一种微阵列生物芯片及其制备方法和应用
一种微阵列生物芯片及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物芯片技术领域，尤其涉及一种微阵列生物芯片及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 研宄小分子药物与蛋白靶标的相互作用，对基础科学研宄和药物开发具有重要意 义。但在实际应用中，存在一种药物针对多靶标相互作用的情况，如对药物杂泛性和副作用 的研宄、先导化合物的优化以及旧药新用等。因此，开发一种高效的小分子-靶标相互作用 检测方法将对靶标活性评价及药物筛选等具有推动作用。
[0003] 在分子生物学层面，药物开发往往需要对先导化合物/药物与蛋白靶标之间的相 互作用信息（如动力学和亲和力）进行采集和评价。近年来，表面等离子共振生物传感器 (surfaceplasmonresonance，SPR)以免标记、高灵敏和实时监测等优势，迅速发展成为研 宄小分子与蛋白靶标相互作用动力学和亲和力的重要工具。目前，SPR检测技术主要为基 于角度检测的方法（以BIAcore系列产品为主），该方法将蛋白固定在芯片表面，流通小分 子药物，对光学信号进行实时监测。然而，随着检测样品的多样性以其相互作用网络的复杂 性，要求检测手段具有高通量和高效率的特征，这种传统的"一对一"的检测方法已经无法 满足应用需求。
[0004] 表面等离子共振成像技术（SPRimaging，SPRi)的出现很好地解决了以上的通量 问题。SPRi技术采用微阵列格式和平行光检测，可以一次性地获得芯片表面在检测区域内 的相互作用信息，具有"一对多"甚至"多对多"的高通量检测优势。利用SPRi技术，研宄 者们开发出了高通量检测蛋白-蛋白、多肽-多肽以及DNA-DNA相互作用的方法。然而，对 于小分子在蛋白阵列上的检测，依旧存在着挑战：①由于当前基于强度检测的SPRi技术的 灵敏度低于角度检测技术，加之小分子检测时，由于其分子量低产生信号响应本身很小，使 得高通量SPRi仪器的检测能力较低；②SPRi的数据质量与采集面积有关，通量越高会导致 样品点面积减小，噪音增加，使得检出困难；③当前SPRi芯片表面多采用硫醇修饰，蛋白固 定量较低，使得与之相互作用的小分子药物也较少，信号自然很难检出。
[0005] 针对以上问题，研宄者们主要针对仪器改良和芯片化学修饰两个方面增强SPRi 的检测灵敏度，以获得在蛋白微阵列上检测小分子的能力。例如，N.J.Tao等利用SPRi和 电化学阻抗结合，提高了SPRi的检测灵敏度，成功在P38激酶阵列上检测到SB203580小 分子的结合，并获得了动力学和亲和力常数（Anal.Chem. 2014, 86, 9860-9865);但该方 法只是适用于该团队开发的仪器，在SPRi主流仪器上没有通用性。另外，在芯片化学修 饰方面，Y.M.Wang等人在SPRi芯片表面构建了三维的聚丙烯酸（PAA)高分子刷，并采 用微接触印刷调控高分子间的空间距离，获得较高的蛋白固定量（App1iedSurfaceScien ce266 (201) 313-318) ;H.W.Ma等利用表面引发聚合的方法在SPR芯片表面构建了三维高分 子表面，并获得优化的抗原-抗体检测信号（Chem.Commun.，2011，47,1190-1192)。但是，以 上针对芯片化学修饰的方法均未在蛋白阵列上成功检测小分子药物。因此，开发出在SPRi 仪器上高通量检测小分子-蛋白相互作用的方法具有极其重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种应用于表面等离子共振系统的微阵列生物芯片及其 制备方法、利用其制备的蛋白微阵列以及利用所述蛋白微阵列进行检测的方法和在小分子 药物检测方面的应用。
[0007] 为达到以上目的，本发明采用如下技术路线：
[0008] 第一方面，本发明提供一种微阵列生物芯片，包括玻璃芯片基底和修饰层，所述修 饰层包括依次叠加在所述玻璃芯片基底表面的铬层、银和/或金层、自组装单分子层、光交 联剂和高分子层。
[0009] 表面等离子共振成像技术是利用光波与金属（金和/或银）中自由电子波产生的 共振，通过检测共振信号来确定金属表面生物分子相互作用情况（结合或解离），因此金和 /或银在表面是必要条件。在玻璃芯片基底与金和/或银之间镀一层铬是由于金和/或银 与玻璃芯片基底的粘附性不好，铬起到粘附缓冲层作用。
[0010] 另外，芯片的修饰方法大致可以分为两类：物理层（玻璃-铬-金和/或银），主 要作用是激发表面等离子激元共振；化学层（自组装单分子层-光交联剂-高分子），其主 要用于生物分子的固定和对金属基底的保护。其中，物理层为SPRi传感芯片的常规技术手 段；而化学层是本发明的重点，经过本发明的方法修饰的芯片，可以有效提高生物分子在生 物芯片表面的固定量，使原来很难检测到的小分子药物能够检测出来。
[0011] 在本发明中，小分子药物检测的实现主要通过提高蛋白分子固定量，而蛋白分子 固定量主要依靠三维高分子表面的修饰，自组装单分子层用于保护基底和提供末端活性基 团，光交联剂起到桥连单分子层和高分子的作用。
[0012] 优选地，所述络层的厚度为0?l_9nm，例如可以是0?lnm、lnm、2nm、3nm、4nm、5nm、 6nm、7nm、8nm或9nm，优选为3nm。对于络层的厚度，本领域的技术人员可根据金属与玻璃的 粘附性进行适当的选择。如果粘附性良好，也可以不加铬层；但现有的技术中，二者的粘附 性一般还未达到可以省去铬层的程度；因此，铬层不宜太薄，以保证成膜，增加粘附性；如 果铬层厚度太大，则不利于光波的传导。
[0013] 优选地，所述银和/或金层的厚度为40_60nm，例如可以是40nm、41nm、42nm、43nm、 44nm、45nm、46nm、47nm、48nm、49nm、50nm、51nm、52nm、53nm、54nm、55nm、56nm、57nm、58nm、 59nm或60nm，优选为47_50nm。如果厚度超过此范围（大于60nm或小于40nm)，会导致灵 敏度下降，影响对于小分子药物检测的灵敏度。
[0014] 优选地，所述自组装单分子层的试剂为末端功能化的硫醇。
[0015] 优选地，所述末端功能化的硫醇为单硫醇和/或双硫醇。
[0016] 优选地，所述末端功能化的硫醇为烷硫醇和/或带有PEG嵌段的硫醇。
[0017] 优选地，所述末端功能化的基团为羟基、羧基、氨基、醛基、环氧基或甲氧基。
[0018] 硫醇的通式为：HS-R1_R2 ;
[0019] 其中，R1为烷烃链，R2 -般为末端功能化的PEG链。例如，硫醇在金表面自组装主 要依靠Au-S键以及R1之间的范德华力，以形成致密单层膜；R2为生物相容性分子，主要用 于抗非特异性吸附，降低背景信号。硫醇的末端功能化基团主要用于进一步的化学修饰，如 连接光交联剂等，不同末端基团可以有不同的化学修饰方法，但反应原理都是基本的化学 共价结合。
[0020] 优选地，所述光交联剂为含有光敏感基团，在特定波长（能量）光照下可以进行 化学反应的试剂，优选为吖丙因、重氮、乙酰苯、二苯甲酮或蒽醌类中的任意一种或者至少 两种的混合物，例如可以是吖丙因，重氮，乙酰苯和二苯甲酮的混合物，或吖丙因、乙酰苯、 二苯甲酮和蒽醌类的混合物。光敏感基团，即光交联基团，为在光照下会产生反应的化学基 团。本发明主要利用光化学反应活化光敏感基团，使其快速、非选择性且共价地将高分子结 合在其表面。
[0021] 优选地，所述高分子指具有生物相容性且具有活性端基的功能高分子，包括但不 限于具有良好抗非特异性结合性能的合成高分子，例如可以是聚乙二醇及其衍生物、含氟 聚合物、聚丙烯酸及其衍生物、聚甲基丙烯酸及其衍生物、聚苯乙烯、聚乳酸、两性甜菜碱类 聚合物等；还可以是具有良好生物相容性的天然高分子，如硝化纤维、壳聚糖或葡聚糖及其 衍生物等。
[0022] 第二方面，本发明提供如第一方面所述的微阵列生物芯片的制备方法，包括以下 步骤：
[0023] (1)在玻璃芯片基底镀上铬层，再在铬层的表面镀上银和/或金层；
[0024] (2)完成步骤（1)后清洗芯片，在表面形成自组装单分子层；
[0025] (3)将光交联剂共价结合于自组装单分子层的表面；
[0026] (4)将高分子溶液旋涂在完成步骤（3)的芯片表面；
[0027] (5)待步骤（4)所述高分子溶液的溶剂挥发后，用紫外光照射使所述高分子接枝 在芯片表面；
[0028] 任选地，进行步骤（6):
[0029] (6)将接枝在芯片表面的高分子进行功能化。
[0030] 优选地，步骤（1)所述镀上铬层及银和/或金层的方法为金属热蒸和/或离子溅 射；采用以上方法形成的镀层颗粒较小且厚度均匀，有利于成像传感的应用。
[0031] 其中，步骤（2)所述清洗的方式为溶剂清洗、超声清洗以及等离子体清洗方法中 的任意一种或至少两种的组合，例如可以是溶剂清洗，超声清洗，等离子清洗和超声清洗的 组合，或溶剂清洗、超声清洗和等离子清洗的组合。所述溶剂清洗所用溶剂为去离子水、乙 醇、丙酮或N，N-二甲基甲酰胺中的任意一种或至少两种的混合，例如可以是去离子水，乙 醇和丙酮的混合物，去离子水和N，N-二甲基甲酰胺的混合物，或乙醇、丙酮和N，N-二甲基 甲酰胺的混合物。
[0032] 优选地，步骤（3)所述共价结合的方 式为酰胺化、酯化、开环或亲核取代反应，使 光交联剂接枝到自组装单分子层的末端，具体方法可根据生物芯片基底表面功能化基团和 光交联剂的末端官能团进行选择。例如，本发明可采用的光交联剂结构式如下所示，对于 (a)结构，采用酯化反应接枝到自组装单分子层末端；对于（b)结构，采用酰胺化反应接枝 到自组装单分子层末端。
[0033]
[0034] 优选地，步骤（4)所述高分子溶液的溶剂为去离子水、乙醇、甲醇、二甲基亚砜或 N，N-二甲基甲酰胺中的任意一种或者至少两种的组合，例如可以是去离子水，乙醇和甲醇 的混合物，二甲基亚砜和去离子水的混合物，或N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙醇和去 离子水的混合物。
[0035] 优选地，步骤（5)所述紫外光的波长为200-400nm，例如可以是200nm、210nm、 220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm、310nm、320nm、330nm、 340nm、350nm、360nm、370nm、380nm、390nm或 400nm，优选为 365nm。在此范围的紫外光波长 下，能保证光交联剂的反应效率处于较高水平。
[0036] 优选地，步骤（6)所述末端功能化并非必需，可以在高分子接枝后进行功能化；也 可以选择具有末端功能化的高分子，接枝到表面后直接使用；其中，步骤（6)所述功能化的 基团为羟基、羧基、醛基、氨基、环氧基、氰基、炔基、叠氮基、叮丙因或生物素。末端活性基团 主要结合生物分子，本发明中特指结合蛋白质，不同的蛋白质需要不同的活性端基进行固 定，如羟基、羧基、醛基或异腈酸基，甚至是修饰的活性生物分子，如生物素或抗体标签等。 此处所述末端功能化非必需，是指有些高分子自带功能化的末端或者在液相中已经进行过 功能化，连接到表面后即可以直接使用；而一些高分子本身不适合固定生物分子，需要进行 后处理，将分子末端改变成反应活性基团。
[0037] 在本发明中，可以通过调控光交联剂密度（摩尔百分比0. 01 %~100 % )、高分子 的数均分子量（100, 000-2, 000,OOODa)及旋涂速度（1，000-8,OOOrpm)等参数，精确控制微 阵列生物芯片表面修饰层的密度和厚度，从而可以简单、快速而高效制备本发明的微阵列 生物芯片。
[0038] 第三方面，本发明提供一种蛋白微阵列，其包括如本发明第一方面所述的微阵列 生物芯片。
[0039] 第四方面，本发明提供如第三方面所述的蛋白微阵列的制备方法，所述制备方法 为将蛋白质配制成溶液后，点样并孵育而制成。
[0040] 优选地，所述将蛋白质配制成溶液为将蛋白质溶于缓冲液中，使其保持蛋白质的 生物活性。
[0041] 优选地，所述缓冲液为PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液或HBS-EP缓冲 液。
[0042] 优选地，所述缓冲液的pH值视蛋白生物活性而按照要求保存，优选pH值为所述蛋 白质等电点以下0-1个单位，例如可以是〇个单位、〇. 1个单位、〇. 2个单位、0. 3个单位、0. 4 个单位、0. 5个单位、0. 6个单位、0. 7个单位、0. 8个单位、0. 9个单位或1个单位。
[0043] 其中，所述点样的方式为利用点样仪和/或手动点样，本发明并未对其作出具体 限制，本领域的技术人员可以根据经验自行选择；典型但非限制性地，可以通过商业化打印 机进行打印、通过移液枪进行手动点样或通过聚二甲基硅氧烷（PDMS)打孔辅助等手段点 样，形成蛋白质阵列。
[0044]优选地，所述孵育的温度为3-8°C，例如可以是3 °C、3. 5 °C、4 °C、4. 5 °C、5°C、 5. 5°C、6°C、6. 5°C、7°C、7. 5°C或 8°C，优选为 4°C。
[0045] 优选地，所述孵育的相对湿度为50-80%，例如可以是50%、52%、54%、56%、 58%、60%、62%、64%、66%、68%、70%、72%、74%、76%、78% 或 80%，优选为 70%。
[0046] 第五方面，本发明提供一种检测方法，所述方法利用本发明第四方面所述的蛋白 微阵列。
[0047] 优选地，所述方法包括以下步骤：
[0048] (1)清洗固定有蛋白微阵列的芯片，吹干后放入表面等离子共振分析成像仪；
[0049] (2)向表面等离子共振分析成像仪中加入缓冲液；
[0050] (3)待基线稳定，用重生液将所述芯片的表面重生；
[0051] (4)通入检测液，重生；
[0052] (5)通入校正液，检测蛋白质信号。
[0053] 优选地，步骤⑵所述缓冲液为PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液或 HBS-EP缓冲液。
[0054] 优选地，步骤⑵所述缓冲液中还加入二甲基亚砜溶液。
[0055]优选地，所述二甲基亚砜溶液的体积分数为0. 5-5 %，例如可以是0. 5 %、1 %、 1. 5%、2%、2. 5%、3%、3. 5%、4%、4. 5%或 5%〇
[0056] 优选地，步骤（3)所述重生液为磷酸溶液、甘氨酸-盐酸缓冲液、乙二醇溶液或 氢氧化钠水溶液；所述磷酸溶液中磷酸与水的体积比为1 : (100-400)，例如可以是1:100、 1:125、1 :150、1 :175、1:200、1 :225、1 :250、1 :275、1 :300、1 :325、1 :350、1 :375 或 1 :400 ; 所述甘氨酸-盐酸缓冲液的pH为1.5-2. 5,例如可以是1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2. 0、2. 1、 2. 2、2. 3、2. 4或2. 5 ;所述乙二醇溶液的体积分数为10-40%，例如可以是10%、12%、14%、 16%、18%、20%、22%、24%、26%、28%、30%、32%、34%、36%、38%或40%;所述氢氧 化钠水溶液的浓度为 7_13mmol/L，例如可以是 7mmol/L、7. 5mmol/L、8mmol/L、8. 5mmol/L、 9mmol/L、9. 5mmol/L、10mmol/L、10. 5mmol/L、llmmol/L、11. 5mmol/L、12mmol/L、12. 5mmol/L 或 13mmol/L〇
[0057] 第六方面，本发明提供如本发明第一方面所述的微阵列生物芯片或第四方面所述 的蛋白微阵列在检测小分子药物中的应用。
[0058] 所述小分子药物为分子量为500-1，OOODa的药物，SPRi检测信号与表面分子的质 量成正相关。小分子药物之所以很难检测，是因为其（流动相）分子量与蛋白（固定相）的 分子量相差悬殊，信号响应小。而本发明利用三维表面的修饰，使得芯片表面能够固定足够 多的蛋白，这些蛋白能够在检测中与足够多的小分子结合，使SPRi获得理想的相应信号。
[0059] 与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
[0060] SPRi虽然具有无标记、高通量和动力学检测等优点，但是传统的蛋白微阵列在 SPRi上检测不到小分子药物，原因是蛋白固定量太低。针对现有技术的不足，本发明通过两 步法修饰生物芯片，先进行物理层修饰（玻璃-铬-金和/或银），再进行化学层修饰（自 组装单分子层-光交联剂-高分子），激发表面等离子基元的同时达到固定蛋白质和保护金 属基底的作用。
[0061] 经过本发明的方法完成三维高分子表面修饰的生物芯片，可以有效提高蛋白在生 物芯片表面的固定量，使现有技术中很难检测到的小分子能够被无标记、精确而高通量地 检测出来，对分子生物学研宄和药物开发等领域具有现实意义。
[0062] 另外，本发明的方法可以精确控制生物芯片表面的蛋白固定量，同时保证芯片表 面具有足够的空间进行小分子药物的检测；制备方法简单、快捷、成本低且容易进行质量控 制，适合大规模生产和推广。
【附图说明】
[0063] 图1为实施例1中在含有SA、BSA和FKBP12蛋白微阵列的生物芯片上检测生物素 的结果图；
[0064] 图2为实施例2中在FKBP12蛋白微阵列上检测他克莫司（FK506)的结果，其中， (a)为蛋白微阵列图，（b)为在含有H-IgG、BSA和FKBP12蛋白微阵列的生物芯片上检测他 克莫司（FK506)的结果图；
[0065] 图3为实施例3中在FKBP12及其突变体蛋白微阵列上检测他克莫司（FK506)的 结果，其中，（a)为蛋白微阵列图，（b)为在含有FKBP12及其突变体的蛋白微阵列生物芯片 上检测他克莫司（FK506)的结果图；
[0066] 图4为实施例4中在淀粉样蛋白A0 42及其突变体微阵列上检测多肽17的结果 图。
【具体实施方式】
[0067] 下面通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明 了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0068] 实施例1在链霉亲和素（SA)微阵列上检测生物素（Biotin)
[0069] 1、生物芯片基底的修饰：
[0070] (1)在玻璃基底上用热蒸镀的方法制备一层3nm厚的络层和一层47nm厚的金层；
[0071 ] (2)准备羟基末端硫醇的乙醇溶液HS- (CH2)n-EG6-0H，浓度为ImM;< br>[0072] (3)将生物芯片基底用乙醇或去离子水清洗干净，然后将生物芯片放入等离子体 清洗仪中清洗3分钟；
[0073] (4)将生物芯片浸泡在准备好的硫醇溶液中，在4°C下孵育12小时，达到预定时间 后，将生物芯片取出，乙醇和去离子水交替清洗，氮气吹干；
[0074] (5)配制酯化连接光交联剂所需溶液20mL，羧基末端光交联剂10mM，1-(3-二甲氨 基丙基）_3_乙基碳二亚胺（EDC) 10mM，4-二甲氨基吡啶（DMAP)ImM，溶剂为N，N-二甲基甲 酰胺（DMF);
[0075] (6)将生物芯片浸入配制好的酯化溶液中，室温避光反应4小时，达到预定时间 后，将生物芯片依次用DMF、乙醇和去离子水进行清洗，氮气吹干备用；
[0076] (7)将分子量为500KDa的葡聚糖配制成质量浓度40%的水溶液，搅拌均勾，除去 气泡至无色透明的均一溶液；
[0077] (8)将配制好的葡聚糖溶液铺满于生物芯片表面，以SOOOrpm的转速，旋涂1分钟， 旋涂后，将生物芯片在室温下避光静置1小时晾干；
[0078] (9)将生物芯片放入紫外光交联仪中，氮气环境下，用365nm紫外光照射15分钟 (2. 4J/cm2)；
[0079] (10)达到预定时间后，将生物芯片用50°C的热水反复摇洗1小时，去除表面未共 价固定的葡聚糖分子，期间换水3-5次，生物芯片清洗后氮气吹干备用；
[0080] (11)将生物芯片浸入丁二酸酐（10mg/mL)和4-二甲氨基吡啶（DMAP，15mg/mL)的 DMF溶液中，室温（25°C)反应16小时，达到预定反应时间后，将生物芯片取出，依次用DMF、 乙醇和去离子水清洗，氮气吹干。
[0081] 2、蛋白微阵列的制备
[0082] (1)分别配制pH= 4. 5且浓度为lmg/mL的链霉亲和素（SA)乙酸钠缓冲液、pH= 4. 5且浓度为lmg/mL的牛血清白蛋白（BSA)乙酸钠缓冲液、以及pH= 4. 5且浓度为lmg/ mL的FKBP12蛋白乙酸钠缓冲液，备用；
[0083] (2)将制备好的生物芯片基底浸入EDC(0. 4M)和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，0. 1M) 的混合溶液中（1:1，v/v)活化30分钟，取出芯片，去离子水快速清洗，氮气吹干；
[0084] (3)将芯片分别与步骤（1)制备的三种蛋白缓冲溶液放入打印机的相应位置，调 整参数，进行打印，环境湿度为70%，针头直径300ym，接触时间ls，阵列为6X6 ;
[0085] (4)将打印好的芯片在70 %湿度环境下，4°C下孵育2小时，然后用PBST(0. 05% Tween20，v/v)进行清洗，迅速吹干，-20°C下保存。
[0086] 3、在蛋白微阵列上检测生物素
[0087] (1)将含有SA、BSA和FKBP12蛋白微阵列的生物芯片进行清洗后，分别放入SPRi 系统中；
[0088] (2)将系统溶液换为PBS缓冲液（含1 %的DMS0)，调整光学位置，通入含有4nM的 生物素-PBS溶液（含1 %的DMS0)，结合300s后解离300s;
[0089] (3)用体积分数为1 %的磷酸水溶液重生后，再用10mM的NaOH水溶液重生。
[0090] 检测结果如图1所示，由于生物素能与链霉亲和素特异性结合，而不与BSA和 FKBP12蛋白结合，因此若本发明的生物芯片能够固定大量SA的话，应该有明显不同于BSA 和FKBP12蛋白的信号差异。从图1的结果可以看出，负载SA的芯片具有较强的信号变化， 峰值在0.08AU稳定波动，说明本发明的方法制备的生物芯片具有很高的蛋白（SA)固定量， 足以检测到与SA结合的小分子生物素。而两个阴性对照，即负载BSA的芯片和负载FKBP12 蛋白的芯片的信号基本在0AU波动，并无明显的信号变化。
[0091] 实施例2在FKBP12蛋白微阵列上检测他克莫司（FK506)
[0092] 1、生物芯片基底的修饰
[0093](1)在玻璃基底上用热蒸镀的方法制备一层3nm厚的络层和一层47nm厚的金层， 作为生物芯片的基底；
[0094] (2)准备羟基末端硫醇的乙醇溶液HS- (CH2)n-EG6-0H和HS- (CH2)n-EG6-C00H，浓 度均为ImM，OH末端硫醇与COOH末端硫醇按体积比999:1进行混合；
[0095] (3)将生物芯片基底用乙醇或去离子水清洗干净，然后将生物芯片放入等离子体 清洗仪中清洗3分钟；
[0096] (4)将生物芯片浸泡在准备好的硫醇溶液中，在4°C下孵育12小时，达到预定时间 后，将生物芯片取出，乙醇和去离子水交替清洗，氮气吹干；
[0097] (5)配制表面活化水溶液20mL，EDC(0? 4M)和NHS(0? 1M)按照1:1体积混合；
[0098] (6)将生物芯片浸入配制好的活化溶液中，室温反应15分钟，达到预定时间后，将 生物芯片依次用去离子水快速冲洗，氮气吹干；
[0099] (7)将芯片表面浸泡入10mM氨基末端光交联剂的DMF溶液，室温避光反应4小时， 达到反应时间后用DMF、乙醇和去离子水进行清洗，氮气吹干备用；
[0100] (8)将分子量为2000KDa的葡聚糖配制成质量浓度20%的水溶液，搅拌均勾，除去 气泡至无色透明的均一溶液；
[0101] (9)将配制好的葡聚糖溶液铺满于生物芯片表面，以4000rpm的转速，旋涂45秒， 旋涂；
[0102] (10)将生物芯片放入紫外光交联仪中，氮气环境下，用365nm紫外光照射15分钟 (2. 4J/cm2)；
[0103] (11)达到预定时间后，将生物芯片用50°C的热水反复摇洗1小时，去除表面未共 价固定的葡聚糖分子，期间换水3-5次，生物芯片清洗后氮气吹干备用；
[0104] (12)将生物芯片浸入丁二酸酐（10mg/mL)和4-二甲氨基吡啶（15mg/mL)的DMF 溶液中，室温（25°C)反应2小时，达到预定反应时间后，将生物芯片取出，依次用DMF、乙 醇、去离子水清洗，氮气吹干。
[0105] 2、蛋白微阵列的制备
[0106] (1)分别配制pH= 7. 4且浓度为lmg/mL的人免疫球蛋白G(H-IgG)的磷酸盐缓冲 液、pH= 7. 4且浓度为lmg/mL的牛血清白蛋白（BSA)的磷酸盐缓冲液、以及pH= 7. 4且 浓度为lmg/mL的FKBP12蛋白的磷酸盐缓冲液，备用；
[0107] (2)将制备好的芯片基底浸入EDC(0. 4M)和NHS(0. 1M)的混合溶液中（1:1，v/v) 活化15分钟，取出芯片，去离子水快速清洗，氮气吹干；
[0108] (3)将芯片分别与步骤（1)制备的三种蛋白缓冲溶液放入打印机的相应位置，调 整参数，进行打印，环境湿度为70%，针头直径300ym，接触时间ls，阵列为6X6(如图 2a);
[0109] (4)将打印好的芯片在70%湿度环境下，4°C下孵育2小时，然后用PBST(0. 05% Tween20,v/v)进行清洗，迅速吹干，-20°C下保存。
[0110] 3、在蛋白微阵列上检测他克莫司（FK506)
[0111] (1)将含有H-IgG、BSA和FKBP12蛋白微阵列的生物芯片进行清洗后，分别放入 SPRi系统中；
[0112] (2)将系统溶液换为PBS缓冲液（含1 %的DMS0)，调整光学位置，通入含有10nM 的他克莫司（FK506) -PBS溶液（含1 %的DMS0)，结合300s后解离300s;
[0113](3)用体积分数为1 %的磷酸水溶液重生。
[0114] 检测结果如图2(b)所示，由于他克莫司能与FKBP12蛋白特异性结合，而不与 H-IgG和BSA结合，因此若本发明的生物芯片能够固定大量FKBP12蛋白的话，应该有明显不 同于H-IgG和BSA蛋白的信号差异。从图2(b)的结果可以看出，负载FKBP12蛋白的芯片 具有较强的信号变化，峰值在100RU稳定波动，说明本发明的方法制备的生物芯片具有很 高的蛋白（FKBP12)固定量，足以检测到与FKBP12蛋白结合的小分子FK506。而两个阴性对 照，即负载H-IgG的芯片和负载BSA蛋白的芯片的信号基本在0RU波动，并无明显的信号变 化。
[0115] 实施例3在FKBP12及其突变体蛋白微阵列上检测FK506
[0116] 1、生物芯片基底的修饰
[0117] 同实施例2。
[0118] 2、蛋白微阵列的制备
[0119] (1)分别配制pH= 7. 4且浓度为0? 5mg/mL的FKBP12 (野生型）蛋白的磷酸缓冲 液，以及相同pH和浓度的5个单氨基酸突变体（M1-M5)的磷酸缓冲液，备用；
[0120] (2)将制备好的芯片基底浸入EDC(0.4M)和NHS(0. 1M)的混合溶液中（1:1，v/v) 活化15分钟，取出芯片，去离子水快速清洗，氮气吹干；
[0121] (3)将芯片分别与步骤（1)制备的六种蛋白缓冲溶液放入打印机的相应位置，调 整参数，进行打印，环境湿度为70%，针头直径300ym，接触时间ls，阵列为6X12 (如图 3a)；
[0122] (4)将打印好 的芯片在70%湿度环境下，4°C下孵育2小时，然后用PBST(0. 05% Tween20,v/v)进行清洗，迅速吹干，-20°C下保存。
[0123] 3、在蛋白微阵列上检测他克莫司（FK506)
[0124] (1)将含有FKBP12及其突变体的蛋白微阵列生物芯片进行清洗后，分别放入SPRi 系统中；
[0125](2)将系统溶液换为PBS缓冲液（含1 %的DMSO)，调整光学位置，通入含有10nM 的他克莫司（FK506) -PBS溶液（含1 %的DMS0)，结合300s后解离300s;
[0126](3)用体积分数为1%的磷酸水溶液重生。
[0127] 检测结果如图3(b)所示，可以看出，负载FKBP12野生型蛋白的芯片具有较强的信 号变化，而五种突变体的信号变化不如FKBP12野生型蛋白明显，说明利用本发明的方法制 备的生物芯片具有很高的蛋白固定量，足以检测到FK506与FKBP12的特异性结合。而突变 体由于只是单氨基酸的突变，与FK506也有一定程度的结合，但结合程度不如野生型，信号 强度也弱与野生型的FKBP12。
[0128] 实施例4在淀粉样蛋白A0 42及其突变体微阵列上检测多肽17
[0129] 1、生物芯片基底的修饰
[0130] 同实施例2。
[0131] 2、蛋白微阵列的制备
[0132] (1)分别配制口11=7.4且浓度为〇.51^/ 1^的淀粉样蛋白六0 42(野生型）的磷酸 缓冲液，以及相同pH和浓度的3个突变体（E型、T型和P型）的磷酸缓冲液，备用；
[0133](2)将制备好的芯片基底浸入EDC(0.4M)和NHS(0. 1M)的混合溶液中（1:1，v/v) 活化15分钟，取出芯片，去离子水快速清洗，氮气吹干；
[0134] (3)将芯片分别与步骤（1)制备的3种蛋白缓冲溶液放入打印机的相应位置，调整 参数，进行打印，环境湿度为70%，针头直径300ym，接触时间ls，阵列为6X12 (如图3a);
[0135] (4)将打印好的芯片在70%湿度环境下，4°C下孵育2小时，然后用PBST(0. 05% Tween20，v/v)进行清洗，迅速吹干，-20°C下保存。
[0136] 3、在蛋白微阵列上检测多肽17
[0137] (1)将含有淀粉样蛋白A042及其突变体的蛋白微阵列生物芯片进行清洗后，分 别放入SPRi系统中；
[0138] (2)将系统溶液换为PBS缓冲液（含1 %的DMSO)，调整光学位置，通入含有50yM 的小分子多肽I7-PBS溶液，结合300s后解离300s;
[0139] (3)用体积分数为1 %的磷酸水溶液重生。
[0140] 检测结果如图4所示，可以看出负载野生型淀粉样蛋白A0 42的芯片具有较强的 信号变化，而三种突变体的信号变化不如野生型蛋白明显，说明利用本发明的方法制备的 生物芯片具有很高的蛋白固定量，足以检测到野生型淀粉样蛋白A0 42与多肽17的特异性 结合。而三种突变体只是若干位点的突变，因此其与多肽T7也有不同程度的结合；其中T 型和E型的突变位点可能不是关键位点，因此与多肽17也有一定程度的结合；而P型为关 键位点的突变，因此疾病与多肽17没有结合；虽然突变型与多肽17的结合程度各异，但都 不如野生型，信号强度也弱于野生型的淀粉样蛋白Af3 42。
[0141] 综合以上结果可以得出，经本发明的方法完成三维高分子表面修饰的生物芯片， 可以有效提高蛋白在生物芯片表面的固定量，使现有技术中很难检测到的小分子能够被无 标记、精确而高通量地检测出来，对分子生物学研宄和药物开发等领域具有现实意义。另 外，本发明的方法可以精确控制生物芯片表面的蛋白固定量，同时保证芯片表面具有足够 的空间进行小分子药物的检测；制备方法简单、快捷、成本低且容易进行质量控制，适合大 规模生产和推广。
[0142] 申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局 限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的 技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的 添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【主权项】
1. 一种微阵列生物芯片，包括玻璃芯片基底和修饰层，其特征在于，所述修饰层包括依 次叠加在所述玻璃芯片基底表面的铬层、银和/或金层、自组装单分子层、光交联剂和高分 子层。2. 根据权利要求1所述的微阵列生物芯片，其特征在于，所述铬层的厚度为0.l_9nm， 优选为3nm; 优选地，所述银和/或金层的厚度为40-60nm，优选为47-50nm; 优选地，所述自组装单分子层的试剂为末端功能化的硫醇； 优选地，所述末端功能化的硫醇为单硫醇和/或双硫醇； 优选地，所述末端功能化的硫醇为烷硫醇和/或带有PEG嵌段的硫醇； 优选地，所述末端功能化的基团为羟基、羧基、氨基、醛基、环氧基或甲氧基； 优选地，所述光交联剂为含有光敏感基团的试剂，优选为吖丙因、重氮、乙酰苯、二苯甲 酮或蒽醌类中的任意一种或者至少两种的混合物； 优选地，所述高分子为聚乙二醇及其衍生物、含氟聚合物、聚丙烯酸及其衍生物、聚甲 基丙烯酸及其衍生物、聚苯乙烯、聚乳酸、两性甜菜碱类聚合物、硝化纤维、壳聚糖或葡聚糖 及其衍生物中的任意一种或至少两种的混合物。3. 根据权利要求1或2所述的微阵列生物芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步 骤： (1) 在玻璃芯片基底镀上铬层，再在铬层的表面镀上银和/或金层； (2) 完成步骤（1)后清洗芯片，在表面形成自组装单分子层； (3) 将光交联剂共价结合于自组装单分子层的表面； (4) 将高分子溶液旋涂在完成步骤（3)的芯片表面； (5) 待步骤（4)所述高分子溶液的溶剂挥发后，用紫外光照射使所述高分子接枝在芯 片表面； 任选地，进行步骤（6): (6) 将接枝在芯片表面的高分子进行功能化。4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)所述镀上铬层及银和/或金 层的方法为金属热蒸和/或离子溅射； 优选地，步骤（3)所述共价结合的方式为酰胺化、酯化、开环或亲核取代反应； 优选地，步骤（4)所述高分子溶液的溶剂为去离子水、乙醇、甲醇、二甲基亚砜或N，N-二甲基甲酰胺中的任意一种或者至少两种的组合； 优选地，步骤（5)所述紫外光的波长为200-400nm，优选为365nm; 优选地，步骤（6)所述功能化的基团为羟基、羧基、醛基、氨基、环氧基、氰基、炔基、叠 氮基、叮丙因或生物素。5. -种蛋白微阵列，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的微阵列生物芯片。6. 根据权利要求5所述的蛋白微阵列的制备方法，其特征在于，所述制备方法为将蛋 白质配制成溶液后，点样并孵育而制成； 优选地，所述将蛋白质配制成溶液为将蛋白质溶于缓冲液中； 优选地，所述缓冲液为PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液或HBS-EP缓冲液； 优选地，所述缓冲液的PH值为所述蛋白质等电点以下0-1个单位； 优选地，所述孵育的温度为3-8°C，优选为4°C; 优选地，所述孵育的相对湿度为50-80 %，优选为70 %。7. -种检测方法，其特征在于，所述方法利用权利要求5所述的蛋白微阵列。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 清洗固定有蛋白微阵列的芯片，吹干后放入表面等离子共振分析成像仪； (2) 向表面等离子共振分析成像仪中加入缓冲液； (3) 待基线稳定，用重生液将所述芯片的表面重生； (4) 通入检测液，重生； (5) 通入校正液，检测蛋白质信号。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（2)所述缓冲液为PBS缓冲液、HEPES 缓冲液、Tris-HCl缓冲液或HBS-EP缓冲液； 优选地，步骤（2)所述缓冲液中还加入二甲基亚砜溶液； 优选地，所述二甲基亚砜溶液的体积分数为0. 5-5% ; 优选地，步骤（3)所述重生液为磷酸溶液、甘氨酸-盐酸缓冲液、乙二醇溶液或氢氧化 钠水溶液；所述磷酸溶液中磷酸与水的体积比为1 : (100-400);所述甘氨酸-盐酸缓冲液 的pH为1. 5-2. 5 ;所述乙二醇溶液的体积分数为10-40% ;所述氢氧化钠水溶液的浓度为 7_13mmol/L〇10. 根据权利要求1或2所述的微阵列生物芯片或权利要求5所述的蛋白微阵列在检 测小分子药物中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种微阵列生物芯片及其制备方法和应用。所述微阵列生物芯片包括玻璃芯片基底和修饰层，所述修饰层包括依次叠加在所述玻璃芯片基底表面的铬层、银和/或金层、自组装单分子层、光交联剂和高分子层。本发明还提供一种蛋白微阵列及其方法和在检测小分子药物中的应用。经过本发明的方法完成三维高分子表面修饰的微阵列生物芯片，可以有效提高蛋白在微阵列生物芯片表面的固定量，使现有技术中很难检测到的小分子能够被无标记、精确而高通量地检测出来，对分子生物学研究和药物开发等领域具有重要现实意义。
【IPC分类】G01N33/68, G01N21/552
【公开号】CN104897617
【申请号】CN201510257349
【发明人】杨墨, 朱劲松, 李少鹏, 周文菲, 王瑞
【申请人】国家纳米科学中心
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月19日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物芯片技术领域，尤其涉及一种微阵列生物芯片及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 研宄小分子药物与蛋白靶标的相互作用，对基础科学研宄和药物开发具有重要意 义。但在实际应用中，存在一种药物针对多靶标相互作用的情况，如对药物杂泛性和副作用 的研宄、先导化合物的优化以及旧药新用等。因此，开发一种高效的小分子-靶标相互作用 检测方法将对靶标活性评价及药物筛选等具有推动作用。
[0003] 在分子生物学层面，药物开发往往需要对先导化合物/药物与蛋白靶标之间的相 互作用信息（如动力学和亲和力）进行采集和评价。近年来，表面等离子共振生物传感器 (surfaceplasmonresonance，SPR)以免标记、高灵敏和实时监测等优势，迅速发展成为研 宄小分子与蛋白靶标相互作用动力学和亲和力的重要工具。目前，SPR检测技术主要为基 于角度检测的方法（以BIAcore系列产品为主），该方法将蛋白固定在芯片表面，流通小分 子药物，对光学信号进行实时监测。然而，随着检测样品的多样性以其相互作用网络的复杂 性，要求检测手段具有高通量和高效率的特征，这种传统的"一对一"的检测方法已经无法 满足应用需求。
[0004] 表面等离子共振成像技术（SPRimaging，SPRi)的出现很好地解决了以上的通量 问题。SPRi技术采用微阵列格式和平行光检测，可以一次性地获得芯片表面在检测区域内 的相互作用信息，具有"一对多"甚至"多对多"的高通量检测优势。利用SPRi技术，研宄 者们开发出了高通量检测蛋白-蛋白、多肽-多肽以及DNA-DNA相互作用的方法。然而，对 于小分子在蛋白阵列上的检测，依旧存在着挑战：①由于当前基于强度检测的SPRi技术的 灵敏度低于角度检测技术，加之小分子检测时，由于其分子量低产生信号响应本身很小，使 得高通量SPRi仪器的检测能力较低；②SPRi的数据质量与采集面积有关，通量越高会导致 样品点面积减小，噪音增加，使得检出困难；③当前SPRi芯片表面多采用硫醇修饰，蛋白固 定量较低，使得与之相互作用的小分子药物也较少，信号自然很难检出。
[0005] 针对以上问题，研宄者们主要针对仪器改良和芯片化学修饰两个方面增强SPRi 的检测灵敏度，以获得在蛋白微阵列上检测小分子的能力。例如，N.J.Tao等利用SPRi和 电化学阻抗结合，提高了SPRi的检测灵敏度，成功在P38激酶阵列上检测到SB203580小 分子的结合，并获得了动力学和亲和力常数（Anal.Chem. 2014, 86, 9860-9865);但该方 法只是适用于该团队开发的仪器，在SPRi主流仪器上没有通用性。另外，在芯片化学修 饰方面，Y.M.Wang等人在SPRi芯片表面构建了三维的聚丙烯酸（PAA)高分子刷，并采 用微接触印刷调控高分子间的空间距离，获得较高的蛋白固定量（App1iedSurfaceScien ce266 (201) 313-318) ;H.W.Ma等利用表面引发聚合的方法在SPR芯片表面构建了三维高分 子表面，并获得优化的抗原-抗体检测信号（Chem.Commun.，2011，47,1190-1192)。但是，以 上针对芯片化学修饰的方法均未在蛋白阵列上成功检测小分子药物。因此，开发出在SPRi 仪器上高通量检测小分子-蛋白相互作用的方法具有极其重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种应用于表面等离子共振系统的微阵列生物芯片及其 制备方法、利用其制备的蛋白微阵列以及利用所述蛋白微阵列进行检测的方法和在小分子 药物检测方面的应用。
[0007] 为达到以上目的，本发明采用如下技术路线：
[0008] 第一方面，本发明提供一种微阵列生物芯片，包括玻璃芯片基底和修饰层，所述修 饰层包括依次叠加在所述玻璃芯片基底表面的铬层、银和/或金层、自组装单分子层、光交 联剂和高分子层。
[0009] 表面等离子共振成像技术是利用光波与金属（金和/或银）中自由电子波产生的 共振，通过检测共振信号来确定金属表面生物分子相互作用情况（结合或解离），因此金和 /或银在表面是必要条件。在玻璃芯片基底与金和/或银之间镀一层铬是由于金和/或银 与玻璃芯片基底的粘附性不好，铬起到粘附缓冲层作用。
[0010] 另外，芯片的修饰方法大致可以分为两类：物理层（玻璃-铬-金和/或银），主 要作用是激发表面等离子激元共振；化学层（自组装单分子层-光交联剂-高分子），其主 要用于生物分子的固定和对金属基底的保护。其中，物理层为SPRi传感芯片的常规技术手 段；而化学层是本发明的重点，经过本发明的方法修饰的芯片，可以有效提高生物分子在生 物芯片表面的固定量，使原来很难检测到的小分子药物能够检测出来。
[0011] 在本发明中，小分子药物检测的实现主要通过提高蛋白分子固定量，而蛋白分子 固定量主要依靠三维高分子表面的修饰，自组装单分子层用于保护基底和提供末端活性基 团，光交联剂起到桥连单分子层和高分子的作用。
[0012] 优选地，所述络层的厚度为0?l_9nm，例如可以是0?lnm、lnm、2nm、3nm、4nm、5nm、 6nm、7nm、8nm或9nm，优选为3nm。对于络层的厚度，本领域的技术人员可根据金属与玻璃的 粘附性进行适当的选择。如果粘附性良好，也可以不加铬层；但现有的技术中，二者的粘附 性一般还未达到可以省去铬层的程度；因此，铬层不宜太薄，以保证成膜，增加粘附性；如 果铬层厚度太大，则不利于光波的传导。
[0013] 优选地，所述银和/或金层的厚度为40_60nm，例如可以是40nm、41nm、42nm、43nm、 44nm、45nm、46nm、47nm、48nm、49nm、50nm、51nm、52nm、53nm、54nm、55nm、56nm、57nm、58nm、 59nm或60nm，优选为47_50nm。如果厚度超过此范围（大于60nm或小于40nm)，会导致灵 敏度下降，影响对于小分子药物检测的灵敏度。
[0014] 优选地，所述自组装单分子层的试剂为末端功能化的硫醇。
[0015] 优选地，所述末端功能化的硫醇为单硫醇和/或双硫醇。
[0016] 优选地，所述末端功能化的硫醇为烷硫醇和/或带有PEG嵌段的硫醇。
[0017] 优选地，所述末端功能化的基团为羟基、羧基、氨基、醛基、环氧基或甲氧基。
[0018] 硫醇的通式为：HS-R1_R2 ;
[0019] 其中，R1为烷烃链，R2 -般为末端功能化的PEG链。例如，硫醇在金表面自组装主 要依靠Au-S键以及R1之间的范德华力，以形成致密单层膜；R2为生物相容性分子，主要用 于抗非特异性吸附，降低背景信号。硫醇的末端功能化基团主要用于进一步的化学修饰，如 连接光交联剂等，不同末端基团可以有不同的化学修饰方法，但反应原理都是基本的化学 共价结合。
[0020] 优选地，所述光交联剂为含有光敏感基团，在特定波长（能量）光照下可以进行 化学反应的试剂，优选为吖丙因、重氮、乙酰苯、二苯甲酮或蒽醌类中的任意一种或者至少 两种的混合物，例如可以是吖丙因，重氮，乙酰苯和二苯甲酮的混合物，或吖丙因、乙酰苯、 二苯甲酮和蒽醌类的混合物。光敏感基团，即光交联基团，为在光照下会产生反应的化学基 团。本发明主要利用光化学反应活化光敏感基团，使其快速、非选择性且共价地将高分子结 合在其表面。
[0021] 优选地，所述高分子指具有生物相容性且具有活性端基的功能高分子，包括但不 限于具有良好抗非特异性结合性能的合成高分子，例如可以是聚乙二醇及其衍生物、含氟 聚合物、聚丙烯酸及其衍生物、聚甲基丙烯酸及其衍生物、聚苯乙烯、聚乳酸、两性甜菜碱类 聚合物等；还可以是具有良好生物相容性的天然高分子，如硝化纤维、壳聚糖或葡聚糖及其 衍生物等。
[0022] 第二方面，本发明提供如第一方面所述的微阵列生物芯片的制备方法，包括以下 步骤：
[0023] (1)在玻璃芯片基底镀上铬层，再在铬层的表面镀上银和/或金层；
[0024] (2)完成步骤（1)后清洗芯片，在表面形成自组装单分子层；
[0025] (3)将光交联剂共价结合于自组装单分子层的表面；
[0026] (4)将高分子溶液旋涂在完成步骤（3)的芯片表面；
[0027] (5)待步骤（4)所述高分子溶液的溶剂挥发后，用紫外光照射使所述高分子接枝 在芯片表面；
[0028] 任选地，进行步骤（6):
[0029] (6)将接枝在芯片表面的高分子进行功能化。
[0030] 优选地，步骤（1)所述镀上铬层及银和/或金层的方法为金属热蒸和/或离子溅 射；采用以上方法形成的镀层颗粒较小且厚度均匀，有利于成像传感的应用。
[0031] 其中，步骤（2)所述清洗的方式为溶剂清洗、超声清洗以及等离子体清洗方法中 的任意一种或至少两种的组合，例如可以是溶剂清洗，超声清洗，等离子清洗和超声清洗的 组合，或溶剂清洗、超声清洗和等离子清洗的组合。所述溶剂清洗所用溶剂为去离子水、乙 醇、丙酮或N，N-二甲基甲酰胺中的任意一种或至少两种的混合，例如可以是去离子水，乙 醇和丙酮的混合物，去离子水和N，N-二甲基甲酰胺的混合物，或乙醇、丙酮和N，N-二甲基 甲酰胺的混合物。
[0032] 优选地，步骤（3)所述共价结合的方 式为酰胺化、酯化、开环或亲核取代反应，使 光交联剂接枝到自组装单分子层的末端，具体方法可根据生物芯片基底表面功能化基团和 光交联剂的末端官能团进行选择。例如，本发明可采用的光交联剂结构式如下所示，对于 (a)结构，采用酯化反应接枝到自组装单分子层末端；对于（b)结构，采用酰胺化反应接枝 到自组装单分子层末端。
[0033]
[0034] 优选地，步骤（4)所述高分子溶液的溶剂为去离子水、乙醇、甲醇、二甲基亚砜或 N，N-二甲基甲酰胺中的任意一种或者至少两种的组合，例如可以是去离子水，乙醇和甲醇 的混合物，二甲基亚砜和去离子水的混合物，或N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙醇和去 离子水的混合物。
[0035] 优选地，步骤（5)所述紫外光的波长为200-400nm，例如可以是200nm、210nm、 220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm、310nm、320nm、330nm、 340nm、350nm、360nm、370nm、380nm、390nm或 400nm，优选为 365nm。在此范围的紫外光波长 下，能保证光交联剂的反应效率处于较高水平。
[0036] 优选地，步骤（6)所述末端功能化并非必需，可以在高分子接枝后进行功能化；也 可以选择具有末端功能化的高分子，接枝到表面后直接使用；其中，步骤（6)所述功能化的 基团为羟基、羧基、醛基、氨基、环氧基、氰基、炔基、叠氮基、叮丙因或生物素。末端活性基团 主要结合生物分子，本发明中特指结合蛋白质，不同的蛋白质需要不同的活性端基进行固 定，如羟基、羧基、醛基或异腈酸基，甚至是修饰的活性生物分子，如生物素或抗体标签等。 此处所述末端功能化非必需，是指有些高分子自带功能化的末端或者在液相中已经进行过 功能化，连接到表面后即可以直接使用；而一些高分子本身不适合固定生物分子，需要进行 后处理，将分子末端改变成反应活性基团。
[0037] 在本发明中，可以通过调控光交联剂密度（摩尔百分比0. 01 %~100 % )、高分子 的数均分子量（100, 000-2, 000,OOODa)及旋涂速度（1，000-8,OOOrpm)等参数，精确控制微 阵列生物芯片表面修饰层的密度和厚度，从而可以简单、快速而高效制备本发明的微阵列 生物芯片。
[0038] 第三方面，本发明提供一种蛋白微阵列，其包括如本发明第一方面所述的微阵列 生物芯片。
[0039] 第四方面，本发明提供如第三方面所述的蛋白微阵列的制备方法，所述制备方法 为将蛋白质配制成溶液后，点样并孵育而制成。
[0040] 优选地，所述将蛋白质配制成溶液为将蛋白质溶于缓冲液中，使其保持蛋白质的 生物活性。
[0041] 优选地，所述缓冲液为PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液或HBS-EP缓冲 液。
[0042] 优选地，所述缓冲液的pH值视蛋白生物活性而按照要求保存，优选pH值为所述蛋 白质等电点以下0-1个单位，例如可以是〇个单位、〇. 1个单位、〇. 2个单位、0. 3个单位、0. 4 个单位、0. 5个单位、0. 6个单位、0. 7个单位、0. 8个单位、0. 9个单位或1个单位。
[0043] 其中，所述点样的方式为利用点样仪和/或手动点样，本发明并未对其作出具体 限制，本领域的技术人员可以根据经验自行选择；典型但非限制性地，可以通过商业化打印 机进行打印、通过移液枪进行手动点样或通过聚二甲基硅氧烷（PDMS)打孔辅助等手段点 样，形成蛋白质阵列。
[0044]优选地，所述孵育的温度为3-8°C，例如可以是3 °C、3. 5 °C、4 °C、4. 5 °C、5°C、 5. 5°C、6°C、6. 5°C、7°C、7. 5°C或 8°C，优选为 4°C。
[0045] 优选地，所述孵育的相对湿度为50-80%，例如可以是50%、52%、54%、56%、 58%、60%、62%、64%、66%、68%、70%、72%、74%、76%、78% 或 80%，优选为 70%。
[0046] 第五方面，本发明提供一种检测方法，所述方法利用本发明第四方面所述的蛋白 微阵列。
[0047] 优选地，所述方法包括以下步骤：
[0048] (1)清洗固定有蛋白微阵列的芯片，吹干后放入表面等离子共振分析成像仪；
[0049] (2)向表面等离子共振分析成像仪中加入缓冲液；
[0050] (3)待基线稳定，用重生液将所述芯片的表面重生；
[0051] (4)通入检测液，重生；
[0052] (5)通入校正液，检测蛋白质信号。
[0053] 优选地，步骤⑵所述缓冲液为PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液或 HBS-EP缓冲液。
[0054] 优选地，步骤⑵所述缓冲液中还加入二甲基亚砜溶液。
[0055]优选地，所述二甲基亚砜溶液的体积分数为0. 5-5 %，例如可以是0. 5 %、1 %、 1. 5%、2%、2. 5%、3%、3. 5%、4%、4. 5%或 5%〇
[0056] 优选地，步骤（3)所述重生液为磷酸溶液、甘氨酸-盐酸缓冲液、乙二醇溶液或 氢氧化钠水溶液；所述磷酸溶液中磷酸与水的体积比为1 : (100-400)，例如可以是1:100、 1:125、1 :150、1 :175、1:200、1 :225、1 :250、1 :275、1 :300、1 :325、1 :350、1 :375 或 1 :400 ; 所述甘氨酸-盐酸缓冲液的pH为1.5-2. 5,例如可以是1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2. 0、2. 1、 2. 2、2. 3、2. 4或2. 5 ;所述乙二醇溶液的体积分数为10-40%，例如可以是10%、12%、14%、 16%、18%、20%、22%、24%、26%、28%、30%、32%、34%、36%、38%或40%;所述氢氧 化钠水溶液的浓度为 7_13mmol/L，例如可以是 7mmol/L、7. 5mmol/L、8mmol/L、8. 5mmol/L、 9mmol/L、9. 5mmol/L、10mmol/L、10. 5mmol/L、llmmol/L、11. 5mmol/L、12mmol/L、12. 5mmol/L 或 13mmol/L〇
[0057] 第六方面，本发明提供如本发明第一方面所述的微阵列生物芯片或第四方面所述 的蛋白微阵列在检测小分子药物中的应用。
[0058] 所述小分子药物为分子量为500-1，OOODa的药物，SPRi检测信号与表面分子的质 量成正相关。小分子药物之所以很难检测，是因为其（流动相）分子量与蛋白（固定相）的 分子量相差悬殊，信号响应小。而本发明利用三维表面的修饰，使得芯片表面能够固定足够 多的蛋白，这些蛋白能够在检测中与足够多的小分子结合，使SPRi获得理想的相应信号。
[0059] 与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
[0060] SPRi虽然具有无标记、高通量和动力学检测等优点，但是传统的蛋白微阵列在 SPRi上检测不到小分子药物，原因是蛋白固定量太低。针对现有技术的不足，本发明通过两 步法修饰生物芯片，先进行物理层修饰（玻璃-铬-金和/或银），再进行化学层修饰（自 组装单分子层-光交联剂-高分子），激发表面等离子基元的同时达到固定蛋白质和保护金 属基底的作用。
[0061] 经过本发明的方法完成三维高分子表面修饰的生物芯片，可以有效提高蛋白在生 物芯片表面的固定量，使现有技术中很难检测到的小分子能够被无标记、精确而高通量地 检测出来，对分子生物学研宄和药物开发等领域具有现实意义。
[0062] 另外，本发明的方法可以精确控制生物芯片表面的蛋白固定量，同时保证芯片表 面具有足够的空间进行小分子药物的检测；制备方法简单、快捷、成本低且容易进行质量控 制，适合大规模生产和推广。
【附图说明】
[0063] 图1为实施例1中在含有SA、BSA和FKBP12蛋白微阵列的生物芯片上检测生物素 的结果图；
[0064] 图2为实施例2中在FKBP12蛋白微阵列上检测他克莫司（FK506)的结果，其中， (a)为蛋白微阵列图，（b)为在含有H-IgG、BSA和FKBP12蛋白微阵列的生物芯片上检测他 克莫司（FK506)的结果图；
[0065] 图3为实施例3中在FKBP12及其突变体蛋白微阵列上检测他克莫司（FK506)的 结果，其中，（a)为蛋白微阵列图，（b)为在含有FKBP12及其突变体的蛋白微阵列生物芯片 上检测他克莫司（FK506)的结果图；
[0066] 图4为实施例4中在淀粉样蛋白A0 42及其突变体微阵列上检测多肽17的结果 图。
【具体实施方式】
[0067] 下面通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明 了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0068] 实施例1在链霉亲和素（SA)微阵列上检测生物素（Biotin)
[0069] 1、生物芯片基底的修饰：
[0070] (1)在玻璃基底上用热蒸镀的方法制备一层3nm厚的络层和一层47nm厚的金层；
[0071 ] (2)准备羟基末端硫醇的乙醇溶液HS- (CH2)n-EG6-0H，浓度为ImM;< br>[0072] (3)将生物芯片基底用乙醇或去离子水清洗干净，然后将生物芯片放入等离子体 清洗仪中清洗3分钟；
[0073] (4)将生物芯片浸泡在准备好的硫醇溶液中，在4°C下孵育12小时，达到预定时间 后，将生物芯片取出，乙醇和去离子水交替清洗，氮气吹干；
[0074] (5)配制酯化连接光交联剂所需溶液20mL，羧基末端光交联剂10mM，1-(3-二甲氨 基丙基）_3_乙基碳二亚胺（EDC) 10mM，4-二甲氨基吡啶（DMAP)ImM，溶剂为N，N-二甲基甲 酰胺（DMF);
[0075] (6)将生物芯片浸入配制好的酯化溶液中，室温避光反应4小时，达到预定时间 后，将生物芯片依次用DMF、乙醇和去离子水进行清洗，氮气吹干备用；
[0076] (7)将分子量为500KDa的葡聚糖配制成质量浓度40%的水溶液，搅拌均勾，除去 气泡至无色透明的均一溶液；
[0077] (8)将配制好的葡聚糖溶液铺满于生物芯片表面，以SOOOrpm的转速，旋涂1分钟， 旋涂后，将生物芯片在室温下避光静置1小时晾干；
[0078] (9)将生物芯片放入紫外光交联仪中，氮气环境下，用365nm紫外光照射15分钟 (2. 4J/cm2)；
[0079] (10)达到预定时间后，将生物芯片用50°C的热水反复摇洗1小时，去除表面未共 价固定的葡聚糖分子，期间换水3-5次，生物芯片清洗后氮气吹干备用；
[0080] (11)将生物芯片浸入丁二酸酐（10mg/mL)和4-二甲氨基吡啶（DMAP，15mg/mL)的 DMF溶液中，室温（25°C)反应16小时，达到预定反应时间后，将生物芯片取出，依次用DMF、 乙醇和去离子水清洗，氮气吹干。
[0081] 2、蛋白微阵列的制备
[0082] (1)分别配制pH= 4. 5且浓度为lmg/mL的链霉亲和素（SA)乙酸钠缓冲液、pH= 4. 5且浓度为lmg/mL的牛血清白蛋白（BSA)乙酸钠缓冲液、以及pH= 4. 5且浓度为lmg/ mL的FKBP12蛋白乙酸钠缓冲液，备用；
[0083] (2)将制备好的生物芯片基底浸入EDC(0. 4M)和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，0. 1M) 的混合溶液中（1:1，v/v)活化30分钟，取出芯片，去离子水快速清洗，氮气吹干；
[0084] (3)将芯片分别与步骤（1)制备的三种蛋白缓冲溶液放入打印机的相应位置，调 整参数，进行打印，环境湿度为70%，针头直径300ym，接触时间ls，阵列为6X6 ;
[0085] (4)将打印好的芯片在70 %湿度环境下，4°C下孵育2小时，然后用PBST(0. 05% Tween20，v/v)进行清洗，迅速吹干，-20°C下保存。
[0086] 3、在蛋白微阵列上检测生物素
[0087] (1)将含有SA、BSA和FKBP12蛋白微阵列的生物芯片进行清洗后，分别放入SPRi 系统中；
[0088] (2)将系统溶液换为PBS缓冲液（含1 %的DMS0)，调整光学位置，通入含有4nM的 生物素-PBS溶液（含1 %的DMS0)，结合300s后解离300s;
[0089] (3)用体积分数为1 %的磷酸水溶液重生后，再用10mM的NaOH水溶液重生。
[0090] 检测结果如图1所示，由于生物素能与链霉亲和素特异性结合，而不与BSA和 FKBP12蛋白结合，因此若本发明的生物芯片能够固定大量SA的话，应该有明显不同于BSA 和FKBP12蛋白的信号差异。从图1的结果可以看出，负载SA的芯片具有较强的信号变化， 峰值在0.08AU稳定波动，说明本发明的方法制备的生物芯片具有很高的蛋白（SA)固定量， 足以检测到与SA结合的小分子生物素。而两个阴性对照，即负载BSA的芯片和负载FKBP12 蛋白的芯片的信号基本在0AU波动，并无明显的信号变化。
[0091] 实施例2在FKBP12蛋白微阵列上检测他克莫司（FK506)
[0092] 1、生物芯片基底的修饰
[0093](1)在玻璃基底上用热蒸镀的方法制备一层3nm厚的络层和一层47nm厚的金层， 作为生物芯片的基底；
[0094] (2)准备羟基末端硫醇的乙醇溶液HS- (CH2)n-EG6-0H和HS- (CH2)n-EG6-C00H，浓 度均为ImM，OH末端硫醇与COOH末端硫醇按体积比999:1进行混合；
[0095] (3)将生物芯片基底用乙醇或去离子水清洗干净，然后将生物芯片放入等离子体 清洗仪中清洗3分钟；
[0096] (4)将生物芯片浸泡在准备好的硫醇溶液中，在4°C下孵育12小时，达到预定时间 后，将生物芯片取出，乙醇和去离子水交替清洗，氮气吹干；
[0097] (5)配制表面活化水溶液20mL，EDC(0? 4M)和NHS(0? 1M)按照1:1体积混合；
[0098] (6)将生物芯片浸入配制好的活化溶液中，室温反应15分钟，达到预定时间后，将 生物芯片依次用去离子水快速冲洗，氮气吹干；
[0099] (7)将芯片表面浸泡入10mM氨基末端光交联剂的DMF溶液，室温避光反应4小时， 达到反应时间后用DMF、乙醇和去离子水进行清洗，氮气吹干备用；
[0100] (8)将分子量为2000KDa的葡聚糖配制成质量浓度20%的水溶液，搅拌均勾，除去 气泡至无色透明的均一溶液；
[0101] (9)将配制好的葡聚糖溶液铺满于生物芯片表面，以4000rpm的转速，旋涂45秒， 旋涂；
[0102] (10)将生物芯片放入紫外光交联仪中，氮气环境下，用365nm紫外光照射15分钟 (2. 4J/cm2)；
[0103] (11)达到预定时间后，将生物芯片用50°C的热水反复摇洗1小时，去除表面未共 价固定的葡聚糖分子，期间换水3-5次，生物芯片清洗后氮气吹干备用；
[0104] (12)将生物芯片浸入丁二酸酐（10mg/mL)和4-二甲氨基吡啶（15mg/mL)的DMF 溶液中，室温（25°C)反应2小时，达到预定反应时间后，将生物芯片取出，依次用DMF、乙 醇、去离子水清洗，氮气吹干。
[0105] 2、蛋白微阵列的制备
[0106] (1)分别配制pH= 7. 4且浓度为lmg/mL的人免疫球蛋白G(H-IgG)的磷酸盐缓冲 液、pH= 7. 4且浓度为lmg/mL的牛血清白蛋白（BSA)的磷酸盐缓冲液、以及pH= 7. 4且 浓度为lmg/mL的FKBP12蛋白的磷酸盐缓冲液，备用；
[0107] (2)将制备好的芯片基底浸入EDC(0. 4M)和NHS(0. 1M)的混合溶液中（1:1，v/v) 活化15分钟，取出芯片，去离子水快速清洗，氮气吹干；
[0108] (3)将芯片分别与步骤（1)制备的三种蛋白缓冲溶液放入打印机的相应位置，调 整参数，进行打印，环境湿度为70%，针头直径300ym，接触时间ls，阵列为6X6(如图 2a);
[0109] (4)将打印好的芯片在70%湿度环境下，4°C下孵育2小时，然后用PBST(0. 05% Tween20,v/v)进行清洗，迅速吹干，-20°C下保存。
[0110] 3、在蛋白微阵列上检测他克莫司（FK506)
[0111] (1)将含有H-IgG、BSA和FKBP12蛋白微阵列的生物芯片进行清洗后，分别放入 SPRi系统中；
[0112] (2)将系统溶液换为PBS缓冲液（含1 %的DMS0)，调整光学位置，通入含有10nM 的他克莫司（FK506) -PBS溶液（含1 %的DMS0)，结合300s后解离300s;
[0113](3)用体积分数为1 %的磷酸水溶液重生。
[0114] 检测结果如图2(b)所示，由于他克莫司能与FKBP12蛋白特异性结合，而不与 H-IgG和BSA结合，因此若本发明的生物芯片能够固定大量FKBP12蛋白的话，应该有明显不 同于H-IgG和BSA蛋白的信号差异。从图2(b)的结果可以看出，负载FKBP12蛋白的芯片 具有较强的信号变化，峰值在100RU稳定波动，说明本发明的方法制备的生物芯片具有很 高的蛋白（FKBP12)固定量，足以检测到与FKBP12蛋白结合的小分子FK506。而两个阴性对 照，即负载H-IgG的芯片和负载BSA蛋白的芯片的信号基本在0RU波动，并无明显的信号变 化。
[0115] 实施例3在FKBP12及其突变体蛋白微阵列上检测FK506
[0116] 1、生物芯片基底的修饰
[0117] 同实施例2。
[0118] 2、蛋白微阵列的制备
[0119] (1)分别配制pH= 7. 4且浓度为0? 5mg/mL的FKBP12 (野生型）蛋白的磷酸缓冲 液，以及相同pH和浓度的5个单氨基酸突变体（M1-M5)的磷酸缓冲液，备用；
[0120] (2)将制备好的芯片基底浸入EDC(0.4M)和NHS(0. 1M)的混合溶液中（1:1，v/v) 活化15分钟，取出芯片，去离子水快速清洗，氮气吹干；
[0121] (3)将芯片分别与步骤（1)制备的六种蛋白缓冲溶液放入打印机的相应位置，调 整参数，进行打印，环境湿度为70%，针头直径300ym，接触时间ls，阵列为6X12 (如图 3a)；
[0122] (4)将打印好 的芯片在70%湿度环境下，4°C下孵育2小时，然后用PBST(0. 05% Tween20,v/v)进行清洗，迅速吹干，-20°C下保存。
[0123] 3、在蛋白微阵列上检测他克莫司（FK506)
[0124] (1)将含有FKBP12及其突变体的蛋白微阵列生物芯片进行清洗后，分别放入SPRi 系统中；
[0125](2)将系统溶液换为PBS缓冲液（含1 %的DMSO)，调整光学位置，通入含有10nM 的他克莫司（FK506) -PBS溶液（含1 %的DMS0)，结合300s后解离300s;
[0126](3)用体积分数为1%的磷酸水溶液重生。
[0127] 检测结果如图3(b)所示，可以看出，负载FKBP12野生型蛋白的芯片具有较强的信 号变化，而五种突变体的信号变化不如FKBP12野生型蛋白明显，说明利用本发明的方法制 备的生物芯片具有很高的蛋白固定量，足以检测到FK506与FKBP12的特异性结合。而突变 体由于只是单氨基酸的突变，与FK506也有一定程度的结合，但结合程度不如野生型，信号 强度也弱与野生型的FKBP12。
[0128] 实施例4在淀粉样蛋白A0 42及其突变体微阵列上检测多肽17
[0129] 1、生物芯片基底的修饰
[0130] 同实施例2。
[0131] 2、蛋白微阵列的制备
[0132] (1)分别配制口11=7.4且浓度为〇.51^/ 1^的淀粉样蛋白六0 42(野生型）的磷酸 缓冲液，以及相同pH和浓度的3个突变体（E型、T型和P型）的磷酸缓冲液，备用；
[0133](2)将制备好的芯片基底浸入EDC(0.4M)和NHS(0. 1M)的混合溶液中（1:1，v/v) 活化15分钟，取出芯片，去离子水快速清洗，氮气吹干；
[0134] (3)将芯片分别与步骤（1)制备的3种蛋白缓冲溶液放入打印机的相应位置，调整 参数，进行打印，环境湿度为70%，针头直径300ym，接触时间ls，阵列为6X12 (如图3a);
[0135] (4)将打印好的芯片在70%湿度环境下，4°C下孵育2小时，然后用PBST(0. 05% Tween20，v/v)进行清洗，迅速吹干，-20°C下保存。
[0136] 3、在蛋白微阵列上检测多肽17
[0137] (1)将含有淀粉样蛋白A042及其突变体的蛋白微阵列生物芯片进行清洗后，分 别放入SPRi系统中；
[0138] (2)将系统溶液换为PBS缓冲液（含1 %的DMSO)，调整光学位置，通入含有50yM 的小分子多肽I7-PBS溶液，结合300s后解离300s;
[0139] (3)用体积分数为1 %的磷酸水溶液重生。
[0140] 检测结果如图4所示，可以看出负载野生型淀粉样蛋白A0 42的芯片具有较强的 信号变化，而三种突变体的信号变化不如野生型蛋白明显，说明利用本发明的方法制备的 生物芯片具有很高的蛋白固定量，足以检测到野生型淀粉样蛋白A0 42与多肽17的特异性 结合。而三种突变体只是若干位点的突变，因此其与多肽T7也有不同程度的结合；其中T 型和E型的突变位点可能不是关键位点，因此与多肽17也有一定程度的结合；而P型为关 键位点的突变，因此疾病与多肽17没有结合；虽然突变型与多肽17的结合程度各异，但都 不如野生型，信号强度也弱于野生型的淀粉样蛋白Af3 42。
[0141] 综合以上结果可以得出，经本发明的方法完成三维高分子表面修饰的生物芯片， 可以有效提高蛋白在生物芯片表面的固定量，使现有技术中很难检测到的小分子能够被无 标记、精确而高通量地检测出来，对分子生物学研宄和药物开发等领域具有现实意义。另 外，本发明的方法可以精确控制生物芯片表面的蛋白固定量，同时保证芯片表面具有足够 的空间进行小分子药物的检测；制备方法简单、快捷、成本低且容易进行质量控制，适合大 规模生产和推广。
[0142] 申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局 限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的 技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的 添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【主权项】
1. 一种微阵列生物芯片，包括玻璃芯片基底和修饰层，其特征在于，所述修饰层包括依 次叠加在所述玻璃芯片基底表面的铬层、银和/或金层、自组装单分子层、光交联剂和高分 子层。2. 根据权利要求1所述的微阵列生物芯片，其特征在于，所述铬层的厚度为0.l_9nm， 优选为3nm; 优选地，所述银和/或金层的厚度为40-60nm，优选为47-50nm; 优选地，所述自组装单分子层的试剂为末端功能化的硫醇； 优选地，所述末端功能化的硫醇为单硫醇和/或双硫醇； 优选地，所述末端功能化的硫醇为烷硫醇和/或带有PEG嵌段的硫醇； 优选地，所述末端功能化的基团为羟基、羧基、氨基、醛基、环氧基或甲氧基； 优选地，所述光交联剂为含有光敏感基团的试剂，优选为吖丙因、重氮、乙酰苯、二苯甲 酮或蒽醌类中的任意一种或者至少两种的混合物； 优选地，所述高分子为聚乙二醇及其衍生物、含氟聚合物、聚丙烯酸及其衍生物、聚甲 基丙烯酸及其衍生物、聚苯乙烯、聚乳酸、两性甜菜碱类聚合物、硝化纤维、壳聚糖或葡聚糖 及其衍生物中的任意一种或至少两种的混合物。3. 根据权利要求1或2所述的微阵列生物芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步 骤： (1) 在玻璃芯片基底镀上铬层，再在铬层的表面镀上银和/或金层； (2) 完成步骤（1)后清洗芯片，在表面形成自组装单分子层； (3) 将光交联剂共价结合于自组装单分子层的表面； (4) 将高分子溶液旋涂在完成步骤（3)的芯片表面； (5) 待步骤（4)所述高分子溶液的溶剂挥发后，用紫外光照射使所述高分子接枝在芯 片表面； 任选地，进行步骤（6): (6) 将接枝在芯片表面的高分子进行功能化。4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)所述镀上铬层及银和/或金 层的方法为金属热蒸和/或离子溅射； 优选地，步骤（3)所述共价结合的方式为酰胺化、酯化、开环或亲核取代反应； 优选地，步骤（4)所述高分子溶液的溶剂为去离子水、乙醇、甲醇、二甲基亚砜或N，N-二甲基甲酰胺中的任意一种或者至少两种的组合； 优选地，步骤（5)所述紫外光的波长为200-400nm，优选为365nm; 优选地，步骤（6)所述功能化的基团为羟基、羧基、醛基、氨基、环氧基、氰基、炔基、叠 氮基、叮丙因或生物素。5. -种蛋白微阵列，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的微阵列生物芯片。6. 根据权利要求5所述的蛋白微阵列的制备方法，其特征在于，所述制备方法为将蛋 白质配制成溶液后，点样并孵育而制成； 优选地，所述将蛋白质配制成溶液为将蛋白质溶于缓冲液中； 优选地，所述缓冲液为PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液或HBS-EP缓冲液； 优选地，所述缓冲液的PH值为所述蛋白质等电点以下0-1个单位； 优选地，所述孵育的温度为3-8°C，优选为4°C; 优选地，所述孵育的相对湿度为50-80 %，优选为70 %。7. -种检测方法，其特征在于，所述方法利用权利要求5所述的蛋白微阵列。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 清洗固定有蛋白微阵列的芯片，吹干后放入表面等离子共振分析成像仪； (2) 向表面等离子共振分析成像仪中加入缓冲液； (3) 待基线稳定，用重生液将所述芯片的表面重生； (4) 通入检测液，重生； (5) 通入校正液，检测蛋白质信号。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（2)所述缓冲液为PBS缓冲液、HEPES 缓冲液、Tris-HCl缓冲液或HBS-EP缓冲液； 优选地，步骤（2)所述缓冲液中还加入二甲基亚砜溶液； 优选地，所述二甲基亚砜溶液的体积分数为0. 5-5% ; 优选地，步骤（3)所述重生液为磷酸溶液、甘氨酸-盐酸缓冲液、乙二醇溶液或氢氧化 钠水溶液；所述磷酸溶液中磷酸与水的体积比为1 : (100-400);所述甘氨酸-盐酸缓冲液 的pH为1. 5-2. 5 ;所述乙二醇溶液的体积分数为10-40% ;所述氢氧化钠水溶液的浓度为 7_13mmol/L〇10. 根据权利要求1或2所述的微阵列生物芯片或权利要求5所述的蛋白微阵列在检 测小分子药物中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种微阵列生物芯片及其制备方法和应用。所述微阵列生物芯片包括玻璃芯片基底和修饰层，所述修饰层包括依次叠加在所述玻璃芯片基底表面的铬层、银和/或金层、自组装单分子层、光交联剂和高分子层。本发明还提供一种蛋白微阵列及其方法和在检测小分子药物中的应用。经过本发明的方法完成三维高分子表面修饰的微阵列生物芯片，可以有效提高蛋白在微阵列生物芯片表面的固定量，使现有技术中很难检测到的小分子能够被无标记、精确而高通量地检测出来，对分子生物学研究和药物开发等领域具有重要现实意义。
【IPC分类】G01N33/68, G01N21/552
【公开号】CN104897617
【申请号】CN201510257349
【发明人】杨墨, 朱劲松, 李少鹏, 周文菲, 王瑞
【申请人】国家纳米科学中心
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月19日
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