酚类雌激素的提取方法
酚类雌激素的提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及样品分离领域，具体而言，涉及一种酚类雌激素的提取方法。
【背景技术】
[0002] 环境雌激素是指存在于环境中，具有类似生物体内雌激素活性的化学物质。双酚 A、壬基酚和辛基酚等数十种化合物以其相似的结构特征和类雌激素活性被划分为同一类 的分析研宄对象，统称为酚类雌激素，其危害有：1)对生殖和发育的危害，表现为性腺发育 不良，易导致生殖道肿瘤和先天畸形；2)对神经系统的危害，表现为神经运动损伤，短时记 忆缺陷及低智商；3)对免疫系统的危害，表现为雌激素浓度大于生理浓度时，可增加免疫 性疾病的隐患性。
[0003] 酚类雌激素广泛应用于现代社会的生产生活中，并通过各种途径进入环境介质， 进而进入野生动物和人体中。为了评估酚类雌激素对环境生态和人群健康的危害，需要对 环境和生物样品中的酚类雌激素进行检测。
[0004]目前大多数对环境此激素进行提取或检测都是关于中草药或环境样品，相比而 言，动物离体组织样品由于基质复杂，目标物浓度低，其酚类雌激素检测一直是个棘手的问 题。显然，寻求一种高效便捷的样品前处理方法是解决这一难题的关键。
[0005] 前处理方法中最关键的步骤为目标化合物的提取，传统方法主要有索氏抽提和振 荡法。传统的提取方法存在诸多缺陷，例如操作过程繁琐费时、提取与净化效率低、容易引 入误差、需要使用大量有毒溶剂、对目标化合物的检出限要求很高、目标化合物稳定性差等 等。由于上述缺点，传统提取方法无法有效应用于离体动物组织样品的前处理，使得离体动 物组织中酚类雌激素的检测面临难以克服的障碍。
[0006] 需要特别说明的是，与一般的环境样品或植物样品（包括中草药）相比，离体动物 组织样品成分更加复杂，对目标化合物的干扰因素更多。离体动物组织样品含大量的水、 蛋白质和高脂肪，因此，脱水、脱蛋白质和脱脂成为离体动物组织前处理过程不可缺少的操 作。在进行这些层层操作过程中，目标化合物也很容易同时被除去，导致提取失败或提取效 率低下。另外，离体动物组织中的糖类、维生素、酶、无机盐等物质也给目标化合物的提取带 来许多干扰和困难。
[0007] 因此，亟需突破传统提取技术的限制，，寻求一种快速、高效地提取复杂动物离体 组织中的酚类雌激素的方法，以便更准确地检测动物离体组织样品中酚类雌激素的含量。
【发明内容】
[0008] 本发明的主要目的在于建立一种酚类雌激素的提取方法，以提供一种从复杂的离 体动物组织中简单、高效提取酚类雌激素的方法。
[0009] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种酚类雌激素的提取方法， 该提取方法包括以下步骤：S1，将离体动物组织置于萃取溶剂中；S2,对离体动物组织进行 微波萃取，得到微波萃取液；S3,对微波萃取液采用固相萃取柱分离，得到酚类雌激素。
[0010] 进一步地，在步骤si中，萃取溶剂为极性溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合 物；优选萃取溶剂的体积为10~20ml，更优选地，离体动物组织与萃取溶剂的质量体积比 为 1/20-1/1。
[0011] 进一步地，极性溶剂为乙醇、甲醇或者丙酮与水的混合物；非极性溶剂为环己烷、 正己烷或二氯化碳。
[0012] 进一步地，在步骤S1之前，提取方法还包括对离体动物组织进行冷冻干燥的步 骤，优选冷冻干燥的步骤采用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，更优选真空冷冻干燥机的冷 却温度为-10°C~-50°c;真空度为1. 3~13pa，冷冻干燥的时间为18~48h。
[0013] 进一步地，在步骤S2中，微波萃取的温度为80~120°C，优选微波萃取的时间为 10 ~25min〇
[0014] 进一步地，在步骤S3中，在对微波萃取液采用固相萃取柱分离之前，还包括对固 相萃取柱进行活化的步骤。
[0015] 进一步地，固相萃取柱为Florisil柱或HLB固相萃取柱。
[0016] 进一步地，步骤S3包括以下步骤：S31，对固相萃取柱进行活化，得到活化固相萃 取柱；S32,以0. 5-2ml/min的流速将微波萃取液转移至活化固相萃取柱中；S33,用淋洗液 对固相萃取柱进行淋洗，得到去除杂质的固相萃取柱；S34,用洗脱液对去除杂质的固相萃 取柱进行洗脱，得到酚类雌激素。
[0017] 进一步地，淋洗液为正己烷、甲醇与水的混合液或者乙酸乙酯与正己烷的混合液； 优选淋洗液的体积为3-8ml。
[0018] 进一步地，洗脱液为甲醇、乙腈、甲醇与乙腈的混合液、正己烷与丙酮的混合液或 者乙酸乙酯与正己烷的混合液；优选洗脱液的体积为6-10ml。
[0019] 应用本发明的技术方案，通过采用微波萃取的方法，利用动物组织样品中不同物 质的介电常数不同，吸收微波能的程度不同的这种差异，选择性地将目标物质酚类雌激素 从动物组织基质中萃取出来，然后通过固相萃取柱进行除杂分离，从而得到纯度和含量相 对较高的酚类雌激素。
【具体实施方式】
[0020] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相 互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
[0021] 如【背景技术】部分所提到，在现有技术中，环境雌激素的提取或检测大多都是针对 中草药、食品或者环境样品，而离体动物组织由于基质复杂，目标物浓度低而无法采用现有 的检测方法进行高效准确地检测其中的雌激素，尤其是酚类雌激素。为了改善现有技术中 的上述缺陷，在本发明典型的实施方式中，提供了一种酚类雌激素的提取方法，该提取方法 包括以下步骤：S1，将离体动物组织置于萃取溶剂中；S2,对离体动物组织进行微波萃取， 得到微波萃取液；S3,对微波萃取液采用固相萃取柱分离，得到酚类雌激素。
[0022] 本发明的上述提取方法，通过采用微波萃取的方法，利用离体动物组织样品中不 同物质的介电常数不同，吸收微波能的程度不同的这种差异，选择性地将目标物质酚类雌 激素从动物组织基质中萃取出来，然后通过固相萃取柱进行除杂分离，从而得到纯度和含 量相对较高的酚类雌激素。
[0023] 在本发明的上述提取方法中，对离体动物组织进行萃取的萃取溶剂可以根据所欲 提取的具体的环境雌激素的种类的不同进行合理选择。在本发明一种优选的实施例中，在 上述步骤S1中，萃取溶剂为极性溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物；优选萃取溶剂的 体积为10~30ml。根据萃取的相似相容原理，选择与目标提取物质极性相似的溶剂作为萃 取溶剂，萃取效果相对较高。对于非极性的目标分离物质，需要采用非极性溶剂与极性溶剂 的混合物，即在非极性溶剂中加入一定量的极性溶剂，原因是由于相似相溶的原理需要选 择一种非极性溶剂，但是微波萃取时又需要极性溶液用于吸收微波能量，所以萃取溶剂采 用极性与非极性溶剂的混合溶液萃取效果好。
[0024] 上述步骤S1中，具体所用到的萃取溶剂的体积可以根据所要处理的离体动物组 织的量进行适当调整，本发明优选将萃取溶剂的体积控制在10~30ml之内，所加入的萃取 溶剂量既能达到有效萃取离体动物组织中的酚类雌激素的目的，又难以造成溶剂过量、增 加成本以及后续去除溶剂等额外步骤。更优选地，离体动物组织与萃取溶剂的质量体积比 为1/20-1/1。将待分离的离体动物组织的质量与萃取溶剂的体积之间的比例控制在上述范 围内，能够更有效地萃取离体动物组织中的酚类雌激素，从而使得对离体动物组织中的酚 类雌激素的检测结果更准确。
[0025] 由于本发明的上述提取方法是针对离体动物组织中的酚类雌激素的，其中所含有 的双酚A、四溴双酚A、雌二醇、雌三醇、乙烯雌酚和氯酚、极性酚类雌激素，壬基酚、辛基酚 和丁基酚非极性酚类雌激素，因而对这些酚类雌激素进行提取时，所用的萃取溶剂既可以 是极性溶剂也可以是非极性溶剂与极性溶剂的混合物。当然，具体的极性溶剂和非极性溶 剂可以从本领域常用的萃取溶剂中进行选择。
[0026] 在本发明一种优选的实施例中，当萃取溶剂为极性溶剂时，极性溶剂为乙醇、甲醇 或者丙酮和水的混合物；当萃取溶剂为非极性溶剂与极性溶剂的混合物时，非极性溶剂为 环己烷、正己烷或二氯化碳。选用乙醇、甲醇或丙酮和水的混合物作为极性的萃取溶剂，对 极性雌激素双酚A、四溴双酚A、雌二醇、雌三醇、乙烯雌酚或氯酚成分具有较高的萃取效 率。而选用上述非极性溶剂和极性溶剂的混合物作为萃取溶剂对壬基酚、辛基酚或丁基 酚.成分具有较高的萃取效率。其中，本发明所优选的非极性溶剂有环己烷、正己烷或二氯 化碳。
[0027] 在本发明的上述提取方法中，在向离体动物组织中加入萃取溶剂之前，优选离体 动物组织处于干燥状态，这样减少离体动物组织中的水分影响萃取溶剂的萃取效率。因而， 若离体动物组织本身为干燥的，可以直接添加萃取溶剂；若离体动物组织中含有水分，优选 在步骤S1之前，对离体动物组织进行冷冻干燥，优选冷冻干燥的步骤采用真空冷冻干燥机 进行冷冻干燥，更优选真空冷冻干燥机的冷却温度为-10°C~-50°c;真空度为1. 3~13pa， 冷冻干燥的时间为18~48h。
[0028] 采用冷冻干燥的方式对离体动物组织进行干燥，可以减少对动物组织细胞的损伤 及细胞内部成分的破坏，使动物组织细胞尽可能地保持原有状态。采用真空冷冻干燥机进 行冷冻干燥，能够实现样品的快速冷冻和干燥。在冷却温度为-l〇°C~-50°C;真空度为 1. 3~13pa的真空冷冻干燥机的设置条件下冷冻干燥的时间为18~48h能够将离体动物 组织样品中的水分去除的更快、更彻底。为使离体动物组织处于与真空干燥冷冻机的冷冻 干燥条件更接近的环境中，进一步减少冷冻干燥过程中对离体动物组织细胞成分的破坏， 在本发明另一种优选的实例中，在进行冷冻干燥之前，还包括在_8〇°C的冰箱或者液氮中进 行预冷冻的步骤。
[0029] 在本发明的上述步骤S2中，微波萃取的温度和时间可以根据离体动物组织量的 多少进行合理微调。在本发明一种优选的实施例中，微波萃取的温度为80~120°C，优选微 波萃取的时间为10~25min。将微波萃取的温度和时间控制在上述范围内，能够使离体动 物组织中的酚类雌激素相对完全地从动物基质中分离出来，进而获得相对高含量的酚类雌 激素。
[0030] 在本发明的上述步骤S3中，由于现有的固相萃取柱在使用前是未经活化的，因而 在对微波萃取液采用固相萃取柱分离之前，还包括对固相萃取柱进行活化的步骤。如果所 使用的固相萃取柱在使用前已经是活化好的，即可直接进行上柱分离。本发明所适用的固 相萃取柱包括但不仅限于市售的Florisil柱或HLB柱（Waters公司 ）。Florisil柱和HLB 柱具有回收率高，对雌激素分离效果好的优点。
[0031] 在本发明的上述步骤S3中，固相萃取柱分离的步骤可以根据本发明的离体动物 组织的不同进行适当调整。在本发明一种优选的实例中，上述步骤S3包括以下步骤：S31， 对固相萃取柱进行活化，得到活化固相萃取柱；S32,以0. 5-2ml/min的流速将微波萃取液 转移至活化固相萃取柱中；S33,用淋洗液对固相萃取柱进行淋洗，得到去除杂质的固相萃 取柱；S34,用洗脱液对去除杂质的固相萃取柱进行洗脱，得到酚类雌激素。
[0032] 上述优选实施例中，通过控制流速在0. 5_2ml/min范围内，使得待测酷类雌激素 与固相分离柱中的固体填料充分吸附，然后用淋洗液除去杂质，最后用洗脱液将目标酚类 雌激素洗脱并收集。
[0033] 在本发明的上述提取方法中，淋洗液对固相萃取柱进行淋洗的目的是除去目标酚 类雌激素之外的其他杂质，因而，采用能够使样品溶解的溶液来作为洗脱液，容易使附着在 柱上的杂质冲洗下来。在本发明一种优选的实施例中，淋洗液为正己烷、甲醇与水的混合液 或者乙酸乙酯与正己烷的混合液；优选淋洗液的体积为3~8ml。采用上述溶液作为淋洗 液具有能够将固相分离柱中附着的离体动物组织中的水、蛋白、脂肪、糖类、维生素、酶、无 机盐等杂质去除的相对彻底的效果。
[0034]在本发明的上述提取方法中，洗脱液是在除杂之后，将吸附在固相分离柱中的固 体填料上的目标分离物质洗脱下来，得到目标分离物质。在本发明另一种优选的实施例中， 上述洗脱液为甲醇、乙腈或者甲醇与乙腈的混合液、正己烷与丙酮的混合液或者乙酸乙酯 与正己烷的混合液；优选洗脱液的体积为6~10ml。采用上述溶液作为洗脱液具有将酚类 雌激素双酚A、四溴双酚A、雌二醇、雌三醇、乙烯雌酚和氯酚、壬基酚、辛基酚和丁基酚洗脱 下来。而使用较小体积的洗脱液洗脱目标化合物能够使目标化合物的浓度相对较高，便于 后续的检测。
[0035] 下面将结合具体的实施例来进一步说明本发明的有益效果。
[0036] 下列实施例中所用的试剂或药品，若无特殊说明，均来自百灵威科技有限公司。固 相萃取柱均来自浙江格陵设备科技有限公司，甲醇来自上海凌峰化学试剂有限公司；丙酮 来自衢州巨化试剂有限公司；二氯甲烷来自西陇化工股份有限公司；无水乙醇来自安徽安 特食品股份有限公司。
[0037] 实施例1 :螺蛳肌肉组织中双酚A的提取
[0038] (a)冷冻干燥：将新鲜螺蛳洗净、去壳，留取肌肉组织5g，置于_80°C冰箱中；24小 时后，置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥24小时，其中，真空冷冻干燥机的冷却温度为_30°C; 真空度为5pa;
[0039] (b)微波萃取：将冷冻干燥后的螺蛳肌肉样品解冻至室温，磨碎过筛，加入15mL无 水乙醇为溶剂；微波萃取lOmin，温度100°C;对获得的萃取液进行离心，获取上清液。
[0040] (c)净化除杂：将上述上清液吹干，加2ml甲醇重新溶解，转移至已经活化平衡 的？1〇1^8；11柱固相萃取柱中，并控制上样的流速11]11/1]1；[11 ;以31]丄20%的甲醇为淋洗液对 Florisil柱固相萃取柱进行淋洗除杂，然后用6mL甲醇为洗脱液进行洗脱，得到螺蛳肌肉 组织中的双酚A。
[0041] 实施例2:猪的肌肉组织中双酚A的提取
[0042] (a)冷冻干燥：取猪的肌肉组织lg置于液氮中，预冷冻12小时后，置于真空冷冻 干燥机中18小时，其中，真空冷冻干燥机的冷却温度为-50°C;真空度为13pa;
[0043] (2)微波萃取：将冷冻干燥后的猪肉样品解冻到室温，研磨过筛，加入10ml甲醇和 l〇ml丙酮为萃取溶剂，微波萃取25min，温度80°C;对获得的萃取液进行离心，取上清液。
[0044] (c)净化除杂：将上述上清液转移到试管，氮吹干后加4ml甲醇重新溶解，然后置 于Florisil固相萃取柱中，控制为流速2ml/min;采用5mL甲醇-水（1 : 1，v/v)作为淋 洗液进行淋洗除杂：；然后用8mL甲醇-乙腈（1 :l，v/v)作为洗脱液进行洗脱，得到猪肉 组织中的双酚A。
[0045] 实施例3:鲫鱼肌肉组织中双酚A、壬基酚、辛基酚的同时提取
[0046] (a)冷冻干燥，对新鲜的鲤鱼进行解剖，留取肌肉组织部分3g，置于_80°C冰箱中； 24小时后，置于真空冷冻干燥机中48小时；其中，真空冷冻干燥机的冷却温度为-10°C，真 空度为1. 3pa;
[0047] (b)微波萃取：将冷冻干燥后的鲤鱼样品解冻到室温，研磨过筛，加入20ml二氯甲 烷/甲醇（2:1，v/v)为萃取溶剂，微波萃取15min，温度120°C;对获得的萃取液进行离心， 取上清液。
[0048] (c)净化除杂：将上述上清液转移到试管中，氮气吹干后加4ml甲醇重新溶解，通 过固相萃取柱HLB，上样流速为0. 5ml/min，淋洗液是8ml甲醇/水（体积比40 :60)，然后 依次用l〇ml甲醇、10ml二氯甲烷、10ml甲醇和二氯甲烷（体积比15:85)的混合液作为洗 脱液进行洗脱；并将洗脱液一并收集，同时别得到鲤鱼肌肉组织中双酚A、壬基酚、辛基酚。
[0049] 实施例4:猪的肌肉组织中双酚A的提取
[0050] (a)冷冻干燥：取猪的肌肉组织20g置于液氮中，预冷冻12小时后，置于真空冷冻 干燥机中18小时，其中，真空冷冻干燥机的冷却温度为_5°C;真空度为15pa;
[0051] (2)微波萃取：将冷冻干燥后的猪肉样品解冻到室温，研磨过筛，加入10ml甲醇和 l〇ml丙酮为萃取溶剂，微波萃取28min，温度125°C;对获得的萃取液进行离心，取上清液。
[0052] (c)净化除杂：将上述上清液转移到试管，氮吹干后加4ml甲醇重新溶解，然后置 于Florisil固相萃取柱中，控制为流速0. 4ml/min;采用5mL甲醇-水（1 :l，v/v)作为 淋洗液进行淋洗除杂：；然后用8mL甲醇-乙腈（1 :l，v/v)作为洗脱液进行洗脱，得到猪 肉组织中的双酚A。
[0053] 对上述各实施例所得到的酚类雌激素中的双酚A含量的加标回收率和相对标准 偏差进行检测，检测结果见表1。
[0054] 其中，加标回收率是指在没有被测物质的空白样品基质中加入定量的标准物质， 按样品的处理步骤分析，得到的结果与理论值的比值。计算公式：加标回收率=(加标试样 测定值一试样测定值加标量X100%。加标回收率是用来监测前处理过程对待测物的 损失有多少，是体现前处理好坏的一个指标。
[0055] 表 1 :
[0058] 表1中数据显示，本发明的方法能够有效提取常见的离体动物组织中的环境雌激 素，且加标回收率和相对标准偏差数值都比较理想。且相比现有中药草和食品中酚类雌激 素的有索氏提取和振荡法，本发明提供的方法具有花费时间少、溶剂消耗少、操作便捷、提 取效率高的优点。
[0059] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种酚类雌激素的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤： S1，将离体动物组织置于萃取溶剂中； S2,对所述离体动物组织进行微波萃取，得到微波萃取液； S3，对所述微波萃取液采用固相萃取柱分离，得到所述酚类雌激素。2. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，在所述步骤Sl中，所述萃取溶剂为极 性溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物；优选所述萃取溶剂的体积为10~20ml，更优选 地，所述离体动物组织与所述萃取溶剂的质量体积比为1/20-1/1。3. 根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述极性溶剂为乙醇、甲醇或者丙酮 与水的混合物；所述非极性溶剂为环己烷、正己烷或二氯化碳。4. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，在所述步骤Sl之前，所述提取方法 还包括对所述离体动物组织进行冷冻干燥的步骤，优选所述冷冻干燥的步骤采用真空冷冻 干燥机进行冷冻干燥，更优选所述真空冷冻干燥机的冷却温度为-KTC~-50°C;真空度为 L3~13pa，所述冷冻干燥的时间为18~48h。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的提取方法，其特征在于，在所述步骤S2中，所述 微波萃取的温度为80~120°C，优选所述微波萃取的时间为10~25min。6. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，在所述步骤S3中，在对所述微波萃取 液采用固相萃取柱分离之前，还包括对所述固相萃取柱进行活化的步骤。7. 根据权利要求1或6所述的提取方法，其特征在于，所述固相萃取柱为Florisil柱 或HLB固相萃取柱。8. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤S3包括以下步骤： S31，对所述固相萃取柱进行活化，得到活化固相萃取柱； 532, 以0. 5-2ml/min的流速将所述微波萃取液转移至所述活化固相萃取柱中； 533, 用淋洗液对所述固相萃取柱进行淋洗，得到去除杂质的固相萃取柱； 534, 用洗脱液对所述去除杂质的固相萃取柱进行洗脱，得到所述酚类雌激素。9. 根据权利要求8所述的提取方法，其特征在于，所述淋洗液为正己烷、甲醇与水的混 合液或者乙酸乙酯与正己烷的混合液；优选所述淋洗液的体积为3-8ml。10. 根据权利要求8所述的提取方法，其特征在于，所述洗脱液为甲醇、乙腈、甲醇与乙 腈的混合液、正己烷与丙酮的混合液或者乙酸乙酯与正己烷的混合液；优选所述洗脱液的 体积为6-10ml。
【专利摘要】本发明提供了一种酚类雌激素的提取方法，该提取方法包括以下步骤：S1，将离体动物组织置于萃取溶剂中；S2，对离体动物组织进行微波萃取，得到微波萃取液；S3，对微波萃取液采用固相萃取柱分离，得到酚类雌激素。上述提取方法通过采用微波萃取的方法，利用离体动物组织样品中不同物质的介电常数不同，吸收微波能的程度不同的这种差异，选择性地将目标物质酚类雌激素从动物组织基质中萃取出来，然后通过固相萃取柱进行除杂分离，从而得到纯度和含量相对较高的酚类雌激素。
【IPC分类】G01N1/34
【公开号】CN104897455
【申请号】CN201510320246
【发明人】林振坤, 张艳芳, 贾银行, 李艳艳
【申请人】温州医科大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月11日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及样品分离领域，具体而言，涉及一种酚类雌激素的提取方法。
【背景技术】
[0002] 环境雌激素是指存在于环境中，具有类似生物体内雌激素活性的化学物质。双酚 A、壬基酚和辛基酚等数十种化合物以其相似的结构特征和类雌激素活性被划分为同一类 的分析研宄对象，统称为酚类雌激素，其危害有：1)对生殖和发育的危害，表现为性腺发育 不良，易导致生殖道肿瘤和先天畸形；2)对神经系统的危害，表现为神经运动损伤，短时记 忆缺陷及低智商；3)对免疫系统的危害，表现为雌激素浓度大于生理浓度时，可增加免疫 性疾病的隐患性。
[0003] 酚类雌激素广泛应用于现代社会的生产生活中，并通过各种途径进入环境介质， 进而进入野生动物和人体中。为了评估酚类雌激素对环境生态和人群健康的危害，需要对 环境和生物样品中的酚类雌激素进行检测。
[0004]目前大多数对环境此激素进行提取或检测都是关于中草药或环境样品，相比而 言，动物离体组织样品由于基质复杂，目标物浓度低，其酚类雌激素检测一直是个棘手的问 题。显然，寻求一种高效便捷的样品前处理方法是解决这一难题的关键。
[0005] 前处理方法中最关键的步骤为目标化合物的提取，传统方法主要有索氏抽提和振 荡法。传统的提取方法存在诸多缺陷，例如操作过程繁琐费时、提取与净化效率低、容易引 入误差、需要使用大量有毒溶剂、对目标化合物的检出限要求很高、目标化合物稳定性差等 等。由于上述缺点，传统提取方法无法有效应用于离体动物组织样品的前处理，使得离体动 物组织中酚类雌激素的检测面临难以克服的障碍。
[0006] 需要特别说明的是，与一般的环境样品或植物样品（包括中草药）相比，离体动物 组织样品成分更加复杂，对目标化合物的干扰因素更多。离体动物组织样品含大量的水、 蛋白质和高脂肪，因此，脱水、脱蛋白质和脱脂成为离体动物组织前处理过程不可缺少的操 作。在进行这些层层操作过程中，目标化合物也很容易同时被除去，导致提取失败或提取效 率低下。另外，离体动物组织中的糖类、维生素、酶、无机盐等物质也给目标化合物的提取带 来许多干扰和困难。
[0007] 因此，亟需突破传统提取技术的限制，，寻求一种快速、高效地提取复杂动物离体 组织中的酚类雌激素的方法，以便更准确地检测动物离体组织样品中酚类雌激素的含量。
【发明内容】
[0008] 本发明的主要目的在于建立一种酚类雌激素的提取方法，以提供一种从复杂的离 体动物组织中简单、高效提取酚类雌激素的方法。
[0009] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种酚类雌激素的提取方法， 该提取方法包括以下步骤：S1，将离体动物组织置于萃取溶剂中；S2,对离体动物组织进行 微波萃取，得到微波萃取液；S3,对微波萃取液采用固相萃取柱分离，得到酚类雌激素。
[0010] 进一步地，在步骤si中，萃取溶剂为极性溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合 物；优选萃取溶剂的体积为10~20ml，更优选地，离体动物组织与萃取溶剂的质量体积比 为 1/20-1/1。
[0011] 进一步地，极性溶剂为乙醇、甲醇或者丙酮与水的混合物；非极性溶剂为环己烷、 正己烷或二氯化碳。
[0012] 进一步地，在步骤S1之前，提取方法还包括对离体动物组织进行冷冻干燥的步 骤，优选冷冻干燥的步骤采用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，更优选真空冷冻干燥机的冷 却温度为-10°C~-50°c;真空度为1. 3~13pa，冷冻干燥的时间为18~48h。
[0013] 进一步地，在步骤S2中，微波萃取的温度为80~120°C，优选微波萃取的时间为 10 ~25min〇
[0014] 进一步地，在步骤S3中，在对微波萃取液采用固相萃取柱分离之前，还包括对固 相萃取柱进行活化的步骤。
[0015] 进一步地，固相萃取柱为Florisil柱或HLB固相萃取柱。
[0016] 进一步地，步骤S3包括以下步骤：S31，对固相萃取柱进行活化，得到活化固相萃 取柱；S32,以0. 5-2ml/min的流速将微波萃取液转移至活化固相萃取柱中；S33,用淋洗液 对固相萃取柱进行淋洗，得到去除杂质的固相萃取柱；S34,用洗脱液对去除杂质的固相萃 取柱进行洗脱，得到酚类雌激素。
[0017] 进一步地，淋洗液为正己烷、甲醇与水的混合液或者乙酸乙酯与正己烷的混合液； 优选淋洗液的体积为3-8ml。
[0018] 进一步地，洗脱液为甲醇、乙腈、甲醇与乙腈的混合液、正己烷与丙酮的混合液或 者乙酸乙酯与正己烷的混合液；优选洗脱液的体积为6-10ml。
[0019] 应用本发明的技术方案，通过采用微波萃取的方法，利用动物组织样品中不同物 质的介电常数不同，吸收微波能的程度不同的这种差异，选择性地将目标物质酚类雌激素 从动物组织基质中萃取出来，然后通过固相萃取柱进行除杂分离，从而得到纯度和含量相 对较高的酚类雌激素。
【具体实施方式】
[0020] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相 互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
[0021] 如【背景技术】部分所提到，在现有技术中，环境雌激素的提取或检测大多都是针对 中草药、食品或者环境样品，而离体动物组织由于基质复杂，目标物浓度低而无法采用现有 的检测方法进行高效准确地检测其中的雌激素，尤其是酚类雌激素。为了改善现有技术中 的上述缺陷，在本发明典型的实施方式中，提供了一种酚类雌激素的提取方法，该提取方法 包括以下步骤：S1，将离体动物组织置于萃取溶剂中；S2,对离体动物组织进行微波萃取， 得到微波萃取液；S3,对微波萃取液采用固相萃取柱分离，得到酚类雌激素。
[0022] 本发明的上述提取方法，通过采用微波萃取的方法，利用离体动物组织样品中不 同物质的介电常数不同，吸收微波能的程度不同的这种差异，选择性地将目标物质酚类雌 激素从动物组织基质中萃取出来，然后通过固相萃取柱进行除杂分离，从而得到纯度和含 量相对较高的酚类雌激素。
[0023] 在本发明的上述提取方法中，对离体动物组织进行萃取的萃取溶剂可以根据所欲 提取的具体的环境雌激素的种类的不同进行合理选择。在本发明一种优选的实施例中，在 上述步骤S1中，萃取溶剂为极性溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物；优选萃取溶剂的 体积为10~30ml。根据萃取的相似相容原理，选择与目标提取物质极性相似的溶剂作为萃 取溶剂，萃取效果相对较高。对于非极性的目标分离物质，需要采用非极性溶剂与极性溶剂 的混合物，即在非极性溶剂中加入一定量的极性溶剂，原因是由于相似相溶的原理需要选 择一种非极性溶剂，但是微波萃取时又需要极性溶液用于吸收微波能量，所以萃取溶剂采 用极性与非极性溶剂的混合溶液萃取效果好。
[0024] 上述步骤S1中，具体所用到的萃取溶剂的体积可以根据所要处理的离体动物组 织的量进行适当调整，本发明优选将萃取溶剂的体积控制在10~30ml之内，所加入的萃取 溶剂量既能达到有效萃取离体动物组织中的酚类雌激素的目的，又难以造成溶剂过量、增 加成本以及后续去除溶剂等额外步骤。更优选地，离体动物组织与萃取溶剂的质量体积比 为1/20-1/1。将待分离的离体动物组织的质量与萃取溶剂的体积之间的比例控制在上述范 围内，能够更有效地萃取离体动物组织中的酚类雌激素，从而使得对离体动物组织中的酚 类雌激素的检测结果更准确。
[0025] 由于本发明的上述提取方法是针对离体动物组织中的酚类雌激素的，其中所含有 的双酚A、四溴双酚A、雌二醇、雌三醇、乙烯雌酚和氯酚、极性酚类雌激素，壬基酚、辛基酚 和丁基酚非极性酚类雌激素，因而对这些酚类雌激素进行提取时，所用的萃取溶剂既可以 是极性溶剂也可以是非极性溶剂与极性溶剂的混合物。当然，具体的极性溶剂和非极性溶 剂可以从本领域常用的萃取溶剂中进行选择。
[0026] 在本发明一种优选的实施例中，当萃取溶剂为极性溶剂时，极性溶剂为乙醇、甲醇 或者丙酮和水的混合物；当萃取溶剂为非极性溶剂与极性溶剂的混合物时，非极性溶剂为 环己烷、正己烷或二氯化碳。选用乙醇、甲醇或丙酮和水的混合物作为极性的萃取溶剂，对 极性雌激素双酚A、四溴双酚A、雌二醇、雌三醇、乙烯雌酚或氯酚成分具有较高的萃取效 率。而选用上述非极性溶剂和极性溶剂的混合物作为萃取溶剂对壬基酚、辛基酚或丁基 酚.成分具有较高的萃取效率。其中，本发明所优选的非极性溶剂有环己烷、正己烷或二氯 化碳。
[0027] 在本发明的上述提取方法中，在向离体动物组织中加入萃取溶剂之前，优选离体 动物组织处于干燥状态，这样减少离体动物组织中的水分影响萃取溶剂的萃取效率。因而， 若离体动物组织本身为干燥的，可以直接添加萃取溶剂；若离体动物组织中含有水分，优选 在步骤S1之前，对离体动物组织进行冷冻干燥，优选冷冻干燥的步骤采用真空冷冻干燥机 进行冷冻干燥，更优选真空冷冻干燥机的冷却温度为-10°C~-50°c;真空度为1. 3~13pa， 冷冻干燥的时间为18~48h。
[0028] 采用冷冻干燥的方式对离体动物组织进行干燥，可以减少对动物组织细胞的损伤 及细胞内部成分的破坏，使动物组织细胞尽可能地保持原有状态。采用真空冷冻干燥机进 行冷冻干燥，能够实现样品的快速冷冻和干燥。在冷却温度为-l〇°C~-50°C;真空度为 1. 3~13pa的真空冷冻干燥机的设置条件下冷冻干燥的时间为18~48h能够将离体动物 组织样品中的水分去除的更快、更彻底。为使离体动物组织处于与真空干燥冷冻机的冷冻 干燥条件更接近的环境中，进一步减少冷冻干燥过程中对离体动物组织细胞成分的破坏， 在本发明另一种优选的实例中，在进行冷冻干燥之前，还包括在_8〇°C的冰箱或者液氮中进 行预冷冻的步骤。
[0029] 在本发明的上述步骤S2中，微波萃取的温度和时间可以根据离体动物组织量的 多少进行合理微调。在本发明一种优选的实施例中，微波萃取的温度为80~120°C，优选微 波萃取的时间为10~25min。将微波萃取的温度和时间控制在上述范围内，能够使离体动 物组织中的酚类雌激素相对完全地从动物基质中分离出来，进而获得相对高含量的酚类雌 激素。
[0030] 在本发明的上述步骤S3中，由于现有的固相萃取柱在使用前是未经活化的，因而 在对微波萃取液采用固相萃取柱分离之前，还包括对固相萃取柱进行活化的步骤。如果所 使用的固相萃取柱在使用前已经是活化好的，即可直接进行上柱分离。本发明所适用的固 相萃取柱包括但不仅限于市售的Florisil柱或HLB柱（Waters公司 ）。Florisil柱和HLB 柱具有回收率高，对雌激素分离效果好的优点。
[0031] 在本发明的上述步骤S3中，固相萃取柱分离的步骤可以根据本发明的离体动物 组织的不同进行适当调整。在本发明一种优选的实例中，上述步骤S3包括以下步骤：S31， 对固相萃取柱进行活化，得到活化固相萃取柱；S32,以0. 5-2ml/min的流速将微波萃取液 转移至活化固相萃取柱中；S33,用淋洗液对固相萃取柱进行淋洗，得到去除杂质的固相萃 取柱；S34,用洗脱液对去除杂质的固相萃取柱进行洗脱，得到酚类雌激素。
[0032] 上述优选实施例中，通过控制流速在0. 5_2ml/min范围内，使得待测酷类雌激素 与固相分离柱中的固体填料充分吸附，然后用淋洗液除去杂质，最后用洗脱液将目标酚类 雌激素洗脱并收集。
[0033] 在本发明的上述提取方法中，淋洗液对固相萃取柱进行淋洗的目的是除去目标酚 类雌激素之外的其他杂质，因而，采用能够使样品溶解的溶液来作为洗脱液，容易使附着在 柱上的杂质冲洗下来。在本发明一种优选的实施例中，淋洗液为正己烷、甲醇与水的混合液 或者乙酸乙酯与正己烷的混合液；优选淋洗液的体积为3~8ml。采用上述溶液作为淋洗 液具有能够将固相分离柱中附着的离体动物组织中的水、蛋白、脂肪、糖类、维生素、酶、无 机盐等杂质去除的相对彻底的效果。
[0034]在本发明的上述提取方法中，洗脱液是在除杂之后，将吸附在固相分离柱中的固 体填料上的目标分离物质洗脱下来，得到目标分离物质。在本发明另一种优选的实施例中， 上述洗脱液为甲醇、乙腈或者甲醇与乙腈的混合液、正己烷与丙酮的混合液或者乙酸乙酯 与正己烷的混合液；优选洗脱液的体积为6~10ml。采用上述溶液作为洗脱液具有将酚类 雌激素双酚A、四溴双酚A、雌二醇、雌三醇、乙烯雌酚和氯酚、壬基酚、辛基酚和丁基酚洗脱 下来。而使用较小体积的洗脱液洗脱目标化合物能够使目标化合物的浓度相对较高，便于 后续的检测。
[0035] 下面将结合具体的实施例来进一步说明本发明的有益效果。
[0036] 下列实施例中所用的试剂或药品，若无特殊说明，均来自百灵威科技有限公司。固 相萃取柱均来自浙江格陵设备科技有限公司，甲醇来自上海凌峰化学试剂有限公司；丙酮 来自衢州巨化试剂有限公司；二氯甲烷来自西陇化工股份有限公司；无水乙醇来自安徽安 特食品股份有限公司。
[0037] 实施例1 :螺蛳肌肉组织中双酚A的提取
[0038] (a)冷冻干燥：将新鲜螺蛳洗净、去壳，留取肌肉组织5g，置于_80°C冰箱中；24小 时后，置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥24小时，其中，真空冷冻干燥机的冷却温度为_30°C; 真空度为5pa;
[0039] (b)微波萃取：将冷冻干燥后的螺蛳肌肉样品解冻至室温，磨碎过筛，加入15mL无 水乙醇为溶剂；微波萃取lOmin，温度100°C;对获得的萃取液进行离心，获取上清液。
[0040] (c)净化除杂：将上述上清液吹干，加2ml甲醇重新溶解，转移至已经活化平衡 的？1〇1^8；11柱固相萃取柱中，并控制上样的流速11]11/1]1；[11 ;以31]丄20%的甲醇为淋洗液对 Florisil柱固相萃取柱进行淋洗除杂，然后用6mL甲醇为洗脱液进行洗脱，得到螺蛳肌肉 组织中的双酚A。
[0041] 实施例2:猪的肌肉组织中双酚A的提取
[0042] (a)冷冻干燥：取猪的肌肉组织lg置于液氮中，预冷冻12小时后，置于真空冷冻 干燥机中18小时，其中，真空冷冻干燥机的冷却温度为-50°C;真空度为13pa;
[0043] (2)微波萃取：将冷冻干燥后的猪肉样品解冻到室温，研磨过筛，加入10ml甲醇和 l〇ml丙酮为萃取溶剂，微波萃取25min，温度80°C;对获得的萃取液进行离心，取上清液。
[0044] (c)净化除杂：将上述上清液转移到试管，氮吹干后加4ml甲醇重新溶解，然后置 于Florisil固相萃取柱中，控制为流速2ml/min;采用5mL甲醇-水（1 : 1，v/v)作为淋 洗液进行淋洗除杂：；然后用8mL甲醇-乙腈（1 :l，v/v)作为洗脱液进行洗脱，得到猪肉 组织中的双酚A。
[0045] 实施例3:鲫鱼肌肉组织中双酚A、壬基酚、辛基酚的同时提取
[0046] (a)冷冻干燥，对新鲜的鲤鱼进行解剖，留取肌肉组织部分3g，置于_80°C冰箱中； 24小时后，置于真空冷冻干燥机中48小时；其中，真空冷冻干燥机的冷却温度为-10°C，真 空度为1. 3pa;
[0047] (b)微波萃取：将冷冻干燥后的鲤鱼样品解冻到室温，研磨过筛，加入20ml二氯甲 烷/甲醇（2:1，v/v)为萃取溶剂，微波萃取15min，温度120°C;对获得的萃取液进行离心， 取上清液。
[0048] (c)净化除杂：将上述上清液转移到试管中，氮气吹干后加4ml甲醇重新溶解，通 过固相萃取柱HLB，上样流速为0. 5ml/min，淋洗液是8ml甲醇/水（体积比40 :60)，然后 依次用l〇ml甲醇、10ml二氯甲烷、10ml甲醇和二氯甲烷（体积比15:85)的混合液作为洗 脱液进行洗脱；并将洗脱液一并收集，同时别得到鲤鱼肌肉组织中双酚A、壬基酚、辛基酚。
[0049] 实施例4:猪的肌肉组织中双酚A的提取
[0050] (a)冷冻干燥：取猪的肌肉组织20g置于液氮中，预冷冻12小时后，置于真空冷冻 干燥机中18小时，其中，真空冷冻干燥机的冷却温度为_5°C;真空度为15pa;
[0051] (2)微波萃取：将冷冻干燥后的猪肉样品解冻到室温，研磨过筛，加入10ml甲醇和 l〇ml丙酮为萃取溶剂，微波萃取28min，温度125°C;对获得的萃取液进行离心，取上清液。
[0052] (c)净化除杂：将上述上清液转移到试管，氮吹干后加4ml甲醇重新溶解，然后置 于Florisil固相萃取柱中，控制为流速0. 4ml/min;采用5mL甲醇-水（1 :l，v/v)作为 淋洗液进行淋洗除杂：；然后用8mL甲醇-乙腈（1 :l，v/v)作为洗脱液进行洗脱，得到猪 肉组织中的双酚A。
[0053] 对上述各实施例所得到的酚类雌激素中的双酚A含量的加标回收率和相对标准 偏差进行检测，检测结果见表1。
[0054] 其中，加标回收率是指在没有被测物质的空白样品基质中加入定量的标准物质， 按样品的处理步骤分析，得到的结果与理论值的比值。计算公式：加标回收率=(加标试样 测定值一试样测定值加标量X100%。加标回收率是用来监测前处理过程对待测物的 损失有多少，是体现前处理好坏的一个指标。
[0055] 表 1 :
[0058] 表1中数据显示，本发明的方法能够有效提取常见的离体动物组织中的环境雌激 素，且加标回收率和相对标准偏差数值都比较理想。且相比现有中药草和食品中酚类雌激 素的有索氏提取和振荡法，本发明提供的方法具有花费时间少、溶剂消耗少、操作便捷、提 取效率高的优点。
[0059] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种酚类雌激素的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤： S1，将离体动物组织置于萃取溶剂中； S2,对所述离体动物组织进行微波萃取，得到微波萃取液； S3，对所述微波萃取液采用固相萃取柱分离，得到所述酚类雌激素。2. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，在所述步骤Sl中，所述萃取溶剂为极 性溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物；优选所述萃取溶剂的体积为10~20ml，更优选 地，所述离体动物组织与所述萃取溶剂的质量体积比为1/20-1/1。3. 根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述极性溶剂为乙醇、甲醇或者丙酮 与水的混合物；所述非极性溶剂为环己烷、正己烷或二氯化碳。4. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，在所述步骤Sl之前，所述提取方法 还包括对所述离体动物组织进行冷冻干燥的步骤，优选所述冷冻干燥的步骤采用真空冷冻 干燥机进行冷冻干燥，更优选所述真空冷冻干燥机的冷却温度为-KTC~-50°C;真空度为 L3~13pa，所述冷冻干燥的时间为18~48h。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的提取方法，其特征在于，在所述步骤S2中，所述 微波萃取的温度为80~120°C，优选所述微波萃取的时间为10~25min。6. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，在所述步骤S3中，在对所述微波萃取 液采用固相萃取柱分离之前，还包括对所述固相萃取柱进行活化的步骤。7. 根据权利要求1或6所述的提取方法，其特征在于，所述固相萃取柱为Florisil柱 或HLB固相萃取柱。8. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤S3包括以下步骤： S31，对所述固相萃取柱进行活化，得到活化固相萃取柱； 532, 以0. 5-2ml/min的流速将所述微波萃取液转移至所述活化固相萃取柱中； 533, 用淋洗液对所述固相萃取柱进行淋洗，得到去除杂质的固相萃取柱； 534, 用洗脱液对所述去除杂质的固相萃取柱进行洗脱，得到所述酚类雌激素。9. 根据权利要求8所述的提取方法，其特征在于，所述淋洗液为正己烷、甲醇与水的混 合液或者乙酸乙酯与正己烷的混合液；优选所述淋洗液的体积为3-8ml。10. 根据权利要求8所述的提取方法，其特征在于，所述洗脱液为甲醇、乙腈、甲醇与乙 腈的混合液、正己烷与丙酮的混合液或者乙酸乙酯与正己烷的混合液；优选所述洗脱液的 体积为6-10ml。
【专利摘要】本发明提供了一种酚类雌激素的提取方法，该提取方法包括以下步骤：S1，将离体动物组织置于萃取溶剂中；S2，对离体动物组织进行微波萃取，得到微波萃取液；S3，对微波萃取液采用固相萃取柱分离，得到酚类雌激素。上述提取方法通过采用微波萃取的方法，利用离体动物组织样品中不同物质的介电常数不同，吸收微波能的程度不同的这种差异，选择性地将目标物质酚类雌激素从动物组织基质中萃取出来，然后通过固相萃取柱进行除杂分离，从而得到纯度和含量相对较高的酚类雌激素。
【IPC分类】G01N1/34
【公开号】CN104897455
【申请号】CN201510320246
【发明人】林振坤, 张艳芳, 贾银行, 李艳艳
【申请人】温州医科大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月11日
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