猪伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒2型的可视化基因芯片以及试剂盒的制作方法
猪伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒2型的可视化基因芯片以及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测猪伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒2型的可视化基因芯片以及 检测方法。
【背景技术】
[0002] 随着我国养猪业向集约化和规模化方向发展，规模化猪场疫病多发、多种病原混 合感染较普遍存在，给养猪业造成了一定损失。其中猪伪狂犬病毒（PRV)、猪圆环病毒2型 (PCV2)是引起猪繁殖障碍的两种重要疫病病原。这两种病临诊症状相似，需要进行鉴别诊 断。
[0003] 目前，对这两种疾病的诊断多采用分离鉴定及常规的血清学方法，所需时间较长， 也有PCR技术的鉴别方法，但还没有建立操作性强且能同时鉴别两种病毒的方法。因此，有 必要建立能同时进行两种疫病快速检测的方法。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述问题，本发明提供了一种特异性强、灵敏度高、可同时检测猪伪狂犬 病毒和/或猪圆环病毒2型的可视化基因芯片和试剂盒。
[0005] 基因芯片，是指指通过不同方法将生物分子（寡核苷酸、cDNA、genomic DNA、多肽、 抗体、抗原等）固着于硅片、玻璃片（珠）、塑料片（珠）、凝胶、尼龙膜等固相递质上形成的 生物分子点阵，其突出的特点是微型化、集成化、平行化和高通量。
[0006] 本发明检测猪伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒2型的基因芯片，它包括固相载体以 及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQ ID NO :1和/或3所示基因片段，用于分别 检测伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒2型。
[0007] 优选地，它还包括SEQ ID NO :2所示所示探针，用于检测伪狂犬病毒野毒株。
[0008] 其中，它还包括质控探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO :4和/或SEQ ID NO :5所 不O
[0009] 本发明检测猪伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒2型的试剂盒，它包括前述的基因芯 片以及扩增试剂；其中，扩增试剂包括SEQ ID NO :6~7、SEQ ID NO :10~11所示引物对， 用于扩增伪狂犬病毒野毒株的基因。
[0010] 优选地，它还包括SEQ ID NO :8~9所示引物对，用于扩增伪狂犬病毒野毒株的基 因。
[0011] 优选地，所述SEQ ID NO :6、8、10所示上游引物标记有生物素。
[0012] 本发明还提供了 SEQ ID NO :1、3所示基因片段在制备检测猪伪狂犬病毒和/或猪 圆环病毒2型的基因芯片的用途。
[0013] 优选地，所述基因芯片还包括SEQ ID NO :2所示所示探针，用于检测伪狂犬病毒野 毒株。
[0014] 本发明还提供了 SEQ ID NO :6~7、SEQ ID NO :10~11所示引物对以及SEQ ID NO :1、3所示基因片段在制备检测猪伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒2型中的用途；其中，两 对引物对为扩增试剂，SEQ ID NO :1或3所示基因片段为检测探针。
[0015] 优选地，所述基因芯片还包括SEQ ID NO :2所示所示探针以及SEQ ID NO :8~9 所示引物对，用于检测和扩增伪狂犬病毒野毒株的基因。
[0016] 本发明基因芯片和试剂盒可以有效检测猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型，还能区 分猪伪狂犬病毒的疫苗株与野毒株感染，具有特异性好、灵敏性高和保存期长等特点，耗时 短，检测快速，检测结果的观察直观，无需昂贵的设备，可以迅速掌握畜禽疫病的感染情况， 临床应用前景良好。
[0017] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要 求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0018] 图1 :阵列排布示意图
[0019] 图2:点阵设置图示
[0020] 图3 :样品设置图示
[0021] 图4 :芯片预杂交的组装图示
[0022] 图5 :芯片特异性检测结果A:PRV检测结果；B:PPV检测结果；C:PCV2检测结果； D:PRV+PPV检测结果；E:PRV+PPV检测结果；F:PRV+PCV2检测结果
[0023] 图6 :gB探针基因不同稀释度芯片灵敏性检测结果
[0024] 图7 :gE探针基因芯片灵敏性检测结果
[0025] 图8 :0RF2探针基因芯片灵敏性检测结果
[0026] 图9 :稳定性检测结果
【具体实施方式】
[0027] 实施例1本发明检测方法
[0028] 一、探针基因的设计以及包含探针的质粒菌的构建
[0029] 1 材料
[0030] I. 1 种毒
[0031] PRV Fa株，由卫生部成都生物制品研宄所惠赠；
[0032] PCV2由本实验室赵春容从四川资阳病料中分离；
[0033] 猪细小病毒灭活疫苗购自北京中海科技动物保健科技公司。
[0034] 1. 2探针基因重组质粒菌
[0035] T/GAPDH由英骏生物公司合成。
[0036] L 3主要实验仪器
[0037] 电子天平：Sartorius BP 310S ;
[0038] 超纯水仪：Milli Qplus，法国产；
[0039] 超净工作台：SW-CJ-2FD，苏州安泰空气技术有限公司；
[0040] 恒温摇床：真空机：SinBo,香港；
[0041] 恒温水浴锅；Thermo Savant冷冻干燥仪；
[0042] 核酸蛋白检测仪：Bio-RAD，SmartSpaee TM 3010 ;
[0043] 高速冷冻离心机3K18型：SigmaR，德国产；
[0044] Mini-SUB凝胶电泳装置，电泳仪：POWER Pac300,凝胶电泳图像分析系统2000型： Bk)-R/\DB，意大利产；
[0045] 梯度 PCR 仪：PX 2, Thermo hybaid ;分子杂交仪：Thermo,美国产；
[0046] 晶芯? SmartArrayer?48 (微阵列芯片点样系统），晶芯? LuxScan?10K微阵列芯片 扫描仪：Capitalbio Corporation，北京博奥生物有限公司；
[0047] 高纯氮气瓶：四川冠峰气体有限公司生产。
[0048] 1. 4主要试剂
[0049] Plasmid miniprep Kit，Gel Extractraction Kit，均购自 Omega (美国）生物技 术有限公司；
[0050] 血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、50bp DNA LadderUOObp DNA Ladder、 2XTaq PCR MasterMix、DH5a感受态细胞-化学转化，Amp均购自北京天根生化科技有限公 司；
[0051] PUC18Cloning Vector，pMD19-T Simple克隆试剂盒，均购自宝生物（大连）科技 有限公司；
[0052] LB 液体培养基（含 100mg/ml Amp) ;LB 平板（含 100mg/ml Amp)等。
[0053] Western Blot膜封闭液，购自天根生物科技有限生司；
[0054] Streptavidin-HRP，DAB Kit (Brown)购自英駿生物科技有限公司；
[0055] Baio?点样缓冲液，购自上海百傲生物工程有限公司；
[0056] 预杂交缓冲液：甲酰胺 50ml、20XSSC 25ml、100Xdenhartd' s 5ml、脱脂奶粉 5g、 0· 2M Na3PO4IOml,超纯水定容至 100ml ;
[0057] 杂交缓冲液，甲酰胺45ml、20XSSC 25ml、100Xdenhartd's 1ml、脱脂奶粉2g、20m M Na3PO4 (pH 6· 5) 10ml，超纯水定容至 100ml ;
[0058] 尼龙膜，购自GE Healthcare ;硝酸纤维素膜，购自Millipore.
[0059] 0· 2M PBS 缓冲液：NaCl 8g、KCl 0· 2g、Na2HPO4L 42g、KH2PO4O. 27g，定容至 IL ;
[0060] 洗液 I :1XSSC 0· 1% SDS ;洗液 II :0· 2XSSC 0· 1% SDS ;洗液III :0· 2XSSC ;超 纯水。
[0061] 2实验方法
[0062] 2. 1探针设计
[0063] 2. I. IPRV
[0064] PRV-gB 基因 （SEQ ID NO :1):
[0065] TCGCCGTGCTCTTCAAGGAGAACGTCGCCCCGCACAAGTTCAAGGCCCACATCTACTACAAGAACGT CATCGTCACGACCGTGTGGTCCGGGAGCACGTACGCGGCCATCACGAACCGCTTCACGGACCGCGTGCCCGCCCC CGTGCAGGAGATCACGGACGTGATCGACC GCCGCGGCAAGTGCGTCTCCAAGGCCGAGTACGTGCGCAACAACCA CAAGGTGACCGCCTTCGACCGCGACGAGAACCCCGTCGAGGTGGACCTGCGCCCCTCGCGCCTGAACGCGCTCGG CACCCGCGGCTGGCACACCACCAACGACACCT
[0066] 可用于检测所有PRV毒株的检测。
[0067] PRV-gE 基因 （SEQ ID NO :2):
[0068] CTGGCTCTGCGTGCTGTGCTCCCGGCGCCGGGCGGCCTCGCGGCCGTTCCGGGTGCCGACGCGGGCG CGGACGCACATGCTCTCTCCGGTGTACACCAGCCTGCCCACGCACGAGGACTACTACGACGACGACGACGACGAC GACGAC
[0069] 可用于检测所有PRV疫苗株的检测。
[0070] PRV野毒株含有gB基因与gE基因，而PRV疫苗株只含有gB基因，gB基因可用于 PRV毒株的检测，两种基因同时应用可判定是否为野毒株或疫苗株感染。
[0071] 2.1.2PCV2 探针
[0072] PCV2-0RF2 基因 （SEQ ID NO :3):
[0073] GGAGTGGTAGGAGAAGGGTTGGGTTATGGTATGGCGGGAGGAGTAGTTTACATAGGGGTCATAGGTTAG GGCATTGGCCTTTGTTACAAAGTTATCATCTAGAATAACAGCAGTGGAGCCCA
[0074] 2. 1. 3 质控 I :PUC18 基因 （SEQ ID NO :4):
[0075] GCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTG TCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCC AGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCC
[0076] 2. L 4 质控 2 :GAPDH 基因 （SEQ ID NO :5):
[0077] CCCCTTCATCACCACGGACTACATGACCTACATGTTCAAGTACGACACCGTCCACGGCCACTGGAAGCA CAGCGACATCACACTCAAGGACTCCAAGACCCTTCTCTTCGGTGACAAGCCGGTCACCGTCTTTGGCATCAGGAACC CTGAGGAAATCCCGTGGGGTGAGGCTGGCGCTGAGTATGTCGTGGAGTCCACCGGCGTCTTCACTGACAAGGACAAG GCTGCTGCACATCTCAAGGGTGGTGCCAAGAAGG
[0078] 2. 1. 6重组质粒及其重组菌的制备
[0079] 2. L 6. 1探针基因的连接
[0080] 采用pMD19-T Simple克隆试剂盒，进行探针基因的连接重组，具体步骤按说明进 行。连接体系如下：
[0081] pMD19-T Simple .我体 LU ul 胶回收PCR产物 2.0 ul Solution 1 5.0 ul 去离子水 2.U ul Total 10.0 ul
[0082] 4°C连接过夜，连接产物用于转化DH5a感受态细胞。
[0083] 2. 1. 6. 2探针基因的转化
[0084] 取9ul连接产物，向其中加入Iul Solution III (可增强转化效率），混匀。将连接 产物加入50ul感受细胞中，混匀，冰浴30min ;42°C水浴热休克90s，快速冰浴冷却5min ;立 即加入600ul 37°C预热的LB液体培养基（不含Amp)，37°C，180r/min振荡培养lh，使受体 菌恢复正常生长状态；4000r/min离心5min，弃上清510ul，重悬菌液后取150ul培养物均 勾涂布于LB平板（含100mg/ml Amp)，瞭干，于37°C培养箱中培养约12h。
[0085] 即得 T/PRV-gB、T/PRV-gE 和 T/0RF22 个检测探针以及 T/PUC18 和 T/GAPDH 2 个定 位探针基因重组质粒菌。
[0086] 2. 2可视芯片的制备
[0087] 2. 2.1阵列的设计排布
[0088] 每张芯片分为2个重复阵列，每个阵列为7排不同的探针基因，每排探针基因重复 喷样4次。每个阵列探针基因排布为：第一排为PRV-gB基因，第二排为PRV-gE基因，第三 排为空白对照（超纯水），第四排为PCV2-ORF2基因，第五排为空白对照（超纯水），第六排 为PUC18基因，第七排为GAPDH基因。阵列排布示意图如图1。
[0089] 2. 2. 2 喷样
[0090] 本试验采用北京博奥生物有限公司的晶芯? SmartArrayer 48系统喷样。在喷样 前，先将384孔板与粘在基片上的硝酸纤维素膜安装到点样仪的指定区域，然后对点样仪 的各项位置参数进行标定，并按2. 2. 1的阵列排布设置点阵。针阵点矩为3000 μ m，阵间间 隔为7mm.点阵及样品参数设置如图2和图3.
[0091] 将纯化好的探针基因浓度调整到200ng/ul，加入等体积的点样缓冲液后混匀。混 合液在PCR仪中95°C变性IOmin后，立即冰浴冷却5min，将探针基因轻轻加至384孔板相 应的孔中。以上均设置完成后，打开氮气瓶，调整压力为0.4~0.5M Pa，即可开始喷样。
[0092] 2. 2. 3探针基因固定、密封与保存
[0093] 喷样完成后将硝酸纤维素膜置于80°C的烘箱中烘焙2h，真空机抽干密封、4°C冰 箱保存。
[0094] 2. 3靶基因的PCR扩增标记
[0095] 分别提取PRV和PCV2DNA，与对应的引物进行PCR扩增标记。
[0096] 2. 3. IDNA提取方法如下：基因组DNA抽提采用天根血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒，具体操作步骤如下：
[0097] (1)处理病料：取疑似患猪圆环病、猪伪狂犬病的肝、肺脏（纤维素性渗出及出血 处）、脾（梗死、出血处）、淋巴结（肿大、出血处）25~50mg剪碎、研磨；
[0098] (2)加入20ul 20mg/ml的Protease K溶液，吹打混匀，56°C水浴锅放置lh，顺离 30s后进行下一步骤；
[0099] (3)加200ul缓冲液GB，上下颠倒混勾，在70°C水浴锅中放置IOmin后，溶液应变 的清亮，顺离30s ;
[0100] (4)加200ul无水乙醇，上下颠倒混匀，此时溶液中可能会出现絮状的沉淀物，顺 离 30s ;
[0101] (5)将上一步所得液体都加入一个带有收集管的吸附柱CB3中，12, OOOrpm离心 30s，倒废液，将吸附柱重新放入收集管中；
[0102] (6)向吸附柱中加入500ul去蛋白液⑶，12, OOOrpm顺离30s，倒废液，再将吸附柱 重新放入收集管中；
[0103] (7)向吸附柱中加入700ul漂洗液PW，12, OOOrpm顺离30s，倒废液，将吸附柱重新 放入收集管中；
[0104] (8)向吸附柱中加入500ul漂洗液PW，12, OOOrpm顺离30s，倒废液；
[0105] (9)将吸附柱放入废液收集管中，12, OOOrpm离心2min.室温开盖放置数分钟；
[0106] (10)将吸附柱转入一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空加入IOOul经预 热过的TE缓冲液，室温放置3min后，12, OOOrpm离心30s ;
[0107] (11)再次将离心得到的溶液加入吸附柱中，室温放置3min，12, OOOrpm离心3min。
[0108] 2. 3. 2引物如下
[0109] 2. 3. 2. IPRV
[0110] PRV-gB 基因的扩增引物（SEQ ID NO :6 ~7):
[0111] F:TCGCCGTGCTCTTCAAGG
[0112] R：AGGTGTCGTTGGTGGTGTG
[0113] PRV-gE 基因的扩增引物（SEQ ID NO :8 ~9):
[0114] F:CTGGCTCTGCGTGCTGTG
[0115] R:GTCGTCGTCGTCGTCGTC
[0116] 2. 3. 2. 3PCV2 (SEQ ID NO : 10 ~11)
[0117] F：GGGAGTGGTAGGAGAAGGGT
[0118] R : TGGGCTCCACTGCTGTTATT
[0119] 2. 3. 2. 4 质控 1(SEQ ID NO :12 ~13)
[0120] F：GGGAGTGGTAGGAGAAGGGT
[0121] R:TGGGCTCCACTGCTGTTATT
[0122] 2 . 3. 2. 5 质控 2 (SEQ ID NO :14 ~15)
[0123] F:CCCCTTCATCACCACGGACTA
[0124] R:CCTTCTTGGCACCACCCT
[0125] 2. 3. 3PCR反应体系如下：
[0126]
[0127] 反应程序为：94°〇、411^11;94°〇、408,58°〇、308,72°〇、308，共30个循环；72°〇延伸 5min ;4°C保存。取6ul用3. 0%的琼脂糖凝胶电泳分析。
[0128] 2. 4可视化基因芯片检测操作程序
[0129] 2. 4.1 预杂交
[0130] 将制备好的芯片放于塑料盒中（如图4)，加入IOml预杂交缓冲液（加入量盖住芯 片即可），然后将塑料盒放入湿盒内44°C预杂交I. 5h.
[0131] 2. 4. 2 杂交
[0132] 吸除预杂交液，将制备好的靶基因在PCR仪中95°C变性IOmin后立即冰浴冷却 5min，然后加入IOml杂交缓冲液中，44°C杂交一定时间。杂交结束后，将芯片固定在洗片夹 上，然后于室温下，依次用洗涤液I、洗涤液II和洗涤液III中各洗涤5min，1000r/min，离心 5min干燥。
[0133] 2. 4. 3 封闭
[0134] 吸除杂交液，加入IOml封闭液，37°C封闭40min.
[0135] 2.4.4 酶联
[0136] 将 str印tavidin-HRP 在避光条件下用 0· 2M PBS buffer 按 I :1000 倍稀释，37°C 酶联30min.然后于室温下，依次用洗涤液I、洗涤液II和洗涤液III中各洗涤5min，1000 r/ min，离心5min干燥。
[0137] 2. 4. 5 显色
[0138] 加入DAB底物显色液（现用现配），显色5~lOmin，肉眼观察结果。
[0139] 2. 5性能检测
[0140] 2. 5. 1可视化基因芯片特异性检测评价
[0141] 分别以PRV、PPV、PCV2、CSFV、PRRSV、JEV的质粒DNA为模板，进行PCR扩增标记， 将标记产物与基因芯片杂交后，观察其特异性杂交结果。
[0142] 2. 5. 2可视化基因芯片灵敏性检测评价
[0143] 提取各探针基因重组质粒菌的质粒DNA，经PCR扩增标记后，分别作IOX倍比稀释 作为靶基因，将各靶基因混合后与基因芯片进行杂交检测，以评价芯片与PCR的灵敏性。
[0144] 2. 5. 3可视化基因芯片的保存期检测评价
[0145] 以PCV2检测基因芯片为例，分别将保存30天、60天、90天和120天后的芯片各抽 取一张，将各质粒DNA进行经PCR扩增标记后进行杂交检测，以评价其保存期。
[0146] 3实验结果
[0147] 3. 1可视化基因芯片特异性检测评价结果
[0148] 分别以PRV、PPV、PCV2、CSFV、PRRSV、JEV的质粒DNA为模板，进行PCR扩增标记， 将标记产物与基因芯片杂交后，观察其特异性杂交结果（如图5)。结果表明芯片特异性好， PRV、PCV2分别在相应位置出现杂交斑点，而其余位置均未出现杂交斑点。
[0149] 3. 2可视化基因芯片灵敏性检测评价结果
[0150] 3. 2. 1基因芯片灵敏性检测结果
[0151] gB探针基因芯片灵敏性检测结果
[0152] 对gB质粒DNA进行PCR扩增标记，IOX系列稀释后与芯片杂交，最低检测浓度可 达18. 3pg/ul，检测结果见图6.
[0153] gE探针基因芯片灵敏性检测结果
[0154] 对gE质粒DNA进行PCR扩增标记，IOX系列稀释后与芯片杂交，最低检测浓度可 达17. 4pg/ul，检测结果见图7.
[0155] 0RF2探针基因芯片灵敏性检测结果
[0156] 对0RF2质粒DNA进行PCR扩增标记，IOX系列稀释后与芯片杂交，最低检测浓度 可达13. 2pg/ul，检测结果见图8.
[0157] 3. 3可视化基因芯片保存期检测评价结果
[0158] 如图9所示，分别将保存30天、60天、90天和120天后的芯片各抽取一张，将各质 粒DNA进行经PCR扩增标记后混合，与芯片经预杂交、杂交、封闭、酶联、显色等一系列操作 后观察结果，结果表明芯片在保存120天后仍可进行有效检测。
[0159] 研宄结果表明，芯片与CSFV、PRRSV、JEV、PPV检测结果均为阴性，PRV、PCV2各靶 基因之间也无交叉反应；PRV-gB、PRV-gE和PCV2-0RF2探针基因的灵敏性分别为：18. 3pg/ ul、17. 4pg/ul和13. 2pu/ul，均较PCR灵敏性高10倍；芯片在保存120天后仍可进行有效 检测。
[0160] 实施例2采用本发明可视化基因芯片和试剂盒对实际样品进行检测
[0161] 1、临床样本：采自四川成都、广安、乐山、德阳、安岳、攀枝花等地疑似猪繁殖障碍 性疾病病猪的脾脏、肺脏、肝脏、肾脏、淋巴结等组织。
[0162] 2、检测方法
[0163] 采集四川、重庆、福建、贵州、甘肃等地103份临床样本的脾脏、肺脏、肝脏、肾脏、 淋巴结的病变部位，采用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取病毒基因组，按 照实施例1的方法进行检测。
[0164] 3、检测结果
[0165] 结果如下表所示：
[0166] 表1 :临床样本检测结果
[0167]
[0168] PRV、PCV2的阳性率分别为22. 3% (其中疫苗株为2. 9%，野毒株为19. 4% )、 78. 6 %，PRV+PCV2 为 22. 3 %。
[0169] 实验结果说明，本发明基因芯片和试剂盒可以有效检测能联合共检PRV和PCV2等 病原，还能区分PRV的疫苗株与野毒株感染。
[0170] 综上，本发明基因芯片和试剂盒可以有效检测PRV和PCV2,还能区分PRV的疫苗株 与野毒株感染，具有特异性好、灵敏性高和保存期长等特点，耗时短，检测快速，检测结果的 观察直观，无需昂贵的设备，具有良好的应用前景。
【主权项】
1. 一种检测猪伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒2型的基因芯片，其特征在于：它包括固 相载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQIDNO:1和/或3所示基因片段， 用于分别检测伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒2型。2. 根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于：它还包括SEQIDNO:2所示所示探 针，用于检测伪狂犬病毒野毒株。3. 根据权利要求2所述的基因芯片，其特征在于：它还包括质控探针，其核苷酸序列如 SEQIDNO:4 和 / 或SEQIDNO:5 所示。4. 一种检测猪伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒2型的试剂盒，其特征在于：它包括权利 要求1~3任意一项所述的基因芯片以及扩增试剂；其中，扩增试剂包括SEQIDNO:6~ 7、SEQIDNO:10~11所示引物对，用于扩增伪狂犬病毒野毒株的基因。5. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：它还包括SEQIDNO:8~9所示引物 对，用于扩增伪狂犬病毒野毒株的基因。6. 根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：所述SEQIDNO:6、8、10所示上游 引物标记有生物素。 7. SEQIDNO:1、3所示基因片段在制备检测猪伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒2型的基 因芯片的用途。8. 根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述基因芯片还包括SEQIDNO:2所示 所示探针，用于检测伪狂犬病毒野毒株。 9. SEQIDNO:6~7、SEQIDNO:10~11所示引物对以及SEQIDNO:1、3所示基因 片段在制备检测猪伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒2型中的用途；其中，两对引物对为扩增试 剂，SEQIDNO:1或3所示基因片段为检测探针。10. 根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述基因芯片还包括SEQIDNO:2所示 所示探针以及SEQIDNO:8~9所示引物对，用于检测和扩增伪狂犬病毒野毒株的基因。
【专利摘要】本发明公开了一种检测猪伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒2型的基因芯片，它包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQ ID NO：1和/或3所示基因片段，用于分别检测伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒2型。本发明公开了一种检测猪伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒2型的试剂盒。本发明基因芯片和试剂盒可以有效检测猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型，还能区分猪伪狂犬病毒的疫苗株与野毒株感染，具有特异性好、灵敏性高和保存期长等特点，耗时短，检测快速，检测结果的观察直观，无需昂贵的设备，可以迅速掌握畜禽疫病的感染情况，临床应用前景良好。
【IPC分类】C12R1/93, C12Q1/70, C12Q1/68
【公开号】CN104894294
【申请号】CN201510313807
【发明人】文心田, 曹三杰, 常晓霞, 黄小波, 文翼平, 伍锐, 张仙, 马锐, 杨国淋
【申请人】四川农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月9日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测猪伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒2型的可视化基因芯片以及 检测方法。
【背景技术】
[0002] 随着我国养猪业向集约化和规模化方向发展，规模化猪场疫病多发、多种病原混 合感染较普遍存在，给养猪业造成了一定损失。其中猪伪狂犬病毒（PRV)、猪圆环病毒2型 (PCV2)是引起猪繁殖障碍的两种重要疫病病原。这两种病临诊症状相似，需要进行鉴别诊 断。
[0003] 目前，对这两种疾病的诊断多采用分离鉴定及常规的血清学方法，所需时间较长， 也有PCR技术的鉴别方法，但还没有建立操作性强且能同时鉴别两种病毒的方法。因此，有 必要建立能同时进行两种疫病快速检测的方法。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述问题，本发明提供了一种特异性强、灵敏度高、可同时检测猪伪狂犬 病毒和/或猪圆环病毒2型的可视化基因芯片和试剂盒。
[0005] 基因芯片，是指指通过不同方法将生物分子（寡核苷酸、cDNA、genomic DNA、多肽、 抗体、抗原等）固着于硅片、玻璃片（珠）、塑料片（珠）、凝胶、尼龙膜等固相递质上形成的 生物分子点阵，其突出的特点是微型化、集成化、平行化和高通量。
[0006] 本发明检测猪伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒2型的基因芯片，它包括固相载体以 及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQ ID NO :1和/或3所示基因片段，用于分别 检测伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒2型。
[0007] 优选地，它还包括SEQ ID NO :2所示所示探针，用于检测伪狂犬病毒野毒株。
[0008] 其中，它还包括质控探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO :4和/或SEQ ID NO :5所 不O
[0009] 本发明检测猪伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒2型的试剂盒，它包括前述的基因芯 片以及扩增试剂；其中，扩增试剂包括SEQ ID NO :6~7、SEQ ID NO :10~11所示引物对， 用于扩增伪狂犬病毒野毒株的基因。
[0010] 优选地，它还包括SEQ ID NO :8~9所示引物对，用于扩增伪狂犬病毒野毒株的基 因。
[0011] 优选地，所述SEQ ID NO :6、8、10所示上游引物标记有生物素。
[0012] 本发明还提供了 SEQ ID NO :1、3所示基因片段在制备检测猪伪狂犬病毒和/或猪 圆环病毒2型的基因芯片的用途。
[0013] 优选地，所述基因芯片还包括SEQ ID NO :2所示所示探针，用于检测伪狂犬病毒野 毒株。
[0014] 本发明还提供了 SEQ ID NO :6~7、SEQ ID NO :10~11所示引物对以及SEQ ID NO :1、3所示基因片段在制备检测猪伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒2型中的用途；其中，两 对引物对为扩增试剂，SEQ ID NO :1或3所示基因片段为检测探针。
[0015] 优选地，所述基因芯片还包括SEQ ID NO :2所示所示探针以及SEQ ID NO :8~9 所示引物对，用于检测和扩增伪狂犬病毒野毒株的基因。
[0016] 本发明基因芯片和试剂盒可以有效检测猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型，还能区 分猪伪狂犬病毒的疫苗株与野毒株感染，具有特异性好、灵敏性高和保存期长等特点，耗时 短，检测快速，检测结果的观察直观，无需昂贵的设备，可以迅速掌握畜禽疫病的感染情况， 临床应用前景良好。
[0017] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要 求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0018] 图1 :阵列排布示意图
[0019] 图2:点阵设置图示
[0020] 图3 :样品设置图示
[0021] 图4 :芯片预杂交的组装图示
[0022] 图5 :芯片特异性检测结果A:PRV检测结果；B:PPV检测结果；C:PCV2检测结果； D:PRV+PPV检测结果；E:PRV+PPV检测结果；F:PRV+PCV2检测结果
[0023] 图6 :gB探针基因不同稀释度芯片灵敏性检测结果
[0024] 图7 :gE探针基因芯片灵敏性检测结果
[0025] 图8 :0RF2探针基因芯片灵敏性检测结果
[0026] 图9 :稳定性检测结果
【具体实施方式】
[0027] 实施例1本发明检测方法
[0028] 一、探针基因的设计以及包含探针的质粒菌的构建
[0029] 1 材料
[0030] I. 1 种毒
[0031] PRV Fa株，由卫生部成都生物制品研宄所惠赠；
[0032] PCV2由本实验室赵春容从四川资阳病料中分离；
[0033] 猪细小病毒灭活疫苗购自北京中海科技动物保健科技公司。
[0034] 1. 2探针基因重组质粒菌
[0035] T/GAPDH由英骏生物公司合成。
[0036] L 3主要实验仪器
[0037] 电子天平：Sartorius BP 310S ;
[0038] 超纯水仪：Milli Qplus，法国产；
[0039] 超净工作台：SW-CJ-2FD，苏州安泰空气技术有限公司；
[0040] 恒温摇床：真空机：SinBo,香港；
[0041] 恒温水浴锅；Thermo Savant冷冻干燥仪；
[0042] 核酸蛋白检测仪：Bio-RAD，SmartSpaee TM 3010 ;
[0043] 高速冷冻离心机3K18型：SigmaR，德国产；
[0044] Mini-SUB凝胶电泳装置，电泳仪：POWER Pac300,凝胶电泳图像分析系统2000型： Bk)-R/\DB，意大利产；
[0045] 梯度 PCR 仪：PX 2, Thermo hybaid ;分子杂交仪：Thermo,美国产；
[0046] 晶芯? SmartArrayer?48 (微阵列芯片点样系统），晶芯? LuxScan?10K微阵列芯片 扫描仪：Capitalbio Corporation，北京博奥生物有限公司；
[0047] 高纯氮气瓶：四川冠峰气体有限公司生产。
[0048] 1. 4主要试剂
[0049] Plasmid miniprep Kit，Gel Extractraction Kit，均购自 Omega (美国）生物技 术有限公司；
[0050] 血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、50bp DNA LadderUOObp DNA Ladder、 2XTaq PCR MasterMix、DH5a感受态细胞-化学转化，Amp均购自北京天根生化科技有限公 司；
[0051] PUC18Cloning Vector，pMD19-T Simple克隆试剂盒，均购自宝生物（大连）科技 有限公司；
[0052] LB 液体培养基（含 100mg/ml Amp) ;LB 平板（含 100mg/ml Amp)等。
[0053] Western Blot膜封闭液，购自天根生物科技有限生司；
[0054] Streptavidin-HRP，DAB Kit (Brown)购自英駿生物科技有限公司；
[0055] Baio?点样缓冲液，购自上海百傲生物工程有限公司；
[0056] 预杂交缓冲液：甲酰胺 50ml、20XSSC 25ml、100Xdenhartd' s 5ml、脱脂奶粉 5g、 0· 2M Na3PO4IOml,超纯水定容至 100ml ;
[0057] 杂交缓冲液，甲酰胺45ml、20XSSC 25ml、100Xdenhartd's 1ml、脱脂奶粉2g、20m M Na3PO4 (pH 6· 5) 10ml，超纯水定容至 100ml ;
[0058] 尼龙膜，购自GE Healthcare ;硝酸纤维素膜，购自Millipore.
[0059] 0· 2M PBS 缓冲液：NaCl 8g、KCl 0· 2g、Na2HPO4L 42g、KH2PO4O. 27g，定容至 IL ;
[0060] 洗液 I :1XSSC 0· 1% SDS ;洗液 II :0· 2XSSC 0· 1% SDS ;洗液III :0· 2XSSC ;超 纯水。
[0061] 2实验方法
[0062] 2. 1探针设计
[0063] 2. I. IPRV
[0064] PRV-gB 基因 （SEQ ID NO :1):
[0065] TCGCCGTGCTCTTCAAGGAGAACGTCGCCCCGCACAAGTTCAAGGCCCACATCTACTACAAGAACGT CATCGTCACGACCGTGTGGTCCGGGAGCACGTACGCGGCCATCACGAACCGCTTCACGGACCGCGTGCCCGCCCC CGTGCAGGAGATCACGGACGTGATCGACC GCCGCGGCAAGTGCGTCTCCAAGGCCGAGTACGTGCGCAACAACCA CAAGGTGACCGCCTTCGACCGCGACGAGAACCCCGTCGAGGTGGACCTGCGCCCCTCGCGCCTGAACGCGCTCGG CACCCGCGGCTGGCACACCACCAACGACACCT
[0066] 可用于检测所有PRV毒株的检测。
[0067] PRV-gE 基因 （SEQ ID NO :2):
[0068] CTGGCTCTGCGTGCTGTGCTCCCGGCGCCGGGCGGCCTCGCGGCCGTTCCGGGTGCCGACGCGGGCG CGGACGCACATGCTCTCTCCGGTGTACACCAGCCTGCCCACGCACGAGGACTACTACGACGACGACGACGACGAC GACGAC
[0069] 可用于检测所有PRV疫苗株的检测。
[0070] PRV野毒株含有gB基因与gE基因，而PRV疫苗株只含有gB基因，gB基因可用于 PRV毒株的检测，两种基因同时应用可判定是否为野毒株或疫苗株感染。
[0071] 2.1.2PCV2 探针
[0072] PCV2-0RF2 基因 （SEQ ID NO :3):
[0073] GGAGTGGTAGGAGAAGGGTTGGGTTATGGTATGGCGGGAGGAGTAGTTTACATAGGGGTCATAGGTTAG GGCATTGGCCTTTGTTACAAAGTTATCATCTAGAATAACAGCAGTGGAGCCCA
[0074] 2. 1. 3 质控 I :PUC18 基因 （SEQ ID NO :4):
[0075] GCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTG TCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCC AGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCC
[0076] 2. L 4 质控 2 :GAPDH 基因 （SEQ ID NO :5):
[0077] CCCCTTCATCACCACGGACTACATGACCTACATGTTCAAGTACGACACCGTCCACGGCCACTGGAAGCA CAGCGACATCACACTCAAGGACTCCAAGACCCTTCTCTTCGGTGACAAGCCGGTCACCGTCTTTGGCATCAGGAACC CTGAGGAAATCCCGTGGGGTGAGGCTGGCGCTGAGTATGTCGTGGAGTCCACCGGCGTCTTCACTGACAAGGACAAG GCTGCTGCACATCTCAAGGGTGGTGCCAAGAAGG
[0078] 2. 1. 6重组质粒及其重组菌的制备
[0079] 2. L 6. 1探针基因的连接
[0080] 采用pMD19-T Simple克隆试剂盒，进行探针基因的连接重组，具体步骤按说明进 行。连接体系如下：
[0081] pMD19-T Simple .我体 LU ul 胶回收PCR产物 2.0 ul Solution 1 5.0 ul 去离子水 2.U ul Total 10.0 ul
[0082] 4°C连接过夜，连接产物用于转化DH5a感受态细胞。
[0083] 2. 1. 6. 2探针基因的转化
[0084] 取9ul连接产物，向其中加入Iul Solution III (可增强转化效率），混匀。将连接 产物加入50ul感受细胞中，混匀，冰浴30min ;42°C水浴热休克90s，快速冰浴冷却5min ;立 即加入600ul 37°C预热的LB液体培养基（不含Amp)，37°C，180r/min振荡培养lh，使受体 菌恢复正常生长状态；4000r/min离心5min，弃上清510ul，重悬菌液后取150ul培养物均 勾涂布于LB平板（含100mg/ml Amp)，瞭干，于37°C培养箱中培养约12h。
[0085] 即得 T/PRV-gB、T/PRV-gE 和 T/0RF22 个检测探针以及 T/PUC18 和 T/GAPDH 2 个定 位探针基因重组质粒菌。
[0086] 2. 2可视芯片的制备
[0087] 2. 2.1阵列的设计排布
[0088] 每张芯片分为2个重复阵列，每个阵列为7排不同的探针基因，每排探针基因重复 喷样4次。每个阵列探针基因排布为：第一排为PRV-gB基因，第二排为PRV-gE基因，第三 排为空白对照（超纯水），第四排为PCV2-ORF2基因，第五排为空白对照（超纯水），第六排 为PUC18基因，第七排为GAPDH基因。阵列排布示意图如图1。
[0089] 2. 2. 2 喷样
[0090] 本试验采用北京博奥生物有限公司的晶芯? SmartArrayer 48系统喷样。在喷样 前，先将384孔板与粘在基片上的硝酸纤维素膜安装到点样仪的指定区域，然后对点样仪 的各项位置参数进行标定，并按2. 2. 1的阵列排布设置点阵。针阵点矩为3000 μ m，阵间间 隔为7mm.点阵及样品参数设置如图2和图3.
[0091] 将纯化好的探针基因浓度调整到200ng/ul，加入等体积的点样缓冲液后混匀。混 合液在PCR仪中95°C变性IOmin后，立即冰浴冷却5min，将探针基因轻轻加至384孔板相 应的孔中。以上均设置完成后，打开氮气瓶，调整压力为0.4~0.5M Pa，即可开始喷样。
[0092] 2. 2. 3探针基因固定、密封与保存
[0093] 喷样完成后将硝酸纤维素膜置于80°C的烘箱中烘焙2h，真空机抽干密封、4°C冰 箱保存。
[0094] 2. 3靶基因的PCR扩增标记
[0095] 分别提取PRV和PCV2DNA，与对应的引物进行PCR扩增标记。
[0096] 2. 3. IDNA提取方法如下：基因组DNA抽提采用天根血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒，具体操作步骤如下：
[0097] (1)处理病料：取疑似患猪圆环病、猪伪狂犬病的肝、肺脏（纤维素性渗出及出血 处）、脾（梗死、出血处）、淋巴结（肿大、出血处）25~50mg剪碎、研磨；
[0098] (2)加入20ul 20mg/ml的Protease K溶液，吹打混匀，56°C水浴锅放置lh，顺离 30s后进行下一步骤；
[0099] (3)加200ul缓冲液GB，上下颠倒混勾，在70°C水浴锅中放置IOmin后，溶液应变 的清亮，顺离30s ;
[0100] (4)加200ul无水乙醇，上下颠倒混匀，此时溶液中可能会出现絮状的沉淀物，顺 离 30s ;
[0101] (5)将上一步所得液体都加入一个带有收集管的吸附柱CB3中，12, OOOrpm离心 30s，倒废液，将吸附柱重新放入收集管中；
[0102] (6)向吸附柱中加入500ul去蛋白液⑶，12, OOOrpm顺离30s，倒废液，再将吸附柱 重新放入收集管中；
[0103] (7)向吸附柱中加入700ul漂洗液PW，12, OOOrpm顺离30s，倒废液，将吸附柱重新 放入收集管中；
[0104] (8)向吸附柱中加入500ul漂洗液PW，12, OOOrpm顺离30s，倒废液；
[0105] (9)将吸附柱放入废液收集管中，12, OOOrpm离心2min.室温开盖放置数分钟；
[0106] (10)将吸附柱转入一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空加入IOOul经预 热过的TE缓冲液，室温放置3min后，12, OOOrpm离心30s ;
[0107] (11)再次将离心得到的溶液加入吸附柱中，室温放置3min，12, OOOrpm离心3min。
[0108] 2. 3. 2引物如下
[0109] 2. 3. 2. IPRV
[0110] PRV-gB 基因的扩增引物（SEQ ID NO :6 ~7):
[0111] F:TCGCCGTGCTCTTCAAGG
[0112] R：AGGTGTCGTTGGTGGTGTG
[0113] PRV-gE 基因的扩增引物（SEQ ID NO :8 ~9):
[0114] F:CTGGCTCTGCGTGCTGTG
[0115] R:GTCGTCGTCGTCGTCGTC
[0116] 2. 3. 2. 3PCV2 (SEQ ID NO : 10 ~11)
[0117] F：GGGAGTGGTAGGAGAAGGGT
[0118] R : TGGGCTCCACTGCTGTTATT
[0119] 2. 3. 2. 4 质控 1(SEQ ID NO :12 ~13)
[0120] F：GGGAGTGGTAGGAGAAGGGT
[0121] R:TGGGCTCCACTGCTGTTATT
[0122] 2 . 3. 2. 5 质控 2 (SEQ ID NO :14 ~15)
[0123] F:CCCCTTCATCACCACGGACTA
[0124] R:CCTTCTTGGCACCACCCT
[0125] 2. 3. 3PCR反应体系如下：
[0126]
[0127] 反应程序为：94°〇、411^11;94°〇、408,58°〇、308,72°〇、308，共30个循环；72°〇延伸 5min ;4°C保存。取6ul用3. 0%的琼脂糖凝胶电泳分析。
[0128] 2. 4可视化基因芯片检测操作程序
[0129] 2. 4.1 预杂交
[0130] 将制备好的芯片放于塑料盒中（如图4)，加入IOml预杂交缓冲液（加入量盖住芯 片即可），然后将塑料盒放入湿盒内44°C预杂交I. 5h.
[0131] 2. 4. 2 杂交
[0132] 吸除预杂交液，将制备好的靶基因在PCR仪中95°C变性IOmin后立即冰浴冷却 5min，然后加入IOml杂交缓冲液中，44°C杂交一定时间。杂交结束后，将芯片固定在洗片夹 上，然后于室温下，依次用洗涤液I、洗涤液II和洗涤液III中各洗涤5min，1000r/min，离心 5min干燥。
[0133] 2. 4. 3 封闭
[0134] 吸除杂交液，加入IOml封闭液，37°C封闭40min.
[0135] 2.4.4 酶联
[0136] 将 str印tavidin-HRP 在避光条件下用 0· 2M PBS buffer 按 I :1000 倍稀释，37°C 酶联30min.然后于室温下，依次用洗涤液I、洗涤液II和洗涤液III中各洗涤5min，1000 r/ min，离心5min干燥。
[0137] 2. 4. 5 显色
[0138] 加入DAB底物显色液（现用现配），显色5~lOmin，肉眼观察结果。
[0139] 2. 5性能检测
[0140] 2. 5. 1可视化基因芯片特异性检测评价
[0141] 分别以PRV、PPV、PCV2、CSFV、PRRSV、JEV的质粒DNA为模板，进行PCR扩增标记， 将标记产物与基因芯片杂交后，观察其特异性杂交结果。
[0142] 2. 5. 2可视化基因芯片灵敏性检测评价
[0143] 提取各探针基因重组质粒菌的质粒DNA，经PCR扩增标记后，分别作IOX倍比稀释 作为靶基因，将各靶基因混合后与基因芯片进行杂交检测，以评价芯片与PCR的灵敏性。
[0144] 2. 5. 3可视化基因芯片的保存期检测评价
[0145] 以PCV2检测基因芯片为例，分别将保存30天、60天、90天和120天后的芯片各抽 取一张，将各质粒DNA进行经PCR扩增标记后进行杂交检测，以评价其保存期。
[0146] 3实验结果
[0147] 3. 1可视化基因芯片特异性检测评价结果
[0148] 分别以PRV、PPV、PCV2、CSFV、PRRSV、JEV的质粒DNA为模板，进行PCR扩增标记， 将标记产物与基因芯片杂交后，观察其特异性杂交结果（如图5)。结果表明芯片特异性好， PRV、PCV2分别在相应位置出现杂交斑点，而其余位置均未出现杂交斑点。
[0149] 3. 2可视化基因芯片灵敏性检测评价结果
[0150] 3. 2. 1基因芯片灵敏性检测结果
[0151] gB探针基因芯片灵敏性检测结果
[0152] 对gB质粒DNA进行PCR扩增标记，IOX系列稀释后与芯片杂交，最低检测浓度可 达18. 3pg/ul，检测结果见图6.
[0153] gE探针基因芯片灵敏性检测结果
[0154] 对gE质粒DNA进行PCR扩增标记，IOX系列稀释后与芯片杂交，最低检测浓度可 达17. 4pg/ul，检测结果见图7.
[0155] 0RF2探针基因芯片灵敏性检测结果
[0156] 对0RF2质粒DNA进行PCR扩增标记，IOX系列稀释后与芯片杂交，最低检测浓度 可达13. 2pg/ul，检测结果见图8.
[0157] 3. 3可视化基因芯片保存期检测评价结果
[0158] 如图9所示，分别将保存30天、60天、90天和120天后的芯片各抽取一张，将各质 粒DNA进行经PCR扩增标记后混合，与芯片经预杂交、杂交、封闭、酶联、显色等一系列操作 后观察结果，结果表明芯片在保存120天后仍可进行有效检测。
[0159] 研宄结果表明，芯片与CSFV、PRRSV、JEV、PPV检测结果均为阴性，PRV、PCV2各靶 基因之间也无交叉反应；PRV-gB、PRV-gE和PCV2-0RF2探针基因的灵敏性分别为：18. 3pg/ ul、17. 4pg/ul和13. 2pu/ul，均较PCR灵敏性高10倍；芯片在保存120天后仍可进行有效 检测。
[0160] 实施例2采用本发明可视化基因芯片和试剂盒对实际样品进行检测
[0161] 1、临床样本：采自四川成都、广安、乐山、德阳、安岳、攀枝花等地疑似猪繁殖障碍 性疾病病猪的脾脏、肺脏、肝脏、肾脏、淋巴结等组织。
[0162] 2、检测方法
[0163] 采集四川、重庆、福建、贵州、甘肃等地103份临床样本的脾脏、肺脏、肝脏、肾脏、 淋巴结的病变部位，采用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取病毒基因组，按 照实施例1的方法进行检测。
[0164] 3、检测结果
[0165] 结果如下表所示：
[0166] 表1 :临床样本检测结果
[0167]
[0168] PRV、PCV2的阳性率分别为22. 3% (其中疫苗株为2. 9%，野毒株为19. 4% )、 78. 6 %，PRV+PCV2 为 22. 3 %。
[0169] 实验结果说明，本发明基因芯片和试剂盒可以有效检测能联合共检PRV和PCV2等 病原，还能区分PRV的疫苗株与野毒株感染。
[0170] 综上，本发明基因芯片和试剂盒可以有效检测PRV和PCV2,还能区分PRV的疫苗株 与野毒株感染，具有特异性好、灵敏性高和保存期长等特点，耗时短，检测快速，检测结果的 观察直观，无需昂贵的设备，具有良好的应用前景。
【主权项】
1. 一种检测猪伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒2型的基因芯片，其特征在于：它包括固 相载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQIDNO:1和/或3所示基因片段， 用于分别检测伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒2型。2. 根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于：它还包括SEQIDNO:2所示所示探 针，用于检测伪狂犬病毒野毒株。3. 根据权利要求2所述的基因芯片，其特征在于：它还包括质控探针，其核苷酸序列如 SEQIDNO:4 和 / 或SEQIDNO:5 所示。4. 一种检测猪伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒2型的试剂盒，其特征在于：它包括权利 要求1~3任意一项所述的基因芯片以及扩增试剂；其中，扩增试剂包括SEQIDNO:6~ 7、SEQIDNO:10~11所示引物对，用于扩增伪狂犬病毒野毒株的基因。5. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：它还包括SEQIDNO:8~9所示引物 对，用于扩增伪狂犬病毒野毒株的基因。6. 根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：所述SEQIDNO:6、8、10所示上游 引物标记有生物素。 7. SEQIDNO:1、3所示基因片段在制备检测猪伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒2型的基 因芯片的用途。8. 根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述基因芯片还包括SEQIDNO:2所示 所示探针，用于检测伪狂犬病毒野毒株。 9. SEQIDNO:6~7、SEQIDNO:10~11所示引物对以及SEQIDNO:1、3所示基因 片段在制备检测猪伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒2型中的用途；其中，两对引物对为扩增试 剂，SEQIDNO:1或3所示基因片段为检测探针。10. 根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述基因芯片还包括SEQIDNO:2所示 所示探针以及SEQIDNO:8~9所示引物对，用于检测和扩增伪狂犬病毒野毒株的基因。
【专利摘要】本发明公开了一种检测猪伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒2型的基因芯片，它包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQ ID NO：1和/或3所示基因片段，用于分别检测伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒2型。本发明公开了一种检测猪伪狂犬病毒和/或猪圆环病毒2型的试剂盒。本发明基因芯片和试剂盒可以有效检测猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型，还能区分猪伪狂犬病毒的疫苗株与野毒株感染，具有特异性好、灵敏性高和保存期长等特点，耗时短，检测快速，检测结果的观察直观，无需昂贵的设备，可以迅速掌握畜禽疫病的感染情况，临床应用前景良好。
【IPC分类】C12R1/93, C12Q1/70, C12Q1/68
【公开号】CN104894294
【申请号】CN201510313807
【发明人】文心田, 曹三杰, 常晓霞, 黄小波, 文翼平, 伍锐, 张仙, 马锐, 杨国淋
【申请人】四川农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月9日
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