检测猪流感病毒h3n2的引物、分子信标探针及试剂盒的制作方法
检测猪流感病毒h3n2的引物、分子信标探针及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物病原微生物检测技术领域，具体涉及一种检测猪流感病毒H3N2 的引物、分子信标探针及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 猪流感（swine influenza，SI)是甲型（A型）流感病毒引起的猪或人的一种急 性、人畜共患呼吸道传染性疾病。目前已经发现流感病毒的HA有16个亚型，NA有9个亚 型，已从猪体内分离到 H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H2N3、H3N1、H3N6、H4N6、H5N1、H5N2 和 H9N2 等11种不同亚型的SIV。近几年流行病学的研宄结果表明：我国猪群中存在H1N1、H1N2、 H3N2、H5N1和H9N2等病毒的感染，其中以H3N2和HlNl亚型流行和危害比较严重。流行 于世界范围内猪群中的H3N2亚型SI都是由类人型H3N2亚型毒株引起的，与此同时，人 类流感的暴发与SI的流行存在惊人的平行性和相关性，种种迹象表明，H3N2亚型SIV与 同时期引起人流感大流行的同亚型流感病毒之间遗传关系十分紧密。因此，建立H3N2亚 型SIV的快速检测方法不仅在兽医学领域具有重要意义，而且对人流感的研宄也有借鉴作 用。
[0003] 要实现对H3N2流感突变株快速检测，最快捷可行的是对病毒的核酸进行检测，目 前使用最多的是荧光定量RT-PCR方法。本发明结合分子信标技术建立猪H3N2流感的荧光 定量RT-PCR方法。不同亚型的猪流感病毒，致病性差异很大，使用传统方法或不能快速、准 确的检测出疫病，或无法对病毒进行分型。本发明结合分子信标方法对流感病毒进行分型， 采用该技术，即使出现新的流感病毒，通过改变分子信标探针，对新的流感毒株进行识别， 这对于流感病毒检测功能是非常强大的。
[0004] 分子信标是设计最为巧妙的探针，由一段包含了茎环结构的单链寡核苷酸组成， 形成一个发夹型结构。在其环状部分，一般是一段长度为15~30碱基的序列，能与目标分 子特异结合，茎区是长度为5~8碱基的互补序列，茎区的两端分别连接有荧光基团和淬灭 基团。发夹结构保证了分子信标的高选择性，只有完全互补的单链DNA或RNA分子才能引 起分子信标的发夹结构完全打开，从而发出荧光，因此分子信标具备高度的特异性，在检测 快速变异的病毒时非常有优势，在病毒分型时也是功能强大的工具。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种检测猪流感H3N2病毒 的HA和NA基因的引物；另外提供一种检测猪流感H3N2病毒的HA和NA基因的分子信标探 针；以及提供一种检测猪流感H3N2病毒的试剂盒。
[0006] 本发明通过以下技术方案实现上述目的：
[0007] -种检测猪流感病毒H3N2的试剂盒，包括以下组分：
[0008] 1)检测H3NA的HA基因的引物和分子信标探针，引物核苷酸序列如SEQ:NO: 1-2所 示；分子信标探针核苷酸序列如SEQ:N0:5所示，该序列5'端标记有发光的报告荧光基团 FAM，3'端标记有不发光的淬灭基团Dabcyle ;
[0009] 2)检测H3NA的NA基因的引物和分子信标探针；引物核苷酸序列如SEQ:NO: 3-4 所示；分子信标探针核苷酸序列如SEQ:N0:6所示，该序列5'端标记有发光的报告荧光基团 HEX，3'端标记有不发光的淬灭基团Dabcyle。
[0010] 上述试剂盒还包括RT-PCR反应缓冲液、RT-PCR酶。
[0011] SEQ：N0:1 GATCCTATGGATTTCCTTTGCC
[0012] SEQ ：NO:2 CAAATGTTGCACCTAATGTTGC
[0013] SEQ ：N0:3 GTTATTCTGGTATTTTCTCCGTTG
[0014] SEQ ： NO :4 TCCTCTTTCCTTCCCCTTATC
[0015] SEQ:N0:5 5' -Fam+CAGCG CTTTGTGTTGTTTTGCTGGGTTTCATC CGCTG+Dabcyle-3'
[0016] SEQNO: 65' -Hex+CAGCG AGCTGCATCAATCGGTGCTTTTATGT CGC TG+Dabcyle-3'
[0017] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0018] 采用分子信标实时荧光定量RT-PCR方法，克服了病毒分离操作过程繁琐且不易 鉴定和传统PCR检测速度慢、易污染、扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等缺点， 可以对样品中的病毒含量进行精确的定量检测。本发明的引物和分子信标探针特异性高， 稳定性好，检测准确率高，分子信标诊断试剂盒具有检测快速、灵敏性高、稳定性好、易于定 量、假阳性低等特点，有利于规模化和自动化检测分析。
[0019] 分子信标探针与传统的TaqMan-TAMRACTaqMan-四甲基罗丹明）探针比较具有以 下优势：
[0020] 1.提高灵敏度：发夹结构保证了分子信标的高选择性，只有完全互补的单链DNA 或RNA分子才能引起分子信标的发夹结构完全打开，从而发出荧光，因此它所具有的高选 择性、高灵敏度的优越性。
[0021] 2.提高信噪比：由于采用的非荧光染料作为淬灭分子，因此荧光本底比较低，有 效的降低了背景干扰。
[0022] 3.简化实验：分子信标探针实验优化步骤简单，杂交的稳定性大大提高，重复性 大大提尚。
【附图说明】
[0023] 图1 :分子信标荧光定量PCR标准曲线；
[0024] 图2 :猪流感H3N2病毒分子信标荧光定量PCR方法敏感性实验；
[0025] 图3 :猪流感H3N2病毒H3 (A)、N2 (B)基因分子信标荧光定量PCR方法特异性实验 检测结果曲线图。
【具体实施方式】
[0026] 为便于理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例来进一步阐述本发明。以下 实施例中，"ηΧ"（η表示数字）意为稀释η倍。
[0027] 实施例中使用的生物材料及试剂说明：
[0028] Η3Ν2毒株由哈尔滨兽医研宄所提供；RNA抽提试剂盒购自Promega公司； PMD18-T、反转录用M-MLV、逆转录试剂盒、感受态细胞JM109试剂盒、质粒提取试剂盒和胶 回收试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。
[0029] 实施例1
[0030] 1)设计引物和分子信标探针
[0031] 根据Gen Bank数据库中下载的H3N2亚型SIV的HA、NA基因核苷酸序列，利用DNA Star软件进行同源性分析比较，选出高度保守且特异的核苷酸区域共10段，登录http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/进行BLAST确定其保守性。运用Oligo 6. 0软件对这些保守序列 做碱基组成成分及稳定性等方面分析，并从引物和探针设计等原则综合考虑，最终筛选出2 段最合适的保守序列，该段保守序列位于SIV基因组的HA基因和NA基因的5'非翻译区。 设计的2对特异性引物H3F、H3R、N2F、N2R和2个特异分子信标探针H3P、N2P，引物和探针 均由上海闪晶生物技术公司合成，探针5'端标记的荧光报告基团是FAM和HEX，3'端标 记的荧光淬灭基团为4(二甲基对胺基偶氮苯）苯甲酸（DABCYL)，HA基因目的扩增片段为 106bp，NA基因的扩增片段为85bp。
[0032] H3F GATCCTATGGATTTCCTTTGCC H3R CAAATGTTGCACCTAATGTTGC H3 probe Fam+ CAGCG CTTTGTGTTGTTTTGCTGGGTTTCATC CGCTG+Dabcylc N2F GTTATTCTGGTATTTTCTCCGTTG N2R TCCTCTTTCCTTCCCCTTATC N2probc Hcx+CAGCG AGCTGCATCAATCGGTGCTTTTATGT CGCTG+Dabcylc
[0033] 2)定量标准质粒的构建和制备
[0034] 以提取H3N2猪流感的RNA为模板，按TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3· 0试剂盒 说明书步骤进行反转录，合成cDNA，以cDNA为模板，用H3F/H3R和N2F/N2R引物分别进行 PCR扩增。 H3F GATCCTATGGATTTCCTTTGCC H3R CAAATGTTGCACCTAATGTTGC N2F GTTATTCTGGTATnTCTCCGTTG N2R 丁CCTCTTTCCTTCCCCT「ATC
[0035] 扩增体系如下：
[0036] cDNA IOyL
[0037] 上游引物 H3F/N2F(10yM) 2yL
[0038] 下游引物 H3R/N2R(10yM) 2yL
[0039] Mix ：25 μ L
[0040] ddH20 up to 50 μ L
[0041] 配好体系混匀后，低速离心，将液体全部置于管底，用PCR自动扩增仪进行扩增， 扩增程序如下：
[0042] 94°C预变性 5min ;94°C变性 15sec ;60°C退火 15sec ;72°C延伸 Imin ;30 个循环后 再延伸lOmin。扩增结束后在1. 5%的琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定，将106bp和85bp处的 目的条带切割下来，通过胶回收试剂盒（Omega公司）进行纯化，纯化的目的片段与pMDlS-T 载体 在16°C条件下连接过夜，连接产物转化JM109感受态细胞，挑选单克隆菌落进行扩大 培养并做PCR鉴定，鉴定为阳性的单克隆菌落送大连宝生物技术有限公司进行测序验证， 测序验证正确的单克隆菌落扩大培养。
[0043] 上述鉴定阳性且测序验证正确的单克隆菌液用质粒抽提试剂盒（TAKARAK 司）进行质粒抽提和纯化，紫外分光光度计测定质粒浓度，并根据以下公式换算为质 粒拷贝数。质粒浓度（yg/yL) = OD26tlX稀释倍数X50/1000 ;质粒拷贝数=质粒浓 度X6. 02X 1023mol/1000M，M代表质粒分子量。该质粒便为以下步骤制作标准曲线的定量 标准质粒。
[0044] 3)病毒RNA的提取：
[0045] 取H3N2猪流感病毒尿囊液，按Omega公司RNA小量提取试剂盒使用说明书进行， 步骤如下：
[0046] ①取 560 μ L Buffer AVL 加入 I. 5mL 离心管中；
[0047] ②吸取140 μ L已知阳性病毒样品，加入上述I. 5mL离心管中，漩涡振荡混合均匀， 静置IOmin ;
[0048] ③加560 μ L无水乙醇，漩涡振荡混合均匀；
[0049] ④吸取上一步中的溶液630 μ L小心加入column中，6000 X g离心lmin，弃滤液；
[0050] ⑤重复步骤4 ;
[0051] ⑥加入 500 μ L Buffer AWl，6000 Xg 离心 Imin,弃滤液；
[0052] ⑦加入 500 μ L Buffer AW2,6000 X g 离心 Imin,弃滤液；；
[0053] ⑧将column置回到2mL离心管中，12000Xg离心Imin ;
[0054] ⑨将column置于洁净的I. 5mL离心管（试剂盒内提供）中，在column膜中央加 60yLBuffer AVE，室温静置 lmin，12000Xg 离心 Imin 洗脱 RNA。
[0055] 4)病毒RNA的逆转录：
[0056] 以步骤3)提取的RNA为模板，按TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0试剂盒说明 书进行反转录合成cDNA，反转录体系如下：5 XAMV buffer 4 μ L，dNTP (IOmM) 2 μ L，Random Primer(6-9mer)50pmol，AMV 反转录酶 10U，RNA 样品 I μ g，RNaseInhibitor 20U，加 DEPC H2O至20 μ L。将各试剂混合均匀，置PCR仪中按以下程序进行：
[0057] 30°C 10min，42°C温浴30min，90°C 5min反应结束后-20°C保存，用于荧光定量PCR 检测。
[0058] 5)分子信标焚光定量PCR反应条件的优化：
[0059] 以步骤4)所得的cDNA为模板，通过对反应体系中不同的引物浓度、分子信标探 针浓度等实验结果比较，选择反应灵敏度高、本底荧光信号低、具有典型S型扩增荧光信号 曲线、扩增效率接近1的反应体系。经优化后的25 μ L最佳反应体系为：2x qPCR buffer 12.5yL，SEQN0:l-2 或者 3-4 上下游引物（10pmol/yL)各为 0.5yL，SEQN0:5 或 6 探针 (10pmol/yL)lyL，cDNA lyL，DEPC水补足25yL。将该体系瞬时离心后，按下列反应参 数进行：95°C 3min ;95°C 20S、60°C 15S、72°C 15s，扩增45个循环。扩增过程中收集荧光信 号。
[0060] 猪流感H3N2病毒分子信标荧光定量PCR的检测结果判定：进行荧光定量PCR时设 置阳性对照和阴性对照，阳性对照为定量标准质粒，阴性对照为灭菌水，检测结果若出现典 型的S型扩增曲线，则判定为阳性结果，表明检测样品中含有猪流感H3N2病毒；若检测样品 中不含有猪流感H3N2病毒则无扩增信号。
[0061] 6)分子信标焚光定量PCR标准曲线的建立
[0062] 用无菌双蒸水将步骤2)获得的定量标准质粒稀释至2. 475X 109,2. 475X 108， 2. 475 X 107, 2. 475 X 106, 2. 475 X IO5Copies/ μ L，用步骤5)最优化的体系进行反应，反应条 件按上述优化好的条件进行。检测结束后荧光定量PCR会自动绘制标准曲线（图1)。本检 测方法在2.475\10 9~2.475父105(3〇?168/^&(^1〇11范围内具有良好的线性关系。
[0063] 7)检测灵敏度分析
[0064] 步骤2)获得的定量标准质粒用无菌双蒸水稀释至2. 475Χ 109,2. 475Χ108， 2.475Χ107, 2.475X106,2·475Χ105, 2.475X104,2·475Χ103, 2.475X102， 2. 475 X IO1c0Pies/μ L，用步骤5)最优化的体系进行反应，反应条件按上述优化好的条件 进行检测其灵敏度。通过分析检测结果可以看出，检测灵敏度可达到IO 2拷贝/ UL(图2)。
[0065] 8)特异性分析
[0066] 设定可能存在潜在交叉反应的病毒cDNA为模板（H1、H5、H9亚型SIV、PCV2、CSFV、 PEDV、TGEV、PRRSV)，设定无菌蒸馏水作为阴性对照，H3N2 cDNA作为阳性对照，按上述最优 反应体系和条件进行荧光定量PCR反应，结果显示该检测体系特异性良好，非目标病毒核 酸均没有扩增曲线，只有猪流感H3N2病毒才有良好的扩增曲线（图3)。
[0067] 9)稳定性分析
[0068] 选取3个已知阳性的临床样品，分别进行批内重复检测和批间重复检测。批内重 复实验：将3个已知阳性样品在同一批中进行检测，每个样品设置两个重复，分析同一样品 在批内检测的稳定性；批间重复实验：将3个已知阳性样品分批次检测，每次单独检测一个 样品，样品设置两个重复，比较同一样品在不同批次中检测的稳定性。从下表中的检测结果 分析，可以看出批内变异系数在〇. 63% -1. 14%之间，批间变异系数在1. 09% -1. 46%之 间，所以可以判断出本检测方法稳定性良好。
[0069] 表1 SIV H3基因重复性试验结果
[0070] Table 2 The reproducibility test result of real-time for H3 genes of SIV
[0071]
[0072] 表2 SIV N2基因重复性试验结果
[0073] Table 3 The reproducibility test result of real-time for N2 genes of SIV
[0074]
[0075] 10)临床样品检测
[0076] 对实验室所保存的101份猪流感疑似样品，用建立的荧光定量PCR方法和试剂盒 方法（圣湘生物）进行检测，两者符合率为100%。
【主权项】
1. 一种检测猪流感病毒H3N2的试剂盒，其特征在于，包括以下组分： 1) 检测H3NA的HA基因的引物和分子信标探针，引物核苷酸序列如SEQ:NO: 1-2所示； 分子信标探针核苷酸序列如SEQ:N0:5所不，该序列5'端标记有发光的报告焚光基团FAM， 3'端标记有不发光的淬灭基团Dabcyle; 2) 检测H3NA的NA基因的引物和分子信标探针；引物核苷酸序列如SEQ:NO: 3-4所示； 分子信标探针核苷酸序列如SEQ:N0:6所不，该序列5'端标记有发光的报告焚光基团HEX， 3'端标记有不发光的淬灭基团Dabcyle。2. 根据权利要求1所述的检测猪流感病毒H3N2的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包 括RT-PCR反应缓冲液、RT-PCR酶。3. 检测猪流感病毒H3N2的HA基因的引物，其特征在于，核苷酸序列如SEQ=NO: 1-2所 不O4. 检测猪流感病毒H3N2的NA基因的引物，其特征在于，核苷酸序列如SEQ:N0:3-4所 不O5. -种检测猪流感病毒H3N2的HA基因的分子信标探针，其特征在于，核苷酸序列如 SEQ:NO: 5所不，该序列5'端标记有发光的报告焚光基团FAM，3'端标记有不发光的淬灭基 团Dabcyle。6. -种检测猪流感病毒H3N2的NA基因的分子信标探针，其特征在于，核苷酸序列如 SEQ:N0:6所不，该序列5'端标记有发光的报告焚光基团HEX，3'端标记有不发光的淬灭基 团Dabcyle。
【专利摘要】本发明公开了检测猪流感病毒H3N2的引物、分子信标探针及试剂盒，属于动物病原微生物检测技术领域。本发明的引物和分子信标探针特异性高，稳定性好，检测准确率高，分子信标诊断试剂盒具有检测快速、灵敏性高、稳定性好、易于定量、假阳性低等特点，有利于规模化和自动化检测分析。采用分子信标实时荧光定量RT-PCR方法，克服了病毒分离操作过程繁琐且不易鉴定和传统RT-PCR检测速度慢、易污染、扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等缺点。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/70, C12N15/11
【公开号】CN104894296
【申请号】CN201510344788
【发明人】禹思宇, 周宇, 唐连飞, 梁斌, 朱中武
【申请人】湖南出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月19日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物病原微生物检测技术领域，具体涉及一种检测猪流感病毒H3N2 的引物、分子信标探针及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 猪流感（swine influenza，SI)是甲型（A型）流感病毒引起的猪或人的一种急 性、人畜共患呼吸道传染性疾病。目前已经发现流感病毒的HA有16个亚型，NA有9个亚 型，已从猪体内分离到 H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H2N3、H3N1、H3N6、H4N6、H5N1、H5N2 和 H9N2 等11种不同亚型的SIV。近几年流行病学的研宄结果表明：我国猪群中存在H1N1、H1N2、 H3N2、H5N1和H9N2等病毒的感染，其中以H3N2和HlNl亚型流行和危害比较严重。流行 于世界范围内猪群中的H3N2亚型SI都是由类人型H3N2亚型毒株引起的，与此同时，人 类流感的暴发与SI的流行存在惊人的平行性和相关性，种种迹象表明，H3N2亚型SIV与 同时期引起人流感大流行的同亚型流感病毒之间遗传关系十分紧密。因此，建立H3N2亚 型SIV的快速检测方法不仅在兽医学领域具有重要意义，而且对人流感的研宄也有借鉴作 用。
[0003] 要实现对H3N2流感突变株快速检测，最快捷可行的是对病毒的核酸进行检测，目 前使用最多的是荧光定量RT-PCR方法。本发明结合分子信标技术建立猪H3N2流感的荧光 定量RT-PCR方法。不同亚型的猪流感病毒，致病性差异很大，使用传统方法或不能快速、准 确的检测出疫病，或无法对病毒进行分型。本发明结合分子信标方法对流感病毒进行分型， 采用该技术，即使出现新的流感病毒，通过改变分子信标探针，对新的流感毒株进行识别， 这对于流感病毒检测功能是非常强大的。
[0004] 分子信标是设计最为巧妙的探针，由一段包含了茎环结构的单链寡核苷酸组成， 形成一个发夹型结构。在其环状部分，一般是一段长度为15~30碱基的序列，能与目标分 子特异结合，茎区是长度为5~8碱基的互补序列，茎区的两端分别连接有荧光基团和淬灭 基团。发夹结构保证了分子信标的高选择性，只有完全互补的单链DNA或RNA分子才能引 起分子信标的发夹结构完全打开，从而发出荧光，因此分子信标具备高度的特异性，在检测 快速变异的病毒时非常有优势，在病毒分型时也是功能强大的工具。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种检测猪流感H3N2病毒 的HA和NA基因的引物；另外提供一种检测猪流感H3N2病毒的HA和NA基因的分子信标探 针；以及提供一种检测猪流感H3N2病毒的试剂盒。
[0006] 本发明通过以下技术方案实现上述目的：
[0007] -种检测猪流感病毒H3N2的试剂盒，包括以下组分：
[0008] 1)检测H3NA的HA基因的引物和分子信标探针，引物核苷酸序列如SEQ:NO: 1-2所 示；分子信标探针核苷酸序列如SEQ:N0:5所示，该序列5'端标记有发光的报告荧光基团 FAM，3'端标记有不发光的淬灭基团Dabcyle ;
[0009] 2)检测H3NA的NA基因的引物和分子信标探针；引物核苷酸序列如SEQ:NO: 3-4 所示；分子信标探针核苷酸序列如SEQ:N0:6所示，该序列5'端标记有发光的报告荧光基团 HEX，3'端标记有不发光的淬灭基团Dabcyle。
[0010] 上述试剂盒还包括RT-PCR反应缓冲液、RT-PCR酶。
[0011] SEQ：N0:1 GATCCTATGGATTTCCTTTGCC
[0012] SEQ ：NO:2 CAAATGTTGCACCTAATGTTGC
[0013] SEQ ：N0:3 GTTATTCTGGTATTTTCTCCGTTG
[0014] SEQ ： NO :4 TCCTCTTTCCTTCCCCTTATC
[0015] SEQ:N0:5 5' -Fam+CAGCG CTTTGTGTTGTTTTGCTGGGTTTCATC CGCTG+Dabcyle-3'
[0016] SEQNO: 65' -Hex+CAGCG AGCTGCATCAATCGGTGCTTTTATGT CGC TG+Dabcyle-3'
[0017] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0018] 采用分子信标实时荧光定量RT-PCR方法，克服了病毒分离操作过程繁琐且不易 鉴定和传统PCR检测速度慢、易污染、扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等缺点， 可以对样品中的病毒含量进行精确的定量检测。本发明的引物和分子信标探针特异性高， 稳定性好，检测准确率高，分子信标诊断试剂盒具有检测快速、灵敏性高、稳定性好、易于定 量、假阳性低等特点，有利于规模化和自动化检测分析。
[0019] 分子信标探针与传统的TaqMan-TAMRACTaqMan-四甲基罗丹明）探针比较具有以 下优势：
[0020] 1.提高灵敏度：发夹结构保证了分子信标的高选择性，只有完全互补的单链DNA 或RNA分子才能引起分子信标的发夹结构完全打开，从而发出荧光，因此它所具有的高选 择性、高灵敏度的优越性。
[0021] 2.提高信噪比：由于采用的非荧光染料作为淬灭分子，因此荧光本底比较低，有 效的降低了背景干扰。
[0022] 3.简化实验：分子信标探针实验优化步骤简单，杂交的稳定性大大提高，重复性 大大提尚。
【附图说明】
[0023] 图1 :分子信标荧光定量PCR标准曲线；
[0024] 图2 :猪流感H3N2病毒分子信标荧光定量PCR方法敏感性实验；
[0025] 图3 :猪流感H3N2病毒H3 (A)、N2 (B)基因分子信标荧光定量PCR方法特异性实验 检测结果曲线图。
【具体实施方式】
[0026] 为便于理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例来进一步阐述本发明。以下 实施例中，"ηΧ"（η表示数字）意为稀释η倍。
[0027] 实施例中使用的生物材料及试剂说明：
[0028] Η3Ν2毒株由哈尔滨兽医研宄所提供；RNA抽提试剂盒购自Promega公司； PMD18-T、反转录用M-MLV、逆转录试剂盒、感受态细胞JM109试剂盒、质粒提取试剂盒和胶 回收试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。
[0029] 实施例1
[0030] 1)设计引物和分子信标探针
[0031] 根据Gen Bank数据库中下载的H3N2亚型SIV的HA、NA基因核苷酸序列，利用DNA Star软件进行同源性分析比较，选出高度保守且特异的核苷酸区域共10段，登录http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/进行BLAST确定其保守性。运用Oligo 6. 0软件对这些保守序列 做碱基组成成分及稳定性等方面分析，并从引物和探针设计等原则综合考虑，最终筛选出2 段最合适的保守序列，该段保守序列位于SIV基因组的HA基因和NA基因的5'非翻译区。 设计的2对特异性引物H3F、H3R、N2F、N2R和2个特异分子信标探针H3P、N2P，引物和探针 均由上海闪晶生物技术公司合成，探针5'端标记的荧光报告基团是FAM和HEX，3'端标 记的荧光淬灭基团为4(二甲基对胺基偶氮苯）苯甲酸（DABCYL)，HA基因目的扩增片段为 106bp，NA基因的扩增片段为85bp。
[0032] H3F GATCCTATGGATTTCCTTTGCC H3R CAAATGTTGCACCTAATGTTGC H3 probe Fam+ CAGCG CTTTGTGTTGTTTTGCTGGGTTTCATC CGCTG+Dabcylc N2F GTTATTCTGGTATTTTCTCCGTTG N2R TCCTCTTTCCTTCCCCTTATC N2probc Hcx+CAGCG AGCTGCATCAATCGGTGCTTTTATGT CGCTG+Dabcylc
[0033] 2)定量标准质粒的构建和制备
[0034] 以提取H3N2猪流感的RNA为模板，按TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3· 0试剂盒 说明书步骤进行反转录，合成cDNA，以cDNA为模板，用H3F/H3R和N2F/N2R引物分别进行 PCR扩增。 H3F GATCCTATGGATTTCCTTTGCC H3R CAAATGTTGCACCTAATGTTGC N2F GTTATTCTGGTATnTCTCCGTTG N2R 丁CCTCTTTCCTTCCCCT「ATC
[0035] 扩增体系如下：
[0036] cDNA IOyL
[0037] 上游引物 H3F/N2F(10yM) 2yL
[0038] 下游引物 H3R/N2R(10yM) 2yL
[0039] Mix ：25 μ L
[0040] ddH20 up to 50 μ L
[0041] 配好体系混匀后，低速离心，将液体全部置于管底，用PCR自动扩增仪进行扩增， 扩增程序如下：
[0042] 94°C预变性 5min ;94°C变性 15sec ;60°C退火 15sec ;72°C延伸 Imin ;30 个循环后 再延伸lOmin。扩增结束后在1. 5%的琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定，将106bp和85bp处的 目的条带切割下来，通过胶回收试剂盒（Omega公司）进行纯化，纯化的目的片段与pMDlS-T 载体 在16°C条件下连接过夜，连接产物转化JM109感受态细胞，挑选单克隆菌落进行扩大 培养并做PCR鉴定，鉴定为阳性的单克隆菌落送大连宝生物技术有限公司进行测序验证， 测序验证正确的单克隆菌落扩大培养。
[0043] 上述鉴定阳性且测序验证正确的单克隆菌液用质粒抽提试剂盒（TAKARAK 司）进行质粒抽提和纯化，紫外分光光度计测定质粒浓度，并根据以下公式换算为质 粒拷贝数。质粒浓度（yg/yL) = OD26tlX稀释倍数X50/1000 ;质粒拷贝数=质粒浓 度X6. 02X 1023mol/1000M，M代表质粒分子量。该质粒便为以下步骤制作标准曲线的定量 标准质粒。
[0044] 3)病毒RNA的提取：
[0045] 取H3N2猪流感病毒尿囊液，按Omega公司RNA小量提取试剂盒使用说明书进行， 步骤如下：
[0046] ①取 560 μ L Buffer AVL 加入 I. 5mL 离心管中；
[0047] ②吸取140 μ L已知阳性病毒样品，加入上述I. 5mL离心管中，漩涡振荡混合均匀， 静置IOmin ;
[0048] ③加560 μ L无水乙醇，漩涡振荡混合均匀；
[0049] ④吸取上一步中的溶液630 μ L小心加入column中，6000 X g离心lmin，弃滤液；
[0050] ⑤重复步骤4 ;
[0051] ⑥加入 500 μ L Buffer AWl，6000 Xg 离心 Imin,弃滤液；
[0052] ⑦加入 500 μ L Buffer AW2,6000 X g 离心 Imin,弃滤液；；
[0053] ⑧将column置回到2mL离心管中，12000Xg离心Imin ;
[0054] ⑨将column置于洁净的I. 5mL离心管（试剂盒内提供）中，在column膜中央加 60yLBuffer AVE，室温静置 lmin，12000Xg 离心 Imin 洗脱 RNA。
[0055] 4)病毒RNA的逆转录：
[0056] 以步骤3)提取的RNA为模板，按TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0试剂盒说明 书进行反转录合成cDNA，反转录体系如下：5 XAMV buffer 4 μ L，dNTP (IOmM) 2 μ L，Random Primer(6-9mer)50pmol，AMV 反转录酶 10U，RNA 样品 I μ g，RNaseInhibitor 20U，加 DEPC H2O至20 μ L。将各试剂混合均匀，置PCR仪中按以下程序进行：
[0057] 30°C 10min，42°C温浴30min，90°C 5min反应结束后-20°C保存，用于荧光定量PCR 检测。
[0058] 5)分子信标焚光定量PCR反应条件的优化：
[0059] 以步骤4)所得的cDNA为模板，通过对反应体系中不同的引物浓度、分子信标探 针浓度等实验结果比较，选择反应灵敏度高、本底荧光信号低、具有典型S型扩增荧光信号 曲线、扩增效率接近1的反应体系。经优化后的25 μ L最佳反应体系为：2x qPCR buffer 12.5yL，SEQN0:l-2 或者 3-4 上下游引物（10pmol/yL)各为 0.5yL，SEQN0:5 或 6 探针 (10pmol/yL)lyL，cDNA lyL，DEPC水补足25yL。将该体系瞬时离心后，按下列反应参 数进行：95°C 3min ;95°C 20S、60°C 15S、72°C 15s，扩增45个循环。扩增过程中收集荧光信 号。
[0060] 猪流感H3N2病毒分子信标荧光定量PCR的检测结果判定：进行荧光定量PCR时设 置阳性对照和阴性对照，阳性对照为定量标准质粒，阴性对照为灭菌水，检测结果若出现典 型的S型扩增曲线，则判定为阳性结果，表明检测样品中含有猪流感H3N2病毒；若检测样品 中不含有猪流感H3N2病毒则无扩增信号。
[0061] 6)分子信标焚光定量PCR标准曲线的建立
[0062] 用无菌双蒸水将步骤2)获得的定量标准质粒稀释至2. 475X 109,2. 475X 108， 2. 475 X 107, 2. 475 X 106, 2. 475 X IO5Copies/ μ L，用步骤5)最优化的体系进行反应，反应条 件按上述优化好的条件进行。检测结束后荧光定量PCR会自动绘制标准曲线（图1)。本检 测方法在2.475\10 9~2.475父105(3〇?168/^&(^1〇11范围内具有良好的线性关系。
[0063] 7)检测灵敏度分析
[0064] 步骤2)获得的定量标准质粒用无菌双蒸水稀释至2. 475Χ 109,2. 475Χ108， 2.475Χ107, 2.475X106,2·475Χ105, 2.475X104,2·475Χ103, 2.475X102， 2. 475 X IO1c0Pies/μ L，用步骤5)最优化的体系进行反应，反应条件按上述优化好的条件 进行检测其灵敏度。通过分析检测结果可以看出，检测灵敏度可达到IO 2拷贝/ UL(图2)。
[0065] 8)特异性分析
[0066] 设定可能存在潜在交叉反应的病毒cDNA为模板（H1、H5、H9亚型SIV、PCV2、CSFV、 PEDV、TGEV、PRRSV)，设定无菌蒸馏水作为阴性对照，H3N2 cDNA作为阳性对照，按上述最优 反应体系和条件进行荧光定量PCR反应，结果显示该检测体系特异性良好，非目标病毒核 酸均没有扩增曲线，只有猪流感H3N2病毒才有良好的扩增曲线（图3)。
[0067] 9)稳定性分析
[0068] 选取3个已知阳性的临床样品，分别进行批内重复检测和批间重复检测。批内重 复实验：将3个已知阳性样品在同一批中进行检测，每个样品设置两个重复，分析同一样品 在批内检测的稳定性；批间重复实验：将3个已知阳性样品分批次检测，每次单独检测一个 样品，样品设置两个重复，比较同一样品在不同批次中检测的稳定性。从下表中的检测结果 分析，可以看出批内变异系数在〇. 63% -1. 14%之间，批间变异系数在1. 09% -1. 46%之 间，所以可以判断出本检测方法稳定性良好。
[0069] 表1 SIV H3基因重复性试验结果
[0070] Table 2 The reproducibility test result of real-time for H3 genes of SIV
[0071]
[0072] 表2 SIV N2基因重复性试验结果
[0073] Table 3 The reproducibility test result of real-time for N2 genes of SIV
[0074]
[0075] 10)临床样品检测
[0076] 对实验室所保存的101份猪流感疑似样品，用建立的荧光定量PCR方法和试剂盒 方法（圣湘生物）进行检测，两者符合率为100%。
【主权项】
1. 一种检测猪流感病毒H3N2的试剂盒，其特征在于，包括以下组分： 1) 检测H3NA的HA基因的引物和分子信标探针，引物核苷酸序列如SEQ:NO: 1-2所示； 分子信标探针核苷酸序列如SEQ:N0:5所不，该序列5'端标记有发光的报告焚光基团FAM， 3'端标记有不发光的淬灭基团Dabcyle; 2) 检测H3NA的NA基因的引物和分子信标探针；引物核苷酸序列如SEQ:NO: 3-4所示； 分子信标探针核苷酸序列如SEQ:N0:6所不，该序列5'端标记有发光的报告焚光基团HEX， 3'端标记有不发光的淬灭基团Dabcyle。2. 根据权利要求1所述的检测猪流感病毒H3N2的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包 括RT-PCR反应缓冲液、RT-PCR酶。3. 检测猪流感病毒H3N2的HA基因的引物，其特征在于，核苷酸序列如SEQ=NO: 1-2所 不O4. 检测猪流感病毒H3N2的NA基因的引物，其特征在于，核苷酸序列如SEQ:N0:3-4所 不O5. -种检测猪流感病毒H3N2的HA基因的分子信标探针，其特征在于，核苷酸序列如 SEQ:NO: 5所不，该序列5'端标记有发光的报告焚光基团FAM，3'端标记有不发光的淬灭基 团Dabcyle。6. -种检测猪流感病毒H3N2的NA基因的分子信标探针，其特征在于，核苷酸序列如 SEQ:N0:6所不，该序列5'端标记有发光的报告焚光基团HEX，3'端标记有不发光的淬灭基 团Dabcyle。
【专利摘要】本发明公开了检测猪流感病毒H3N2的引物、分子信标探针及试剂盒，属于动物病原微生物检测技术领域。本发明的引物和分子信标探针特异性高，稳定性好，检测准确率高，分子信标诊断试剂盒具有检测快速、灵敏性高、稳定性好、易于定量、假阳性低等特点，有利于规模化和自动化检测分析。采用分子信标实时荧光定量RT-PCR方法，克服了病毒分离操作过程繁琐且不易鉴定和传统RT-PCR检测速度慢、易污染、扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等缺点。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/70, C12N15/11
【公开号】CN104894296
【申请号】CN201510344788
【发明人】禹思宇, 周宇, 唐连飞, 梁斌, 朱中武
【申请人】湖南出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月19日
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