核酸制剂的检测试剂及核酸制剂检测方法
核酸制剂的检测试剂及核酸制剂检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种核酸制剂的定量检测方法，属于生物医学技术领域。
【背景技术】
[0002] 核酸作为药物、在基因治疗和基因沉默的基础研宄和临床应用日益广泛。核酸，包 括DNA、RNA的应用应为其带有强的负电荷及不稳定性受到限制。因此，核酸的应用需要载 体保护其不受酶的水解和携带其进入靶组织。纳米颗粒技术的发展，在很大程度上促进了 核酸在研宄及开发核酸药物的应用。而药理作用取决于核酸分子包裹程度。因此，核酸分 子包裹量的测定变得尤其重要。因为核酸分子被酶水解的不稳定性，在颗粒表面的核酸分 子，是可被水解，不能发生生物效应。只有在纳米颗粒内部的核酸才有可能到达靶组织和细 胞，发挥效应，测定其剂量。核酸是易溶于水的物质，最常用的方法是将被包裹的核酸分子 溶于水中，直接在紫外吸收光谱法UV260下测其光吸收。根据其消光系数，就可以直接计算 出溶液中核酸含量。而在纳米颗粒中，由于纳米化合物的包裹或相互作用，有些纳米颗粒中 的核酸不能溶出在水中，不能直接用光谱测量。目前常用的方法测量纳米颗粒尤其是脂质 体包裹的核酸的方法有以下几种：第一种技术方案应用核酸染料，先利用TritonX-100将 脂质体破碎，加入核酸结合焚光染料RiboGreen。然后在kex= 500nm,kem= 525nm下测 定荧光的量，推算出核酸在纳米颗粒中的含量。此方案手续繁琐，需要荧光色谱仪和荧光染 料，成本较高，且变量较大；第二种技术方案采用层析法：对于脂质体而言，可先利用层析 柱将游离的和结合的核酸分子分开，然后将其溶于酒精，直利用光谱在260nm下测定核酸 的量。这种方案需要层析柱，避免不了样品稀释，同时，如果纳米颗粒带有阳电荷，核酸分子 将可能与其结合，不能完全游离，加上有些成分在酒精中溶解度较低，均会影响核酸的准确 定量。其他技术方案还包括酶保护法、超速密度离心及毛细管电泳，上述方案均需要特殊技 术或昂贵设备，且准确性也应手续复杂而打折扣。因此，为解决以上问题，亟待研发一种新 的定量方法。
【发明内容】
[0003] (一）要解决的技术问题
[0004] 为解决上述问题，本发明提出了一种核酸制剂的定量检测方法，简化了纳米颗粒 中核酸的定量方法，比现有的方法更经济、快速、且保持了准确性、不需要特殊的设备。
[0005] (二）技术方案
[0006] 本发明提供一种用于核酸的定量检测的CK介质，其由水1-10份、水溶型有机溶剂 20-80份和水不溶型有机溶剂2-20份制成。
[0007] 进一步地，其由水2-5份、水溶型有机溶剂25-40份和与水不溶型有机溶剂10-18 份制成。
[0008] 进一步地，其由水2份、水溶型有机溶剂30份和与水不溶型有机溶剂15份制成。
[0009] 进一步地，水溶型有机溶剂选自乙醛、乙酸、丙酮、乙腈、1，2-丁二醇、1，3-丁二 醇、1，4-丁二醇、2-丁氧基乙醇、丁酸、二乙醇氨、二乙烯三胺、二甲基甲酰胺、乙二醇二甲 醚、二甲亚砜、1，4-二氧六环、乙醇、乙胺、乙二醇、甲酸、糠醇、甘油、甲醇、甲基二乙醇氨、甲 基异腈、1-丙醇、1，3-异丙醇、戊醇、2-丙醇、丙酸、丙二醇、吡啶、四氢呋喃、三乙二醇中的 一种或两种以上的组合。
[0010] 进一步地，水不溶型有机溶剂选自己烷，甲苯六氢化苯，乙酸乙酯、醋酸异丙酯、 甲基异丁酮、正辛醇、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯甲烷，、四氯化碳、氯仿、1，1，1-三氯乙烷、 一氟二氯甲烷、氟三氯甲烷、四氟化碳中的一种或两种以上的组合。
[0011] 进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，酒精30份，氯仿15份混合。
[0012] 进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，酒精30份，二氯甲烷15份混合。
[0013] 进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，异丙醇30份，氯仿15份混合。
[0014] 进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，异丙醇30份，二氯甲烷15份混 合。
[0015] 本发明还提供一种核酸制剂的定量检测方法，所述方法包括如下步骤：
[0016] 步骤一：配制CK介质：取水1~10份、与水溶型有机溶剂20~80份和水不溶型 有机溶剂2~20份混合；
[0017] 步骤二：将纳米颗粒加入到配制好的CK介质中，得到混合溶液；
[0018] 步骤三：取混合溶液，放置于紫外分光光度计下进行测量，测定纳米颗粒包裹的核 酸的吸光值；
[0019] 步骤四：重复步骤二及步骤三的操作，并完成三次测量；
[0020] 步骤五：根据步骤四测量得到的三组吸光值，取平均值后，按照常规的计算方法， 按照纳米颗粒包裹的核酸的消光系数，并计算得到纳米颗粒包裹的核酸的量。
[0021] 进一步地，所述步骤二具体如下：将纳米颗粒的样品稀释至合适的浓度，得到样品 液；各取2ml配制好的CK介质至2支比色皿中，调零；取Xul样品液放入测量的比色皿内， 使该样品液完全溶解于CK介质，并混合均匀。
[0022] 进一步地，所述步骤三具体如下：将紫外分光光度计开启预热后，进入调光度模 式，并调节波长为260nm;取混合溶液于UV260nm的紫外分光光度计下进行吸光测定，并测 量得吸光值。
[0023] 进一步地，所述步骤一中的水溶型有机溶剂是酒精或异丙醇；和水不溶型有机溶 剂是氯仿或二氯甲烷。
[0024] 进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，酒精30份，氯仿15份混合。
[0025] 进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，酒精30份，二氯甲烷15份混合。
[0026] 进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，异丙醇30份，氯仿15份混合。
[0027] 进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，异丙醇30份，二氯甲烷15份混 合。
[0028] (三）有益效果
[0029] 与现有技术相比，本发明的核酸制剂的定量检测方法，简化了纳米颗粒中核酸的 定量方法，不需要添加任何设备，利用实验室常用的溶剂就可以完成操作，成本低，准确性 较高。
【附图说明】
[0030] 图1是本发明的定磷法标准曲线的示意图；
[0031] 图2是本发明的超纯水稀释标准siRNA样品的配制方法的示意图；
[0032] 图3是本发明的CK介质中标准siRNA样品的配制方法的示意图；
[0033] 图4是本发明的标准品41110-Agalh的色谱图；
[0034] 图5是本发明的样品纳米制剂，批号R14032的色谱图；
[0035] 图6是本发明的样品纳米制剂，批号R14061的色谱图；
[0036] 图7是本发明的样品纳米制剂，批号R14079的色谱图；
[0037] 图8是本发明的样品纳米制剂，批号R14133的色谱图；
[0038] 图9是本发明的样品纳米制剂，批号R14134的色谱图；
[0039] 图10是本发明的样品纳米制剂，批号R14135的色谱图；
【具体实施方式】
[0040] 实施例1定磷法测定标准品未包裹的siRNA的含量
[0041] 准确称取干燥标准siRNA(本实验室固相合成）样品A= 36mg，B= 24mg，C= 62mg，分别溶于lmL无菌水中。
[0042]制备标准磷溶液：将磷酸二氢钾于110°C烘至恒重（4小时），准确称取0. 8775g溶 于少量蒸馏水中，转移至500ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。此溶液每lml含磷400yg， 稀释20倍（20yg/ml)。定磷试剂需要：17%硫酸、2. 5%钼酸铵溶液及10%抗坏血酸溶液， 上述三种溶液贮存于棕色瓶中，溶液呈淡黄色尚可使用，呈深黄甚至棕色即失效，临时制备 定磷试剂时将上述三种溶液与水按如下比例混合：17%硫酸：2. 5%钼酸铵溶液：10%抗坏 血酸溶液：水=1:1:1:2(V:V)。
[0043] 取干燥试管7支，按0~6依次编号，根据表1所示加入试剂，加毕摇匀；在45°C 水浴中保温l〇min，冷却，以零号管调零点，于660nm处测吸光度；如图1所示为以磷含量为 横坐标，吸光度为纵坐标所作的定磷法标准曲线图；
[0044] 表1 :标准曲线测定数据：
[0047] 标准曲线：y= 0? 483x+0. 0024
[0048] 标准品测定方法：取50毫升凯氏烧瓶2只，做平行样，分别取标准siRNA样品，置 于各凯氏烧瓶内，分别加入6mol/L硫酸1.OmL置消化架用酒精灯加热消化15min，（溶液呈 褐色甚至更深），稍加冷却，加入2mol/L硝酸2滴，再继续加热5min(逸出白色烟雾，溶液无 色透明，表示消化完成时为止）。待凯氏烧瓶冷却后，分别加入1.OmL蒸馏水，置沸水浴蒸煮 5min，使焦磷酸分解。凯氏烧瓶从沸水浴中取出，待其冷却，将瓶内的消化液分别移入两 只 50ml容量瓶中，用少量蒸馏水洗涤凯氏烧瓶两次，并将洗涤液一并倒入容量瓶内，再各加蒸 馏水稀释至刻度。
[0049] 取试管5支，按7~11依次编号，7号管为空白对照。准确吸取蒸馏水3.OmL，置 于7号管内；再分别准确吸取经过消化的核糖核酸样液3.OmL，置于8、9和10、11号管内，各 管分别加入3. 0ml定磷试剂，摇匀；在45°C水浴中保温lOmin，取出冷却；以7号管调零点， 于660nm处测吸光度，算出平均A660nm值；取12、13号试管分别准确吸取未经消化的核酸 溶液（8000RMP/min*10min离心后）0. 020ml，分别加蒸馏水2. 980ml，加定磷试剂3. 0ml，摇 匀。于45°C水浴中保温lOmin，取出后冷却以11000RMP/min*10min离心后，测得A660nm(此 步骤与总磷测定同时做）；并从图1的定磷法标准曲线图上查出总磷微克数（X)及无机磷 微克数（Y)。根据标准品A、B、C三组不同的标准siRNA样品的量重复该步骤，其结果如以 下三个数据表所示：
[0050] 表2标准品A测定及结果：
[0052] 表3标准品B测定及结果：
[0053]
[0054] 表4标准品C测定结果表：
[0056] 实施例2定磷法测定纳米颗粒包裹的核酸量
[0057] siRNA纳米颗粒的制备见专利ZL201180041450.X。测定方法见实施例一。把合成 的未包裹的siRNA替代为脂质体包裹的siRNA增加一组纳米颗粒空壳（未包裹核酸的纳米 颗粒）。测得的总磷量减去空壳的磷含量，即得到纳米颗粒的磷含量。然后根据与实施例一 相同公式，推算出核酸的含量。
[0058] 实施例3紫外吸收光谱法UV260siRNA含量
[0059] 表5紫外吸收光谱法UV260纯水中标准siRNA(如实施例1)样品消光系数的测 定：
[0060]
[0061] 如图3所示在CK介质中标准siRNA样品的配制方法，根据图3中的配制方法，得 到每个浓度2个平行样；置于波长为260nm的紫外分光光度计进行测定，如下表所示得到紫 外吸收光谱法UV260CK介质中标准siRNA样品消光系数；并根据下表中的数据所示，得到 siRNA在CK介质中的消光系数为30。
[0062] 实施例4紫外吸收光谱法测定
[0063] 核酸的紫外吸收光谱法测定通常是在水溶液中测定的，然后根据核酸的消光系 数，计算核酸在溶液中的浓度。其公式为
[0065] 其中A为在UV260下的吸光度，e为摩尔消光系数（L/mol/cm),C为浓度（mol/ 1)。
[0066]因为，介质的变化，CK介质含有有机溶剂，紫外吸收光谱法测定时，其消光系数不 会与水中测定的消光系数一样。
[0067] CK介质中化学合成的未包裹的标准siRNA样品，
[0068] 表6紫外吸收光谱法UV260CK介质中标准siRNA样品消光系数测定表：
[0069]
[0070] 将标准siRNA样品和纳米颗粒组分分别加入CK介质中，检测纳米颗粒成分对 siRNA定量的影响，根据下表中的数据所示，标准siRNA样品与脂质体其他组份混合后的溶 液，在CK介质中的消光系数也为30。
[0071] 用经典的定磷的方法测量核酸的绝对量作为标准，用光谱UV260为实验室常用的 核酸的定量方法为基础，为纳米颗粒核酸的测定的准确性提供参考。
[0072] 实施例5
[0073] 紫外吸收光谱法UV标准siRNA样品与脂质体其他组份混合后的溶液，在CK介质 中的消光系数测定，UV260将siRNA标准品和纳米颗粒组分分别加入CK介质中，以检测纳 米颗粒成分对siRNA定量的影响
[0074] 表7纳米颗粒成分对siRNA定量的影响
[0075]
[0076] 如上数据所示，得到纯siRNA与脂质体其他组份混合后的溶液，在CK介质中的消 光系数也为30。在纳米颗粒组分存在的情况下，测定核酸在CK介质中的定量不被干扰。消 光系数不变。
[0077] 实施例6 :HPLC方法纳米制剂核酸方法的定量的比较：
[0078] 对照品及样品溶液的制备：精取量取已知溶度的双链siRNA，用水精确稀释至 10〇Ug/ml左右；分别吸取对照品和供试品10ul进样在260nm波长的HPLC仪器下进行测定； 并按外标法以峰面积计算，得到测量的色谱图如图6所示。
[0079] 分别取样品批次町4032、1?14061、1?14079、1?14133、1?14134及1?14135的样品进行测 量，得到的色谱图如图7至图10所示；以下是取样品批次R14032、R14061、R14079、R14133、 R14134及R14135的测量数据表；
[0080] 表8不同样品批次定磷法、HPLC和CK介质方法SiRNA定量量数据比较：
[0082] 不同批号的纳米制剂利用专利ZL201180041450.X中的方法制备。
[0083] 上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的构 思和范围进行限定。在不脱离本发明设计构思的前提下，本领域普通人员对本发明的技术 方案做出的各种变型和改进，均应落入到本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容， 已经全部记载在权利要求书中。
【主权项】
1. 一种用于核酸的定量检测的CK介质，其特征在于，其由水1-10份、水溶型有机溶剂 20-80份和水不溶型有机溶剂2-20份制成。2. 根据权利要求1所述的CK介质，其特征在于，其由水2-5份、水溶型有机溶剂25-40 份和与水不溶型有机溶剂10-18份制成。3. 根据权利要求1所述的CK介质，其特征在于，其由水2份、水溶型有机溶剂30份和 与水不溶型有机溶剂15份制成。4. 根据权利要求1所述的CK介质，其特征在于，水溶型有机溶剂选自乙醛、乙酸、丙酮、 乙腈、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、1，4-丁二醇、2-丁氧基乙醇、丁酸、二乙醇氨、二乙烯三胺、 二甲基甲酰胺、乙二醇二甲醚、二甲亚砜、1，4-二氧六环、乙醇、乙胺、乙二醇、甲酸、糠醇、甘 油、甲醇、甲基二乙醇氨、甲基异腈、1-丙醇、1，3-异丙醇、戊醇、2-丙醇、丙酸、丙二醇、 吡啶、四氢呋喃、三乙二醇中的一种或两种以上的组合。5. 根据权利要求1所述的CK介质，其特征在于，水不溶型有机溶剂选自己烷，甲苯 六氢化苯，乙酸乙酯、醋酸异丙酯、甲基异丁酮、正辛醇、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯 甲烷，、四氯化碳、氯仿、1，1，1-三氯乙烷、一氟二氯甲烷、氟三氯甲烷、四氟化碳中的一种 或两种以上的组合。6. -种核酸制剂的定量检测方法，包括如下步骤： 步骤一：配制权利要求1-5所述CK介质：取水与水溶型有机溶剂和水不溶型有机溶剂 混合； 步骤二：将包裹有核酸的纳米颗粒加入到配制好的权利要求1-5所述CK介质中，得到 混合溶液； 步骤三：取混合溶液，测定纳米颗粒包裹的核酸的量。7. -种核酸制剂的定量检测方法，所述的步骤三为采用紫外分光光度法、高效液相色 谱法或凝胶电泳法测定。包括如下步骤： 步骤一：配制权利要求1-5所述CK介质：取水1~10份、与水溶型有机溶剂20-80份和 水不溶型有机溶剂2-20份混合； 步骤二：将包裹有核酸的纳米颗粒加入到配制好的权利要求1-5所述CK介质中，得到 混合溶液； 步骤三：取混合溶液，放置于紫外分光光度计下进行测量，测定纳米颗粒包裹的核酸的 量； 步骤四：重复步骤二及步骤三的操作，并完成三次测量； 步骤五：根据步骤四测量得到的三组吸光值，取平均值后，计算纳米颗粒包裹的核酸的 消光系数，并计算得到纳米颗粒包裹的核酸的量。8. 根据权利要求6所述核酸制剂的定量检测方法，其特征在于：所述步骤二具体如下： 将纳米颗粒的样品稀释至合适的浓度，得到样品液；各取2ml配制好的CK介质至2支比色 皿中，调零；取xy1样品液放入测量的比色皿内，记录相应的稀释倍数，使该样品液完全溶 解于CK介质，并混合均勾。9. 根据权利要求1所述的核酸制剂的定量检测方法，其特征在于：所述步骤三具体如 下：将紫外分光光度计开启预热后，进入调光度模式，并调节波长为260nm;取混合溶液于 UV260nm的紫外分光光度计下进行吸光测定，并测量得吸光值。
【专利摘要】本发明公开了一种核酸制剂的检测试剂及核酸制剂检测方法，其由水1-10份、水溶型有机溶剂20-80份和水不溶型有机溶剂2-20份制成。本发明的核酸制剂的定量检测方法，不需要添加任何设备，利用实验室常用的溶剂就可以完成操作，经济适用，不增加成本。
【IPC分类】G01N30/02, G01N27/447, G01N21/33
【公开号】CN104897597
【申请号】CN201510287196
【发明人】崔坤元, 陈波
【申请人】厦门成坤生物技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月29日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种核酸制剂的定量检测方法，属于生物医学技术领域。
【背景技术】
[0002] 核酸作为药物、在基因治疗和基因沉默的基础研宄和临床应用日益广泛。核酸，包 括DNA、RNA的应用应为其带有强的负电荷及不稳定性受到限制。因此，核酸的应用需要载 体保护其不受酶的水解和携带其进入靶组织。纳米颗粒技术的发展，在很大程度上促进了 核酸在研宄及开发核酸药物的应用。而药理作用取决于核酸分子包裹程度。因此，核酸分 子包裹量的测定变得尤其重要。因为核酸分子被酶水解的不稳定性，在颗粒表面的核酸分 子，是可被水解，不能发生生物效应。只有在纳米颗粒内部的核酸才有可能到达靶组织和细 胞，发挥效应，测定其剂量。核酸是易溶于水的物质，最常用的方法是将被包裹的核酸分子 溶于水中，直接在紫外吸收光谱法UV260下测其光吸收。根据其消光系数，就可以直接计算 出溶液中核酸含量。而在纳米颗粒中，由于纳米化合物的包裹或相互作用，有些纳米颗粒中 的核酸不能溶出在水中，不能直接用光谱测量。目前常用的方法测量纳米颗粒尤其是脂质 体包裹的核酸的方法有以下几种：第一种技术方案应用核酸染料，先利用TritonX-100将 脂质体破碎，加入核酸结合焚光染料RiboGreen。然后在kex= 500nm,kem= 525nm下测 定荧光的量，推算出核酸在纳米颗粒中的含量。此方案手续繁琐，需要荧光色谱仪和荧光染 料，成本较高，且变量较大；第二种技术方案采用层析法：对于脂质体而言，可先利用层析 柱将游离的和结合的核酸分子分开，然后将其溶于酒精，直利用光谱在260nm下测定核酸 的量。这种方案需要层析柱，避免不了样品稀释，同时，如果纳米颗粒带有阳电荷，核酸分子 将可能与其结合，不能完全游离，加上有些成分在酒精中溶解度较低，均会影响核酸的准确 定量。其他技术方案还包括酶保护法、超速密度离心及毛细管电泳，上述方案均需要特殊技 术或昂贵设备，且准确性也应手续复杂而打折扣。因此，为解决以上问题，亟待研发一种新 的定量方法。
【发明内容】
[0003] (一）要解决的技术问题
[0004] 为解决上述问题，本发明提出了一种核酸制剂的定量检测方法，简化了纳米颗粒 中核酸的定量方法，比现有的方法更经济、快速、且保持了准确性、不需要特殊的设备。
[0005] (二）技术方案
[0006] 本发明提供一种用于核酸的定量检测的CK介质，其由水1-10份、水溶型有机溶剂 20-80份和水不溶型有机溶剂2-20份制成。
[0007] 进一步地，其由水2-5份、水溶型有机溶剂25-40份和与水不溶型有机溶剂10-18 份制成。
[0008] 进一步地，其由水2份、水溶型有机溶剂30份和与水不溶型有机溶剂15份制成。
[0009] 进一步地，水溶型有机溶剂选自乙醛、乙酸、丙酮、乙腈、1，2-丁二醇、1，3-丁二 醇、1，4-丁二醇、2-丁氧基乙醇、丁酸、二乙醇氨、二乙烯三胺、二甲基甲酰胺、乙二醇二甲 醚、二甲亚砜、1，4-二氧六环、乙醇、乙胺、乙二醇、甲酸、糠醇、甘油、甲醇、甲基二乙醇氨、甲 基异腈、1-丙醇、1，3-异丙醇、戊醇、2-丙醇、丙酸、丙二醇、吡啶、四氢呋喃、三乙二醇中的 一种或两种以上的组合。
[0010] 进一步地，水不溶型有机溶剂选自己烷，甲苯六氢化苯，乙酸乙酯、醋酸异丙酯、 甲基异丁酮、正辛醇、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯甲烷，、四氯化碳、氯仿、1，1，1-三氯乙烷、 一氟二氯甲烷、氟三氯甲烷、四氟化碳中的一种或两种以上的组合。
[0011] 进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，酒精30份，氯仿15份混合。
[0012] 进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，酒精30份，二氯甲烷15份混合。
[0013] 进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，异丙醇30份，氯仿15份混合。
[0014] 进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，异丙醇30份，二氯甲烷15份混 合。
[0015] 本发明还提供一种核酸制剂的定量检测方法，所述方法包括如下步骤：
[0016] 步骤一：配制CK介质：取水1~10份、与水溶型有机溶剂20~80份和水不溶型 有机溶剂2~20份混合；
[0017] 步骤二：将纳米颗粒加入到配制好的CK介质中，得到混合溶液；
[0018] 步骤三：取混合溶液，放置于紫外分光光度计下进行测量，测定纳米颗粒包裹的核 酸的吸光值；
[0019] 步骤四：重复步骤二及步骤三的操作，并完成三次测量；
[0020] 步骤五：根据步骤四测量得到的三组吸光值，取平均值后，按照常规的计算方法， 按照纳米颗粒包裹的核酸的消光系数，并计算得到纳米颗粒包裹的核酸的量。
[0021] 进一步地，所述步骤二具体如下：将纳米颗粒的样品稀释至合适的浓度，得到样品 液；各取2ml配制好的CK介质至2支比色皿中，调零；取Xul样品液放入测量的比色皿内， 使该样品液完全溶解于CK介质，并混合均匀。
[0022] 进一步地，所述步骤三具体如下：将紫外分光光度计开启预热后，进入调光度模 式，并调节波长为260nm;取混合溶液于UV260nm的紫外分光光度计下进行吸光测定，并测 量得吸光值。
[0023] 进一步地，所述步骤一中的水溶型有机溶剂是酒精或异丙醇；和水不溶型有机溶 剂是氯仿或二氯甲烷。
[0024] 进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，酒精30份，氯仿15份混合。
[0025] 进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，酒精30份，二氯甲烷15份混合。
[0026] 进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，异丙醇30份，氯仿15份混合。
[0027] 进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，异丙醇30份，二氯甲烷15份混 合。
[0028] (三）有益效果
[0029] 与现有技术相比，本发明的核酸制剂的定量检测方法，简化了纳米颗粒中核酸的 定量方法，不需要添加任何设备，利用实验室常用的溶剂就可以完成操作，成本低，准确性 较高。
【附图说明】
[0030] 图1是本发明的定磷法标准曲线的示意图；
[0031] 图2是本发明的超纯水稀释标准siRNA样品的配制方法的示意图；
[0032] 图3是本发明的CK介质中标准siRNA样品的配制方法的示意图；
[0033] 图4是本发明的标准品41110-Agalh的色谱图；
[0034] 图5是本发明的样品纳米制剂，批号R14032的色谱图；
[0035] 图6是本发明的样品纳米制剂，批号R14061的色谱图；
[0036] 图7是本发明的样品纳米制剂，批号R14079的色谱图；
[0037] 图8是本发明的样品纳米制剂，批号R14133的色谱图；
[0038] 图9是本发明的样品纳米制剂，批号R14134的色谱图；
[0039] 图10是本发明的样品纳米制剂，批号R14135的色谱图；
【具体实施方式】
[0040] 实施例1定磷法测定标准品未包裹的siRNA的含量
[0041] 准确称取干燥标准siRNA(本实验室固相合成）样品A= 36mg，B= 24mg，C= 62mg，分别溶于lmL无菌水中。
[0042]制备标准磷溶液：将磷酸二氢钾于110°C烘至恒重（4小时），准确称取0. 8775g溶 于少量蒸馏水中，转移至500ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。此溶液每lml含磷400yg， 稀释20倍（20yg/ml)。定磷试剂需要：17%硫酸、2. 5%钼酸铵溶液及10%抗坏血酸溶液， 上述三种溶液贮存于棕色瓶中，溶液呈淡黄色尚可使用，呈深黄甚至棕色即失效，临时制备 定磷试剂时将上述三种溶液与水按如下比例混合：17%硫酸：2. 5%钼酸铵溶液：10%抗坏 血酸溶液：水=1:1:1:2(V:V)。
[0043] 取干燥试管7支，按0~6依次编号，根据表1所示加入试剂，加毕摇匀；在45°C 水浴中保温l〇min，冷却，以零号管调零点，于660nm处测吸光度；如图1所示为以磷含量为 横坐标，吸光度为纵坐标所作的定磷法标准曲线图；
[0044] 表1 :标准曲线测定数据：
[0047] 标准曲线：y= 0? 483x+0. 0024
[0048] 标准品测定方法：取50毫升凯氏烧瓶2只，做平行样，分别取标准siRNA样品，置 于各凯氏烧瓶内，分别加入6mol/L硫酸1.OmL置消化架用酒精灯加热消化15min，（溶液呈 褐色甚至更深），稍加冷却，加入2mol/L硝酸2滴，再继续加热5min(逸出白色烟雾，溶液无 色透明，表示消化完成时为止）。待凯氏烧瓶冷却后，分别加入1.OmL蒸馏水，置沸水浴蒸煮 5min，使焦磷酸分解。凯氏烧瓶从沸水浴中取出，待其冷却，将瓶内的消化液分别移入两 只 50ml容量瓶中，用少量蒸馏水洗涤凯氏烧瓶两次，并将洗涤液一并倒入容量瓶内，再各加蒸 馏水稀释至刻度。
[0049] 取试管5支，按7~11依次编号，7号管为空白对照。准确吸取蒸馏水3.OmL，置 于7号管内；再分别准确吸取经过消化的核糖核酸样液3.OmL，置于8、9和10、11号管内，各 管分别加入3. 0ml定磷试剂，摇匀；在45°C水浴中保温lOmin，取出冷却；以7号管调零点， 于660nm处测吸光度，算出平均A660nm值；取12、13号试管分别准确吸取未经消化的核酸 溶液（8000RMP/min*10min离心后）0. 020ml，分别加蒸馏水2. 980ml，加定磷试剂3. 0ml，摇 匀。于45°C水浴中保温lOmin，取出后冷却以11000RMP/min*10min离心后，测得A660nm(此 步骤与总磷测定同时做）；并从图1的定磷法标准曲线图上查出总磷微克数（X)及无机磷 微克数（Y)。根据标准品A、B、C三组不同的标准siRNA样品的量重复该步骤，其结果如以 下三个数据表所示：
[0050] 表2标准品A测定及结果：
[0052] 表3标准品B测定及结果：
[0053]
[0054] 表4标准品C测定结果表：
[0056] 实施例2定磷法测定纳米颗粒包裹的核酸量
[0057] siRNA纳米颗粒的制备见专利ZL201180041450.X。测定方法见实施例一。把合成 的未包裹的siRNA替代为脂质体包裹的siRNA增加一组纳米颗粒空壳（未包裹核酸的纳米 颗粒）。测得的总磷量减去空壳的磷含量，即得到纳米颗粒的磷含量。然后根据与实施例一 相同公式，推算出核酸的含量。
[0058] 实施例3紫外吸收光谱法UV260siRNA含量
[0059] 表5紫外吸收光谱法UV260纯水中标准siRNA(如实施例1)样品消光系数的测 定：
[0060]
[0061] 如图3所示在CK介质中标准siRNA样品的配制方法，根据图3中的配制方法，得 到每个浓度2个平行样；置于波长为260nm的紫外分光光度计进行测定，如下表所示得到紫 外吸收光谱法UV260CK介质中标准siRNA样品消光系数；并根据下表中的数据所示，得到 siRNA在CK介质中的消光系数为30。
[0062] 实施例4紫外吸收光谱法测定
[0063] 核酸的紫外吸收光谱法测定通常是在水溶液中测定的，然后根据核酸的消光系 数，计算核酸在溶液中的浓度。其公式为
[0065] 其中A为在UV260下的吸光度，e为摩尔消光系数（L/mol/cm),C为浓度（mol/ 1)。
[0066]因为，介质的变化，CK介质含有有机溶剂，紫外吸收光谱法测定时，其消光系数不 会与水中测定的消光系数一样。
[0067] CK介质中化学合成的未包裹的标准siRNA样品，
[0068] 表6紫外吸收光谱法UV260CK介质中标准siRNA样品消光系数测定表：
[0069]
[0070] 将标准siRNA样品和纳米颗粒组分分别加入CK介质中，检测纳米颗粒成分对 siRNA定量的影响，根据下表中的数据所示，标准siRNA样品与脂质体其他组份混合后的溶 液，在CK介质中的消光系数也为30。
[0071] 用经典的定磷的方法测量核酸的绝对量作为标准，用光谱UV260为实验室常用的 核酸的定量方法为基础，为纳米颗粒核酸的测定的准确性提供参考。
[0072] 实施例5
[0073] 紫外吸收光谱法UV标准siRNA样品与脂质体其他组份混合后的溶液，在CK介质 中的消光系数测定，UV260将siRNA标准品和纳米颗粒组分分别加入CK介质中，以检测纳 米颗粒成分对siRNA定量的影响
[0074] 表7纳米颗粒成分对siRNA定量的影响
[0075]
[0076] 如上数据所示，得到纯siRNA与脂质体其他组份混合后的溶液，在CK介质中的消 光系数也为30。在纳米颗粒组分存在的情况下，测定核酸在CK介质中的定量不被干扰。消 光系数不变。
[0077] 实施例6 :HPLC方法纳米制剂核酸方法的定量的比较：
[0078] 对照品及样品溶液的制备：精取量取已知溶度的双链siRNA，用水精确稀释至 10〇Ug/ml左右；分别吸取对照品和供试品10ul进样在260nm波长的HPLC仪器下进行测定； 并按外标法以峰面积计算，得到测量的色谱图如图6所示。
[0079] 分别取样品批次町4032、1?14061、1?14079、1?14133、1?14134及1?14135的样品进行测 量，得到的色谱图如图7至图10所示；以下是取样品批次R14032、R14061、R14079、R14133、 R14134及R14135的测量数据表；
[0080] 表8不同样品批次定磷法、HPLC和CK介质方法SiRNA定量量数据比较：
[0082] 不同批号的纳米制剂利用专利ZL201180041450.X中的方法制备。
[0083] 上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的构 思和范围进行限定。在不脱离本发明设计构思的前提下，本领域普通人员对本发明的技术 方案做出的各种变型和改进，均应落入到本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容， 已经全部记载在权利要求书中。
【主权项】
1. 一种用于核酸的定量检测的CK介质，其特征在于，其由水1-10份、水溶型有机溶剂 20-80份和水不溶型有机溶剂2-20份制成。2. 根据权利要求1所述的CK介质，其特征在于，其由水2-5份、水溶型有机溶剂25-40 份和与水不溶型有机溶剂10-18份制成。3. 根据权利要求1所述的CK介质，其特征在于，其由水2份、水溶型有机溶剂30份和 与水不溶型有机溶剂15份制成。4. 根据权利要求1所述的CK介质，其特征在于，水溶型有机溶剂选自乙醛、乙酸、丙酮、 乙腈、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、1，4-丁二醇、2-丁氧基乙醇、丁酸、二乙醇氨、二乙烯三胺、 二甲基甲酰胺、乙二醇二甲醚、二甲亚砜、1，4-二氧六环、乙醇、乙胺、乙二醇、甲酸、糠醇、甘 油、甲醇、甲基二乙醇氨、甲基异腈、1-丙醇、1，3-异丙醇、戊醇、2-丙醇、丙酸、丙二醇、 吡啶、四氢呋喃、三乙二醇中的一种或两种以上的组合。5. 根据权利要求1所述的CK介质，其特征在于，水不溶型有机溶剂选自己烷，甲苯 六氢化苯，乙酸乙酯、醋酸异丙酯、甲基异丁酮、正辛醇、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯 甲烷，、四氯化碳、氯仿、1，1，1-三氯乙烷、一氟二氯甲烷、氟三氯甲烷、四氟化碳中的一种 或两种以上的组合。6. -种核酸制剂的定量检测方法，包括如下步骤： 步骤一：配制权利要求1-5所述CK介质：取水与水溶型有机溶剂和水不溶型有机溶剂 混合； 步骤二：将包裹有核酸的纳米颗粒加入到配制好的权利要求1-5所述CK介质中，得到 混合溶液； 步骤三：取混合溶液，测定纳米颗粒包裹的核酸的量。7. -种核酸制剂的定量检测方法，所述的步骤三为采用紫外分光光度法、高效液相色 谱法或凝胶电泳法测定。包括如下步骤： 步骤一：配制权利要求1-5所述CK介质：取水1~10份、与水溶型有机溶剂20-80份和 水不溶型有机溶剂2-20份混合； 步骤二：将包裹有核酸的纳米颗粒加入到配制好的权利要求1-5所述CK介质中，得到 混合溶液； 步骤三：取混合溶液，放置于紫外分光光度计下进行测量，测定纳米颗粒包裹的核酸的 量； 步骤四：重复步骤二及步骤三的操作，并完成三次测量； 步骤五：根据步骤四测量得到的三组吸光值，取平均值后，计算纳米颗粒包裹的核酸的 消光系数，并计算得到纳米颗粒包裹的核酸的量。8. 根据权利要求6所述核酸制剂的定量检测方法，其特征在于：所述步骤二具体如下： 将纳米颗粒的样品稀释至合适的浓度，得到样品液；各取2ml配制好的CK介质至2支比色 皿中，调零；取xy1样品液放入测量的比色皿内，记录相应的稀释倍数，使该样品液完全溶 解于CK介质，并混合均勾。9. 根据权利要求1所述的核酸制剂的定量检测方法，其特征在于：所述步骤三具体如 下：将紫外分光光度计开启预热后，进入调光度模式，并调节波长为260nm;取混合溶液于 UV260nm的紫外分光光度计下进行吸光测定，并测量得吸光值。
【专利摘要】本发明公开了一种核酸制剂的检测试剂及核酸制剂检测方法，其由水1-10份、水溶型有机溶剂20-80份和水不溶型有机溶剂2-20份制成。本发明的核酸制剂的定量检测方法，不需要添加任何设备，利用实验室常用的溶剂就可以完成操作，经济适用，不增加成本。
【IPC分类】G01N30/02, G01N27/447, G01N21/33
【公开号】CN104897597
【申请号】CN201510287196
【发明人】崔坤元, 陈波
【申请人】厦门成坤生物技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月29日
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