一种cTnI人源化单链抗体库的构建及应用
一种cTnI人源化单链抗体库的构建及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属基因工程，涉及一种人源cTnl单链抗体库的构建及其应用。
【背景技术】
[0002] 抗体技术发展经历了三个阶段，第一代为抗血清多克隆抗体，第二代为70年代中 期德国学者Kohler和英国学者Milstein利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备了杂交瘤单克 隆抗体（McAb)，这一发现是生物技术发展的里程碑之一，它在诊断，治疗，预防和蛋白质提 纯等方面已显示了重要重要。然而，由于异蛋白易引起人抗小鼠抗体（Human anti-mouse antibody，HAM)反应，而人杂交瘤技术又难以突破，因此出现了第三代抗体，基因工程抗 体。基因工程抗体包括三种，即嵌合抗体，改形抗体和抗体库技术制备的抗体。其中前两者 属部分人源化抗体，抗体库技术制备的抗体属全人源化抗体。
[0003] 抗体库技术不仅可以模拟动物免疫系统产生抗体的过程，还具有许多独特的优 点，令杂交瘤技术难以相比。抗体库技术无需免疫，从理论上讲，10 1°的库容就可能包容所 有的抗体。利用抗原即可直接从非免疫动物抗体库中筛选出特异性抗体，并能筛选到针对 该物种自身抗原的抗体。从人的抗体库中可以得到完全是人源的McAb，克服了难以用杂交 瘤技术获得人源McAb的障碍。
[0004] 酵母是一种理想的真核生物表达载体宿主，其基因的表达调控及蛋白质的翻译后 加工、分泌机制比较接近高等真核生物，对哺乳动物蛋白质，尤其是对人的蛋白质的展示有 独特的优越性。但受到酵母细胞转化率低的限制，构建酵母文库时需进行多个小文库的建 立，再将多个小文库进行并库，使得建库过程繁琐、复杂。在开发的多种展示技术中，细菌表 面展示技术的应用研宄近年来取得了显著进展，该技术结合流式细胞筛选，可进行有效的 高通量筛选。细菌细胞增殖快，培养成本低廉，利于大量制备高纯度抗体。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种cTnl单链抗体库，即细菌单链抗体库，含有人类抗 体重链可变区VH和轻链可变区VL，及中间连接区，有完整的抗原结合部位，以细菌 pRSF-Autodisplay为载体，库容达到2 X 105。经DNA序列分析后证明其多样性良好，并且 可以通过感染宿主（大肠细菌Turbo)进行大量扩增和再生。利用细菌体外表达的cTNI蛋 白作为抗原，通过细菌展示的方法，方便地筛选出cTNI特异的单链抗体，进而用于cTNI的 检测。
[0006] 本发明的另一个目的是提供一种cTNI单链抗体库的构建方法，通过以下技术方 案实现：
[0007] 1.本发明将分别提取20名男性和女性成人脾脏及淋巴结mRNA，合并后将其逆转 录成cDNA。利用针对抗体重链和轻链可变区的引物分别扩增VH和VL基因片段，将两种 Error prone PCR产物进行纯化并测定浓度，再用含柔性连接肽的引物将VH和VL基因片段 通过连接片段组装到一起形成单链抗体编码序列。将单链抗体编码片段ScFv纯化并与载 体PPNL6连接，通过高效醋酸锂转化法转化进入EBYlOO酵母中，构建半合成抗体文库。
[0008] 2.用磁珠法和流式细胞术筛选结合进行筛选：
[0009] A.体外大肠杆菌表达cTNI蛋白作为抗原；
[0010] B.将磁珠与cTNI蛋白结合，借助抗原与抗体特异性结合，经过3轮"吸附-洗 脱-扩增"循环，实现对单链抗体的富集筛选。
[0011] C. cTNI蛋白用荧光素 FITC标记，单链抗体会竞争性的与靶抗原进行结合，被流式 细胞分选仪分选出来。
[0012] D.流式细胞分选以后，随机挑取单菌落进行单链抗体的分泌表达，ELISA方法检 测表达抗体的特异性，获得可表达特异性单链抗体的阳性菌株。
[0013] 3.构建用于细菌中的竞争性表达载体pRSF-Autodisplay。
[0014] 4.初步筛选的阳性菌株进行PCR，获得阳性菌株pPNL6-ScFv的DNA片段。
[0015] 5.设计含Sfil酶切位点的引物，对该DNA片段进行Erron PCR，扩增抗体重链和 轻链可变区基因。
[0016] 6. cTNI单链抗体scFv突变体库的构建：用Sfil双酶切scFv基因片段，并插入 pRSF-Autodisplay构建重组质粒，转化感受态E. coli Turbo细胞，获得抗cTnl蛋白单链抗 体突变体库。
[0017] 7.利用磁珠法和流式细胞术筛选结合对单链抗体突变体库进行富集筛选。
[0018] 8.随机挑取单菌落进行单链抗体的分泌表达，ELISA方法检测表达抗体的特异 性，获得可表达特异性单链抗体的阳性菌株。
[0019] 9.单链抗体库的多样性分析：随机挑取多个单克隆菌，测定插入区scFv基因的 DNA序列，经ClustalW序列比对软件分析其序列的相似性，判断单链抗体库的多样性分析， 证明其多样性良好。
[0020] 本发明的特点是：
[0021] (1)本发明提供的人源CTNI单链抗体突变体库，以细菌pRSF-Autodisplay为载 体，库容达到2X10 5,多样性良好；单链抗体由重链可变区VH和轻链可变区VL通过连接肽 连接而成，且含有完整的抗原结合部位。
[0022] (2)本发明提供的构建人源cTNI单链抗体突变体库的技术，从人类半合成抗体文 库出发，以cTnl蛋白为抗原，获取野生型cTnl抗体，利用Error prone PCR等分子生物学 技术结合细菌展示技术，通过重复电转化，获得人源cTNI单链抗体突变体库抗体库；技术 可操作性强，库容量大。
[0023] (3)本发明的人源cTNI单链抗体突变体库，因为以细菌为载体，通过感染大肠杆 菌而扩增并将单链抗体展示在细菌表面，从而可以用特定的cTNI相关抗原作为靶标，方便 地筛选出对cTNI特异的全人源单链抗体，这些人源单链抗体可作为检测试剂，用于cTNI筛 查。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1 :半人源化单链抗体库的构建
[0025] 本发明将分别提取20名男性和女性成人脾脏及淋巴结mRNA，合并后将其逆转录 成cDNA。利用针对抗体重链和轻链可变区的引物分别扩增VH和VL基因片段，将两种Error prone PCR产物进行纯化并测定浓度，再用含柔性连接肽的引物将VH和VL基因片段通过连 接片段组装到一起形成单链抗体编码序列。将单链抗体编码片段ScFv纯化并与载体pPNL6 连接，通过高效醋酸锂转化法转化进入EBYlOO酵母中，构建半合成抗体文库。
[0026] 实施例2 cTNI单链抗体突变体库的构建
[0027] 1.用磁珠法和流式细胞术筛选结合对半人源化单链抗体库进行筛选：
[0028] A.体外大肠杆菌表达cTNI蛋白作为抗原；
[0029] B.将磁珠与cTNI蛋白结合，借助抗原与抗体特异性结合，经过3轮"吸附-洗 脱-扩增"循环，实现对单链抗体的富集筛选。
[0030] C. cTNI蛋白用荧光素 FITC标记，单链抗体会竞争性的与靶抗原进行结合，被流式 细胞分选仪分选出来。
[0031] D.流式细胞分选以后，随机挑取单菌落进行单链抗体的分泌表达，ELISA方法检 测表达抗体的特异性，获得可表达特异性单链抗体的阳性菌株。
[0032] 2.构建用于细菌中的竞争性表达载体pRSF-Autodisplay 。
[0033] 3.初步筛选的阳性菌株进行PCR，获得阳性菌株pPNL6-ScFv的DNA片段。
[0034] 4.设计含Sfil酶切位点的引物，对该DNA片段进行Erron PCR，扩增抗体重链和 轻链可变区基因。
[0035] 5. cTNI单链抗体scFv突变体库的构建：双酶切scFv基因片段，并插入 pRSF-Autodisplay构建重组质粒，转化感受态E. coli Turbo细胞，获得抗cTnl蛋白单链抗 体突变体库。
[0036] 6.实验方法：随机挑取6株单克隆菌，送北京擎科生物科技有限公司进行插入区 域的DNA序列测定。
[0037] 实验结果：DNA序列测定分析可知插入率> 99 %，6株均可以正确通读，经 ClustalW序列比对软件分析，其中两个序列一致，序列比对结果见表。
[0038] 表· ClustalW序列比对分析结果
[0039]
[0040] 7.随机挑取的克隆之间的DNA序列不同，证明该抗体库的多样性良好。
[0041] 实施例3 :从细菌抗体突变体库中筛选人源单链抗体
[0042] 用磁珠法进行筛选：
[0043] 1.体外大肠杆菌表达cTNI蛋白作为抗原；
[0044] 2.将磁珠与cTNI蛋白结合，借助抗原与抗体特异性结合，经过3轮"吸附-洗 脱-扩增"循环，实现对单链抗体的富集筛选。
[0045] 3.随机挑选最后一轮得到的克隆20个，送北京擎科生物科技有限公司进行scFv 区域的DNA序列测定。并进行单链抗体序列的结构分析。
[0046]
[0047] 实施例4抗体的制备
[0048] 1.对阳性菌株进行重复试验，确定稳定性最好的阳性菌株，将其命名为 cTnl-Anti-ScFv 2A-2,提取该质粒DNA，序列测定得到其相应的核苷酸序列。该单链抗体由 重链可变区、连接所述重链可变区和轻链可变区的短肽、轻链可变区顺次连接组成。重链可 变区如图IN端第36至162位所述氨基酸残基序列；轻链可变区如图IN端第183位至248 位所示氨基酸残基序列。编码所述cTnl蛋白单链抗体的基因，由重链可变区的编码序列、 连接重链可变区的编码序列和轻链可变区的编码序列组成。重链可变区的编码序列如图1 自5'末端第106至486位所示核苷酸序列，轻链可变区的编码序列如图1自5'末端第549 至744位所示核苷酸序列（其后跟上3位编码基因 TGA，作为终止子）。
[0049] 2.细菌表达抗体蛋白。
[0050] 1).以BL21 (DE3)为宿主菌，将cTnl-Anti-ScFv 2A-2进行转化，挑取单菌落于3ml LB培养基培养过夜；
[0051] 2).以1 : 500比例将菌液转接至400ml LB培养基，恒温在37°C，230rpm培养至 0D600 = 0. 4-0. 6 ；
[0052] 3).加 IPTG诱导，IPTG诱导终浓度为0. 5mM，保持25°C条件下表达8小时后收菌。
[0053] 4) · cTnl-Anti-ScFv 2A-2 蛋白的纯化：
[0054] A.取400ml培养液3000rpm离心分离10分钟后收集菌体，菌体重悬于IOml蛋 白提取缓冲液中（50mM Na-PO4, ρΗ8· 0, 500mM NaCl，IOmMImidazle)，15MPa 高压破菌， 12,000印111，4°(^离心1〇111；[11，上清液与附-阶4冰上孵育1小时；
[0055] B.过Ni-NTA亲和层析柱，用蛋白提取buffer洗绦，最后用250mM Imidazle洗脱， 收集洗脱液。
[0056] C.蛋白洗脱液过G50柱去除Imidazle，这样可以得到90 %以上纯度的 cTnl-Anti-ScFv 2A-2 蛋白。
[0057] D.收集上述纯化产物，进行12% SDS-PAGE电泳。
[0058] 3. cTnl-Anti-ScFv 2A-2 蛋白含量测定：
【附图说明】
[0059] 图1、细菌表达载体pRSF-Autodisplay构建图谱
[0060] 图 2、PCR 扩增 pPNL6-ScFv 的 DNA 片段
[0061] 图 3、erron PCR 二次扩增 pPNL6-ScFv 的 DNA 片段。
【主权项】
1. 一种cTNI单链抗体库，其特征在于：该抗体库含有全套人类抗体重链可变区VH和 轻链可变区VL，及中间连接区linker序列，有完整的抗原结合部位，以pRSF-Autodisplay 为载体，库容达到2X105。2. 根据权利要求1所述的一种cTNI单链抗体库的构建方法，其特征在于通过以下步骤 实现： (1) 本发明将分别提取20名男性和女性成人脾脏及淋巴结mRNA，合并后将其逆转录成 cDNA。利用针对抗体重链和轻链可变区的引物分别扩增VH和VL基因片段，将两种Error pronePCR产物进行纯化并测定浓度，再用含柔性连接肽的引物将VH和VL基因片段通过连 接片段组装到一起形成单链抗体编码序列。将单链抗体编码片段ScFv纯化并与载体pPNL6 连接，通过高效醋酸锂转化法转化进入EBY100酵母中，构建半合成抗体文库。 (2) 以体外大肠杆菌表达cTNI蛋白作为抗原，磁珠法和流式细胞术筛选结合进行筛 选，获得可表达特异性单链抗体的阳性菌株。 (3) 构建用于细菌中的竞争性表达载体pRSF-Autodisplay。 (4) 初步筛选的阳性菌株进行PCR，获得阳性菌株pPNL6-ScFv的DNA片段。 (5) 设计含Sfil酶切位点的引物，对该DNA片段进行ErronPCR，扩增抗体重链和轻链 可变区基因。 (6) Sfil双酶切scFv基因片段，并插入pRSF-Autodisplay构建重组质粒，转化感受态 E.coliTurbo细胞，获得抗cTnl蛋白单链抗体突变体库。3. 单链抗体库的多样性分析：随机挑取多个单克隆菌，测定插入区scFv基因的DNA序 列，经ClustalW序列比对软件分析其序列的相似性，判断单链抗体库的多样性分析，证明 其多样性良好。
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，涉及一种构建cTnl蛋白的单链抗体T突变体库的方法，以细菌pRSF-Autodisplay为载体，库容达到1.5×105，经DNA测序证明其多样性良好。从该全人源cTnl单链抗体库中，通过细菌展示技术，以cTnl抗原为靶标，经过多轮淘筛，可以方便地获得cTnl的人源单链抗体。本发明的单链抗体是用基因工程方法将抗体重链可变区和轻链可变区通过一段连接肽连接而成的重组抗体，是保持了亲本抗体的抗原亲和活性和特异性的最小功能性抗体片段，可通过基因工程技术体外表达得到，可在细菌中经济地大规模生产，从而使得免疫检测用抗体的生产变得非常容易、简便和经济，进而大大减少检测试剂的费用，具有灵敏度高、特异性强和操作简便的特点，适合于对大量样品的筛检，应用前景十分广阔。
【IPC分类】C40B40/10, C40B50/06
【公开号】CN104894652
【申请号】CN201510353199
【发明人】肖飞, 黄薇, 许宏涛, 姜惠英, 王萌, 邹丽辉
【申请人】黄薇
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月25日
【技术领域】
[0001] 本发明属基因工程，涉及一种人源cTnl单链抗体库的构建及其应用。
【背景技术】
[0002] 抗体技术发展经历了三个阶段，第一代为抗血清多克隆抗体，第二代为70年代中 期德国学者Kohler和英国学者Milstein利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备了杂交瘤单克 隆抗体（McAb)，这一发现是生物技术发展的里程碑之一，它在诊断，治疗，预防和蛋白质提 纯等方面已显示了重要重要。然而，由于异蛋白易引起人抗小鼠抗体（Human anti-mouse antibody，HAM)反应，而人杂交瘤技术又难以突破，因此出现了第三代抗体，基因工程抗 体。基因工程抗体包括三种，即嵌合抗体，改形抗体和抗体库技术制备的抗体。其中前两者 属部分人源化抗体，抗体库技术制备的抗体属全人源化抗体。
[0003] 抗体库技术不仅可以模拟动物免疫系统产生抗体的过程，还具有许多独特的优 点，令杂交瘤技术难以相比。抗体库技术无需免疫，从理论上讲，10 1°的库容就可能包容所 有的抗体。利用抗原即可直接从非免疫动物抗体库中筛选出特异性抗体，并能筛选到针对 该物种自身抗原的抗体。从人的抗体库中可以得到完全是人源的McAb，克服了难以用杂交 瘤技术获得人源McAb的障碍。
[0004] 酵母是一种理想的真核生物表达载体宿主，其基因的表达调控及蛋白质的翻译后 加工、分泌机制比较接近高等真核生物，对哺乳动物蛋白质，尤其是对人的蛋白质的展示有 独特的优越性。但受到酵母细胞转化率低的限制，构建酵母文库时需进行多个小文库的建 立，再将多个小文库进行并库，使得建库过程繁琐、复杂。在开发的多种展示技术中，细菌表 面展示技术的应用研宄近年来取得了显著进展，该技术结合流式细胞筛选，可进行有效的 高通量筛选。细菌细胞增殖快，培养成本低廉，利于大量制备高纯度抗体。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种cTnl单链抗体库，即细菌单链抗体库，含有人类抗 体重链可变区VH和轻链可变区VL，及中间连接区，有完整的抗原结合部位，以细菌 pRSF-Autodisplay为载体，库容达到2 X 105。经DNA序列分析后证明其多样性良好，并且 可以通过感染宿主（大肠细菌Turbo)进行大量扩增和再生。利用细菌体外表达的cTNI蛋 白作为抗原，通过细菌展示的方法，方便地筛选出cTNI特异的单链抗体，进而用于cTNI的 检测。
[0006] 本发明的另一个目的是提供一种cTNI单链抗体库的构建方法，通过以下技术方 案实现：
[0007] 1.本发明将分别提取20名男性和女性成人脾脏及淋巴结mRNA，合并后将其逆转 录成cDNA。利用针对抗体重链和轻链可变区的引物分别扩增VH和VL基因片段，将两种 Error prone PCR产物进行纯化并测定浓度，再用含柔性连接肽的引物将VH和VL基因片段 通过连接片段组装到一起形成单链抗体编码序列。将单链抗体编码片段ScFv纯化并与载 体PPNL6连接，通过高效醋酸锂转化法转化进入EBYlOO酵母中，构建半合成抗体文库。
[0008] 2.用磁珠法和流式细胞术筛选结合进行筛选：
[0009] A.体外大肠杆菌表达cTNI蛋白作为抗原；
[0010] B.将磁珠与cTNI蛋白结合，借助抗原与抗体特异性结合，经过3轮"吸附-洗 脱-扩增"循环，实现对单链抗体的富集筛选。
[0011] C. cTNI蛋白用荧光素 FITC标记，单链抗体会竞争性的与靶抗原进行结合，被流式 细胞分选仪分选出来。
[0012] D.流式细胞分选以后，随机挑取单菌落进行单链抗体的分泌表达，ELISA方法检 测表达抗体的特异性，获得可表达特异性单链抗体的阳性菌株。
[0013] 3.构建用于细菌中的竞争性表达载体pRSF-Autodisplay。
[0014] 4.初步筛选的阳性菌株进行PCR，获得阳性菌株pPNL6-ScFv的DNA片段。
[0015] 5.设计含Sfil酶切位点的引物，对该DNA片段进行Erron PCR，扩增抗体重链和 轻链可变区基因。
[0016] 6. cTNI单链抗体scFv突变体库的构建：用Sfil双酶切scFv基因片段，并插入 pRSF-Autodisplay构建重组质粒，转化感受态E. coli Turbo细胞，获得抗cTnl蛋白单链抗 体突变体库。
[0017] 7.利用磁珠法和流式细胞术筛选结合对单链抗体突变体库进行富集筛选。
[0018] 8.随机挑取单菌落进行单链抗体的分泌表达，ELISA方法检测表达抗体的特异 性，获得可表达特异性单链抗体的阳性菌株。
[0019] 9.单链抗体库的多样性分析：随机挑取多个单克隆菌，测定插入区scFv基因的 DNA序列，经ClustalW序列比对软件分析其序列的相似性，判断单链抗体库的多样性分析， 证明其多样性良好。
[0020] 本发明的特点是：
[0021] (1)本发明提供的人源CTNI单链抗体突变体库，以细菌pRSF-Autodisplay为载 体，库容达到2X10 5,多样性良好；单链抗体由重链可变区VH和轻链可变区VL通过连接肽 连接而成，且含有完整的抗原结合部位。
[0022] (2)本发明提供的构建人源cTNI单链抗体突变体库的技术，从人类半合成抗体文 库出发，以cTnl蛋白为抗原，获取野生型cTnl抗体，利用Error prone PCR等分子生物学 技术结合细菌展示技术，通过重复电转化，获得人源cTNI单链抗体突变体库抗体库；技术 可操作性强，库容量大。
[0023] (3)本发明的人源cTNI单链抗体突变体库，因为以细菌为载体，通过感染大肠杆 菌而扩增并将单链抗体展示在细菌表面，从而可以用特定的cTNI相关抗原作为靶标，方便 地筛选出对cTNI特异的全人源单链抗体，这些人源单链抗体可作为检测试剂，用于cTNI筛 查。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1 :半人源化单链抗体库的构建
[0025] 本发明将分别提取20名男性和女性成人脾脏及淋巴结mRNA，合并后将其逆转录 成cDNA。利用针对抗体重链和轻链可变区的引物分别扩增VH和VL基因片段，将两种Error prone PCR产物进行纯化并测定浓度，再用含柔性连接肽的引物将VH和VL基因片段通过连 接片段组装到一起形成单链抗体编码序列。将单链抗体编码片段ScFv纯化并与载体pPNL6 连接，通过高效醋酸锂转化法转化进入EBYlOO酵母中，构建半合成抗体文库。
[0026] 实施例2 cTNI单链抗体突变体库的构建
[0027] 1.用磁珠法和流式细胞术筛选结合对半人源化单链抗体库进行筛选：
[0028] A.体外大肠杆菌表达cTNI蛋白作为抗原；
[0029] B.将磁珠与cTNI蛋白结合，借助抗原与抗体特异性结合，经过3轮"吸附-洗 脱-扩增"循环，实现对单链抗体的富集筛选。
[0030] C. cTNI蛋白用荧光素 FITC标记，单链抗体会竞争性的与靶抗原进行结合，被流式 细胞分选仪分选出来。
[0031] D.流式细胞分选以后，随机挑取单菌落进行单链抗体的分泌表达，ELISA方法检 测表达抗体的特异性，获得可表达特异性单链抗体的阳性菌株。
[0032] 2.构建用于细菌中的竞争性表达载体pRSF-Autodisplay 。
[0033] 3.初步筛选的阳性菌株进行PCR，获得阳性菌株pPNL6-ScFv的DNA片段。
[0034] 4.设计含Sfil酶切位点的引物，对该DNA片段进行Erron PCR，扩增抗体重链和 轻链可变区基因。
[0035] 5. cTNI单链抗体scFv突变体库的构建：双酶切scFv基因片段，并插入 pRSF-Autodisplay构建重组质粒，转化感受态E. coli Turbo细胞，获得抗cTnl蛋白单链抗 体突变体库。
[0036] 6.实验方法：随机挑取6株单克隆菌，送北京擎科生物科技有限公司进行插入区 域的DNA序列测定。
[0037] 实验结果：DNA序列测定分析可知插入率> 99 %，6株均可以正确通读，经 ClustalW序列比对软件分析，其中两个序列一致，序列比对结果见表。
[0038] 表· ClustalW序列比对分析结果
[0039]
[0040] 7.随机挑取的克隆之间的DNA序列不同，证明该抗体库的多样性良好。
[0041] 实施例3 :从细菌抗体突变体库中筛选人源单链抗体
[0042] 用磁珠法进行筛选：
[0043] 1.体外大肠杆菌表达cTNI蛋白作为抗原；
[0044] 2.将磁珠与cTNI蛋白结合，借助抗原与抗体特异性结合，经过3轮"吸附-洗 脱-扩增"循环，实现对单链抗体的富集筛选。
[0045] 3.随机挑选最后一轮得到的克隆20个，送北京擎科生物科技有限公司进行scFv 区域的DNA序列测定。并进行单链抗体序列的结构分析。
[0046]
[0047] 实施例4抗体的制备
[0048] 1.对阳性菌株进行重复试验，确定稳定性最好的阳性菌株，将其命名为 cTnl-Anti-ScFv 2A-2,提取该质粒DNA，序列测定得到其相应的核苷酸序列。该单链抗体由 重链可变区、连接所述重链可变区和轻链可变区的短肽、轻链可变区顺次连接组成。重链可 变区如图IN端第36至162位所述氨基酸残基序列；轻链可变区如图IN端第183位至248 位所示氨基酸残基序列。编码所述cTnl蛋白单链抗体的基因，由重链可变区的编码序列、 连接重链可变区的编码序列和轻链可变区的编码序列组成。重链可变区的编码序列如图1 自5'末端第106至486位所示核苷酸序列，轻链可变区的编码序列如图1自5'末端第549 至744位所示核苷酸序列（其后跟上3位编码基因 TGA，作为终止子）。
[0049] 2.细菌表达抗体蛋白。
[0050] 1).以BL21 (DE3)为宿主菌，将cTnl-Anti-ScFv 2A-2进行转化，挑取单菌落于3ml LB培养基培养过夜；
[0051] 2).以1 : 500比例将菌液转接至400ml LB培养基，恒温在37°C，230rpm培养至 0D600 = 0. 4-0. 6 ；
[0052] 3).加 IPTG诱导，IPTG诱导终浓度为0. 5mM，保持25°C条件下表达8小时后收菌。
[0053] 4) · cTnl-Anti-ScFv 2A-2 蛋白的纯化：
[0054] A.取400ml培养液3000rpm离心分离10分钟后收集菌体，菌体重悬于IOml蛋 白提取缓冲液中（50mM Na-PO4, ρΗ8· 0, 500mM NaCl，IOmMImidazle)，15MPa 高压破菌， 12,000印111，4°(^离心1〇111；[11，上清液与附-阶4冰上孵育1小时；
[0055] B.过Ni-NTA亲和层析柱，用蛋白提取buffer洗绦，最后用250mM Imidazle洗脱， 收集洗脱液。
[0056] C.蛋白洗脱液过G50柱去除Imidazle，这样可以得到90 %以上纯度的 cTnl-Anti-ScFv 2A-2 蛋白。
[0057] D.收集上述纯化产物，进行12% SDS-PAGE电泳。
[0058] 3. cTnl-Anti-ScFv 2A-2 蛋白含量测定：
【附图说明】
[0059] 图1、细菌表达载体pRSF-Autodisplay构建图谱
[0060] 图 2、PCR 扩增 pPNL6-ScFv 的 DNA 片段
[0061] 图 3、erron PCR 二次扩增 pPNL6-ScFv 的 DNA 片段。
【主权项】
1. 一种cTNI单链抗体库，其特征在于：该抗体库含有全套人类抗体重链可变区VH和 轻链可变区VL，及中间连接区linker序列，有完整的抗原结合部位，以pRSF-Autodisplay 为载体，库容达到2X105。2. 根据权利要求1所述的一种cTNI单链抗体库的构建方法，其特征在于通过以下步骤 实现： (1) 本发明将分别提取20名男性和女性成人脾脏及淋巴结mRNA，合并后将其逆转录成 cDNA。利用针对抗体重链和轻链可变区的引物分别扩增VH和VL基因片段，将两种Error pronePCR产物进行纯化并测定浓度，再用含柔性连接肽的引物将VH和VL基因片段通过连 接片段组装到一起形成单链抗体编码序列。将单链抗体编码片段ScFv纯化并与载体pPNL6 连接，通过高效醋酸锂转化法转化进入EBY100酵母中，构建半合成抗体文库。 (2) 以体外大肠杆菌表达cTNI蛋白作为抗原，磁珠法和流式细胞术筛选结合进行筛 选，获得可表达特异性单链抗体的阳性菌株。 (3) 构建用于细菌中的竞争性表达载体pRSF-Autodisplay。 (4) 初步筛选的阳性菌株进行PCR，获得阳性菌株pPNL6-ScFv的DNA片段。 (5) 设计含Sfil酶切位点的引物，对该DNA片段进行ErronPCR，扩增抗体重链和轻链 可变区基因。 (6) Sfil双酶切scFv基因片段，并插入pRSF-Autodisplay构建重组质粒，转化感受态 E.coliTurbo细胞，获得抗cTnl蛋白单链抗体突变体库。3. 单链抗体库的多样性分析：随机挑取多个单克隆菌，测定插入区scFv基因的DNA序 列，经ClustalW序列比对软件分析其序列的相似性，判断单链抗体库的多样性分析，证明 其多样性良好。
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，涉及一种构建cTnl蛋白的单链抗体T突变体库的方法，以细菌pRSF-Autodisplay为载体，库容达到1.5×105，经DNA测序证明其多样性良好。从该全人源cTnl单链抗体库中，通过细菌展示技术，以cTnl抗原为靶标，经过多轮淘筛，可以方便地获得cTnl的人源单链抗体。本发明的单链抗体是用基因工程方法将抗体重链可变区和轻链可变区通过一段连接肽连接而成的重组抗体，是保持了亲本抗体的抗原亲和活性和特异性的最小功能性抗体片段，可通过基因工程技术体外表达得到，可在细菌中经济地大规模生产，从而使得免疫检测用抗体的生产变得非常容易、简便和经济，进而大大减少检测试剂的费用，具有灵敏度高、特异性强和操作简便的特点，适合于对大量样品的筛检，应用前景十分广阔。
【IPC分类】C40B40/10, C40B50/06
【公开号】CN104894652
【申请号】CN201510353199
【发明人】肖飞, 黄薇, 许宏涛, 姜惠英, 王萌, 邹丽辉
【申请人】黄薇
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月25日
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