微量起始dna的高通量测序文库构建方法及其所构建的高通量测序文库的制作方法
微量起始dna的高通量测序文库构建方法及其所构建的高通量测序文库的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及高通量测序领域，具体而言，涉及一种微量起始DNA的高通量测序文 库构建方法及其所构建的高通量测序文库。
【背景技术】
[0002] 生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研宄有着十分重要的意义。第一代 测序仪对电泳分离技术的依赖，使其难以进一步提高分析的速度和并行化程度，也难以 通过微型化降低测序成本。经过不断的技术开发和改进，21世纪初，以Roche454技术、 illumina公司的Genome Analyzer技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技 术诞生了。第二代技术大大降低了测序成本，还大幅度提高了测序速度并保持了高准确 性。其中，illumina公司的第一台测序仪于2006年问世，之后开发出来一系列的测序仪，如 Hiseq2000、Hiseq2500、Miseq、Hiseq X等，在准确性、通量、成本和速度方面表现更优秀，而 使其成为全球使用量最大的第二代测序仪。在第二代测序平台不断完善的同时，以对单分 子DNA进行非PCR测序为主要特征的第三代测序技术也初显端倪。但由于其关键技术问题 尚待解决，目前还未得到广泛应用。
[0003] 近几年来，包括人、拟南芥以及水稻等越来越多的基因组被测序，全基因组测序为 重要基因的克隆、基因的系统进化和基因组学研宄提供了坚实的平台。但依然有部分珍贵 物种由于样本较少获取难度大，或者个体较小获得的基因组浓度较低等原因，得到的基因 组DNA少（低于50ng)，按照目前现有的建库流程和方法，建库难度非常大。
[0004] 目前针对低起始量DNA的建库方法主要有转座酶建库和普通流程建库，转座酶建 库主要是利用转座酶随机切割基因组DNA，并在片段两端加上接头，然后进行扩增建库，该 方法是一种高效的低起始量建库方法。但这种建库方法有一个较为明显的缺点，就是其使 用转座酶随机切割打断过程中易受到样本中杂质的干扰，导致打断建库失败。而普通流程 建库无法进行低于20ng的建库，在起始量为50ng时，在后期扩增时扩增循环数较高，需要 达到18-25个循环，文库库容较低，质量较差，且建库成功率只有30 %左右。
[0005] 如上所述，转座酶切割打断建库的方法易受到样本质量的影响，导致切割打断失 败，基因组无法正常片段化，在后续扩增中无法得到有效扩增。而普通流程建库无法进行低 于20ng的建库，在起始量为50ng时，建库成功率为30%，且文库质量较差，库容低，信息分 析结果显示片段重复较高。
[0006] 因此，仍需要对现有技术进行改进，以改善现有的微量起始样本建库成功率较低 的缺陷。
【发明内容】
[0007] 本发明的主要目的在于提供一种微量起始DNA的高通量测序文库构建方法及其 所构建的高通量测序文库，以改善现有技术中微量起始样本建库成功率较低的缺陷。
[0008] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种微量起始DNA的高通量 测序文库构建方法，该构建方法包括：步骤Sl，对样本DNA进行物理打断，得到片段化DNA ; 步骤S2,对片段化DNA进行末端修复及加 A，得到修复DNA ;步骤S3,利用连接增强剂对修复 DNA进行接头连接，得到带接头片段；以及步骤S4,对带接头片段进行扩增，得到高通量测 序文库；其中，增强剂为DMSO、乙醇、乙二醇或甘油。
[0009] 进一步地，在步骤S2中，利用高通量测序文库构建试剂盒中的修复酶混合物进行 修复，高通量测序文库构建试剂盒中的修复酶混合物包括dNTPs、T4DNA聚合酶、T4PNK和 Klenow酶或Taq酶，并在修复过程中向修复酶混合物中添加 dATP。
[0010] 进一步地，高通量测序文库构建试剂盒包括NEB公司的DNA文库构建试剂盒、BiOO 公司的DNA文库构建试剂盒或诺唯赞公司的DNA文库构建试剂盒。
[0011] 进一步地，在修复过程中向修复酶混合物中添加小于等于0. 4 μ I IOOmM的dATP。
[0012] 进一步地，在步骤S3之后以及步骤S4之前，构建方法还包括对带接头片段进行磁 珠纯化的步骤。
[0013] 进一步地，步骤S4包括：对连接片段进行分步扩增，并在每次扩增之后增加磁珠 纯化的步骤，得到高通量测序文库。
[0014] 进一步地，步骤S4包括：对带接头片段扩增4~7个循环，得到第一扩增片段；对 第一扩增片段进行〇. 95~1. 20倍体积的磁珠纯化，得到第一扩增纯化片段；对第一扩增纯 化片段扩增6~9个循环，得到第二扩增片段；对第二扩增片段进行0. 95~1. 20倍体积的 磁珠纯化，得到第二扩增纯化片段；以及利用0. 7~0. 85倍体积的磁珠对第二扩增纯化片 段进行分选，得到高通量测序文库。
[0015] 根据本发明的另一方面，提供了一种高通量测序文库，该高通量测序文库采用上 述任一种构建方法构建而成。
[0016] 进一步地，高通量测序文库的库容为50~500ng。
[0017] 应用本发明的技术方案，通过在接头连接的步骤中添加具有连接增强作用的小分 子物质，利用这些小分子物质刺激连接酶的活性中心区域，使得其连接活性增强，提高接头 连接效率，使得更多的修复DNA片段被成功连上接头序列，进而通过与接头序列互补的引 物进行扩增，进而得到了目的扩增片段含量更多的高通量测序文库；从而提高了微量起始 量样本（可低至1~IOng)的测序成功率及库容。
【附图说明】
[0018] 构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示 意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0019] 图1示出了根据本发明的优选实施例中以Ing DNA作为起始DNA所构建的文库的 插入片段的大小检测结果图；以及
[0020] 图2示出了图1所示的优选实施例所构建的文库经上机测序后经数据分析得到的 不同插入片段占整个测序数据比例的结果图。
【具体实施方式】
[0021] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相 互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
[0022] 针对【背景技术】部分提到的现有微量起始样本建库成功率低的技术问题，在本发明 一种典型的实施方式中，提供了一种高通量测序文库的构建方法，该构建方法包括：对样本 DNA进行物理打断，得到片段化DNA ;对片段化DNA进行末端修复及加 A，得到修复DNA ;利用 连接增强剂对修复DNA进行接头连接，得到带接头片段；对带接头片段进行扩增，得到高通 量测序文库，其中连接增加剂为DMSO、乙醇、乙二醇或甘油。
[0023] 本发明的上述文库构建方法，在上述接头连接的步骤中通过添加具有连接增强作 用的小分子物质，利用这些小分子物质刺激连接酶的活性中心区域，使得其连接活性增强， 提高接头连接效率，使得更多的修复DNA片段被成功连上接头序列，进而通过与接头序列 互补的引物进行扩增，进而得到了目的扩增片段量更多的高通量测序文库。
[0024] 在上述优选的实施例中，连接增强剂的作用是增加连接酶的连接活性，因而，任何 具有上述活性的试剂均适用于本发明。在本发明中，上述连接增强剂优选但不仅限于DMSO、 乙醇、乙二醇或甘油。
[0025] 在上述文库构建方法中，为了进一步提高建库成功率及稳定性，在本发明一种优 选的实施例中，在利用现有文库构建试剂盒中的修复酶混合物进行修复的过程中，向反应 体系中添加 dATP来进行末端修复加 A。
[0026] 上述优选实施例中，在末端修复加 A的步骤中，在常规的用修复酶混合的基础上， 通过在末端修复加 A步骤中额外增加 dATP的用量，提高了加 A的效率，进而得到更多修复 后3'末端加 A的修复片段，更多修复后3'末端加 A的修复片段经后续接头连接及扩增 步骤，使得所构建得到的高通量测序文库具有更多的目的片段，进而提高了低起始量样本 (可低至1~IOng)的测序成功率及库容。
[0027] 由于现有的文库构建方法大都采用市售试剂盒进行上述修复和加 A步骤，其中 dNTP中dATP以及其他dCTP、dGTP和dTTP的都是按照等比例直接混合而成的产品，而且还 是与修复酶混合在一起的产品。比如NEB公司的DNA文库构建试剂盒、Bioo公司的DNA文 库构建试剂盒或诺唯赞公司的DNA文库构建试剂盒。也就是说，通常在进行该步操作时，不 会对其中的dNTP或者某一种脱氧核糖核苷酸的用量进行特意调整，而是直接采用试剂盒 中的推荐用量，或者将修复酶混合物作为一个整体在用量上进行适当调整。
[0028] 而在本发明中，发明人意外发现，在采用试剂盒或者按照现有的dNTP和dATP的用 量在进行上述步骤时，额外增加 dATP 的用量能显著增加片段化的修复后加 A的片段的量， 即提高了加 A效率。在本发明一种优选的实施例中，额外增加的dATP的用量为小于等于 〇. 4 μ 1。发明人发现，只要在试剂盒的修复酶混合物的基础上，额外增加 dATP，其加 A效率 就能明显提升，而当额外增加的dATP的量达到0. 4 μ 1后，提高加 A效率的不再显著，因而， 增加的dATP的量在上述范围内不仅提高建库成功率，而且提高了所构建的高通量测序文 库的库容。
[0029] 在上述优选实施例的基础上，为了进一步提高建库成功率并提高库容，在本发明 另一种优选的实施例中，在得到上述连接片段以及对连接片段进行扩增之前，该构建方法 还包括对连接片段进行磁珠纯化的步骤，磁珠纯化步骤中所使用的XP磁珠的体积为连接 片段体积的1. 15~1. 25倍。
[0030] 在接头连接的步骤，为了使修复片段尽可能多地连上接头序列，通常使用过量的 接头序列，因而在接头连接步骤之后，会有部分过剩的未连上修复片段的接头序列。在对连 上接头的连接片段进行扩增之前，增加上述磁珠纯化的步骤，有助于将大部分多余的未连 上片段的接头去除，减少后续对扩增步骤的不利影响，提高目的片段的有效扩增，进而提高 所得文库中的目的片段的含量。
[0031] 上述优选实施例中，纯化步骤中所用到的磁珠的用量，可以在现有的磁珠纯化 不同大小的片段磁珠的用量范围的基础上进行适当调整即可得到。本发明中优选使用 1. 15~1. 25倍体积的磁珠用量具有纯化效果相对较好的效果。更优选地，使用1. 2倍体积 用量的磁珠对连接片段进行纯化。
[0032] 上述构建方法中，对连接片段进行扩增，得到高通量测序文库的步骤采用现有技 术的方法进行操作即可。为了更有效地提高文库构建的成功率和所构建的文库的库容，在 本发明又一种优选的实施例中，该步骤包括：对连接片段进行多次扩增，并在每次扩增之后 增加磁珠纯化的步骤。
[0033] 通过将现有技术的一次扩增步骤分为多次，并在多次扩增之间增加对每次的扩增 产物进行纯化的步骤，使得扩增产物更纯，目的片段的扩增效率更高，进而提高了建库成功 率，同时也能相应地提高文库的库容。
[0034] 在本发明一种更优选的实施例中，上述对连接片段进行扩增，得到高通量测序文 库的步骤包括：对连接片段进行2次扩增，并在每次扩增之后增加0. 95~1. 05倍体积的 磁珠纯化的步骤。进行2次扩增，操作步骤相对简单不繁琐，而且提高了目的片段的扩增效 率。而用0. 95~1. 05倍体积的磁珠对扩增产物进行第一次纯化，能够有效去除初次扩增 步骤中大量产生的接头，使得后期目的片段得到有效扩增。而采用上述用量的磁珠进行第 二次纯化，能够除去小于270bp以下的小片段，进一步提高了目的片段的含量。
[0035] 在本发明又一种优选的实施例中，对连接片段进行扩增，得到高通量测序文库的 步骤包括：对连接片段扩增4~7个循环，得到第一扩增片段；对第一扩增片段进行0. 95~ 1. 05倍体积的磁珠纯化，得到第一扩增纯化片段；对第一扩增纯化片段扩增5~11个循 环，得到第二扩增片段；对第二扩增片段进行0. 95~1. 05倍体积的磁珠纯化，得到第二扩 增纯化片段；利用〇. 6~0. 9倍体积的磁珠对第二扩增纯化片段进行分选，得到高通量测序 文库。
[0036] 上述优选实施例中，通过将第一次循环的次数限定在4~7次内，第二次循环的次 数限定在5~11次内，并在两次扩增之后采用0. 95~1. 05倍体积的磁珠纯化进行纯化扩 增产物，使得目的大小的片段的含量相对更高。并且，在第二次纯化之后，又利用〇. 6~0. 9 倍体积的磁珠对纯化片段的大小进行筛选，从而得到目的片段大小含量较高的高通量测序 文库。
[0037] 在本发明一种更优选的实施例中，上述对连接片段进行扩增，得到高通量测序文 库的步骤包括：对连接片段扩增6个循环，得到第一扩增片段；对第一扩增片段进行1倍体 积的磁珠纯化，得到第一扩增纯化片段；对第一扩增纯化片段扩增6~9个循环，得到第二 扩增片段；对第二扩增片段进行1倍体积的磁珠纯化，得到第二扩增纯化片段；利用〇. 7~ 0. 85倍体积的磁珠对第二扩增纯化片段进行分选，得到高通量测序文库。
[0038] 在上述更优选的实施例中，对总扩增循环数在12~15个内的扩增步骤，按照上述 方式进行扩增，不仅能够提高建库的成功率，使得所构建的文库的插入片段在300~600bp 之间，而且能够更显著地提高高通量测序文库的库容。
[0039] 在上述扩增步骤中，为了减少扩增所带来的碱基误差，尽量采用高保真酶进行扩 增。本发明优选但不仅限于采用Kapa高保真酶。Kapa高保真酶活性较高且稳定，保真性 好。
[0040] 在本发明另一种典型的实施方式中，提供了一种高通量测序文库，该高通量测序 文库采用上述任一种构建方法构建而成。相比现有技术的方法所构建的文库，由上述构建 方法构建而成的高通量测序文库的库容为50ng~500ng。具有上述库容的文库，测序产出 的有效数据量较高，进而相对减少测序成本。
[0041] 下面将结合具体的实施例来进一步说明本发明的有益效果。
[0042] 本发明以拟南芥基因组DNA标准品作为实验材料，以NEB建库试剂盒作为建库试 剂盒进行实验，具体实验步骤如下：
[0043] 1.取拟南芥基因组DNA的标准品，稀释100倍，振荡混匀，用Qbuit精确测定浓度。
[0044] 2.按测定的浓度计算lng、2ng、5ng和IOng所需要添加的体积，加水（NFW)至 55 μ 1 〇
[0045] 3.使用Covaris S220超声打断样本，Ing和2ng的样品的超声时间为lmin，5ng 样品的超声时间为2min ;10ng样品的超声时间为3min。
[0046] 4.使用NEB标准建库试剂盒进行末端修复和加 A，体系中额外补加 dATP，具体反应 体系如下：
[0047] 片段化DNA 55.2μ1
[0048] NEBNext末端修复缓冲液（IOX) 6.5 μΙ NEBNext末端修复酶混合物 3 μL dATP(!00 mM) 0.3μ1 总体积 65 μL
[0049] 反应程序如下：
[0050] 20 〇C 30min
[0051] 65 °C 30min
[0052] 4 °C Hold。
[0053] 对IOng的片段化DNA，在用5 μ I NEBNext末端修复缓冲液（IOX)、3 μ I NEBNext 末端修复酶混合物混合均匀后，再额外添加〇. 4 μ 1的dATP (IOOmM)，混合后置于设置有上 述反应程序的加热反应器中（Block中）进行修复加 A反应。
[0054] 5.反应结束后将样本放置于冰上，进行下一步连接反应，额外补加 DMSO作为连接 酶增强剂（IOng的样品用乙醇代替），反应体系如下所示：
[0055] 平末端/TA连接酶混和物 15 μL 接头（15μΜ) 0.5μ1 连接增强剂 ΙμL DMSO 1,6μ1 总体积 ?β μL
[0056] 反应程序如下：
[0057] 20°C 反应 60min。
[0058] 6.将连接后的产物进行1. 2倍XP磁珠纯化，纯化后的样本使用kapa高保真酶进 行扩增（Ing样品为7个循环，2ng样品为6个循环，5ng和IOng为4个循环），反应程序如 下：
[0059] 步骤I :98°C预变性30s ;步骤2 :98°C变性IOs ;步骤3 :65°C退火30s ;步骤4 : 72°C延伸30s ;步骤5 :重复步骤2~4,6次；步骤6 :72°C延伸5min ;步骤7 :4°C结束。
[0060] 7.将扩增后的产物使用XP磁珠纯化（Ing样品为1. 20倍体积的XP磁珠，2ng样 品为1倍体积的XP磁珠，5ng样品为0. 95倍体积的XP磁珠），将得到的纯化产物使用kapa 高保真酶扩增6-9个循环（Ing和2ng样品为9个循环，5ng样品为8个循环；IOng样品为 6个循环），反应程序如下：
[0061] 步骤I :98°C预变性30s ;步骤2 :98°C变性IOs ;步骤3 :65°C退火30s ;步骤4 : 72°C延伸30s ;步骤5 :重复步骤2~4,6~9次；步骤6 :72°C延伸5min ;步骤7 :4°C结束。
[0062] 8.将扩增后的产物使用XP磁珠纯化（Ing样品为1. 20倍体积的XP磁珠，2ng样品 为1倍体积的XP磁珠，5ng样品为0. 95倍体积的XP磁珠），将得到的纯化产物使用0. 7~ 0. 85倍XP磁珠进行片段分选，即在0. 7倍磁珠纯化时留上清，补加至0. 85倍XP磁珠，纯化 得到三个文库。
[0063] 对上述三个文库的目的 插入片段进行检。其中，图1为Ing起始DNA所构建的文 库在2100检测仪上检测的峰图。从图1中可以看出，文库片段分布集中与300-600bp。图 2为该文库上机测序后，对数据进行信息分析，评估出该文库中不同插入片段占整个数据比 例，从图2中可以看到主峰位置位于300bp左右。
[0064] 同时，构建好的三个起始量的样品的体积为15 μ 1，然后用Qubit进行了浓度检 测，具体分别为5. 67ng/ μ l、15ng/ μ l、9ng/ μ 1和33. 67ng/ μ 1。因此，Ing样品所构建的 文库的库容为85ng ;2ng样品所构建的文库的库容为225ng ;5ng样品所构建的文库的库容 为135ng ; IOng样品所构建的文库的库容为505ng。可见，当起始样本量为Ing时，采用本 发明的构建方法所构建的文库的库容都大于50ng。而且，l-2ng起始DNA构建文库在扩增 15循环后，库容可达到80-225ng，5-10ng打断起始构建文库扩增12个循环后，库容可达到 100_500ng 〇
[0065] 同样，发明人同时采用现有的常规物理打断的建库方式（在修复步骤中不额外添 dATP或者/和扩增步骤中直接进行一步扩增）对上述lng、2ng、5ng和IOng的样品进行了 建库。当采用Ing和2ng的样品按照NEB的常规建库流程进行建库后，最后通过凝胶电泳 的方法来检测扩增的文库的片段大小及扩增量，发现根本检测不到任何片段。即达不到凝 胶检测的分辨率。这与现有的常规建库过程中所遇到的问题一致。而当采用5ng的样品按 照常规建库流程进行建库时，在扩增步骤中扩增循环数为18。通过检测，该文库的库容低于 l〇ng，根本无法上机。而采用IOng的样品按照增加乙醇连接增强剂，但在修复步骤中仅用 试剂盒中的修复酶混合物，不额外添加 dATP，在对带接头片段进行扩增的步骤中也是一步 扩增16个循环，所得文库的库容为25ng，上机后重复数据过多，有效数据量很低，也无法使 用。
[0066] 由上述结果可知，本发明的方法不仅提高了低起始量样品文库构建的成功率，而 且所构建得到的文库的库容达到了显著提高。
[0067] 另外，发明人还利用不同添加量范围的dATP添加到Ing样品的文库构建中，发现 在现有试剂盒的基础上，额外添加 IOOmM的dATP，当添加量为0. 1 μ 1~0. 3 μ 1时，加 A的 效率会随着dATP的添加量的增加而增加；当添加量增至0. 4μ 1时，加 A的效率不再随着 dATP的添加量的增加而增加。而且，发明人还对2ng样品、5ng样品以及可以利用常规构建 方法的1 μ g的样品进行了上述0. 1~0. 4 μ 1的梯度添加，发现具有相同的变化趋势。
[0068] 发明人还对不同种类的连接增强剂对文库构建的效果进行了比较，以Ing样品作 为建库起始量，其他步骤均相同，将DMSO (成功率为100 % )分别用乙二醇和甘油所替代，发 现后两种方法所构建的文库的成功率分别为83%和92% ;库容分别为53ng和58ng。
[0069] 从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：通过在末 端修复加 A步骤中额外增加 dATP的用量，提高了加 A的效率，进而得到更多修复后3'末端 加 A的修复片段，更多修复后3'末端加 A的修复片段经后续接头连接及扩增步骤，使得所 构建得到的高通量测序文库具有更多的目的片段，进而提高了低起始量样本（可低至1~ IOng)的测序成功率及库容。
[0070] 上述优选实施例中，将低于IOng的样本进行超声打断，打断后对样本进行末端修 复和加 A，随后进行接头连接。在加 A这一步骤中额外补加 dATP的量，增加了加 A的效率。 在接头连接中额外添加连接增强剂，增加连接酶活性。连接产物进行1. 2倍XP磁珠纯化，去 掉大部分未连上片段的接头。将纯化后的产物使用kapa高保真酶扩增6个循环，将扩增产 物进行1倍XP磁珠纯化。这一步骤主要是为了去除初期扩增中大量产生的接头，使得后期 目的片段得到有效扩增。将纯化后的产物再次使用kapa高保真酶扩增6~9个循环。将 扩增后的产物使用1倍XP磁珠纯化，去除小于270bp以下的小片段，然后使用0. 7~0. 85 倍XP磁珠分选目的片段，得到片段大小主要为300~550bp的目的片段。
[0071] 可见，本发明通过改进实验流程，改变关键步骤的处理方法，使得微量起始建库成 功率得到很大提高，将最低建库起始量从50ng降低到lng。该方法有效解决了部分珍贵的、 难获得的样本总量过低无法建库测序，或者建库成功率低，文库质量较差的问题，提高了二 次测序的适用范围，使得其应用范围更广。
[0072] 本发明的上述构建方法不仅改变了微量起始建库流程，同时对建库过程中的试剂 进行特异性优化，找到了最适合建库的反应体系和时间，提供了一种新的微量建库的方法。 而且，本发明的方法还有助于对普通的建库试剂盒中的试剂进行优化，使其更加有利于微 量起始建库。上述改进拓宽了二代测序技术的应用领域，使得低起始样本也可以使用二代 测序方法来分析其数据结果。
[0073] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种微量起始DNA的高通量测序文库构建方法，其特征在于，所述构建方法包括： 步骤Sl，对样本DNA进行物理打断，得到片段化DNA; 步骤S2,对所述片段化DNA进行末端修复及加A，得到修复DNA; 步骤S3,利用连接增强剂对所述修复DNA进行接头连接，得到带接头片段；以及 步骤S4,对所述带接头片段进行扩增，得到所述高通量测序文库； 其中，所述连接增强剂为DMSO、乙醇、乙二醇或甘油。2. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在所述步骤S2中，利用高通量测序文 库构建试剂盒中的修复酶混合物进行修复，所述高通量测序文库构建试剂盒中的修复酶混 合物包括dNTPs、T4DNA聚合酶、T4PNK以及Klenow酶或Taq酶，并在所述修复过程中向所 述修复酶混合物中添加dATP。3. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述高通量测序文库构建试剂盒包 括NEB公司的DNA文库构建试剂盒、Bioo公司的DNA文库构建试剂盒或诺唯赞公司的DNA 文库构建试剂盒。4. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，在所述修复过程中向所述修复酶混 合物中添加小于等于0. 4yIIOOmM的dATP。5. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在所述步骤S3之后以及所述步骤S4 之前，所述构建方法还包括对所述带接头片段进行磁珠纯化的步骤。6. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S4包括：对所述连接片段 进行分步扩增，并在每次扩增之后增加磁珠纯化的步骤，得到所述高通量测序文库。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S4包括： 对所述带接头片段扩增4~7个循环，得到第一扩增片段； 对所述第一扩增片段进行〇. 95~1. 20倍体积的磁珠纯化，得到第一扩增纯化片段； 对所述第一扩增纯化片段扩增6~9个循环，得到第二扩增片段； 对所述第二扩增片段进行〇. 95~1. 20倍体积的磁珠纯化，得到第二扩增纯化片段；以 及 利用0. 7~0. 85倍体积的磁珠对所述第二扩增纯化片段进行分选，得到所述高通量测 序文库。8. -种高通量测序文库，其特征在于，所述高通量测序文库采用权利要求1至7中任一 项所述的构建方法构建而成。9. 根据权利要求8所述的高通量测序文库，其特征在于，所述高通量测序文库的库容 为 50 ~500ng。
【专利摘要】本发明提供了一种微量起始DNA的高通量测序文库构建方法及其所构建的高通量测序文库。该构建方法包括：对样本DNA进行物理打断，得到片段化DNA；对片段化DNA进行末端修复及加A，得到修复DNA；利用连接增强剂对修复DNA进行接头连接，得到带接头片段；以及对带接头片段进行扩增，得到高通量测序文库；连接增强剂为DMSO、乙醇、乙二醇或甘油。通过在接头连接的步骤中添加具有连接增强作用的DMSO、乙醇、乙二醇或甘油等小分子物质，利用这些小分子物质刺激连接酶的活性中心区域来增强连接活性，提高接头连接效率，使更多修复DNA片段连上接头序列，从而提高了微量起始量样本的测序成功率。
【IPC分类】C40B40/06, C40B50/06, C12Q1/68
【公开号】CN104894651
【申请号】CN201510369505
【发明人】胡政, 刘运超, 王大伟, 朱海浩, 李明洲
【申请人】天津诺禾医学检验所有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月29日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及高通量测序领域，具体而言，涉及一种微量起始DNA的高通量测序文 库构建方法及其所构建的高通量测序文库。
【背景技术】
[0002] 生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研宄有着十分重要的意义。第一代 测序仪对电泳分离技术的依赖，使其难以进一步提高分析的速度和并行化程度，也难以 通过微型化降低测序成本。经过不断的技术开发和改进，21世纪初，以Roche454技术、 illumina公司的Genome Analyzer技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技 术诞生了。第二代技术大大降低了测序成本，还大幅度提高了测序速度并保持了高准确 性。其中，illumina公司的第一台测序仪于2006年问世，之后开发出来一系列的测序仪，如 Hiseq2000、Hiseq2500、Miseq、Hiseq X等，在准确性、通量、成本和速度方面表现更优秀，而 使其成为全球使用量最大的第二代测序仪。在第二代测序平台不断完善的同时，以对单分 子DNA进行非PCR测序为主要特征的第三代测序技术也初显端倪。但由于其关键技术问题 尚待解决，目前还未得到广泛应用。
[0003] 近几年来，包括人、拟南芥以及水稻等越来越多的基因组被测序，全基因组测序为 重要基因的克隆、基因的系统进化和基因组学研宄提供了坚实的平台。但依然有部分珍贵 物种由于样本较少获取难度大，或者个体较小获得的基因组浓度较低等原因，得到的基因 组DNA少（低于50ng)，按照目前现有的建库流程和方法，建库难度非常大。
[0004] 目前针对低起始量DNA的建库方法主要有转座酶建库和普通流程建库，转座酶建 库主要是利用转座酶随机切割基因组DNA，并在片段两端加上接头，然后进行扩增建库，该 方法是一种高效的低起始量建库方法。但这种建库方法有一个较为明显的缺点，就是其使 用转座酶随机切割打断过程中易受到样本中杂质的干扰，导致打断建库失败。而普通流程 建库无法进行低于20ng的建库，在起始量为50ng时，在后期扩增时扩增循环数较高，需要 达到18-25个循环，文库库容较低，质量较差，且建库成功率只有30 %左右。
[0005] 如上所述，转座酶切割打断建库的方法易受到样本质量的影响，导致切割打断失 败，基因组无法正常片段化，在后续扩增中无法得到有效扩增。而普通流程建库无法进行低 于20ng的建库，在起始量为50ng时，建库成功率为30%，且文库质量较差，库容低，信息分 析结果显示片段重复较高。
[0006] 因此，仍需要对现有技术进行改进，以改善现有的微量起始样本建库成功率较低 的缺陷。
【发明内容】
[0007] 本发明的主要目的在于提供一种微量起始DNA的高通量测序文库构建方法及其 所构建的高通量测序文库，以改善现有技术中微量起始样本建库成功率较低的缺陷。
[0008] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种微量起始DNA的高通量 测序文库构建方法，该构建方法包括：步骤Sl，对样本DNA进行物理打断，得到片段化DNA ; 步骤S2,对片段化DNA进行末端修复及加 A，得到修复DNA ;步骤S3,利用连接增强剂对修复 DNA进行接头连接，得到带接头片段；以及步骤S4,对带接头片段进行扩增，得到高通量测 序文库；其中，增强剂为DMSO、乙醇、乙二醇或甘油。
[0009] 进一步地，在步骤S2中，利用高通量测序文库构建试剂盒中的修复酶混合物进行 修复，高通量测序文库构建试剂盒中的修复酶混合物包括dNTPs、T4DNA聚合酶、T4PNK和 Klenow酶或Taq酶，并在修复过程中向修复酶混合物中添加 dATP。
[0010] 进一步地，高通量测序文库构建试剂盒包括NEB公司的DNA文库构建试剂盒、BiOO 公司的DNA文库构建试剂盒或诺唯赞公司的DNA文库构建试剂盒。
[0011] 进一步地，在修复过程中向修复酶混合物中添加小于等于0. 4 μ I IOOmM的dATP。
[0012] 进一步地，在步骤S3之后以及步骤S4之前，构建方法还包括对带接头片段进行磁 珠纯化的步骤。
[0013] 进一步地，步骤S4包括：对连接片段进行分步扩增，并在每次扩增之后增加磁珠 纯化的步骤，得到高通量测序文库。
[0014] 进一步地，步骤S4包括：对带接头片段扩增4~7个循环，得到第一扩增片段；对 第一扩增片段进行〇. 95~1. 20倍体积的磁珠纯化，得到第一扩增纯化片段；对第一扩增纯 化片段扩增6~9个循环，得到第二扩增片段；对第二扩增片段进行0. 95~1. 20倍体积的 磁珠纯化，得到第二扩增纯化片段；以及利用0. 7~0. 85倍体积的磁珠对第二扩增纯化片 段进行分选，得到高通量测序文库。
[0015] 根据本发明的另一方面，提供了一种高通量测序文库，该高通量测序文库采用上 述任一种构建方法构建而成。
[0016] 进一步地，高通量测序文库的库容为50~500ng。
[0017] 应用本发明的技术方案，通过在接头连接的步骤中添加具有连接增强作用的小分 子物质，利用这些小分子物质刺激连接酶的活性中心区域，使得其连接活性增强，提高接头 连接效率，使得更多的修复DNA片段被成功连上接头序列，进而通过与接头序列互补的引 物进行扩增，进而得到了目的扩增片段含量更多的高通量测序文库；从而提高了微量起始 量样本（可低至1~IOng)的测序成功率及库容。
【附图说明】
[0018] 构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示 意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0019] 图1示出了根据本发明的优选实施例中以Ing DNA作为起始DNA所构建的文库的 插入片段的大小检测结果图；以及
[0020] 图2示出了图1所示的优选实施例所构建的文库经上机测序后经数据分析得到的 不同插入片段占整个测序数据比例的结果图。
【具体实施方式】
[0021] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相 互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
[0022] 针对【背景技术】部分提到的现有微量起始样本建库成功率低的技术问题，在本发明 一种典型的实施方式中，提供了一种高通量测序文库的构建方法，该构建方法包括：对样本 DNA进行物理打断，得到片段化DNA ;对片段化DNA进行末端修复及加 A，得到修复DNA ;利用 连接增强剂对修复DNA进行接头连接，得到带接头片段；对带接头片段进行扩增，得到高通 量测序文库，其中连接增加剂为DMSO、乙醇、乙二醇或甘油。
[0023] 本发明的上述文库构建方法，在上述接头连接的步骤中通过添加具有连接增强作 用的小分子物质，利用这些小分子物质刺激连接酶的活性中心区域，使得其连接活性增强， 提高接头连接效率，使得更多的修复DNA片段被成功连上接头序列，进而通过与接头序列 互补的引物进行扩增，进而得到了目的扩增片段量更多的高通量测序文库。
[0024] 在上述优选的实施例中，连接增强剂的作用是增加连接酶的连接活性，因而，任何 具有上述活性的试剂均适用于本发明。在本发明中，上述连接增强剂优选但不仅限于DMSO、 乙醇、乙二醇或甘油。
[0025] 在上述文库构建方法中，为了进一步提高建库成功率及稳定性，在本发明一种优 选的实施例中，在利用现有文库构建试剂盒中的修复酶混合物进行修复的过程中，向反应 体系中添加 dATP来进行末端修复加 A。
[0026] 上述优选实施例中，在末端修复加 A的步骤中，在常规的用修复酶混合的基础上， 通过在末端修复加 A步骤中额外增加 dATP的用量，提高了加 A的效率，进而得到更多修复 后3'末端加 A的修复片段，更多修复后3'末端加 A的修复片段经后续接头连接及扩增 步骤，使得所构建得到的高通量测序文库具有更多的目的片段，进而提高了低起始量样本 (可低至1~IOng)的测序成功率及库容。
[0027] 由于现有的文库构建方法大都采用市售试剂盒进行上述修复和加 A步骤，其中 dNTP中dATP以及其他dCTP、dGTP和dTTP的都是按照等比例直接混合而成的产品，而且还 是与修复酶混合在一起的产品。比如NEB公司的DNA文库构建试剂盒、Bioo公司的DNA文 库构建试剂盒或诺唯赞公司的DNA文库构建试剂盒。也就是说，通常在进行该步操作时，不 会对其中的dNTP或者某一种脱氧核糖核苷酸的用量进行特意调整，而是直接采用试剂盒 中的推荐用量，或者将修复酶混合物作为一个整体在用量上进行适当调整。
[0028] 而在本发明中，发明人意外发现，在采用试剂盒或者按照现有的dNTP和dATP的用 量在进行上述步骤时，额外增加 dATP 的用量能显著增加片段化的修复后加 A的片段的量， 即提高了加 A效率。在本发明一种优选的实施例中，额外增加的dATP的用量为小于等于 〇. 4 μ 1。发明人发现，只要在试剂盒的修复酶混合物的基础上，额外增加 dATP，其加 A效率 就能明显提升，而当额外增加的dATP的量达到0. 4 μ 1后，提高加 A效率的不再显著，因而， 增加的dATP的量在上述范围内不仅提高建库成功率，而且提高了所构建的高通量测序文 库的库容。
[0029] 在上述优选实施例的基础上，为了进一步提高建库成功率并提高库容，在本发明 另一种优选的实施例中，在得到上述连接片段以及对连接片段进行扩增之前，该构建方法 还包括对连接片段进行磁珠纯化的步骤，磁珠纯化步骤中所使用的XP磁珠的体积为连接 片段体积的1. 15~1. 25倍。
[0030] 在接头连接的步骤，为了使修复片段尽可能多地连上接头序列，通常使用过量的 接头序列，因而在接头连接步骤之后，会有部分过剩的未连上修复片段的接头序列。在对连 上接头的连接片段进行扩增之前，增加上述磁珠纯化的步骤，有助于将大部分多余的未连 上片段的接头去除，减少后续对扩增步骤的不利影响，提高目的片段的有效扩增，进而提高 所得文库中的目的片段的含量。
[0031] 上述优选实施例中，纯化步骤中所用到的磁珠的用量，可以在现有的磁珠纯化 不同大小的片段磁珠的用量范围的基础上进行适当调整即可得到。本发明中优选使用 1. 15~1. 25倍体积的磁珠用量具有纯化效果相对较好的效果。更优选地，使用1. 2倍体积 用量的磁珠对连接片段进行纯化。
[0032] 上述构建方法中，对连接片段进行扩增，得到高通量测序文库的步骤采用现有技 术的方法进行操作即可。为了更有效地提高文库构建的成功率和所构建的文库的库容，在 本发明又一种优选的实施例中，该步骤包括：对连接片段进行多次扩增，并在每次扩增之后 增加磁珠纯化的步骤。
[0033] 通过将现有技术的一次扩增步骤分为多次，并在多次扩增之间增加对每次的扩增 产物进行纯化的步骤，使得扩增产物更纯，目的片段的扩增效率更高，进而提高了建库成功 率，同时也能相应地提高文库的库容。
[0034] 在本发明一种更优选的实施例中，上述对连接片段进行扩增，得到高通量测序文 库的步骤包括：对连接片段进行2次扩增，并在每次扩增之后增加0. 95~1. 05倍体积的 磁珠纯化的步骤。进行2次扩增，操作步骤相对简单不繁琐，而且提高了目的片段的扩增效 率。而用0. 95~1. 05倍体积的磁珠对扩增产物进行第一次纯化，能够有效去除初次扩增 步骤中大量产生的接头，使得后期目的片段得到有效扩增。而采用上述用量的磁珠进行第 二次纯化，能够除去小于270bp以下的小片段，进一步提高了目的片段的含量。
[0035] 在本发明又一种优选的实施例中，对连接片段进行扩增，得到高通量测序文库的 步骤包括：对连接片段扩增4~7个循环，得到第一扩增片段；对第一扩增片段进行0. 95~ 1. 05倍体积的磁珠纯化，得到第一扩增纯化片段；对第一扩增纯化片段扩增5~11个循 环，得到第二扩增片段；对第二扩增片段进行0. 95~1. 05倍体积的磁珠纯化，得到第二扩 增纯化片段；利用〇. 6~0. 9倍体积的磁珠对第二扩增纯化片段进行分选，得到高通量测序 文库。
[0036] 上述优选实施例中，通过将第一次循环的次数限定在4~7次内，第二次循环的次 数限定在5~11次内，并在两次扩增之后采用0. 95~1. 05倍体积的磁珠纯化进行纯化扩 增产物，使得目的大小的片段的含量相对更高。并且，在第二次纯化之后，又利用〇. 6~0. 9 倍体积的磁珠对纯化片段的大小进行筛选，从而得到目的片段大小含量较高的高通量测序 文库。
[0037] 在本发明一种更优选的实施例中，上述对连接片段进行扩增，得到高通量测序文 库的步骤包括：对连接片段扩增6个循环，得到第一扩增片段；对第一扩增片段进行1倍体 积的磁珠纯化，得到第一扩增纯化片段；对第一扩增纯化片段扩增6~9个循环，得到第二 扩增片段；对第二扩增片段进行1倍体积的磁珠纯化，得到第二扩增纯化片段；利用〇. 7~ 0. 85倍体积的磁珠对第二扩增纯化片段进行分选，得到高通量测序文库。
[0038] 在上述更优选的实施例中，对总扩增循环数在12~15个内的扩增步骤，按照上述 方式进行扩增，不仅能够提高建库的成功率，使得所构建的文库的插入片段在300~600bp 之间，而且能够更显著地提高高通量测序文库的库容。
[0039] 在上述扩增步骤中，为了减少扩增所带来的碱基误差，尽量采用高保真酶进行扩 增。本发明优选但不仅限于采用Kapa高保真酶。Kapa高保真酶活性较高且稳定，保真性 好。
[0040] 在本发明另一种典型的实施方式中，提供了一种高通量测序文库，该高通量测序 文库采用上述任一种构建方法构建而成。相比现有技术的方法所构建的文库，由上述构建 方法构建而成的高通量测序文库的库容为50ng~500ng。具有上述库容的文库，测序产出 的有效数据量较高，进而相对减少测序成本。
[0041] 下面将结合具体的实施例来进一步说明本发明的有益效果。
[0042] 本发明以拟南芥基因组DNA标准品作为实验材料，以NEB建库试剂盒作为建库试 剂盒进行实验，具体实验步骤如下：
[0043] 1.取拟南芥基因组DNA的标准品，稀释100倍，振荡混匀，用Qbuit精确测定浓度。
[0044] 2.按测定的浓度计算lng、2ng、5ng和IOng所需要添加的体积，加水（NFW)至 55 μ 1 〇
[0045] 3.使用Covaris S220超声打断样本，Ing和2ng的样品的超声时间为lmin，5ng 样品的超声时间为2min ;10ng样品的超声时间为3min。
[0046] 4.使用NEB标准建库试剂盒进行末端修复和加 A，体系中额外补加 dATP，具体反应 体系如下：
[0047] 片段化DNA 55.2μ1
[0048] NEBNext末端修复缓冲液（IOX) 6.5 μΙ NEBNext末端修复酶混合物 3 μL dATP(!00 mM) 0.3μ1 总体积 65 μL
[0049] 反应程序如下：
[0050] 20 〇C 30min
[0051] 65 °C 30min
[0052] 4 °C Hold。
[0053] 对IOng的片段化DNA，在用5 μ I NEBNext末端修复缓冲液（IOX)、3 μ I NEBNext 末端修复酶混合物混合均匀后，再额外添加〇. 4 μ 1的dATP (IOOmM)，混合后置于设置有上 述反应程序的加热反应器中（Block中）进行修复加 A反应。
[0054] 5.反应结束后将样本放置于冰上，进行下一步连接反应，额外补加 DMSO作为连接 酶增强剂（IOng的样品用乙醇代替），反应体系如下所示：
[0055] 平末端/TA连接酶混和物 15 μL 接头（15μΜ) 0.5μ1 连接增强剂 ΙμL DMSO 1,6μ1 总体积 ?β μL
[0056] 反应程序如下：
[0057] 20°C 反应 60min。
[0058] 6.将连接后的产物进行1. 2倍XP磁珠纯化，纯化后的样本使用kapa高保真酶进 行扩增（Ing样品为7个循环，2ng样品为6个循环，5ng和IOng为4个循环），反应程序如 下：
[0059] 步骤I :98°C预变性30s ;步骤2 :98°C变性IOs ;步骤3 :65°C退火30s ;步骤4 : 72°C延伸30s ;步骤5 :重复步骤2~4,6次；步骤6 :72°C延伸5min ;步骤7 :4°C结束。
[0060] 7.将扩增后的产物使用XP磁珠纯化（Ing样品为1. 20倍体积的XP磁珠，2ng样 品为1倍体积的XP磁珠，5ng样品为0. 95倍体积的XP磁珠），将得到的纯化产物使用kapa 高保真酶扩增6-9个循环（Ing和2ng样品为9个循环，5ng样品为8个循环；IOng样品为 6个循环），反应程序如下：
[0061] 步骤I :98°C预变性30s ;步骤2 :98°C变性IOs ;步骤3 :65°C退火30s ;步骤4 : 72°C延伸30s ;步骤5 :重复步骤2~4,6~9次；步骤6 :72°C延伸5min ;步骤7 :4°C结束。
[0062] 8.将扩增后的产物使用XP磁珠纯化（Ing样品为1. 20倍体积的XP磁珠，2ng样品 为1倍体积的XP磁珠，5ng样品为0. 95倍体积的XP磁珠），将得到的纯化产物使用0. 7~ 0. 85倍XP磁珠进行片段分选，即在0. 7倍磁珠纯化时留上清，补加至0. 85倍XP磁珠，纯化 得到三个文库。
[0063] 对上述三个文库的目的 插入片段进行检。其中，图1为Ing起始DNA所构建的文 库在2100检测仪上检测的峰图。从图1中可以看出，文库片段分布集中与300-600bp。图 2为该文库上机测序后，对数据进行信息分析，评估出该文库中不同插入片段占整个数据比 例，从图2中可以看到主峰位置位于300bp左右。
[0064] 同时，构建好的三个起始量的样品的体积为15 μ 1，然后用Qubit进行了浓度检 测，具体分别为5. 67ng/ μ l、15ng/ μ l、9ng/ μ 1和33. 67ng/ μ 1。因此，Ing样品所构建的 文库的库容为85ng ;2ng样品所构建的文库的库容为225ng ;5ng样品所构建的文库的库容 为135ng ; IOng样品所构建的文库的库容为505ng。可见，当起始样本量为Ing时，采用本 发明的构建方法所构建的文库的库容都大于50ng。而且，l-2ng起始DNA构建文库在扩增 15循环后，库容可达到80-225ng，5-10ng打断起始构建文库扩增12个循环后，库容可达到 100_500ng 〇
[0065] 同样，发明人同时采用现有的常规物理打断的建库方式（在修复步骤中不额外添 dATP或者/和扩增步骤中直接进行一步扩增）对上述lng、2ng、5ng和IOng的样品进行了 建库。当采用Ing和2ng的样品按照NEB的常规建库流程进行建库后，最后通过凝胶电泳 的方法来检测扩增的文库的片段大小及扩增量，发现根本检测不到任何片段。即达不到凝 胶检测的分辨率。这与现有的常规建库过程中所遇到的问题一致。而当采用5ng的样品按 照常规建库流程进行建库时，在扩增步骤中扩增循环数为18。通过检测，该文库的库容低于 l〇ng，根本无法上机。而采用IOng的样品按照增加乙醇连接增强剂，但在修复步骤中仅用 试剂盒中的修复酶混合物，不额外添加 dATP，在对带接头片段进行扩增的步骤中也是一步 扩增16个循环，所得文库的库容为25ng，上机后重复数据过多，有效数据量很低，也无法使 用。
[0066] 由上述结果可知，本发明的方法不仅提高了低起始量样品文库构建的成功率，而 且所构建得到的文库的库容达到了显著提高。
[0067] 另外，发明人还利用不同添加量范围的dATP添加到Ing样品的文库构建中，发现 在现有试剂盒的基础上，额外添加 IOOmM的dATP，当添加量为0. 1 μ 1~0. 3 μ 1时，加 A的 效率会随着dATP的添加量的增加而增加；当添加量增至0. 4μ 1时，加 A的效率不再随着 dATP的添加量的增加而增加。而且，发明人还对2ng样品、5ng样品以及可以利用常规构建 方法的1 μ g的样品进行了上述0. 1~0. 4 μ 1的梯度添加，发现具有相同的变化趋势。
[0068] 发明人还对不同种类的连接增强剂对文库构建的效果进行了比较，以Ing样品作 为建库起始量，其他步骤均相同，将DMSO (成功率为100 % )分别用乙二醇和甘油所替代，发 现后两种方法所构建的文库的成功率分别为83%和92% ;库容分别为53ng和58ng。
[0069] 从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：通过在末 端修复加 A步骤中额外增加 dATP的用量，提高了加 A的效率，进而得到更多修复后3'末端 加 A的修复片段，更多修复后3'末端加 A的修复片段经后续接头连接及扩增步骤，使得所 构建得到的高通量测序文库具有更多的目的片段，进而提高了低起始量样本（可低至1~ IOng)的测序成功率及库容。
[0070] 上述优选实施例中，将低于IOng的样本进行超声打断，打断后对样本进行末端修 复和加 A，随后进行接头连接。在加 A这一步骤中额外补加 dATP的量，增加了加 A的效率。 在接头连接中额外添加连接增强剂，增加连接酶活性。连接产物进行1. 2倍XP磁珠纯化，去 掉大部分未连上片段的接头。将纯化后的产物使用kapa高保真酶扩增6个循环，将扩增产 物进行1倍XP磁珠纯化。这一步骤主要是为了去除初期扩增中大量产生的接头，使得后期 目的片段得到有效扩增。将纯化后的产物再次使用kapa高保真酶扩增6~9个循环。将 扩增后的产物使用1倍XP磁珠纯化，去除小于270bp以下的小片段，然后使用0. 7~0. 85 倍XP磁珠分选目的片段，得到片段大小主要为300~550bp的目的片段。
[0071] 可见，本发明通过改进实验流程，改变关键步骤的处理方法，使得微量起始建库成 功率得到很大提高，将最低建库起始量从50ng降低到lng。该方法有效解决了部分珍贵的、 难获得的样本总量过低无法建库测序，或者建库成功率低，文库质量较差的问题，提高了二 次测序的适用范围，使得其应用范围更广。
[0072] 本发明的上述构建方法不仅改变了微量起始建库流程，同时对建库过程中的试剂 进行特异性优化，找到了最适合建库的反应体系和时间，提供了一种新的微量建库的方法。 而且，本发明的方法还有助于对普通的建库试剂盒中的试剂进行优化，使其更加有利于微 量起始建库。上述改进拓宽了二代测序技术的应用领域，使得低起始样本也可以使用二代 测序方法来分析其数据结果。
[0073] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种微量起始DNA的高通量测序文库构建方法，其特征在于，所述构建方法包括： 步骤Sl，对样本DNA进行物理打断，得到片段化DNA; 步骤S2,对所述片段化DNA进行末端修复及加A，得到修复DNA; 步骤S3,利用连接增强剂对所述修复DNA进行接头连接，得到带接头片段；以及 步骤S4,对所述带接头片段进行扩增，得到所述高通量测序文库； 其中，所述连接增强剂为DMSO、乙醇、乙二醇或甘油。2. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在所述步骤S2中，利用高通量测序文 库构建试剂盒中的修复酶混合物进行修复，所述高通量测序文库构建试剂盒中的修复酶混 合物包括dNTPs、T4DNA聚合酶、T4PNK以及Klenow酶或Taq酶，并在所述修复过程中向所 述修复酶混合物中添加dATP。3. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述高通量测序文库构建试剂盒包 括NEB公司的DNA文库构建试剂盒、Bioo公司的DNA文库构建试剂盒或诺唯赞公司的DNA 文库构建试剂盒。4. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，在所述修复过程中向所述修复酶混 合物中添加小于等于0. 4yIIOOmM的dATP。5. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在所述步骤S3之后以及所述步骤S4 之前，所述构建方法还包括对所述带接头片段进行磁珠纯化的步骤。6. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S4包括：对所述连接片段 进行分步扩增，并在每次扩增之后增加磁珠纯化的步骤，得到所述高通量测序文库。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S4包括： 对所述带接头片段扩增4~7个循环，得到第一扩增片段； 对所述第一扩增片段进行〇. 95~1. 20倍体积的磁珠纯化，得到第一扩增纯化片段； 对所述第一扩增纯化片段扩增6~9个循环，得到第二扩增片段； 对所述第二扩增片段进行〇. 95~1. 20倍体积的磁珠纯化，得到第二扩增纯化片段；以 及 利用0. 7~0. 85倍体积的磁珠对所述第二扩增纯化片段进行分选，得到所述高通量测 序文库。8. -种高通量测序文库，其特征在于，所述高通量测序文库采用权利要求1至7中任一 项所述的构建方法构建而成。9. 根据权利要求8所述的高通量测序文库，其特征在于，所述高通量测序文库的库容 为 50 ~500ng。
【专利摘要】本发明提供了一种微量起始DNA的高通量测序文库构建方法及其所构建的高通量测序文库。该构建方法包括：对样本DNA进行物理打断，得到片段化DNA；对片段化DNA进行末端修复及加A，得到修复DNA；利用连接增强剂对修复DNA进行接头连接，得到带接头片段；以及对带接头片段进行扩增，得到高通量测序文库；连接增强剂为DMSO、乙醇、乙二醇或甘油。通过在接头连接的步骤中添加具有连接增强作用的DMSO、乙醇、乙二醇或甘油等小分子物质，利用这些小分子物质刺激连接酶的活性中心区域来增强连接活性，提高接头连接效率，使更多修复DNA片段连上接头序列，从而提高了微量起始量样本的测序成功率。
【IPC分类】C40B40/06, C40B50/06, C12Q1/68
【公开号】CN104894651
【申请号】CN201510369505
【发明人】胡政, 刘运超, 王大伟, 朱海浩, 李明洲
【申请人】天津诺禾医学检验所有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月29日
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