一种定量评估药物溶血性指标的方法
一种定量评估药物溶血性指标的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种定量评估药物溶血性指标的方法。
【背景技术】
[0002] 某些中药注射剂，由于含有溶血成分（皂苷）或物理、化学及生物等方面的原因， 在直接注入血管后可产生溶血作用，也有些注射剂中因含有杂质等成分，注入局部会引起 胀痛，注入血管后可产生血细胞凝聚，引起血液循环功能障碍等不良反应，因此，凡是注 射剂和可能引起免疫性溶血或非免疫性溶血反应的其他药物制剂均应进行溶血性试验。溶 血性试验将考察受试药物是否具有溶血和红细胞凝聚等不良反应。
[0003] 中草药注射剂溶血作用测定方法，多年来一直用常规的试管法观察其溶血现象， 也有用溶血指数法测定溶血作用的，但不能精确地检测中草药注射剂的溶血作用。秦百宣 探讨出以红细胞计数测定中草药溶血值的新方法，周燕文采用全自动血球分析仪计数红细 胞，它们虽能够精确测定任何浓度下溶解红细胞的具体数值，对临床安全用药具有重要的 意义，但操作工序较为繁琐。在常规体外试管法基础上，刘萍等根据红细胞破裂释放出来的 血红素在可见光波长段具有最大吸收的原理，采用分光光度法测定供试药物的溶血程度， 以作为判断中药注射剂的临床应用标准，但该方法采用的标准只局限于本次试验，具有相 对性，并且一次只能适用于一种药物溶血性测试。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种定量评估药物溶血性指标的方法，能够同时用于多种注射剂溶 血性检测。
[0005] 本发明提供一种定量评估药物溶血性指标的方法，步骤如下：（1)用常规试管法 测定供试药品溶血性，从而确定供试药品含量的临界值A，即出现溶血、部分溶血或出现凝 集反应与否时的供试药品含量；其中常规试管法步骤如下：将供试药品、2%红细胞混悬液 和生理盐水混合得到混合液，反应一段时间后，肉眼观察是否出现溶血、部分溶血或出现凝 集反应；固定混合液总体积B和2%红细胞混悬液体积C，调整供试药品和生理盐水的体积 进行反应，来确定供试药品含量的临界值； (2) 标准液的制备：分别以2%红细胞混悬液体积C的5%、20%作为溶质，以蒸馏水作为 溶剂，配制总体积为B的标准液；将其分别称为5%标准液和20%标准液； (3) 标准液中血红蛋白含量OD545nm值的测定； (4) 以供试药品含量临界值A、生理盐水和2%红细胞混悬液体积C配制总体积为B的 混合液，并测定混合液的〇D545nJl; (5) 结果判定：如果供试药品混合液的OD值小于20%标准液的OD值，则供试药品可用 于肌肉注射；如果供试药品混合液的OD值小于5%标准液的OD值，则供试药品可用于静脉 注射。
[0006] 优选地，所述标准液还包括以2%红细胞体积C的0%-4%或6%-19%中任一浓度作 为溶质配制的溶液。
[0007] 优选地，步骤（4)中是将混合液混合均匀后置37°C恒温恒湿箱中反应，之后吸取 上清液于比色皿中，进行测定的。
[0008] 本发明的方法是在中药注射剂溶血性常规试管检测方法的基础上，结合中华人民 共和国国家标准GB/-142332-93之规定，利用分光光度计测定试管中红细胞溶解产生的血 红蛋白含量OD值，通过比较供试药品所在试管溶液OD值与标准参考管溶液的OD值，以确 定供试药品是否符合要求。本发明用测得的OD值替代了常规方法中眼观结果，准确度高， 能够定量检测，并且可以同时进行多种不同供试药品溶血性的检测。为中药注射剂研宄与 开发提供了一种快捷、客观、准确判定能否用于临床静脉注射、肌肉注射的新方法。
【具体实施方式】
[0009] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0010] 实施例1 1、材料需求： 器材：三角瓶、试管架，试管，分光光度计，比色杯，移液器，恒温恒湿箱； 试剂：蒸馏水，0. 9%生理盐水，2%红细胞悬液； 其它：供试药品，玻璃珠。
[0011] 2、具体实施方法 (1)2% (v/v)红细胞混悬液制备：取受试动物或人新鲜血液(约20ml)，加入装有玻璃 的三角烧瓶中，振摇5-10min分钟或用玻璃棒搅拌，除去纤维蛋白原，加0. 9%氯化钠溶液约 10倍量，1000-1500转/min，离心洗涤2-3次，至上清液呈澄清为止。然后用生理盐水将所 得红细胞配成2 %红细胞混悬液。备用。
[0012] (2 )进行现有常规试管法： 取试管7支，编号并置于试管架上，按表1所述加入各溶液。
[0013] 表 1
[0014] 结果判定：1小时后，通过眼睛观察，第3管或第3管以前的各管出现溶血、部分溶 血或出现凝集反应的供试药品，不宜做静脉注射或肌肉注射。
[0015] (3 )定量评估药物溶血性指标： 在上述常规试管法中第3号试管红细胞溶血度或溶血情况是确定供试样品是否用于 静脉或肌肉注射的关键点。因此，以第3管药物样品量（0. 300ml)作为测试品用量。
[0016] 依据中华人民共和国国家标准GB/-142332-93中"溶血度小于5%时，药品可用于 静脉注射，溶血度小于20%时，可用于肌肉注射"的规定，由于上述方法中2%的红细胞悬液 总用量为2. 50ml，按照该总量的0%、3%、5%、10%、15%、20%设立不同红细胞悬液量梯度。
[0017] 具体试验方法为：取干净试管9支，按表2排列并编号，1-6管为实验通用管，7-9 为供试药品管（3个重复管，药物样品量0. 300ml)，依次分别加入表2中所述各种物质，混 合，摇匀，置37°C恒湿恒温箱中，1小时后，轻轻吸取上清液于比色皿中，在545nm波长下进 行比色，测定各管OD值。则各OD值分别为2%的红细胞悬液在0%、3%、5%、10%、15%、20%溶 血度时的血红蛋白含量OD值。
[0018] 表 2
[0019] 结果判定： 按照国家标准GB/-142332-93,将供试药品管所测的OD值与第3管、第6管对应的OD值（OD3、OD6)直接比较，如果OD样s <0D6则供试药品可用于肌肉注射，OD样s <OD3则供试药品 可用于静脉注射。
[0020] 以上结果判定是基于药物对红细胞不凝集的情况下，如果发生凝集，则直接按相 关药物对红细胞影响的规定作出结论定性。
[0021] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可 以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。
【主权项】
1. 一种定量评估药物溶血性指标的方法，其特征在于：步骤如下：（1)用常规试管法 测定供试药品溶血性，从而确定供试药品含量的临界值A，即出现溶血、部分溶血或出现凝 集反应与否时的供试药品含量；其中常规试管法步骤如下：将供试药品、2%红细胞混悬液 和生理盐水混合得到混合液，反应一段时间后，肉眼观察是否出现溶血、部分溶血或出现凝 集反应；固定混合液总体积B和2%红细胞混悬液体积C，调整供试药品和生理盐水的体积 进行反应，来确定供试药品含量的临界值； (2) 标准液的制备：分别以2%红细胞混悬液体积C的5%、20%作为溶质，以蒸馏水作为 溶剂，配制总体积为B的标准液；将其分别称为5%标准液和20%标准液； (3) 标准液中血红蛋白含量OD545nm值的测定； (4) 以供试药品含量临界值A、生理盐水和2%红细胞混悬液体积C配制总体积为B的 混合液，并测定混合液的OD545nJl; (5) 结果判定：如果供试药品混合液的OD值小于20%标准液的OD值，则供试药品可用 于肌肉注射；如果供试药品混合液的OD值小于5%标准液的OD值，则供试药品可用于静脉 注射。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述标准液还包括以2%红细胞体积C的 0%-4%或6%-19%中任一浓度作为溶质配制的溶液。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4)中是将混合液混合均匀后置 37°C恒温恒湿箱中反应，之后吸取上清液于比色皿中，进行测定的。
【专利摘要】本发明提供一种定量评估药物溶血性指标的方法，步骤如下：（1）用常规试管法测定供试药品溶血性，从而确定供试药品含量的临界值A；（2）标准液的制备：分别以2%红细胞混悬液体积C的5%、20%作为溶质，以蒸馏水作为溶剂，配制总体积为B的标准液；将其分别称为5%标准液和20%标准液；（3）测定标准液中血红蛋白含量OD545nm值；（4）以供试药品含量临界值A、生理盐水和2%红细胞混悬液体积C配制总体积为B的混合液，并测定混合液的OD545nm值；（5）结果判定。本发明的方法替代了常规方法中眼观结果，准确度高，能够定量检测，并且可以同时进行多种不同供试药品溶血性的检测。
【IPC分类】G01N21/31
【公开号】CN104897589
【申请号】CN201510295237
【发明人】程富胜, 张继瑜, 张霞, 周绪正, 李冰, 魏小娟, 牛建荣, 刘宇, 王娟娟
【申请人】中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月2日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种定量评估药物溶血性指标的方法。
【背景技术】
[0002] 某些中药注射剂，由于含有溶血成分（皂苷）或物理、化学及生物等方面的原因， 在直接注入血管后可产生溶血作用，也有些注射剂中因含有杂质等成分，注入局部会引起 胀痛，注入血管后可产生血细胞凝聚，引起血液循环功能障碍等不良反应，因此，凡是注 射剂和可能引起免疫性溶血或非免疫性溶血反应的其他药物制剂均应进行溶血性试验。溶 血性试验将考察受试药物是否具有溶血和红细胞凝聚等不良反应。
[0003] 中草药注射剂溶血作用测定方法，多年来一直用常规的试管法观察其溶血现象， 也有用溶血指数法测定溶血作用的，但不能精确地检测中草药注射剂的溶血作用。秦百宣 探讨出以红细胞计数测定中草药溶血值的新方法，周燕文采用全自动血球分析仪计数红细 胞，它们虽能够精确测定任何浓度下溶解红细胞的具体数值，对临床安全用药具有重要的 意义，但操作工序较为繁琐。在常规体外试管法基础上，刘萍等根据红细胞破裂释放出来的 血红素在可见光波长段具有最大吸收的原理，采用分光光度法测定供试药物的溶血程度， 以作为判断中药注射剂的临床应用标准，但该方法采用的标准只局限于本次试验，具有相 对性，并且一次只能适用于一种药物溶血性测试。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种定量评估药物溶血性指标的方法，能够同时用于多种注射剂溶 血性检测。
[0005] 本发明提供一种定量评估药物溶血性指标的方法，步骤如下：（1)用常规试管法 测定供试药品溶血性，从而确定供试药品含量的临界值A，即出现溶血、部分溶血或出现凝 集反应与否时的供试药品含量；其中常规试管法步骤如下：将供试药品、2%红细胞混悬液 和生理盐水混合得到混合液，反应一段时间后，肉眼观察是否出现溶血、部分溶血或出现凝 集反应；固定混合液总体积B和2%红细胞混悬液体积C，调整供试药品和生理盐水的体积 进行反应，来确定供试药品含量的临界值； (2) 标准液的制备：分别以2%红细胞混悬液体积C的5%、20%作为溶质，以蒸馏水作为 溶剂，配制总体积为B的标准液；将其分别称为5%标准液和20%标准液； (3) 标准液中血红蛋白含量OD545nm值的测定； (4) 以供试药品含量临界值A、生理盐水和2%红细胞混悬液体积C配制总体积为B的 混合液，并测定混合液的〇D545nJl; (5) 结果判定：如果供试药品混合液的OD值小于20%标准液的OD值，则供试药品可用 于肌肉注射；如果供试药品混合液的OD值小于5%标准液的OD值，则供试药品可用于静脉 注射。
[0006] 优选地，所述标准液还包括以2%红细胞体积C的0%-4%或6%-19%中任一浓度作 为溶质配制的溶液。
[0007] 优选地，步骤（4)中是将混合液混合均匀后置37°C恒温恒湿箱中反应，之后吸取 上清液于比色皿中，进行测定的。
[0008] 本发明的方法是在中药注射剂溶血性常规试管检测方法的基础上，结合中华人民 共和国国家标准GB/-142332-93之规定，利用分光光度计测定试管中红细胞溶解产生的血 红蛋白含量OD值，通过比较供试药品所在试管溶液OD值与标准参考管溶液的OD值，以确 定供试药品是否符合要求。本发明用测得的OD值替代了常规方法中眼观结果，准确度高， 能够定量检测，并且可以同时进行多种不同供试药品溶血性的检测。为中药注射剂研宄与 开发提供了一种快捷、客观、准确判定能否用于临床静脉注射、肌肉注射的新方法。
【具体实施方式】
[0009] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0010] 实施例1 1、材料需求： 器材：三角瓶、试管架，试管，分光光度计，比色杯，移液器，恒温恒湿箱； 试剂：蒸馏水，0. 9%生理盐水，2%红细胞悬液； 其它：供试药品，玻璃珠。
[0011] 2、具体实施方法 (1)2% (v/v)红细胞混悬液制备：取受试动物或人新鲜血液(约20ml)，加入装有玻璃 的三角烧瓶中，振摇5-10min分钟或用玻璃棒搅拌，除去纤维蛋白原，加0. 9%氯化钠溶液约 10倍量，1000-1500转/min，离心洗涤2-3次，至上清液呈澄清为止。然后用生理盐水将所 得红细胞配成2 %红细胞混悬液。备用。
[0012] (2 )进行现有常规试管法： 取试管7支，编号并置于试管架上，按表1所述加入各溶液。
[0013] 表 1
[0014] 结果判定：1小时后，通过眼睛观察，第3管或第3管以前的各管出现溶血、部分溶 血或出现凝集反应的供试药品，不宜做静脉注射或肌肉注射。
[0015] (3 )定量评估药物溶血性指标： 在上述常规试管法中第3号试管红细胞溶血度或溶血情况是确定供试样品是否用于 静脉或肌肉注射的关键点。因此，以第3管药物样品量（0. 300ml)作为测试品用量。
[0016] 依据中华人民共和国国家标准GB/-142332-93中"溶血度小于5%时，药品可用于 静脉注射，溶血度小于20%时，可用于肌肉注射"的规定，由于上述方法中2%的红细胞悬液 总用量为2. 50ml，按照该总量的0%、3%、5%、10%、15%、20%设立不同红细胞悬液量梯度。
[0017] 具体试验方法为：取干净试管9支，按表2排列并编号，1-6管为实验通用管，7-9 为供试药品管（3个重复管，药物样品量0. 300ml)，依次分别加入表2中所述各种物质，混 合，摇匀，置37°C恒湿恒温箱中，1小时后，轻轻吸取上清液于比色皿中，在545nm波长下进 行比色，测定各管OD值。则各OD值分别为2%的红细胞悬液在0%、3%、5%、10%、15%、20%溶 血度时的血红蛋白含量OD值。
[0018] 表 2
[0019] 结果判定： 按照国家标准GB/-142332-93,将供试药品管所测的OD值与第3管、第6管对应的OD值（OD3、OD6)直接比较，如果OD样s <0D6则供试药品可用于肌肉注射，OD样s <OD3则供试药品 可用于静脉注射。
[0020] 以上结果判定是基于药物对红细胞不凝集的情况下，如果发生凝集，则直接按相 关药物对红细胞影响的规定作出结论定性。
[0021] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可 以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。
【主权项】
1. 一种定量评估药物溶血性指标的方法，其特征在于：步骤如下：（1)用常规试管法 测定供试药品溶血性，从而确定供试药品含量的临界值A，即出现溶血、部分溶血或出现凝 集反应与否时的供试药品含量；其中常规试管法步骤如下：将供试药品、2%红细胞混悬液 和生理盐水混合得到混合液，反应一段时间后，肉眼观察是否出现溶血、部分溶血或出现凝 集反应；固定混合液总体积B和2%红细胞混悬液体积C，调整供试药品和生理盐水的体积 进行反应，来确定供试药品含量的临界值； (2) 标准液的制备：分别以2%红细胞混悬液体积C的5%、20%作为溶质，以蒸馏水作为 溶剂，配制总体积为B的标准液；将其分别称为5%标准液和20%标准液； (3) 标准液中血红蛋白含量OD545nm值的测定； (4) 以供试药品含量临界值A、生理盐水和2%红细胞混悬液体积C配制总体积为B的 混合液，并测定混合液的OD545nJl; (5) 结果判定：如果供试药品混合液的OD值小于20%标准液的OD值，则供试药品可用 于肌肉注射；如果供试药品混合液的OD值小于5%标准液的OD值，则供试药品可用于静脉 注射。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述标准液还包括以2%红细胞体积C的 0%-4%或6%-19%中任一浓度作为溶质配制的溶液。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4)中是将混合液混合均匀后置 37°C恒温恒湿箱中反应，之后吸取上清液于比色皿中，进行测定的。
【专利摘要】本发明提供一种定量评估药物溶血性指标的方法，步骤如下：（1）用常规试管法测定供试药品溶血性，从而确定供试药品含量的临界值A；（2）标准液的制备：分别以2%红细胞混悬液体积C的5%、20%作为溶质，以蒸馏水作为溶剂，配制总体积为B的标准液；将其分别称为5%标准液和20%标准液；（3）测定标准液中血红蛋白含量OD545nm值；（4）以供试药品含量临界值A、生理盐水和2%红细胞混悬液体积C配制总体积为B的混合液，并测定混合液的OD545nm值；（5）结果判定。本发明的方法替代了常规方法中眼观结果，准确度高，能够定量检测，并且可以同时进行多种不同供试药品溶血性的检测。
【IPC分类】G01N21/31
【公开号】CN104897589
【申请号】CN201510295237
【发明人】程富胜, 张继瑜, 张霞, 周绪正, 李冰, 魏小娟, 牛建荣, 刘宇, 王娟娟
【申请人】中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月2日
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