有时会相互融合成条带状，在极少情况 下皮肤病变会消失。病猪表现厌食、消瘦、苍白、跛行、结膜炎、腹泻，皮下水肿，有时体温上 升。患病猪剖检可见肾脏苍白，肿大，表面有瘀斑，病理组织学变化为出血性坏死性皮炎、动 脉炎及渗出性肾小球性肾炎和间质性肾炎；母猪繁殖障碍（Reproductive failure)，PCV-2 感染猪群会出现繁殖障碍的症状，导致妊娠母猪发生流产、死胎、木乃伊胎及断奶前仔猪死 亡率高；猪呼吸道综合症（PRDC)主要影响11~22周龄的育肥猪和育成猪，主要临床症状 为生长缓慢、精神沉郁、饲料效率低下、厌食、发热、咳嗽、腹泻及呼吸困难等症状。但一般 PCV-2单纯感染不会出现PRDS的临床症状，而是与猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪流感、 猪肺炎支原体、传染性胸膜肺炎放线杆菌等其他病原混合感染是才导致PRDC ;猪增生性和 坏死性肺炎（PNP)主要影响6~14周龄的猪只，死亡率达4%~10%，表现为增生性和坏 死性肺炎。PNP能形成特征性的肺脏损伤，其确诊主要根据组织病理学变化（如坏死性和溃 疡性细支气管炎、纤维闭塞性细支气管炎，肺泡壁形成肉芽肿性炎症等）。
[0004] 目前，国内采用的PCV-2检测技术主要有：病毒分离培养、间接免疫荧光、免疫酶 单层试验、原位杂交、酶联免疫试验等，这些方法均存在操作复杂、实验条件要求高、特异性 不强、耗时长、不适合大规模检测等不足。因此，研制开发用于普通实验的快速、简便的PCV2 检测方法，实现PCV2的快速诊断，对疫病的预防和控制有着重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种猪2型圆环病毒（PCV-2) 等温PCR现场快速检测试剂盒，本发明利用Bst DNA酶的链置换特性，设计4条引物，识别 靶序列的6个区域，在等温条件下生成大量重复的茎环状结构，在定性检测时不需任何特 殊设备，只需眼观反应管道颜色变化即可判定，因此具有特异性、敏感性高和检测时间比普 通PCR短、适用于猪场现场的快速检测等特点。
[0006] 本发明具体通过以下技术方案实现：
[0007] 一种2型猪圆环病毒等温PCR现场快速检测试剂盒，包括引物组合物、10倍等温扩 增反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和显色剂，所述的引物组合物由外引物和内引物 组成，所述的外引物序列为SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2,所述的内引物为SEQ ID NO. 3和 SEQ ID NO. 4。
[0008] 本发明所述的外引物与内引物的摩尔数之比为1:6~9 ;
[0009] 所述的10倍等温扩增反应液由200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、lOOmmol/L 氯化钾、100mm〇l/L硫酸按、40~100mmol/L硫酸镁、4~10mol/L甜菜碱、5~18mmol/L的 dNTPs和质量百分浓度0· 1%的Triton X-100组成。
[0010] 所述的dNTPs为含有四种dNTP的等量混合物。
[0011] 所述的DNA聚合酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，活力为8个活性单位/ 微升；
[0012] 所述的阳性对照为含有插入猪2型圆环病毒0RF2共有片断基因一段特异序列的 阳性质粒，等温扩增反应扩增区位于该特异序列中，其浓度为IO 7拷贝/ y L，其制作方法为： 采用PCR扩增一段猪2型圆环病毒0RF2共有片断基因特异序列，然后装入PMD18-T载体， 转化至DH5 α感受态细菌，抽取质粒DNA经序列确定后，采用紫外分光光度计测定质粒DNA 的浓度并用灭菌双蒸水调整拷贝数至IO7拷贝/ μ L。
[0013] 所述的阴性对照为灭菌双蒸水；
[0014] 所述的显色剂为20倍SYBR Green L·
[0015] 本发明还要求保护上述引物组合物，并提供了该引物组合物在2型猪圆环病毒检 测中的应用。
[0016] 本发明的有益效果为：1)检测快捷，常规PCR检测技术相比本技术速度慢，从采样 到出结果最少需要48h，本技术仅需30-90分钟；2)使用方便，常规PCR需要PCR仪、电泳系 统、凝胶成像系统等大型、昂贵的仪器设备，本技术仅需要一个恒温箱或保温杯即可；3)本 发明的结果判断不需经电泳，比PCR简单，极易推广。对于定量检测，虽然借助了荧光定量 PCR仪，但不需合成荧光探针，只需借助荧光染料SYBR Green I，成本大大减低；4)本发明 的反应温度在60°C~65°C左右，且识别靶基因6个特定区域，引物多聚体及非特异性扩增 几率大大降低，定量准确性大大提高。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0018] 猪2型圆环病毒等温PCR现场快速检测试剂盒，由一套引物组合物、10倍等温扩增 反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和显色剂组成。弓丨物组合物是外引物与内引物的 摩尔数之比为1:6~9组成，其序列为：
[0019] 外引物 I :TGTCACCCTGGGTGATCG ;
[0020] 外引物 2 :GCATCTTCAACACCCGCC ;
[0021] 内引物 I :CTCAAACCCCCGCTCTGTGCCAGGGCCAGAATT CAACCT ;
[0022] 内引物 2 :AATCTCATCATGTCCACCGCCC-CTCCCGCACCTT CGGATA。
[0023] 10倍等温扩增反应液（通常用"10XLAMP反应液"的形式来表示，数字"10"表 示的是使用时稀释的倍数）是由200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、lOOmmol/L氯化钾、 100mmol/L 硫酸按、40 ~100mmol/L 硫酸儀、4 ~10mol/L 甜菜喊、5 ~18mmo1 /T,的 dNTP s 和质量百分浓度〇. 1%的Triton X-100组成，dNTPs为含有四种dN TP的等量混合物。
[0024] DNA聚合酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，活力为8个活性单位/微升；阳 性对照为含有插入猪2型圆环病毒0RF2共有片断基因一段特异序列的阳性质粒，等温扩 增反应扩增区位于该特异序列中，其浓度为IO 7拷贝/y L。阳性质粒的制作方法为：采用 PCR扩增一段猪2型圆环病毒0RF2共有片断基因特异序列，然后装入PM D18-T载体，转化 至DH5 α感受态细菌，抽取质粒DNA经序列确定后，采用紫外分光光度计测定质粒DNA的浓 度并用灭菌双蒸水调整拷贝数至IO7拷贝/ μ L ;阴性对照为灭菌双蒸水；显色剂为20倍SY BR Green I，。SYBR Green I为高灵敏度的DNA荧光染料。SYBR Green I与双链DNA的亲 和力非常高，对分子生物学中常用的酶没有抑制作用。
[0025] 该试剂盒的原理为：等温扩增反应过程是先由外引物扩增出内引物扩增所需要的 模板即起始反应物模板的合成；紧接着由内引物引导合成靶基因 DNA片段，由于内引物扩 增的DNA片段含有该引物5,端DNA片段的反向互补序列，因而这些反向互补序列之间通过 杂交形成茎环结构，另外一条内引物与其互补链退火杂交后引导链置换合成反应，在扩增 的DNA片段的另外一端产生了新的茎环结构，形成哑铃状结构，在一小时内该循环反应可 使靶DNA累积到IO 9拷贝，电泳后可见扩增终产物由大小不等的DNA片段组成，呈梯状条带， 也可通过荧光染料来观察扩增结果。LAMP的整个反应分三步完成，即起初反应物模板的合 成、循环扩增阶段、延伸和再循环。
[0026] 实施例1
[0027] 1)样品的采集与处理：
[0028] 活体猪采集的样品为鼻腔分泌物、尿液、粪便、鼻黏膜之一，鼻腔黏膜和鼻腔分泌 物为最佳活体材料；病死猪采集的样品为支气管、肺脏、扁桃体、肾脏、脾脏之一，以肺脏、扁 桃体、支气管淋巴结最佳。分泌物等液体材料采集100 μ L，组织材料100mg，组织材料适当 剪碎或研磨效果更佳。
[0029] 2)采集的样品不需进一步处理，直接加入反应管；
[0030] 3)将样品反应管、阳性对照管、阴性对照管轻微震荡；
[0031] 4)将样品、阳性及阴性对照管同时放入65°C水浴锅或恒温培养箱60min ;
[0032] 5)结果判定：阴性管仍保持无色、阳性管变为淡蓝色时为检测标准符合要求；样 品反应管无色表明样品阴性，即无圆环病毒2型感染；样品反应管淡蓝色表明样品阳性，即 该猪存在圆环病毒2型感染；
[0033] 实施例2
[0034] 商南县瑞生实业有限责任公司猪存栏4000头，适繁母猪200头，2013年7月、9月 分别采集250份（其中母猪50份）、180份（其中母猪50份）鼻腔分泌物进行检测，本试 剂盒检测育成猪阳性率1. 57%，母猪阳性率0. 0%。常规PCR检测育成猪阳性率1. 36%，母 猪阳性率〇. 〇%。结果表明本试剂盒检测方法简便、耗时短、敏感性高于常规PCR。
[0035] 实施例3
[0036] 星光良种猪繁养殖有限公司猪存栏80000头，适繁母猪600头，2014年3月场内出 现流产、木乃伊胎、僵猪及部分猪瘟免疫抗体水平不稳定等，随即采集母猪鼻腔分泌物230 份、僵猪和木乃伊胎26份进行检测，本试剂盒结果显示母猪阳性率23%，僵猪和木乃伊胎 阳性率78%。常规PCR检测显示母猪阳性率21.8%，僵猪和木乃伊胎阳性率77.6%。随 后该公司使用某公司圆环病毒灭活疫苗，2014年7月场内流产和僵猪显著减少，再次采集 母猪鼻腔分泌物180份、育成猪220份用本试剂盒检测，母猪阳性率6. 08%，育成猪阳性率 8. 73%〇
[0037]
[0038]
【主权项】
1. 一种2型猪圆环病毒等温PCR现场快速检测试剂盒，其特征在于：包括引物组合物、 10倍等温扩增反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和显色剂，所述的引物组合物由外 引物和内引物组成，所述的外引物序列为SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2,所述的内引物为SEQ IDNO. 3 和SEQIDNO. 4。2. 根据权利要求1所述的一种2型猪圆环病毒等温PCR现场快速检测试剂盒，其特征 在于：所述的外引物与内引物的摩尔数之比为1:6~9。3. 根据权利要求1所述的一种2型猪圆环病毒等温PCR现场快速检测试剂盒，其特征 在于：所述的10倍等温扩增反应液由200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、lOOmmol/L氯 化钟、100mm〇l/L硫酸按、40~100mmol/L硫酸儀、4~10mol/L甜菜喊、5~18mmo1 /T,的 dNTPs和质量百分浓度0? 1%的TritonX-100组成。4. 根据权利要求3所述的一种2型猪圆环病毒等温PCR现场快速检测试剂盒，其特征 在于：所述的dNTPs为含有四种dNTP的等量混合物。5. 根据权利要求1所述的一种2型猪圆环病毒等温PCR现场快速检测试剂盒，其特征 在于：所述的DNA聚合酶为具有链置换作用的BstDNA聚合酶，活力为8个活性单位/微 升。6. 根据权利要求1所述的一种2型猪圆环病毒等温PCR现场快速检测试剂盒，其特征 在于：所述的阳性对照为含有插入猪2型圆环病毒0RF2共有片断基因一段特异序列的阳性 质粒，其制作方法为：采用PCR扩增一段猪2型圆环病毒0RF2共有片断基因特异序列，然后 装入PMD18-T载体，转化至DH5a感受态细菌，抽取质粒DNA经序列确定后，采用紫外分光 光度计测定质粒DNA的浓度并用灭菌双蒸水调整拷贝数至IO7拷贝/yL。7. 权利要求1所述的引物组合物，其特征在于：所述的引物组合物由外引物和内引物 组成，所述的外引物序列为SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2,所述的内引物为SEQIDNO. 3和 SEQIDNO. 4。8. 权利要求7所述的引物组合物在2型猪圆环病毒检测中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种2型猪圆环病毒等温PCR现场快速检测试剂盒，由一套引物、10倍等温扩增反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和显色剂组成；所述的一套引物是由外引物和内引物组成。采用本发明可以定性定量检测猪2型圆环病毒。本发明利用Bst DNA酶的链置换特性，设计4条引物，识别靶序列的6个区域，在等温条件下生成大量重复的茎环状结构，在定性检测时不需任何特殊设备，只需眼观反应管道颜色变化即可判定，因此具有特异性、敏感性高和检测时间比普通PCR短、适用于猪场场现场的快速检测等特点。
【IPC分类】C12R1/93, C12Q1/70, C12Q1/68
【公开号】CN104894293
【申请号】CN201510219751
【发明人】敬晓棋, 黄光东, 张琼, 陈生, 黄广争, 黄广磊
【申请人】陕西溯源农业发展有限公司, 黄光东
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月30日
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，涉及一种2型猪圆环病毒等温PCR现场快速检测 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒（porcine circovirus, PCV)是一种环状、无囊膜的单股DNA病毒， 它包括猪1型圆环病毒（PCV-I)和猪2型圆环病毒（PCV-2)两个基因型。猪群普遍存 在PCV-1，但PCV-I不具有致病性，而PCV-2的感染能够导致断奶仔猪多系统衰竭综合征 (Postweaning Multisystemic wasting syndrome, PMWS)、怀孕母猪繁殖障碍、猪皮炎肾 病综合征（Porcine dermatitis and nephropathy syndrome, F1DNS)、猪呼吸道病综合征 (Porcine respiratory disease complex, PRDC)和仔猪的 A2 型先天性震颤（Congenital tremors, CT)等多种疾病。
[0003] 断奶仔猪多系统呼吸衰竭综合征（PMWS)主要影响6-8周龄的猪群，多发于保育 后期和转肥育舍的前期阶段，主要症状为生长发育不良，皮肤与可视性黏膜苍白或黄疸、贫 血，呼吸困难、皮肤苍白、消瘦、腹泻、体表淋巴结，特别是腹股沟淋巴结肿大，偶有咳嗽和中 枢神经系统紊乱等症状，死亡率约为8%~35%。此外，PMWS常与繁殖与呼吸障碍综合征 病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌等病原发生混 合感染，而使PMWS的症状更加复杂化；猪皮炎肾病综合征（PDNS)是一种免疫介导的血管疾 病，其主要病变在皮肤和肾脏。该病通常发生于8~18周龄的猪群发病率为0. 15%~2%， 有时达到7%。临床症状主要为会阴部、四肢、胸腹部及耳朵等处皮肤发生圆形或不规则的 隆起，呈红色或紫色，中央为黑色的斑块，这些斑块有时会相互融合成条带状，在极少情况 下皮肤病变会消失。病猪表现厌食、消瘦、苍白、跛行、结膜炎、腹泻，皮下水肿，有时体温上 升。患病猪剖检可见肾脏苍白，肿大，表面有瘀斑，病理组织学变化为出血性坏死性皮炎、动 脉炎及渗出性肾小球性肾炎和间质性肾炎；母猪繁殖障碍（Reproductive failure)，PCV-2 感染猪群会出现繁殖障碍的症状，导致妊娠母猪发生流产、死胎、木乃伊胎及断奶前仔猪死 亡率高；猪呼吸道综合症（PRDC)主要影响11~22周龄的育肥猪和育成猪，主要临床症状 为生长缓慢、精神沉郁、饲料效率低下、厌食、发热、咳嗽、腹泻及呼吸困难等症状。但一般 PCV-2单纯感染不会出现PRDS的临床症状，而是与猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪流感、 猪肺炎支原体、传染性胸膜肺炎放线杆菌等其他病原混合感染是才导致PRDC ;猪增生性和 坏死性肺炎（PNP)主要影响6~14周龄的猪只，死亡率达4%~10%，表现为增生性和坏 死性肺炎。PNP能形成特征性的肺脏损伤，其确诊主要根据组织病理学变化（如坏死性和溃 疡性细支气管炎、纤维闭塞性细支气管炎，肺泡壁形成肉芽肿性炎症等）。
[0004] 目前，国内采用的PCV-2检测技术主要有：病毒分离培养、间接免疫荧光、免疫酶 单层试验、原位杂交、酶联免疫试验等，这些方法均存在操作复杂、实验条件要求高、特异性 不强、耗时长、不适合大规模检测等不足。因此，研制开发用于普通实验的快速、简便的PCV2 检测方法，实现PCV2的快速诊断，对疫病的预防和控制有着重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种猪2型圆环病毒（PCV-2) 等温PCR现场快速检测试剂盒，本发明利用Bst DNA酶的链置换特性，设计4条引物，识别 靶序列的6个区域，在等温条件下生成大量重复的茎环状结构，在定性检测时不需任何特 殊设备，只需眼观反应管道颜色变化即可判定，因此具有特异性、敏感性高和检测时间比普 通PCR短、适用于猪场现场的快速检测等特点。
[0006] 本发明具体通过以下技术方案实现：
[0007] 一种2型猪圆环病毒等温PCR现场快速检测试剂盒，包括引物组合物、10倍等温扩 增反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和显色剂，所述的引物组合物由外引物和内引物 组成，所述的外引物序列为SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2,所述的内引物为SEQ ID NO. 3和 SEQ ID NO. 4。
[0008] 本发明所述的外引物与内引物的摩尔数之比为1:6~9 ;
[0009] 所述的10倍等温扩增反应液由200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、lOOmmol/L 氯化钾、100mm〇l/L硫酸按、40~100mmol/L硫酸镁、4~10mol/L甜菜碱、5~18mmol/L的 dNTPs和质量百分浓度0· 1%的Triton X-100组成。
[0010] 所述的dNTPs为含有四种dNTP的等量混合物。
[0011] 所述的DNA聚合酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，活力为8个活性单位/ 微升；
[0012] 所述的阳性对照为含有插入猪2型圆环病毒0RF2共有片断基因一段特异序列的 阳性质粒，等温扩增反应扩增区位于该特异序列中，其浓度为IO 7拷贝/ y L，其制作方法为： 采用PCR扩增一段猪2型圆环病毒0RF2共有片断基因特异序列，然后装入PMD18-T载体， 转化至DH5 α感受态细菌，抽取质粒DNA经序列确定后，采用紫外分光光度计测定质粒DNA 的浓度并用灭菌双蒸水调整拷贝数至IO7拷贝/ μ L。
[0013] 所述的阴性对照为灭菌双蒸水；
[0014] 所述的显色剂为20倍SYBR Green L·
[0015] 本发明还要求保护上述引物组合物，并提供了该引物组合物在2型猪圆环病毒检 测中的应用。
[0016] 本发明的有益效果为：1)检测快捷，常规PCR检测技术相比本技术速度慢，从采样 到出结果最少需要48h，本技术仅需30-90分钟；2)使用方便，常规PCR需要PCR仪、电泳系 统、凝胶成像系统等大型、昂贵的仪器设备，本技术仅需要一个恒温箱或保温杯即可；3)本 发明的结果判断不需经电泳，比PCR简单，极易推广。对于定量检测，虽然借助了荧光定量 PCR仪，但不需合成荧光探针，只需借助荧光染料SYBR Green I，成本大大减低；4)本发明 的反应温度在60°C~65°C左右，且识别靶基因6个特定区域，引物多聚体及非特异性扩增 几率大大降低，定量准确性大大提高。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0018] 猪2型圆环病毒等温PCR现场快速检测试剂盒，由一套引物组合物、10倍等温扩增 反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和显色剂组成。弓丨物组合物是外引物与内引物的 摩尔数之比为1:6~9组成，其序列为：
[0019] 外引物 I :TGTCACCCTGGGTGATCG ;
[0020] 外引物 2 :GCATCTTCAACACCCGCC ;
[0021] 内引物 I :CTCAAACCCCCGCTCTGTGCCAGGGCCAGAATT CAACCT ;
[0022] 内引物 2 :AATCTCATCATGTCCACCGCCC-CTCCCGCACCTT CGGATA。
[0023] 10倍等温扩增反应液（通常用"10XLAMP反应液"的形式来表示，数字"10"表 示的是使用时稀释的倍数）是由200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、lOOmmol/L氯化钾、 100mmol/L 硫酸按、40 ~100mmol/L 硫酸儀、4 ~10mol/L 甜菜喊、5 ~18mmo1 /T,的 dNTP s 和质量百分浓度〇. 1%的Triton X-100组成，dNTPs为含有四种dN TP的等量混合物。
[0024] DNA聚合酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，活力为8个活性单位/微升；阳 性对照为含有插入猪2型圆环病毒0RF2共有片断基因一段特异序列的阳性质粒，等温扩 增反应扩增区位于该特异序列中，其浓度为IO 7拷贝/y L。阳性质粒的制作方法为：采用 PCR扩增一段猪2型圆环病毒0RF2共有片断基因特异序列，然后装入PM D18-T载体，转化 至DH5 α感受态细菌，抽取质粒DNA经序列确定后，采用紫外分光光度计测定质粒DNA的浓 度并用灭菌双蒸水调整拷贝数至IO7拷贝/ μ L ;阴性对照为灭菌双蒸水；显色剂为20倍SY BR Green I，。SYBR Green I为高灵敏度的DNA荧光染料。SYBR Green I与双链DNA的亲 和力非常高，对分子生物学中常用的酶没有抑制作用。
[0025] 该试剂盒的原理为：等温扩增反应过程是先由外引物扩增出内引物扩增所需要的 模板即起始反应物模板的合成；紧接着由内引物引导合成靶基因 DNA片段，由于内引物扩 增的DNA片段含有该引物5,端DNA片段的反向互补序列，因而这些反向互补序列之间通过 杂交形成茎环结构，另外一条内引物与其互补链退火杂交后引导链置换合成反应，在扩增 的DNA片段的另外一端产生了新的茎环结构，形成哑铃状结构，在一小时内该循环反应可 使靶DNA累积到IO 9拷贝，电泳后可见扩增终产物由大小不等的DNA片段组成，呈梯状条带， 也可通过荧光染料来观察扩增结果。LAMP的整个反应分三步完成，即起初反应物模板的合 成、循环扩增阶段、延伸和再循环。
[0026] 实施例1
[0027] 1)样品的采集与处理：
[0028] 活体猪采集的样品为鼻腔分泌物、尿液、粪便、鼻黏膜之一，鼻腔黏膜和鼻腔分泌 物为最佳活体材料；病死猪采集的样品为支气管、肺脏、扁桃体、肾脏、脾脏之一，以肺脏、扁 桃体、支气管淋巴结最佳。分泌物等液体材料采集100 μ L，组织材料100mg，组织材料适当 剪碎或研磨效果更佳。
[0029] 2)采集的样品不需进一步处理，直接加入反应管；
[0030] 3)将样品反应管、阳性对照管、阴性对照管轻微震荡；
[0031] 4)将样品、阳性及阴性对照管同时放入65°C水浴锅或恒温培养箱60min ;
[0032] 5)结果判定：阴性管仍保持无色、阳性管变为淡蓝色时为检测标准符合要求；样 品反应管无色表明样品阴性，即无圆环病毒2型感染；样品反应管淡蓝色表明样品阳性，即 该猪存在圆环病毒2型感染；
[0033] 实施例2
[0034] 商南县瑞生实业有限责任公司猪存栏4000头，适繁母猪200头，2013年7月、9月 分别采集250份（其中母猪50份）、180份（其中母猪50份）鼻腔分泌物进行检测，本试 剂盒检测育成猪阳性率1. 57%，母猪阳性率0. 0%。常规PCR检测育成猪阳性率1. 36%，母 猪阳性率〇. 〇%。结果表明本试剂盒检测方法简便、耗时短、敏感性高于常规PCR。
[0035] 实施例3
[0036] 星光良种猪繁养殖有限公司猪存栏80000头，适繁母猪600头，2014年3月场内出 现流产、木乃伊胎、僵猪及部分猪瘟免疫抗体水平不稳定等，随即采集母猪鼻腔分泌物230 份、僵猪和木乃伊胎26份进行检测，本试剂盒结果显示母猪阳性率23%，僵猪和木乃伊胎 阳性率78%。常规PCR检测显示母猪阳性率21.8%，僵猪和木乃伊胎阳性率77.6%。随 后该公司使用某公司圆环病毒灭活疫苗，2014年7月场内流产和僵猪显著减少，再次采集 母猪鼻腔分泌物180份、育成猪220份用本试剂盒检测，母猪阳性率6. 08%，育成猪阳性率 8. 73%〇
[0037]
[0038]
【主权项】
1. 一种2型猪圆环病毒等温PCR现场快速检测试剂盒，其特征在于：包括引物组合物、 10倍等温扩增反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和显色剂，所述的引物组合物由外 引物和内引物组成，所述的外引物序列为SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2,所述的内引物为SEQ IDNO. 3 和SEQIDNO. 4。2. 根据权利要求1所述的一种2型猪圆环病毒等温PCR现场快速检测试剂盒，其特征 在于：所述的外引物与内引物的摩尔数之比为1:6~9。3. 根据权利要求1所述的一种2型猪圆环病毒等温PCR现场快速检测试剂盒，其特征 在于：所述的10倍等温扩增反应液由200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、lOOmmol/L氯 化钟、100mm〇l/L硫酸按、40~100mmol/L硫酸儀、4~10mol/L甜菜喊、5~18mmo1 /T,的 dNTPs和质量百分浓度0? 1%的TritonX-100组成。4. 根据权利要求3所述的一种2型猪圆环病毒等温PCR现场快速检测试剂盒，其特征 在于：所述的dNTPs为含有四种dNTP的等量混合物。5. 根据权利要求1所述的一种2型猪圆环病毒等温PCR现场快速检测试剂盒，其特征 在于：所述的DNA聚合酶为具有链置换作用的BstDNA聚合酶，活力为8个活性单位/微 升。6. 根据权利要求1所述的一种2型猪圆环病毒等温PCR现场快速检测试剂盒，其特征 在于：所述的阳性对照为含有插入猪2型圆环病毒0RF2共有片断基因一段特异序列的阳性 质粒，其制作方法为：采用PCR扩增一段猪2型圆环病毒0RF2共有片断基因特异序列，然后 装入PMD18-T载体，转化至DH5a感受态细菌，抽取质粒DNA经序列确定后，采用紫外分光 光度计测定质粒DNA的浓度并用灭菌双蒸水调整拷贝数至IO7拷贝/yL。7. 权利要求1所述的引物组合物，其特征在于：所述的引物组合物由外引物和内引物 组成，所述的外引物序列为SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2,所述的内引物为SEQIDNO. 3和 SEQIDNO. 4。8. 权利要求7所述的引物组合物在2型猪圆环病毒检测中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种2型猪圆环病毒等温PCR现场快速检测试剂盒，由一套引物、10倍等温扩增反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和显色剂组成；所述的一套引物是由外引物和内引物组成。采用本发明可以定性定量检测猪2型圆环病毒。本发明利用Bst DNA酶的链置换特性，设计4条引物，识别靶序列的6个区域，在等温条件下生成大量重复的茎环状结构，在定性检测时不需任何特殊设备，只需眼观反应管道颜色变化即可判定，因此具有特异性、敏感性高和检测时间比普通PCR短、适用于猪场场现场的快速检测等特点。
【IPC分类】C12R1/93, C12Q1/70, C12Q1/68
【公开号】CN104894293
【申请号】CN201510219751
【发明人】敬晓棋, 黄光东, 张琼, 陈生, 黄广争, 黄广磊
【申请人】陕西溯源农业发展有限公司, 黄光东
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月30日
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