一种检测人精子活力的方法
一种检测人精子活力的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种检测人精子活力的方法。
【背景技术】
[0002] 精子质量或精子活力是评估男性生育能力的重要标准，准确、客观地评价精子的 质量是人工授精和体外受精技术成功的关键，用于反映精子质量的指标和评估方法有：精 子形态、存活率、活动率、顶体膜完整性、精子线粒体活性等。目前，检测精子活力的金标准 是用显微镜直接观察，但是显微镜观察存在费时费力、检测效率低的问题，难以满足临床检 测的需要。
[0003] 流式细胞仪能高通量地快速分析细胞状态，可同时对单个细胞进行多荧光参数检 测。采用流式细胞术对精子质量进行评估分析，是近几年来刚刚兴起的一项新技术。流式 细胞仪可以用来检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位（MMP)，MMP值是反映线粒体能量状 态的指标，它与精子活力之间存在正相关，可以反映精子的活力高低。但是目前采用流式细 胞仪对精子活力的检测较为粗放，不够准确，主要原因是流式细胞仪检测结果的准确性依 赖于检测数据的选择和分析，特别是调整补偿阶段非常关键，但是，目前大多数技术人员不 会调整补偿或者难以找到合适的补偿值，导致结果不准确。如，夏欣一等，"JC-1单标法流式 细胞术检测精子线粒体膜电位的研宄"，中华男科学杂志2008年2月第14卷第2期，公开 了一种以JC-1为染料进行流式细胞仪检测精子活力的方法，其流式细胞仪检测未设补偿， 检测结果不准确。
[0004] 另外，由于精液粘度大，容易凝固，目前均采用胰蛋白酶或者稀释后反复离心的方 式来解决这个问题，但是，这些处理都会降低精子活力，影响检测结果的准确度。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种准确、简便、快速的检测人精子活力的方法。
[0006] 本发明提供了一种检测人精子活力的方法，它是用流式细胞仪进行检测，步骤如 下：
[0007] (1)取待检精液，使用PBS稀释10倍，得到精液稀释液；
[0008] (2)用荧光染料JC-1进行细胞染色；
[0009] (3)检测：用流式细胞仪检测检测，其中，激发波长为488nm，获得每一个细胞的FS Lin、SSLog、FLILog和FL2Log的数值； _〇] (4)数据分析：以所有细胞的FSLin为X轴，SSLog为Y轴，绘制散点图，设门后， 以门里面的细胞的FL1Log为X轴，门里面的细胞的FL2Log为Y轴，绘制散点图，然后调 整补偿，补偿为：FL1-8%FL2和FL2-10%FL1，再设门，最后对门内细胞进行计数，即可。
[0011] 其中，步骤（1)中，所述PBS为0.lM，pH7. 2的PBS溶液。0. 1M是指PBS溶液中磷 酸盐的摩尔浓度。
[0012] 其中，步骤（2)中，所述染色是在精液稀释液中，加入荧光染料JC-1至终浓度为 2yg/ml，孵育lOmin。
[0013] 其中，所述孵育的温度为：37°C。
[0014] 其中，步骤（3)中，流式细胞仪检测采用的仪器为美国Beckman公司的FC-500分 析型流式细胞仪。
[0015] 其中，步骤（4)中，数据分析采用CXPAnalysis软件进行分析。
[0016] 其中，步骤（4)中，设门方式为散射光设门。
[0017] 散射光设门，是指以FSC和SSC联合设门，具体是根据散点图中明显存在的集聚的 细胞群和其边缘的散在点群，用矩形设门方式圈出这个明显存在的集聚细胞群，排除其边 缘的散在点群。
[0018] 本发明通过改进流式细胞仪的数据分析方法，具体是通过设置合适的补偿值，提 高了检测方法的准确度；另外，本发明人还意外的发现，采用PBS稀释液将精液稀释10倍， 即可解决精液粘度大、容易凝固的问题，可以实现准确检测，而且还克服了现有胰蛋白酶或 者稀释后反复离心存在的降低精子活力的缺陷。
[0019] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0020] 以下通过【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将 此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术 均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0021] 图1流式细胞仪分析的补偿调节图，调整补偿为FL1-8%FL2和FL2-10%FL1。
[0022] 图2对CCCP处理前后的精子的荧光显微镜检测；A、B、C:分别为未经CCCP处理的 精子的普通白光、红色荧光（代表高活力精子）和绿色荧光（代表低活力精子）的检测； D、E、F:分别为经CCCP处理的精子的普通白光、红色荧光和绿色荧光的检测；图中标尺代表 200 um〇
[0023] 图3流式细胞术分析的精子的活力；I、II:未经CCCP处理的人精子的流式细胞术 分析；III、IV:CCCP处理后的人精子的流式细胞术分析；
[0024] 门A、门D为两个圈出了主要细胞群的门，门B、门C代表的细胞群来自门A，门E、 门F代表的细胞群来自门D;B、E为红色荧光细胞群（代表高活力精子）；C、F为绿色荧光 细胞群（代表低活力精子）。
[0025] 图4 "正常液化的精液"和"不液化精液"的实物图；A:"正常液化的精液"滴落顺 利，不粘稠拖尾；B:"不液化精液"粘稠而且严重拖尾。
[0026] 图5使用本发明方法和传统方法处理精液后的精子数量对比图；A:新方法处理的 精液；B:传统法处理的精液，图中标尺代表50ym。
[0027] 图6设门以去除杂质碎片；A:FS/SS的原始散点图；B:设门去除杂质碎片，门A为 精子主群，门B为杂质碎片群。
[0028] 图7"设立补偿"和"不设立补偿"的散点图对比；A:"设立补偿"的散点图；B:"不 设立补偿"的散点图。
[0029] 图8 "不设立补偿"、"设立补偿不充分"、"正确设立补偿"和"设立补偿过度"的 散点图对比；A:"不设立补偿"的散点图；B:"设立补偿不充分"的散点图，FL1-5%FL2和FL2-5%FL1;C:"设立补偿不充分"的散点图，FL1-7. 5%FL2和FL2-7. 5%FL1;D:"正确 设立补偿"的散点图，FL1-8%FL2和FL2-10%FL1;E:"设立补偿过度"的散点图，FL1-8% FL2 和FL2-11%FL1;F:"设立补偿过度"的散点图，FL1-8%FL2 和FL2-12%FL1。
【具体实施方式】
[0030] 本发明所用的实验仪器与试剂如下：
[0031]FC-500分析型流式细胞仪（美国Beckman) ;DMI3000B型倒置显微镜（德国 Leica公司）；UPR-I-10T纯水机（中国优普公司）；3111型C02细胞培养箱（美国Thermo Scientific公司）；SW-CJ-2FD超净工作台（中国苏州净化公司）JDL-40B型大体积离心 机（中国Anke公司）。染料JC-1和解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙（CCCP)来自线粒体膜电 位检测试剂盒（中国碧云天）；磷酸缓冲液（PBS)(成都哈里）。
[0032]实施例1本发明检测人精子活力的方法
[0033] 1、试验方法
[0034] 取得精液，用PBS稀释10倍，加入JC-1至终浓度为2yg/ml，37°C处理lOmin;对 混合物不进行离心处理，直接进行流式细胞仪分析，荧光检测使用波长为488nm的激发光， 检测时收集FSLin、SSLog、FLlLog、FL2Log等参数的数据。
[0035] 2、数据分析
[0036] 对流式细胞仪的数据：以所有细胞的FSLin为X轴，SSLog为Y轴，绘制散点图， 并通过设门圈出主要细胞群并去除细胞碎片，在此门的基础上，以门里面的细胞的FL1Log 为X轴，门里面的细胞的FL2Log为Y轴，绘制散点图，然后调整补偿，补偿为：FL1-8%FL2 和FL2-10%FL1 (见图1)，再设门分别圈出红色荧光细胞群和绿色荧光细胞群并计数，红 色荧光细胞群的比例代表高活力精子的比例，绿色荧光细胞群的比例代表低活力精子的比 例。
[0037]设门方式为：根据散点图中明显分开的两个细胞群的轮廓和边缘，用多边形设门 方式分别圈出这两个明显分开的细胞群。
[0038] 为了说明本发明的有益效果，本发明还提供了以下试验：
[0039] 试验例1本发明检测人精子活力的方法的准确性
[0040] 1、试验方法
[0041] 取得精液，用PBS稀释10倍，分为两部分，一部分加入CCCP至终浓度为10yM， 37°C处理10min;另一部分不加CCCP作为对照；加入JC-1至终浓度为2yg/ml，37°C处理 10min;对混合物不进行离心处理，直接进行流式细胞仪分析，荧光检测使用波长为488nm 的激发光，检测时收集FSLin、SSLog、FLlLog、FL2Log等参数的数据。
[0042] 用荧光显微镜法验证本发明方法的准确性：为了验证新建立的流式细胞分析法的 可靠性，对CCCP处理后和未经CCCP处理的精子进行了荧光显微成像并用软件IPP分析了 图像。在进行荧光显微成像时，保持针对所有照片的各种成像参数一致，比如曝光时间等。 对荧光显微照片使用软件ImageProPlus(IPP)对所有荧光照片进行平均光密度计算，并 进行照片间的比较。
[0043] 2、数据分析
[0044] 对流式细胞仪的数据：以所有细胞的FSLin为X轴，SSLog为Y轴，绘制散点图， 并通过设门圈出主要细胞群并去除细胞碎片，在此门的基础上，以门里面的细胞的FL1Log 为X轴，门里面的细胞的FL2Log为Y轴，绘制散点图，然后调整补偿，补偿为：FL1-8%FL2 和FL2-10%FL1，再设门分别圈出红色荧光细胞群和绿色荧光细胞群并计数，红色荧光细 胞群的比例代表高活力精子的比例，绿色荧光细胞群的比例代表低活力精子的比例。
[0045] 设门方式为：根据散点图中明显分开的两个细胞群的轮廓和边缘，用多边形设门 方式分别圈出这两个明显分开的细胞群。
[0046] 3、试验结果
[0047] CCCP是细胞电子链的解偶联剂，用它处理细胞后，细胞的线粒体膜电位会大幅下 降，所以可以确定精子经CCCP处理后，高活力精子比例将下降（红色荧光的强度下降），而 低活力精子比例将上升（绿色荧光的强度上升）。
[0048] 3. 1荧光显微镜法检测结果
[0049] 结果见图2、表1。
[0050] 表1对CCCP处理前后的精子的荧光显微图像分析
[0052] 由图2、表1可见，相对于未经CCCP处理的精子，CCCP处理后的精子红色荧光强度 下降，而绿色荧光强度上升。
[0053] 3. 2本发明流式细胞仪检测结果
[0054] 本研宄用CCCP处理一部分精子，与未经CCCP处理的精子对比，结果见图3、表2。
[0055] 表2对CCCP处理前后的精子的流式细胞术分析
[0057] 由图3、表2可见，相对于未经CCCP处理的精子，用CCCP处理一部分精子的绿色荧 光部分上升（代表低活力精子），而红色荧光部分下降（代表高活力精子）。
[0058] 比较可以看出，本发明方法的检测结果与理论预期结果以及荧光显微镜检测 结果 均一致，说明本发明检测方法可以准确检测精子活力。
[0059] 实验例2本发明方法中精液前处理方法的验证
[0060] 一、本发明精液前处理方法可以解决精子不液化和粘稠度高的问题
[0061] 在精子不液化和粘稠度高的情况下，使用常规的显微分析得到的检测值误差极 大，而对于流式细胞仪检测法，也极为不利。
[0062] 发明人通过摸索，发现使用PBS稀释10倍能解决精子不液化和粘稠度高的问题。 "正常液化的精液"和"不液化精液"的实物图见图4。
[0063] 二、本发明方法与传统方法对精子损伤的比较
[0064](一）显微镜观察
[0065] 本发明方法的精液前处理：取得精液，用PBS稀释10倍，待测；
[0066] 传统方法的精液前处理：同样的精液，用PBS稀释10倍后，500g离心lOmin，弃上 清液，这样完成了第一次离心清洗，然后再加入与前等量的PBS悬浮精子沉淀，500g离心lOmin，弃上清液，这样完成了第二次离心清洗，最后，加入与前等量的PBS悬浮精子沉淀， 待测。
[0067] 然后两部分精液分别用精子活力常规显微镜观察法检测。精子活力常规显微镜观 察法检测是世界卫生组织WHO认可的检测方法。
[0068] 得到的结果见图5和表3。
[0069] 表3本发明方法和传统方法的精液前处理后的精子活力检测对比
[0071] 由图5可见，精液经过离心清洗后，精子数量相比不离心清洗处理的精液大为降 低；
[0072] 由表3可见，使用常规显微镜观察法对两部分精液中运动精子分析，精液经过离 心清洗后，运动精子的数量和质量相比不离心清洗处理的精液也大为降低。
[0073] 本发明方法的精液前处理过程，对精子数量和运动力有更好的保持，效果优于传 统方法的精液前处理过程。
[0074](二）本发明流式细胞仪检测
[0075] 本发明方法：同实验例1方法。
[0076] 传统方法：取与本发明方法中同样的精液，用10倍体积的PBS稀释，然后500g离 心lOmin，弃上清液；加入lml的PBS稀释，加入JC-1至终浓度2yg/ml，37°C处理lOmin;; 对混合物500g离心lOmin，弃上清液，再加入10倍体积的PBS稀释，然后500g离心lOmin， 弃上清液，以去除未结合的JC-1;再加入lmlPBS稀释，最后进行流式细胞术分析。在流式 细胞仪上的检测与数据分析方法同本发明方法。
[0077] 对比结果见表4。
[0078] 表4本发明方法和传统方法的对比
[0080] 由表4可见，使用本发明方法时，低活力精子的比例显著下降（18.68% )，而使用 传统方法时，即使没有加入CCCP，低活力精子比例占到31. 57%。说明传统方法的反复清洗 和离心对精子造成较大损伤；相对于传统方法，本发明方法不仅省时省力，而且对精子的损 伤大为减少。
[0081] 实验结果说明：1、相对于传统方法，本发明方法不仅省时省力，而且对精子的损伤 大为减少；2、本发明流式细胞仪检测方法的检测结果与传统显微镜检测结果一致，说明本 发明方法是准确的。
[0082] 实验例3本发明方法中设门方式的验证
[0083] 原始的FS/SS散点图中，相对主群有离散的点，这些点为杂质碎片，如果不排除的 话，会影响分析，所以可以通过设门去除这些杂质碎片，以使得分析正常进行。
[0084]本发明方法的设门方式为散射光设门，具体是根据散点图中明显存在的集聚的细 胞群和其边缘的散在点群，用矩形设门方式圈出这个明显存在的集聚细胞群，排除其边缘 的散在点群。
[0085]本发明的设门方式依据FS和SS的原理而建立，FS作为前向散射能客观反映颗粒 的大小，颗粒大小与FS强度呈现正相关关系；SS作为侧向散射能客观翻译颗粒内部精细 结构，颗粒内部结构复杂程度与SS成正相关关系；由于细胞混合物中总是存在一些异常颗 粒，比如体积较小的细胞碎片和体积较大的多个细胞的集聚物，这些异类物质在FS/SS散 点图中就表现为"不合群"的散在点，要么FS太小，要么FS太大，完全可以通过设门排除这 些干扰检测的散在点。
[0086] 设门前的原始散点图与设门后的图比较见图6。
[0087] 图6结果说明，本发明散射光设门的方式可以有效排除干扰，实现准确检测。
[0088] 试验例4本发明方法中补偿方式的验证
[0089] 一、设立补偿与不设立补偿的对比
[0090] 不设立补偿：对流式细胞仪的数据：以所有细胞的FSLin为X轴，SSLog为Y轴， 绘制散点图，并通过设门圈出主要细胞群并去除细胞碎片，在此门的基础上，以门里面的细 胞的FL1Log为X轴，门里面的细胞的FL2Log为Y轴，绘制散点图，再设门分别圈出红色 荧光细胞群和绿色荧光细胞群并计数，红色荧光细胞群的比例代表高活力精子的比例，绿 色荧光细胞群的比例代表低活力精子的比例。
[0091] 设立补偿：对流式细胞仪的数据：以所有细胞的FSLin为X轴，SSLog为Y轴，绘 制散点图，并通过设门圈出主要细胞群并去除细胞碎片，在此门的基础上，以门里面的细胞 的FL1Log为X轴，门里面的细胞的FL2Log为Y轴，绘制散点图，然后调整补偿，补偿为： FL1-8%FL2和FL2-10%FL1，再设门分别圈出红色荧光细胞群和绿色荧光细胞群并计数， 红色荧光细胞群的比例代表高活力精子的比例，绿色荧光细胞群的比例代表低活力精子的 比例。
[0092] 对比见图7,由图7可见，同样的数据，"设立补偿"后，可明显分开高活力精子群和 低活力精子群；而"不设立补偿"时，高活力精子群和低活力精子群无法清楚分界实现，导致 后期检测结果不准确。
[0093] 二、本发明补偿调节程度的确定
[0094] 如果补偿调节得不到位，将无法把高活力精子群和低活力精子群分开，影响结果 的分析；同时，如果补偿调节得过度，也无法正常分析；只有正确设立补偿（FL1-8%FL2和FL2-10%FL1)，才能进行正常分析。
[0095] 1、试验方法：首先取得一份精液，从中取两份。
[0096] 第一份精液再等分为两份，分别标记为"-CCCP"和"+CCCP"，"-CCCP"样品不加入 CCCP处理，按本发明所述进行流式细胞仪检测，"+CCCP"样品加入CCCP处理，然后按本发明 所述进行流式细胞仪检测，
[0097] 对于"-CCCP"和"+CCCP"的流式细胞仪分析结果，分别使用不同的补偿条件，补偿 条件分别为：C1 :不设立补偿；C2 :FLl-5%FL2，FL2-5%FL1 ;C3 :FLl-7. 5%FL2，FL2-7. 5% FL1 ；C4 ：FLl-8%FL2,FL2-10%FL1 ；C5 ：FLl-8%FL2,FL2-11%FL1 ；C6：FLl-8%FL2, FL2-12%FL1，然后分别计算在相同补偿条件下"-CCCP"和"+CCCP"的高活力精子率的比 值，得到R-C1至R-C6;
[0098] 第二份精液也等分为两份，分别标记为"-CCCP"和"+CCCP"，"-CCCP"样品不加入 CCCP处理，由医院检验科进行WHO认定的显微镜检测，"+CCCP"样品加入CCCP处理，也由医 院检验科进行WHO认定的显微镜检测，对于"-CCCP"和"+CCCP"的检测结果，分别统计有运 动力的精子数量，然后计算有运动力的精子数量的比值，得到R-WH0。
[0099] 然后，以R-WH0为准，查R-C1至R-C6中哪个更接近R-WH0,最后确定哪个补偿条件 最合适。
[0100] 注：在计算上述几种比值时，都采用的是比较来自高活力精子的数据，而没有采用 的是比较来自低活力精子的数据，这是因为在本发明的试验中和一般情况下，精液中高活 力精子多于低活力精子，所以比较来自高活力精子的数据能有效降低系统误差。
[0101] 2、试验结果
[0102] 见图8和表5-6。
[0103] 表5第一份精液的使用流式细胞检测在不同补偿条件下的比值
[0105] 表6相同的第二份精液使用WHO认定方法检测的比值
[0107] 由图8可见，本发明（R-C4)的补偿可以分开高活力精子群和低活力精子群。
[0108] 综合表5、表6的结果可见：采用本发明补偿值的检测方法的检测结果跟公认的显 微镜检测结果一致，而采用其他补偿值则检测结果与显微镜检测结果相差较大，说明只有 采用本发明特定的补偿值才能准确检测。
[0109] 本发明通过分析流式细胞术检测精子的原理和操作，建立了基于荧光染料JC-1 的对人精子的流式细胞分析法，通过试验证实，本发明方法可以准确检测精液的活力，操作 更为简便、快速。
【主权项】
1. 一种检测人精子活力的方法，其特征在于：它是用流式细胞仪进行检测，步骤如下： (1) 取待检精液，使用PBS稀释10倍，得到精液稀释液； (2) 用荧光染料JC-I进行细胞染色； (3) 检测：用流式细胞仪检测，其中，激发波长为488nm，获得每一个细胞的FSLin、SS Log、FLlLog和FL2Log的数值； ⑷数据分析：以所有细胞的FSLin为X轴，SSLog为Y轴，绘制散点图，设门后，以门 里面的细胞的FLlLog为X轴，门里面的细胞的FL2Log为Y轴，绘制散点图，然后调整补偿， 补偿为：FLl-8%FL2和FL2-10%FL1，再设门，最后对门内细胞进行计数，即可。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1)中，所述PBS为0. 1M，pH7. 2的 PBS溶液。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2)中，所述染色是在精液稀释液 中，加入荧光染料JC-I至终浓度为2yg/ml，孵育lOmin。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述孵育的温度为：37°C。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤⑶中，流式细胞仪检测采用的仪器 为美国Beckman公司的FC-500分析型流式细胞仪。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4)中，数据分析采用CXPAnalysis 软件进行分析。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4)中，设门方式为散射光设门。
【专利摘要】本发明提供了一种检测人精子活力的方法，它是用流式细胞仪进行检测，步骤如下：(1)取待检精液，使用PBS稀释10倍，得到精液稀释液；(2)用荧光染料JC-1进行细胞染色；(3)检测：用流式细胞仪检测，其中，激发波长为488nm，获得每一个细胞的FS Lin、SS Log、FL1 Log和FL2 Log的数值；(4)数据分析：以所有细胞的FS Lin为X轴，SS Log为Y轴，绘制散点图，设门后，以门里面的细胞的FL1 Log为X轴，门里面的细胞的FL2 Log为Y轴，绘制散点图，然后调整补偿，补偿为：FL1-8％ FL2和FL2-10％ FL1，再设门，最后对门内细胞进行计数，即可。本发明可以准确检测精液的活力，方法更为简便、快速。
【IPC分类】G01N21/64
【公开号】CN104897630
【申请号】CN201510253246
【发明人】万谦, 陈强, 陆华, 高小平
【申请人】四川新生命干细胞科技股份有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月18日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种检测人精子活力的方法。
【背景技术】
[0002] 精子质量或精子活力是评估男性生育能力的重要标准，准确、客观地评价精子的 质量是人工授精和体外受精技术成功的关键，用于反映精子质量的指标和评估方法有：精 子形态、存活率、活动率、顶体膜完整性、精子线粒体活性等。目前，检测精子活力的金标准 是用显微镜直接观察，但是显微镜观察存在费时费力、检测效率低的问题，难以满足临床检 测的需要。
[0003] 流式细胞仪能高通量地快速分析细胞状态，可同时对单个细胞进行多荧光参数检 测。采用流式细胞术对精子质量进行评估分析，是近几年来刚刚兴起的一项新技术。流式 细胞仪可以用来检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位（MMP)，MMP值是反映线粒体能量状 态的指标，它与精子活力之间存在正相关，可以反映精子的活力高低。但是目前采用流式细 胞仪对精子活力的检测较为粗放，不够准确，主要原因是流式细胞仪检测结果的准确性依 赖于检测数据的选择和分析，特别是调整补偿阶段非常关键，但是，目前大多数技术人员不 会调整补偿或者难以找到合适的补偿值，导致结果不准确。如，夏欣一等，"JC-1单标法流式 细胞术检测精子线粒体膜电位的研宄"，中华男科学杂志2008年2月第14卷第2期，公开 了一种以JC-1为染料进行流式细胞仪检测精子活力的方法，其流式细胞仪检测未设补偿， 检测结果不准确。
[0004] 另外，由于精液粘度大，容易凝固，目前均采用胰蛋白酶或者稀释后反复离心的方 式来解决这个问题，但是，这些处理都会降低精子活力，影响检测结果的准确度。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种准确、简便、快速的检测人精子活力的方法。
[0006] 本发明提供了一种检测人精子活力的方法，它是用流式细胞仪进行检测，步骤如 下：
[0007] (1)取待检精液，使用PBS稀释10倍，得到精液稀释液；
[0008] (2)用荧光染料JC-1进行细胞染色；
[0009] (3)检测：用流式细胞仪检测检测，其中，激发波长为488nm，获得每一个细胞的FS Lin、SSLog、FLILog和FL2Log的数值； _〇] (4)数据分析：以所有细胞的FSLin为X轴，SSLog为Y轴，绘制散点图，设门后， 以门里面的细胞的FL1Log为X轴，门里面的细胞的FL2Log为Y轴，绘制散点图，然后调 整补偿，补偿为：FL1-8%FL2和FL2-10%FL1，再设门，最后对门内细胞进行计数，即可。
[0011] 其中，步骤（1)中，所述PBS为0.lM，pH7. 2的PBS溶液。0. 1M是指PBS溶液中磷 酸盐的摩尔浓度。
[0012] 其中，步骤（2)中，所述染色是在精液稀释液中，加入荧光染料JC-1至终浓度为 2yg/ml，孵育lOmin。
[0013] 其中，所述孵育的温度为：37°C。
[0014] 其中，步骤（3)中，流式细胞仪检测采用的仪器为美国Beckman公司的FC-500分 析型流式细胞仪。
[0015] 其中，步骤（4)中，数据分析采用CXPAnalysis软件进行分析。
[0016] 其中，步骤（4)中，设门方式为散射光设门。
[0017] 散射光设门，是指以FSC和SSC联合设门，具体是根据散点图中明显存在的集聚的 细胞群和其边缘的散在点群，用矩形设门方式圈出这个明显存在的集聚细胞群，排除其边 缘的散在点群。
[0018] 本发明通过改进流式细胞仪的数据分析方法，具体是通过设置合适的补偿值，提 高了检测方法的准确度；另外，本发明人还意外的发现，采用PBS稀释液将精液稀释10倍， 即可解决精液粘度大、容易凝固的问题，可以实现准确检测，而且还克服了现有胰蛋白酶或 者稀释后反复离心存在的降低精子活力的缺陷。
[0019] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0020] 以下通过【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将 此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术 均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0021] 图1流式细胞仪分析的补偿调节图，调整补偿为FL1-8%FL2和FL2-10%FL1。
[0022] 图2对CCCP处理前后的精子的荧光显微镜检测；A、B、C:分别为未经CCCP处理的 精子的普通白光、红色荧光（代表高活力精子）和绿色荧光（代表低活力精子）的检测； D、E、F:分别为经CCCP处理的精子的普通白光、红色荧光和绿色荧光的检测；图中标尺代表 200 um〇
[0023] 图3流式细胞术分析的精子的活力；I、II:未经CCCP处理的人精子的流式细胞术 分析；III、IV:CCCP处理后的人精子的流式细胞术分析；
[0024] 门A、门D为两个圈出了主要细胞群的门，门B、门C代表的细胞群来自门A，门E、 门F代表的细胞群来自门D;B、E为红色荧光细胞群（代表高活力精子）；C、F为绿色荧光 细胞群（代表低活力精子）。
[0025] 图4 "正常液化的精液"和"不液化精液"的实物图；A:"正常液化的精液"滴落顺 利，不粘稠拖尾；B:"不液化精液"粘稠而且严重拖尾。
[0026] 图5使用本发明方法和传统方法处理精液后的精子数量对比图；A:新方法处理的 精液；B:传统法处理的精液，图中标尺代表50ym。
[0027] 图6设门以去除杂质碎片；A:FS/SS的原始散点图；B:设门去除杂质碎片，门A为 精子主群，门B为杂质碎片群。
[0028] 图7"设立补偿"和"不设立补偿"的散点图对比；A:"设立补偿"的散点图；B:"不 设立补偿"的散点图。
[0029] 图8 "不设立补偿"、"设立补偿不充分"、"正确设立补偿"和"设立补偿过度"的 散点图对比；A:"不设立补偿"的散点图；B:"设立补偿不充分"的散点图，FL1-5%FL2和FL2-5%FL1;C:"设立补偿不充分"的散点图，FL1-7. 5%FL2和FL2-7. 5%FL1;D:"正确 设立补偿"的散点图，FL1-8%FL2和FL2-10%FL1;E:"设立补偿过度"的散点图，FL1-8% FL2 和FL2-11%FL1;F:"设立补偿过度"的散点图，FL1-8%FL2 和FL2-12%FL1。
【具体实施方式】
[0030] 本发明所用的实验仪器与试剂如下：
[0031]FC-500分析型流式细胞仪（美国Beckman) ;DMI3000B型倒置显微镜（德国 Leica公司）；UPR-I-10T纯水机（中国优普公司）；3111型C02细胞培养箱（美国Thermo Scientific公司）；SW-CJ-2FD超净工作台（中国苏州净化公司）JDL-40B型大体积离心 机（中国Anke公司）。染料JC-1和解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙（CCCP)来自线粒体膜电 位检测试剂盒（中国碧云天）；磷酸缓冲液（PBS)(成都哈里）。
[0032]实施例1本发明检测人精子活力的方法
[0033] 1、试验方法
[0034] 取得精液，用PBS稀释10倍，加入JC-1至终浓度为2yg/ml，37°C处理lOmin;对 混合物不进行离心处理，直接进行流式细胞仪分析，荧光检测使用波长为488nm的激发光， 检测时收集FSLin、SSLog、FLlLog、FL2Log等参数的数据。
[0035] 2、数据分析
[0036] 对流式细胞仪的数据：以所有细胞的FSLin为X轴，SSLog为Y轴，绘制散点图， 并通过设门圈出主要细胞群并去除细胞碎片，在此门的基础上，以门里面的细胞的FL1Log 为X轴，门里面的细胞的FL2Log为Y轴，绘制散点图，然后调整补偿，补偿为：FL1-8%FL2 和FL2-10%FL1 (见图1)，再设门分别圈出红色荧光细胞群和绿色荧光细胞群并计数，红 色荧光细胞群的比例代表高活力精子的比例，绿色荧光细胞群的比例代表低活力精子的比 例。
[0037]设门方式为：根据散点图中明显分开的两个细胞群的轮廓和边缘，用多边形设门 方式分别圈出这两个明显分开的细胞群。
[0038] 为了说明本发明的有益效果，本发明还提供了以下试验：
[0039] 试验例1本发明检测人精子活力的方法的准确性
[0040] 1、试验方法
[0041] 取得精液，用PBS稀释10倍，分为两部分，一部分加入CCCP至终浓度为10yM， 37°C处理10min;另一部分不加CCCP作为对照；加入JC-1至终浓度为2yg/ml，37°C处理 10min;对混合物不进行离心处理，直接进行流式细胞仪分析，荧光检测使用波长为488nm 的激发光，检测时收集FSLin、SSLog、FLlLog、FL2Log等参数的数据。
[0042] 用荧光显微镜法验证本发明方法的准确性：为了验证新建立的流式细胞分析法的 可靠性，对CCCP处理后和未经CCCP处理的精子进行了荧光显微成像并用软件IPP分析了 图像。在进行荧光显微成像时，保持针对所有照片的各种成像参数一致，比如曝光时间等。 对荧光显微照片使用软件ImageProPlus(IPP)对所有荧光照片进行平均光密度计算，并 进行照片间的比较。
[0043] 2、数据分析
[0044] 对流式细胞仪的数据：以所有细胞的FSLin为X轴，SSLog为Y轴，绘制散点图， 并通过设门圈出主要细胞群并去除细胞碎片，在此门的基础上，以门里面的细胞的FL1Log 为X轴，门里面的细胞的FL2Log为Y轴，绘制散点图，然后调整补偿，补偿为：FL1-8%FL2 和FL2-10%FL1，再设门分别圈出红色荧光细胞群和绿色荧光细胞群并计数，红色荧光细 胞群的比例代表高活力精子的比例，绿色荧光细胞群的比例代表低活力精子的比例。
[0045] 设门方式为：根据散点图中明显分开的两个细胞群的轮廓和边缘，用多边形设门 方式分别圈出这两个明显分开的细胞群。
[0046] 3、试验结果
[0047] CCCP是细胞电子链的解偶联剂，用它处理细胞后，细胞的线粒体膜电位会大幅下 降，所以可以确定精子经CCCP处理后，高活力精子比例将下降（红色荧光的强度下降），而 低活力精子比例将上升（绿色荧光的强度上升）。
[0048] 3. 1荧光显微镜法检测结果
[0049] 结果见图2、表1。
[0050] 表1对CCCP处理前后的精子的荧光显微图像分析
[0052] 由图2、表1可见，相对于未经CCCP处理的精子，CCCP处理后的精子红色荧光强度 下降，而绿色荧光强度上升。
[0053] 3. 2本发明流式细胞仪检测结果
[0054] 本研宄用CCCP处理一部分精子，与未经CCCP处理的精子对比，结果见图3、表2。
[0055] 表2对CCCP处理前后的精子的流式细胞术分析
[0057] 由图3、表2可见，相对于未经CCCP处理的精子，用CCCP处理一部分精子的绿色荧 光部分上升（代表低活力精子），而红色荧光部分下降（代表高活力精子）。
[0058] 比较可以看出，本发明方法的检测结果与理论预期结果以及荧光显微镜检测 结果 均一致，说明本发明检测方法可以准确检测精子活力。
[0059] 实验例2本发明方法中精液前处理方法的验证
[0060] 一、本发明精液前处理方法可以解决精子不液化和粘稠度高的问题
[0061] 在精子不液化和粘稠度高的情况下，使用常规的显微分析得到的检测值误差极 大，而对于流式细胞仪检测法，也极为不利。
[0062] 发明人通过摸索，发现使用PBS稀释10倍能解决精子不液化和粘稠度高的问题。 "正常液化的精液"和"不液化精液"的实物图见图4。
[0063] 二、本发明方法与传统方法对精子损伤的比较
[0064](一）显微镜观察
[0065] 本发明方法的精液前处理：取得精液，用PBS稀释10倍，待测；
[0066] 传统方法的精液前处理：同样的精液，用PBS稀释10倍后，500g离心lOmin，弃上 清液，这样完成了第一次离心清洗，然后再加入与前等量的PBS悬浮精子沉淀，500g离心lOmin，弃上清液，这样完成了第二次离心清洗，最后，加入与前等量的PBS悬浮精子沉淀， 待测。
[0067] 然后两部分精液分别用精子活力常规显微镜观察法检测。精子活力常规显微镜观 察法检测是世界卫生组织WHO认可的检测方法。
[0068] 得到的结果见图5和表3。
[0069] 表3本发明方法和传统方法的精液前处理后的精子活力检测对比
[0071] 由图5可见，精液经过离心清洗后，精子数量相比不离心清洗处理的精液大为降 低；
[0072] 由表3可见，使用常规显微镜观察法对两部分精液中运动精子分析，精液经过离 心清洗后，运动精子的数量和质量相比不离心清洗处理的精液也大为降低。
[0073] 本发明方法的精液前处理过程，对精子数量和运动力有更好的保持，效果优于传 统方法的精液前处理过程。
[0074](二）本发明流式细胞仪检测
[0075] 本发明方法：同实验例1方法。
[0076] 传统方法：取与本发明方法中同样的精液，用10倍体积的PBS稀释，然后500g离 心lOmin，弃上清液；加入lml的PBS稀释，加入JC-1至终浓度2yg/ml，37°C处理lOmin;; 对混合物500g离心lOmin，弃上清液，再加入10倍体积的PBS稀释，然后500g离心lOmin， 弃上清液，以去除未结合的JC-1;再加入lmlPBS稀释，最后进行流式细胞术分析。在流式 细胞仪上的检测与数据分析方法同本发明方法。
[0077] 对比结果见表4。
[0078] 表4本发明方法和传统方法的对比
[0080] 由表4可见，使用本发明方法时，低活力精子的比例显著下降（18.68% )，而使用 传统方法时，即使没有加入CCCP，低活力精子比例占到31. 57%。说明传统方法的反复清洗 和离心对精子造成较大损伤；相对于传统方法，本发明方法不仅省时省力，而且对精子的损 伤大为减少。
[0081] 实验结果说明：1、相对于传统方法，本发明方法不仅省时省力，而且对精子的损伤 大为减少；2、本发明流式细胞仪检测方法的检测结果与传统显微镜检测结果一致，说明本 发明方法是准确的。
[0082] 实验例3本发明方法中设门方式的验证
[0083] 原始的FS/SS散点图中，相对主群有离散的点，这些点为杂质碎片，如果不排除的 话，会影响分析，所以可以通过设门去除这些杂质碎片，以使得分析正常进行。
[0084]本发明方法的设门方式为散射光设门，具体是根据散点图中明显存在的集聚的细 胞群和其边缘的散在点群，用矩形设门方式圈出这个明显存在的集聚细胞群，排除其边缘 的散在点群。
[0085]本发明的设门方式依据FS和SS的原理而建立，FS作为前向散射能客观反映颗粒 的大小，颗粒大小与FS强度呈现正相关关系；SS作为侧向散射能客观翻译颗粒内部精细 结构，颗粒内部结构复杂程度与SS成正相关关系；由于细胞混合物中总是存在一些异常颗 粒，比如体积较小的细胞碎片和体积较大的多个细胞的集聚物，这些异类物质在FS/SS散 点图中就表现为"不合群"的散在点，要么FS太小，要么FS太大，完全可以通过设门排除这 些干扰检测的散在点。
[0086] 设门前的原始散点图与设门后的图比较见图6。
[0087] 图6结果说明，本发明散射光设门的方式可以有效排除干扰，实现准确检测。
[0088] 试验例4本发明方法中补偿方式的验证
[0089] 一、设立补偿与不设立补偿的对比
[0090] 不设立补偿：对流式细胞仪的数据：以所有细胞的FSLin为X轴，SSLog为Y轴， 绘制散点图，并通过设门圈出主要细胞群并去除细胞碎片，在此门的基础上，以门里面的细 胞的FL1Log为X轴，门里面的细胞的FL2Log为Y轴，绘制散点图，再设门分别圈出红色 荧光细胞群和绿色荧光细胞群并计数，红色荧光细胞群的比例代表高活力精子的比例，绿 色荧光细胞群的比例代表低活力精子的比例。
[0091] 设立补偿：对流式细胞仪的数据：以所有细胞的FSLin为X轴，SSLog为Y轴，绘 制散点图，并通过设门圈出主要细胞群并去除细胞碎片，在此门的基础上，以门里面的细胞 的FL1Log为X轴，门里面的细胞的FL2Log为Y轴，绘制散点图，然后调整补偿，补偿为： FL1-8%FL2和FL2-10%FL1，再设门分别圈出红色荧光细胞群和绿色荧光细胞群并计数， 红色荧光细胞群的比例代表高活力精子的比例，绿色荧光细胞群的比例代表低活力精子的 比例。
[0092] 对比见图7,由图7可见，同样的数据，"设立补偿"后，可明显分开高活力精子群和 低活力精子群；而"不设立补偿"时，高活力精子群和低活力精子群无法清楚分界实现，导致 后期检测结果不准确。
[0093] 二、本发明补偿调节程度的确定
[0094] 如果补偿调节得不到位，将无法把高活力精子群和低活力精子群分开，影响结果 的分析；同时，如果补偿调节得过度，也无法正常分析；只有正确设立补偿（FL1-8%FL2和FL2-10%FL1)，才能进行正常分析。
[0095] 1、试验方法：首先取得一份精液，从中取两份。
[0096] 第一份精液再等分为两份，分别标记为"-CCCP"和"+CCCP"，"-CCCP"样品不加入 CCCP处理，按本发明所述进行流式细胞仪检测，"+CCCP"样品加入CCCP处理，然后按本发明 所述进行流式细胞仪检测，
[0097] 对于"-CCCP"和"+CCCP"的流式细胞仪分析结果，分别使用不同的补偿条件，补偿 条件分别为：C1 :不设立补偿；C2 :FLl-5%FL2，FL2-5%FL1 ;C3 :FLl-7. 5%FL2，FL2-7. 5% FL1 ；C4 ：FLl-8%FL2,FL2-10%FL1 ；C5 ：FLl-8%FL2,FL2-11%FL1 ；C6：FLl-8%FL2, FL2-12%FL1，然后分别计算在相同补偿条件下"-CCCP"和"+CCCP"的高活力精子率的比 值，得到R-C1至R-C6;
[0098] 第二份精液也等分为两份，分别标记为"-CCCP"和"+CCCP"，"-CCCP"样品不加入 CCCP处理，由医院检验科进行WHO认定的显微镜检测，"+CCCP"样品加入CCCP处理，也由医 院检验科进行WHO认定的显微镜检测，对于"-CCCP"和"+CCCP"的检测结果，分别统计有运 动力的精子数量，然后计算有运动力的精子数量的比值，得到R-WH0。
[0099] 然后，以R-WH0为准，查R-C1至R-C6中哪个更接近R-WH0,最后确定哪个补偿条件 最合适。
[0100] 注：在计算上述几种比值时，都采用的是比较来自高活力精子的数据，而没有采用 的是比较来自低活力精子的数据，这是因为在本发明的试验中和一般情况下，精液中高活 力精子多于低活力精子，所以比较来自高活力精子的数据能有效降低系统误差。
[0101] 2、试验结果
[0102] 见图8和表5-6。
[0103] 表5第一份精液的使用流式细胞检测在不同补偿条件下的比值
[0105] 表6相同的第二份精液使用WHO认定方法检测的比值
[0107] 由图8可见，本发明（R-C4)的补偿可以分开高活力精子群和低活力精子群。
[0108] 综合表5、表6的结果可见：采用本发明补偿值的检测方法的检测结果跟公认的显 微镜检测结果一致，而采用其他补偿值则检测结果与显微镜检测结果相差较大，说明只有 采用本发明特定的补偿值才能准确检测。
[0109] 本发明通过分析流式细胞术检测精子的原理和操作，建立了基于荧光染料JC-1 的对人精子的流式细胞分析法，通过试验证实，本发明方法可以准确检测精液的活力，操作 更为简便、快速。
【主权项】
1. 一种检测人精子活力的方法，其特征在于：它是用流式细胞仪进行检测，步骤如下： (1) 取待检精液，使用PBS稀释10倍，得到精液稀释液； (2) 用荧光染料JC-I进行细胞染色； (3) 检测：用流式细胞仪检测，其中，激发波长为488nm，获得每一个细胞的FSLin、SS Log、FLlLog和FL2Log的数值； ⑷数据分析：以所有细胞的FSLin为X轴，SSLog为Y轴，绘制散点图，设门后，以门 里面的细胞的FLlLog为X轴，门里面的细胞的FL2Log为Y轴，绘制散点图，然后调整补偿， 补偿为：FLl-8%FL2和FL2-10%FL1，再设门，最后对门内细胞进行计数，即可。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1)中，所述PBS为0. 1M，pH7. 2的 PBS溶液。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2)中，所述染色是在精液稀释液 中，加入荧光染料JC-I至终浓度为2yg/ml，孵育lOmin。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述孵育的温度为：37°C。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤⑶中，流式细胞仪检测采用的仪器 为美国Beckman公司的FC-500分析型流式细胞仪。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4)中，数据分析采用CXPAnalysis 软件进行分析。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4)中，设门方式为散射光设门。
【专利摘要】本发明提供了一种检测人精子活力的方法，它是用流式细胞仪进行检测，步骤如下：(1)取待检精液，使用PBS稀释10倍，得到精液稀释液；(2)用荧光染料JC-1进行细胞染色；(3)检测：用流式细胞仪检测，其中，激发波长为488nm，获得每一个细胞的FS Lin、SS Log、FL1 Log和FL2 Log的数值；(4)数据分析：以所有细胞的FS Lin为X轴，SS Log为Y轴，绘制散点图，设门后，以门里面的细胞的FL1 Log为X轴，门里面的细胞的FL2 Log为Y轴，绘制散点图，然后调整补偿，补偿为：FL1-8％ FL2和FL2-10％ FL1，再设门，最后对门内细胞进行计数，即可。本发明可以准确检测精液的活力，方法更为简便、快速。
【IPC分类】G01N21/64
【公开号】CN104897630
【申请号】CN201510253246
【发明人】万谦, 陈强, 陆华, 高小平
【申请人】四川新生命干细胞科技股份有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月18日
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