糖原磷酸化酶同工酶bb近红外荧光法检测试剂盒的制作方法
糖原磷酸化酶同工酶bb近红外荧光法检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种糖原磷酸化酶同工酶BB近红外法荧 光检测试剂盒及其用途。
【背景技术】
[0002] 糖原磷酸化酶同工酶BB(GPBB)是一种心肌细胞中含量较高的酶。糖原磷酸化酶 为糖原分解的关键酶，在心肌细胞肌浆网构成糖原分解复合物，该复合物对缺血引起的糖 原分解特别敏感，使其构成发生改变，形成町溶性糖原磷酸化酶同工酶BB(GPBB)，透过细胞 膜进入血液。
[0003] 糖原磷酸化酶同工酶BB(GPBB)对心肌缺血缺氧敏感，在心肌损伤早期（小于4h) 即可释放入血，是急性心肌损伤早期诊断的一项很好的指标。对急性心肌缺血的早期诊断 优于心电图，是目前发现的急性心肌梗死（AMI)病人胸痛发作后4h内最敏感的指标。GPBB 的这一特点在AMI的早期诊断方面弥补了cTnl的不足。随着生物化学、免疫、分子生物学 及其检测技术的发展，发现GPBB对缺血性心肌损伤的早期诊断、产科、儿科学等方面的研 宄颇具价值。
[0004] 常用的酶联免疫吸附试验（ELIsA)等检测方法耗时、需要特殊设备，不适于急诊 室和现场对AMI的快速诊查的需要。
【发明内容】
[0005] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种糖原磷酸化酶同工酶 BB近红外荧光法检测试剂盒及其用途，用于建立高效可行的糖原磷酸化酶同工酶BB近红 外荧光检测技术，解决现有技术中的问题。本发明所提供的检测试剂盒结合近红外荧光检 测技术，可快速，准确的检测出人全血/血清/血浆中糖原磷酸化酶同工酶BB。
[0006] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] 本发明的第一方面提供一种糖原磷酸化酶同工酶BB近红外荧光法检测试剂盒， 包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻 璃纤维素膜、包被有抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸。
[0008] 优选的，所述免疫荧光探针为抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体包被的近红 外荧光乳胶微球颗粒。
[0009] 优选的，硝酸纤维素膜上包被的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体和所述近 红外荧光乳胶微球颗粒上包被的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体可以为相同的抗糖 原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体，也可以为不同的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体。
[0010] 更优选的，所述硝酸纤维素膜上包被的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体为 Abeam?Anti-GPBB抗体[17B6]，所述近红外焚光乳胶微球颗粒上包被的抗糖原磷酸化酶 同工酶BB单克隆抗体为Abeam?Anti-GPBB抗体[17B6]，或所述硝酸纤维素膜上包被的抗 糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体为Abeam?.Anti-GPBB抗体[17B6]，所述近红外荧光 乳胶微球颗粒上包被的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体为Abeam?Anti-GPBB抗体 [lG6]〇
[0011] 更优选的，所述荧光乳胶微球颗粒的直径为140-160nm。
[0012]近红外光（NIR)，是介于可见光（VIS)和中红外光（MIR)之间的电磁波，ASTM定义 NIR为波长在780nm-2526nm范围内的电磁波。在近红外光区，生物体自吸收或荧光强度很 小，可避免背景干扰。同时由于散射光强度与波长的四次方呈反比，近红外区的散射干扰大 为减少。
[0013] 本发明的第二方面提供所述糖原磷酸化酶同工酶BB近红外荧光法检测试剂盒的 制备方法，包括如下步骤：
[0014] 1)用缓冲液将荧光乳胶微粒离心清洗并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒分 散液中加入抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体；加入EDCA使抗体与颗粒偶联；再加入 封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，制备获得探针溶液；
[0015] 2)将含有抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的缓冲溶液喷加到硝酸纤维素膜 上，烘干备用；
[0016] 3)将步骤1)制备获得的探针溶液浸润玻璃纤维薄膜，干燥备用；
[0017] 4)将步骤2)所得的硝酸纤维素膜、步骤3)所得的标记有免疫荧光探针的玻璃 纤维素膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成糖原磷酸化酶同工酶BB近红外荧光检测试剂 盒。
[0018] 优选的，所述步骤1)中，再加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，并加入冠醚， 制备获得探针溶液，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种 或多种的组合。
[0019] 更优选的，步骤1)制备获得的探针溶液中冠醚的浓度为0.l-20mg/ml，更优选为 4_8mg/ml〇
[0020] 优选的，所述步骤1)中，缓冲液为磷酸盐（PBS)缓冲液。
[0021] 更优选的，所述PBS缓冲液为0? 009-0. 011mol/L，PH7. 25-7. 35的PBS缓冲液。
[0022] 优选的，所述步骤1)中，荧光乳胶微粒的直径为140-160nm。
[0023] 优选的，所述步骤1)中，乳胶颗粒、抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体、EDCA的 重量比为 9-11 :0? 9-1. 1 :0? 9-1. 1。
[0024] 在本发明一优选实施例中，乳胶颗粒、抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体、 EDCA的投料量分别为lmg、100ug、100ug。
[0025] 优选的，所述封闭液为乙醇胺，加入量为适量，本领域技术人员可根据实际情况调 整乙醇胺的用量。
[0026] 优选的，所述步骤2)中，所述缓冲溶液为PBS缓冲液。
[0027] 本领域技术人员可选取适当浓度和pH的PBS缓冲液，更优选为0. 009-0.Ollmol/ L，PH7. 25-7. 35 的PBS缓冲液。
[0028]优选的，所述步骤2)中，含有抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的缓冲溶液中 还含有冠醚，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种 的组合。
[0029] 更优选的，所述含有抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的 浓度为〇?l-20mg/ml，更优选为4-8mg/ml。
[0030] 优选的，所述步骤2)中，含有抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的缓冲溶液中 抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的浓度为1. 8-2. 2mg/ml。
[0031] 优选的，所述步骤2)中，抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的缓冲溶液的喷加 量为 0? 9-1.lul/cm。
[0032] 优选的，所述步骤2)中，烘干的具体条件为36_38°C烘箱烘干。
[0033] 所述喷加过程利用微量蛋白点膜系统。
[0034] 优选的，所述步骤1)中的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体为Abeam? Anti-GPBB抗体[17B6]，所述步骤2)中的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体为Abeam? Anti-GPBB抗体[17B6]，或所述步骤1)中的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体为 AAbeam?Anti-GPBB抗体[17B6]，所述步骤2)中的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗 体为Abeam?Anti-GPBB抗体[1G6]。
[0035] 优选的，所述步骤3)中，干燥的具体条件为真空干燥机干燥。
[0036] 本发明的第三方面提供了所述糖原磷酸化酶同工酶BB近红外荧光法检测试剂盒 在糖原磷酸化酶同工酶BB检测领域的用途。
[0037] 所述用途具体为使用所述糖原磷酸化酶同工酶BB近红外荧光法检测试剂盒对样 品中的糖原磷酸化酶同工酶BB进行检测，所述样品选自人全血、血清或血浆中的一种或多 种的组合。
[0038] 本发明所提供的检测试剂盒以人全血/血清/血浆为检测样本，结合近红外荧光 检测技术，可快速，准确的检测出患者标本中的糖原磷酸化酶同工酶BB。所述试剂盒采用免 疫荧光层析法，其最小可测量可达〇. 6pg/ml，检测方便、成本低，灵敏度高，特异性好，比同 类定量诊断试剂价格低20-30%，大大节约了社会医疗成本，检测过程中样品收集及处理简 单，可快速准确的获得结果，非常适合突发事件现场和基层使用，并可应用到临床检测中， 为临床治疗提供定性依据。
【具体实施方式】
[0039] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实 施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0040] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中 另外明确指出，单数形式"一个"、"一"和"这个"包括复数形式。
[0041] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0042] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术 领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技 术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook 等MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarbor LaboratoryPress，1989andThirdedition，2001;Ausubel等，CURRENTPROTOCOLS INMOLECULARBIOLOGY,Johnffiley&Sons,NewYork,1987andperiodicupdates； theseriesMETHODSINENZYMOLOGY, AcademicPress,SanDiego；ffolffe,CHROMATIN STRUCTUREANDFUNCTION,Thirdedition,AcademicPress,SanDiego,1998 ；METH0DS INENZYMOLOGY,Vol. 304,Chromatin(P.M.ffassarmanandA.P.ffolffe,eds.),Academic Press，SanDiego，1999;和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，V〇1.119,Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed. )HumanaPress，Totowa，1999 等。
[0043] 本发明各实施例中试验样品由浦东新区人民医院提供。近红外荧光检测仪，由上 海凯创生物技术有限公司开发提供。
[0044] 实施例1
[0045] 1.免疫荧光抗糖原磷酸化酶同工酶BB抗体颗粒制备：
[0046] 用0? 01mol/L，PH7. 3±0. 05的磷酸盐缓冲液将直径为150nm的荧光乳胶微粒 离心清洗2遍并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒中加入Abeam?Anti-GPBB抗体 [17B6];加入EDCA使抗体与颗粒偶联；加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，再加入二 环已基-18-冠-6。按每毫克微球乳胶100微克的待标记抗体，100微克的EDCA用量标记。 每毫克的微球乳胶最后加相当于20微克的乙醇胺当量的封闭液进行封闭，冠醚的终浓度 为 6mg/ml〇
[0047] 2.试剂盒的制备：
[0048] 用 0? 01MpH7. 2 的PBS缓冲液稀释Abeam?Anti-GPBB抗体[17B6]至浓度 2.Omg/ ml，并加入冠醚，冠醚的终浓度为6mg/ml，再利用微量蛋白点膜系统将溶液喷加到适当孔径 的硝酸纤维素膜上，按lul/cm的量进行喷膜，37°C烘箱烘干备用。
[0049] 用制备好的探针（步骤1制得的标记有Abeam?Anti-GPBB抗体[17B6]的近红外 荧光乳胶微球）溶液浸润玻璃纤维薄膜，真空干燥机中干燥备用。
[0050] 将包被抗糖原磷酸化酶同工酶BB抗体的硝酸纤维素膜、标记有免疫荧光探针的 玻璃纤维素膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成糖原磷酸化酶同工酶BB近红外荧光法检 测试剂盒。
[0051] 实施例2
[0052] 试剂盒检测：
[0053] 以基因工程合成的糖原磷酸化酶同工酶BB和PBS缓冲液分别配置浓度为0. 4pg/ ml、0. 6pg/ml、0. 8pg/ml、lpg/ml、2pg/ml、4pg/ml、10pg/ml、20pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、 200pg/ml、300pg/ml、400pg/ml、500pg/ml、lOOOpg/ml的糖原磷酸化酶同工酶BB标准品，以 〇pg/ml作为空白对照，空白对照及每个浓度的标准品均重复测定6次。标准品及试剂盒均 平衡至室温后再开始检测，用滴管在每个试剂盒的加样孔内滴加3滴样本（约120-150ul)。 15分钟时，用近红外荧光检测仪检测荧光信号，并用荧光仪器进行判断，分析仪的对荧光信 号的检测范围是AD值0-10000。以糖原磷酸化酶同工酶BB浓度为横坐标，近红外荧光检测 仪检测荧光信号（平均值）为纵坐标，建立标准曲线。在标准曲线上，随着标准品浓度的升 高，测得的荧光信号值也随之升高。
[0054] 根据标准曲线计算可知，本试剂盒对0. 6pg/ml的样品可以部分检出，对1.Opg/ml 的样品全部检出，其最低检出限< 1. 〇pg/ml，并在l-1000pg/ml的范围具有良好的线性。
[0055] 各浓度的批内最大CVs为4. 2%，平均CVs为3. 56% (每个浓度的样品同批进行 测试），各浓度的批间最大CVs为5. 4%，平均CVs为4. 6% (每个浓度的样品分5批进行测 试）表明本发明所提供的试剂盒具有良好的重复性。
[0056] 选择未检测出的糖原磷酸化酶同工酶BB进行加标回收实验，加入糖原磷酸化酶 同工酶BB标准品，将糖原磷酸化酶同工酶BB的浓度分别调整至2pg/ml、4pg/ml、10pg/ml、 20pg/ml、50pg/ml、100pg/ml，空白对照及每个浓度的样品均重复测定6次。各浓度的批内 最大CVs为4. 3%，平均CVs为3. 6%，各浓度的加标回收率为97. 5% -100. 1%，表明本发 明所提供的试剂盒具有良好的准确度。
[0057] 将本发明所提供的糖原磷酸化酶同工酶BB近红外荧光法检测试剂盒密封保存， 并存放于4°C及室温（25°C左右）下，观察不同存放温度对试剂盒稳定性的影响。保存于 4°C的试剂盒每周取出4盒，分别检测0. 6pg/ml、0. 8pg/ml、l. 0pg/ml、l. 5pg/ml的糖原磷酸 化酶同工酶BB标准品；保存于室温（25°C)的试剂盒每3天取出4盒，分别检测0.6pg/ml、 0? 8pg/ml、l. 0pg/ml、l. 5pg/ml的糖原磷酸化酶同工酶BB标准品。经验证，试纸盒在4°C 下可保存24个月，且最低检出限和重复性没有明显变化，在室温下可保存18个月，且最低 检出限和重复性没有明显变化；在可保存的期限内，试剂盒均可达到1. 〇pg/ml的检测灵敏 度。
[0058] 综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
[0059] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟 悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因 此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完 成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 一种糖原磷酸化酶同工酶BB近红外荧光法检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条， 试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、包被有抗糖原 磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸，所述免疫荧光探针为抗糖原磷 酸化酶同工酶BB单克隆抗体包被的近红外荧光乳胶微球颗粒。2. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上包被的抗糖 原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体和所述近红外荧光乳胶微球颗粒上包被的抗糖原磷酸化 酶同工酶BB单克隆抗体为相同的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体，或者为不同的抗 糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体。3. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上包被的抗糖 原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体为Abeam? Anti-GPBB抗体[17B6]，所述近红外焚光乳 胶微球颗粒上包被的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体为Abeam? Anti-GPBB抗体 [17B6]，或所述硝酸纤维素膜上包被的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体为Abeam? Anti-GPBB抗体[17B6]，所述近红外荧光乳胶微球颗粒上包被的抗糖原磷酸化酶同工酶BB 单克隆抗体为Abeam? Anti-GPBB抗体[1G6]。4. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光乳胶微球颗粒的直径为 140_160nm。5. 根据权利要求1-4任一权利要求所述的检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤： 1) 用缓冲液将荧光乳胶微粒离心清洗并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒分散液 中加入抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体；加入EDCA使抗体与颗粒偶联；再加入封闭 液封闭乳胶颗粒上多余的基团，制备获得探针溶液； 2) 将含有抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的缓冲溶液喷加到硝酸纤维素膜上， 烘干备用； 3) 将步骤1)制备获得的探针溶液浸润玻璃纤维薄膜，干燥备用； 4) 将步骤2)所得的硝酸纤维素膜、步骤3)所得的标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素 膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成糖原磷酸化酶同工酶BB近红外荧光检测试剂盒。6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，再加入封闭液封闭乳 胶颗粒上多余的基团，并加入冠醚，制备获得探针溶液，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、 15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合； 和/或，步骤1)制备获得的探针溶液中冠醚的浓度为0. l-20mg/ml ; 和/或，所述步骤1)中，缓冲液为PBS缓冲液； 和/或，所述步骤1)中，乳胶颗粒、抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体、EDCA的重 量比为 9-11 :0· 9-1. 1 :0· 9-1. 1 ; 和/或，所述封闭液为乙醇胺。7. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，含有抗糖原磷酸化酶 同工酶BB单克隆抗体的缓冲溶液中还含有冠醚，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠 醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合； 和/或，所述含有抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度为 0· l_20mg/ml ; 和/或，含有抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的缓冲溶液中抗糖原磷酸化酶同工 酶BB单克隆抗体的浓度为I. 8-2. 2mg/ml ; 和/或，抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的缓冲溶液的喷加量为0. 9-1. lul/cm ; 和/或，所述步骤2)中，所述缓冲溶液为PBS缓冲液。8. 根据权利要求1-4任一权利要求所述的检测试剂盒在糖原磷酸化酶同工酶BB检测 领域的用途。9. 根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述用途具体为使用所述糖原磷酸化酶 同工酶BB近红外荧光法检测试剂盒对样品中的糖原磷酸化酶同工酶BB进行检测，所述样 品选自人全血、血清或血浆中的一种或多种的组合。
【专利摘要】本发明公开了一种糖原磷酸化酶同工酶BB近红外荧光法检测试剂盒及其用途。本发明提供的一种糖原磷酸化酶同工酶BB近红外荧光法检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、包被有抗糖原磷酸化酶同工酶BB抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸。本发明所提供的检测试剂盒结合近红外荧光检测技术，可快速，准确地检测出人全血、血清或血浆中的糖原磷酸化酶同工酶BB。
【IPC分类】G01N21/64, G01N33/573, G01N33/533
【公开号】CN104897631
【申请号】CN201510292240
【发明人】李林
【申请人】上海凯创生物技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月1日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种糖原磷酸化酶同工酶BB近红外法荧 光检测试剂盒及其用途。
【背景技术】
[0002] 糖原磷酸化酶同工酶BB(GPBB)是一种心肌细胞中含量较高的酶。糖原磷酸化酶 为糖原分解的关键酶，在心肌细胞肌浆网构成糖原分解复合物，该复合物对缺血引起的糖 原分解特别敏感，使其构成发生改变，形成町溶性糖原磷酸化酶同工酶BB(GPBB)，透过细胞 膜进入血液。
[0003] 糖原磷酸化酶同工酶BB(GPBB)对心肌缺血缺氧敏感，在心肌损伤早期（小于4h) 即可释放入血，是急性心肌损伤早期诊断的一项很好的指标。对急性心肌缺血的早期诊断 优于心电图，是目前发现的急性心肌梗死（AMI)病人胸痛发作后4h内最敏感的指标。GPBB 的这一特点在AMI的早期诊断方面弥补了cTnl的不足。随着生物化学、免疫、分子生物学 及其检测技术的发展，发现GPBB对缺血性心肌损伤的早期诊断、产科、儿科学等方面的研 宄颇具价值。
[0004] 常用的酶联免疫吸附试验（ELIsA)等检测方法耗时、需要特殊设备，不适于急诊 室和现场对AMI的快速诊查的需要。
【发明内容】
[0005] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种糖原磷酸化酶同工酶 BB近红外荧光法检测试剂盒及其用途，用于建立高效可行的糖原磷酸化酶同工酶BB近红 外荧光检测技术，解决现有技术中的问题。本发明所提供的检测试剂盒结合近红外荧光检 测技术，可快速，准确的检测出人全血/血清/血浆中糖原磷酸化酶同工酶BB。
[0006] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] 本发明的第一方面提供一种糖原磷酸化酶同工酶BB近红外荧光法检测试剂盒， 包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻 璃纤维素膜、包被有抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸。
[0008] 优选的，所述免疫荧光探针为抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体包被的近红 外荧光乳胶微球颗粒。
[0009] 优选的，硝酸纤维素膜上包被的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体和所述近 红外荧光乳胶微球颗粒上包被的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体可以为相同的抗糖 原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体，也可以为不同的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体。
[0010] 更优选的，所述硝酸纤维素膜上包被的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体为 Abeam?Anti-GPBB抗体[17B6]，所述近红外焚光乳胶微球颗粒上包被的抗糖原磷酸化酶 同工酶BB单克隆抗体为Abeam?Anti-GPBB抗体[17B6]，或所述硝酸纤维素膜上包被的抗 糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体为Abeam?.Anti-GPBB抗体[17B6]，所述近红外荧光 乳胶微球颗粒上包被的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体为Abeam?Anti-GPBB抗体 [lG6]〇
[0011] 更优选的，所述荧光乳胶微球颗粒的直径为140-160nm。
[0012]近红外光（NIR)，是介于可见光（VIS)和中红外光（MIR)之间的电磁波，ASTM定义 NIR为波长在780nm-2526nm范围内的电磁波。在近红外光区，生物体自吸收或荧光强度很 小，可避免背景干扰。同时由于散射光强度与波长的四次方呈反比，近红外区的散射干扰大 为减少。
[0013] 本发明的第二方面提供所述糖原磷酸化酶同工酶BB近红外荧光法检测试剂盒的 制备方法，包括如下步骤：
[0014] 1)用缓冲液将荧光乳胶微粒离心清洗并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒分 散液中加入抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体；加入EDCA使抗体与颗粒偶联；再加入 封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，制备获得探针溶液；
[0015] 2)将含有抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的缓冲溶液喷加到硝酸纤维素膜 上，烘干备用；
[0016] 3)将步骤1)制备获得的探针溶液浸润玻璃纤维薄膜，干燥备用；
[0017] 4)将步骤2)所得的硝酸纤维素膜、步骤3)所得的标记有免疫荧光探针的玻璃 纤维素膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成糖原磷酸化酶同工酶BB近红外荧光检测试剂 盒。
[0018] 优选的，所述步骤1)中，再加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，并加入冠醚， 制备获得探针溶液，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种 或多种的组合。
[0019] 更优选的，步骤1)制备获得的探针溶液中冠醚的浓度为0.l-20mg/ml，更优选为 4_8mg/ml〇
[0020] 优选的，所述步骤1)中，缓冲液为磷酸盐（PBS)缓冲液。
[0021] 更优选的，所述PBS缓冲液为0? 009-0. 011mol/L，PH7. 25-7. 35的PBS缓冲液。
[0022] 优选的，所述步骤1)中，荧光乳胶微粒的直径为140-160nm。
[0023] 优选的，所述步骤1)中，乳胶颗粒、抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体、EDCA的 重量比为 9-11 :0? 9-1. 1 :0? 9-1. 1。
[0024] 在本发明一优选实施例中，乳胶颗粒、抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体、 EDCA的投料量分别为lmg、100ug、100ug。
[0025] 优选的，所述封闭液为乙醇胺，加入量为适量，本领域技术人员可根据实际情况调 整乙醇胺的用量。
[0026] 优选的，所述步骤2)中，所述缓冲溶液为PBS缓冲液。
[0027] 本领域技术人员可选取适当浓度和pH的PBS缓冲液，更优选为0. 009-0.Ollmol/ L，PH7. 25-7. 35 的PBS缓冲液。
[0028]优选的，所述步骤2)中，含有抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的缓冲溶液中 还含有冠醚，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种 的组合。
[0029] 更优选的，所述含有抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的 浓度为〇?l-20mg/ml，更优选为4-8mg/ml。
[0030] 优选的，所述步骤2)中，含有抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的缓冲溶液中 抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的浓度为1. 8-2. 2mg/ml。
[0031] 优选的，所述步骤2)中，抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的缓冲溶液的喷加 量为 0? 9-1.lul/cm。
[0032] 优选的，所述步骤2)中，烘干的具体条件为36_38°C烘箱烘干。
[0033] 所述喷加过程利用微量蛋白点膜系统。
[0034] 优选的，所述步骤1)中的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体为Abeam? Anti-GPBB抗体[17B6]，所述步骤2)中的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体为Abeam? Anti-GPBB抗体[17B6]，或所述步骤1)中的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体为 AAbeam?Anti-GPBB抗体[17B6]，所述步骤2)中的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗 体为Abeam?Anti-GPBB抗体[1G6]。
[0035] 优选的，所述步骤3)中，干燥的具体条件为真空干燥机干燥。
[0036] 本发明的第三方面提供了所述糖原磷酸化酶同工酶BB近红外荧光法检测试剂盒 在糖原磷酸化酶同工酶BB检测领域的用途。
[0037] 所述用途具体为使用所述糖原磷酸化酶同工酶BB近红外荧光法检测试剂盒对样 品中的糖原磷酸化酶同工酶BB进行检测，所述样品选自人全血、血清或血浆中的一种或多 种的组合。
[0038] 本发明所提供的检测试剂盒以人全血/血清/血浆为检测样本，结合近红外荧光 检测技术，可快速，准确的检测出患者标本中的糖原磷酸化酶同工酶BB。所述试剂盒采用免 疫荧光层析法，其最小可测量可达〇. 6pg/ml，检测方便、成本低，灵敏度高，特异性好，比同 类定量诊断试剂价格低20-30%，大大节约了社会医疗成本，检测过程中样品收集及处理简 单，可快速准确的获得结果，非常适合突发事件现场和基层使用，并可应用到临床检测中， 为临床治疗提供定性依据。
【具体实施方式】
[0039] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实 施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0040] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中 另外明确指出，单数形式"一个"、"一"和"这个"包括复数形式。
[0041] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0042] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术 领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技 术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook 等MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarbor LaboratoryPress，1989andThirdedition，2001;Ausubel等，CURRENTPROTOCOLS INMOLECULARBIOLOGY,Johnffiley&Sons,NewYork,1987andperiodicupdates； theseriesMETHODSINENZYMOLOGY, AcademicPress,SanDiego；ffolffe,CHROMATIN STRUCTUREANDFUNCTION,Thirdedition,AcademicPress,SanDiego,1998 ；METH0DS INENZYMOLOGY,Vol. 304,Chromatin(P.M.ffassarmanandA.P.ffolffe,eds.),Academic Press，SanDiego，1999;和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，V〇1.119,Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed. )HumanaPress，Totowa，1999 等。
[0043] 本发明各实施例中试验样品由浦东新区人民医院提供。近红外荧光检测仪，由上 海凯创生物技术有限公司开发提供。
[0044] 实施例1
[0045] 1.免疫荧光抗糖原磷酸化酶同工酶BB抗体颗粒制备：
[0046] 用0? 01mol/L，PH7. 3±0. 05的磷酸盐缓冲液将直径为150nm的荧光乳胶微粒 离心清洗2遍并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒中加入Abeam?Anti-GPBB抗体 [17B6];加入EDCA使抗体与颗粒偶联；加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，再加入二 环已基-18-冠-6。按每毫克微球乳胶100微克的待标记抗体，100微克的EDCA用量标记。 每毫克的微球乳胶最后加相当于20微克的乙醇胺当量的封闭液进行封闭，冠醚的终浓度 为 6mg/ml〇
[0047] 2.试剂盒的制备：
[0048] 用 0? 01MpH7. 2 的PBS缓冲液稀释Abeam?Anti-GPBB抗体[17B6]至浓度 2.Omg/ ml，并加入冠醚，冠醚的终浓度为6mg/ml，再利用微量蛋白点膜系统将溶液喷加到适当孔径 的硝酸纤维素膜上，按lul/cm的量进行喷膜，37°C烘箱烘干备用。
[0049] 用制备好的探针（步骤1制得的标记有Abeam?Anti-GPBB抗体[17B6]的近红外 荧光乳胶微球）溶液浸润玻璃纤维薄膜，真空干燥机中干燥备用。
[0050] 将包被抗糖原磷酸化酶同工酶BB抗体的硝酸纤维素膜、标记有免疫荧光探针的 玻璃纤维素膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成糖原磷酸化酶同工酶BB近红外荧光法检 测试剂盒。
[0051] 实施例2
[0052] 试剂盒检测：
[0053] 以基因工程合成的糖原磷酸化酶同工酶BB和PBS缓冲液分别配置浓度为0. 4pg/ ml、0. 6pg/ml、0. 8pg/ml、lpg/ml、2pg/ml、4pg/ml、10pg/ml、20pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、 200pg/ml、300pg/ml、400pg/ml、500pg/ml、lOOOpg/ml的糖原磷酸化酶同工酶BB标准品，以 〇pg/ml作为空白对照，空白对照及每个浓度的标准品均重复测定6次。标准品及试剂盒均 平衡至室温后再开始检测，用滴管在每个试剂盒的加样孔内滴加3滴样本（约120-150ul)。 15分钟时，用近红外荧光检测仪检测荧光信号，并用荧光仪器进行判断，分析仪的对荧光信 号的检测范围是AD值0-10000。以糖原磷酸化酶同工酶BB浓度为横坐标，近红外荧光检测 仪检测荧光信号（平均值）为纵坐标，建立标准曲线。在标准曲线上，随着标准品浓度的升 高，测得的荧光信号值也随之升高。
[0054] 根据标准曲线计算可知，本试剂盒对0. 6pg/ml的样品可以部分检出，对1.Opg/ml 的样品全部检出，其最低检出限< 1. 〇pg/ml，并在l-1000pg/ml的范围具有良好的线性。
[0055] 各浓度的批内最大CVs为4. 2%，平均CVs为3. 56% (每个浓度的样品同批进行 测试），各浓度的批间最大CVs为5. 4%，平均CVs为4. 6% (每个浓度的样品分5批进行测 试）表明本发明所提供的试剂盒具有良好的重复性。
[0056] 选择未检测出的糖原磷酸化酶同工酶BB进行加标回收实验，加入糖原磷酸化酶 同工酶BB标准品，将糖原磷酸化酶同工酶BB的浓度分别调整至2pg/ml、4pg/ml、10pg/ml、 20pg/ml、50pg/ml、100pg/ml，空白对照及每个浓度的样品均重复测定6次。各浓度的批内 最大CVs为4. 3%，平均CVs为3. 6%，各浓度的加标回收率为97. 5% -100. 1%，表明本发 明所提供的试剂盒具有良好的准确度。
[0057] 将本发明所提供的糖原磷酸化酶同工酶BB近红外荧光法检测试剂盒密封保存， 并存放于4°C及室温（25°C左右）下，观察不同存放温度对试剂盒稳定性的影响。保存于 4°C的试剂盒每周取出4盒，分别检测0. 6pg/ml、0. 8pg/ml、l. 0pg/ml、l. 5pg/ml的糖原磷酸 化酶同工酶BB标准品；保存于室温（25°C)的试剂盒每3天取出4盒，分别检测0.6pg/ml、 0? 8pg/ml、l. 0pg/ml、l. 5pg/ml的糖原磷酸化酶同工酶BB标准品。经验证，试纸盒在4°C 下可保存24个月，且最低检出限和重复性没有明显变化，在室温下可保存18个月，且最低 检出限和重复性没有明显变化；在可保存的期限内，试剂盒均可达到1. 〇pg/ml的检测灵敏 度。
[0058] 综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
[0059] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟 悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因 此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完 成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 一种糖原磷酸化酶同工酶BB近红外荧光法检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条， 试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、包被有抗糖原 磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸，所述免疫荧光探针为抗糖原磷 酸化酶同工酶BB单克隆抗体包被的近红外荧光乳胶微球颗粒。2. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上包被的抗糖 原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体和所述近红外荧光乳胶微球颗粒上包被的抗糖原磷酸化 酶同工酶BB单克隆抗体为相同的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体，或者为不同的抗 糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体。3. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上包被的抗糖 原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体为Abeam? Anti-GPBB抗体[17B6]，所述近红外焚光乳 胶微球颗粒上包被的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体为Abeam? Anti-GPBB抗体 [17B6]，或所述硝酸纤维素膜上包被的抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体为Abeam? Anti-GPBB抗体[17B6]，所述近红外荧光乳胶微球颗粒上包被的抗糖原磷酸化酶同工酶BB 单克隆抗体为Abeam? Anti-GPBB抗体[1G6]。4. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光乳胶微球颗粒的直径为 140_160nm。5. 根据权利要求1-4任一权利要求所述的检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤： 1) 用缓冲液将荧光乳胶微粒离心清洗并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒分散液 中加入抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体；加入EDCA使抗体与颗粒偶联；再加入封闭 液封闭乳胶颗粒上多余的基团，制备获得探针溶液； 2) 将含有抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的缓冲溶液喷加到硝酸纤维素膜上， 烘干备用； 3) 将步骤1)制备获得的探针溶液浸润玻璃纤维薄膜，干燥备用； 4) 将步骤2)所得的硝酸纤维素膜、步骤3)所得的标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素 膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成糖原磷酸化酶同工酶BB近红外荧光检测试剂盒。6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，再加入封闭液封闭乳 胶颗粒上多余的基团，并加入冠醚，制备获得探针溶液，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、 15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合； 和/或，步骤1)制备获得的探针溶液中冠醚的浓度为0. l-20mg/ml ; 和/或，所述步骤1)中，缓冲液为PBS缓冲液； 和/或，所述步骤1)中，乳胶颗粒、抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体、EDCA的重 量比为 9-11 :0· 9-1. 1 :0· 9-1. 1 ; 和/或，所述封闭液为乙醇胺。7. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，含有抗糖原磷酸化酶 同工酶BB单克隆抗体的缓冲溶液中还含有冠醚，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠 醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合； 和/或，所述含有抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度为 0· l_20mg/ml ; 和/或，含有抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的缓冲溶液中抗糖原磷酸化酶同工 酶BB单克隆抗体的浓度为I. 8-2. 2mg/ml ; 和/或，抗糖原磷酸化酶同工酶BB单克隆抗体的缓冲溶液的喷加量为0. 9-1. lul/cm ; 和/或，所述步骤2)中，所述缓冲溶液为PBS缓冲液。8. 根据权利要求1-4任一权利要求所述的检测试剂盒在糖原磷酸化酶同工酶BB检测 领域的用途。9. 根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述用途具体为使用所述糖原磷酸化酶 同工酶BB近红外荧光法检测试剂盒对样品中的糖原磷酸化酶同工酶BB进行检测，所述样 品选自人全血、血清或血浆中的一种或多种的组合。
【专利摘要】本发明公开了一种糖原磷酸化酶同工酶BB近红外荧光法检测试剂盒及其用途。本发明提供的一种糖原磷酸化酶同工酶BB近红外荧光法检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、包被有抗糖原磷酸化酶同工酶BB抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸。本发明所提供的检测试剂盒结合近红外荧光检测技术，可快速，准确地检测出人全血、血清或血浆中的糖原磷酸化酶同工酶BB。
【IPC分类】G01N21/64, G01N33/573, G01N33/533
【公开号】CN104897631
【申请号】CN201510292240
【发明人】李林
【申请人】上海凯创生物技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月1日
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