一种卡那霉素的化学发光试剂盒及其应用
一种卡那霉素的化学发光试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测卡那霉素的化学发光免疫检测试剂盒，用于检测牛奶、奶粉 中的卡那霉素含量或残留量。属于免疫学检测领域。
【背景技术】
[0002] 卡那霉素是一种高效、广谱的氨基糖苷类抗生素，在治疗由革兰氏菌引起的感染 方面具有许多优点，其在动物中广泛应用的一个主要后果就是在动物性食品中抗生素的非 法残留。如果长期摄入含有药物残留的动物性食品，这些药物就可在体内蓄积，产生慢性毒 害作用，氨基糖苷类抗生素均有潜在的耳毒性，可引起前庭功能障碍和听力永久丧失。
[0003] 目前，测定卡那霉素的主要方法是微生物法、高效液相色谱、酶联免疫吸附法等。 色谱技术是非常有效、准确、敏感的方法，但是待检样品需经一系列的预处理，繁琐费时，从 样品预处理到得出检验结果需要较长时间，检测费用很高；另一方面这种检测方法还必须 有昂贵的仪器设备，只有特定的专业人员才能应用，而且每次检测的样品有限，不适应大批 样品的筛查，严重阻碍了该检测方法的推广应用，更不适合于现场检验。与之相比，化学发 光免疫法具有快速、灵敏、方便、检测成本较低等特点，能最大限度地减少操作误差和工作 强度，是一种非常适合基层检测牛奶、奶粉中卡那霉素的筛选方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种卡那霉素的化学发光检测试剂盒。该试剂盒具有检测灵 敏度高、应用灵活、方便的特点，可用于牛奶、奶粉等样品中卡那霉素的残留量检测。
[0005] 为实现上述目的，本发明主要是利用抗原与抗体的特异性免疫反应的基本原理来 实现的。化学发光免疫分析法是化学发光法和免疫分析法结合的产物，因此同时具有化学 发光法的高灵敏性和免疫分析法的高特异性。在整个反应过程中，样品中卡那霉素含量越 高，反应体系中发光强度越弱；反之，样品中卡那霉素含量越少，发光强度越高。
[0006] 本发明的检测卡那霉素的化学发光免疫检测试剂盒含有盒体，设在盒体内的化学 发光板和设在盒体内的试剂。具体含有以下成分：
[0007] 包被有抗卡那霉素抗体的白色不透明96孔可拆卸或不可拆卸的聚苯乙烯化学发 光板。
[0008] 应用pH= 7. 4 0. 05mol/L的PBS溶液稀释卡那霉素纯品得到的卡那霉素系列标 准品溶液，浓度范围至少包含了 〇. 05~4. 05ng/mL的浓度区间。
[0009] 酶标抗原浓缩液：由卡那霉素与卵清蛋白偶合制成的人工抗原与辣根过氧化物酶 偶联制备得到。
[0010] 酶标抗原稀释液：pH7. 6的0. 01M的磷酸钠、0. 25M的NaCl溶液。
[0011] 发光底物液：发光底物液分为A、B液。A液为化学发光底物-鲁米诺和发光增强 剂-对甲苯酚溶液，B液为过氧化氢脲溶液。
[0012] 浓缩复溶液：浓缩复溶液具体为2倍浓缩磷酸盐缓冲液，使用前用双蒸水稀释至 工作浓度后使用，用于样品前处理。
[0013] 浓缩洗涤液：浓缩洗涤溶液具体为含有吐温-20 (Tween-20)缓冲液的20倍浓缩磷 酸盐缓冲液，使用前用双蒸水稀释至工作浓度后使用，用于实验过程中洗涤化学发光板。 [0014] 本发明溶液的配制：
[0015] 本发明试剂盒中涉及的卡那霉素标准品溶液、酶标卡那霉素抗原溶液、化学发光 溶液及洗涤溶液及其配方对本发明试剂盒检测的灵敏度影响很大；其中各溶液的主要成分 及其配制方法是：
[0016] 1、卡那霉素标准溶液：以常规方法将卡那霉素纯品用0. 05mol/L，pH= 7. 4的PBS 配制成浓度分别为〇、〇. 05、0. 15、0. 45、1. 35、4. 05ng/mL的卡那霉素标准溶液。
[0017] 2、酶标卡那霉素抗原溶液：用卡那霉素与偶联蛋白偶联制备的人工抗原与辣根过 氧化物酶偶联制备得到，将所得酶标卡那霉素抗原用酶标卡那霉素稀释液稀释成1:4000 的工作浓度。
[0018] 3、酶标抗原稀释液：为pH7. 6的磷酸钠为0? 01M、NaCl为0? 25M的缓冲溶液。
[0019] 4、化学发光溶液:A液为鲁米诺含量为0. 01M、对甲苯酚含量为0. 001MpH= 8. 8 的三（羟甲基）氨基甲烷溶液，B液为每100mL溶液含柠檬酸2.lg，无水Na2HP042. 82g， 0. 75%的过氧化氢脲0. 64mL的水溶液。
[0020] 5、浓缩复溶工作液：NaH2P04 ? 2H20 5. 74g、Na2HP04 ? 12H20 32. 6g溶于 1L的去离子 水中。
[0021] 6、浓缩洗涤溶液：按体积分数0. 05 %将吐温-20添加至pH= 7. 4,0.lmol/L磷酸 盐缓冲液中。
[0022] 7、包被溶液：1. 59g碳酸钠和2. 53g碳酸氢钠溶于1L水中，调节pH= 9. 5。
[0023] 8、封闭溶液配制：10gBSA溶于1L洗涤溶液中，再加入重量比为5%。的NaN3。
[0024] 本发明化学发光板的包被：
[0025] 本发明中包被化学发光板采用将抗卡那霉素抗体置于设定的包被溶液中，以设定 的浓度，在37 °C恒温箱中反应包被。
[0026] 本发明采用的是pH= 9. 5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液。本发明中微孔板中所 包被的抗卡那霉素抗体在碱性环境下可以很好的结合在微孔板塑料表面上，可以经受多次 洗板，采用的抗体包被浓度为5. 0yg/mL。
[0027] 包被好的微孔板可以用封闭溶液封闭，封闭液中惰性蛋白优选BSA，需加入似％防 止变质。
[0028] 酶标卡那霉素抗原溶液的制备：
[0029] 本发明中酶标卡那霉素抗原溶液浓度是决定本发明中卡那霉素化学发光检测试 剂盒测定范围及灵敏度的重要因素。
[0030] 本发明中涉及的酶标卡那霉素抗原溶液可以用酶标卡那霉素稀释液稀释成 1:4000的工作浓度。
[0031] 按照上述酶标卡那霉素抗原溶液浓度制备的试剂盒可以达到很好的线性范围 (标准线范围可以达到0. 05~4. 05ng/mL)和很好的灵敏度（IC5Q为0. 065ng/mL)。
[0032] 化学发光溶液的配制：
[0033] 所述化学发光液A液为鲁米诺含量为0. 01M、对甲苯酚含量为0. 001MpH= 8. 8的 三（羟甲基）氨基甲烷溶液，B液为lOOmL溶液含柠檬酸2.lg，无水Na2HP042. 82g，0. 75% 的过氧化氢脲0. 64mL的水溶液。所述鲁米诺为化学发光底物，对甲苯酚为发光增强剂。 [0034] 本发明的原理是将抗体-抗原反应的高度特异性与酶催化的高度灵敏性结合起 来，利用酶催化底物的化学发光反应检测产物浓度。
[0035] 本发明的化学发光检测试剂盒具有灵敏度高、简便快速、准确的特点，与传统的比 色ELISA法比较，灵敏度可以提高一个数量级。有望在牛奶、奶粉中的卡那霉素残留检测中 发挥重要作用。
【附图说明】
[0036] 图1为卡那霉素半抗原合成反应式。
[0037] 图2为卡那霉素半抗原核磁共振氢谱图。
[0038] 图3为本发明化学发光试剂盒工作曲线。
【具体实施方式】
[0039] 实施例1 :半抗原、抗原及单克隆抗体的制备
[0040] (1)卡那霉素半抗原合成
[0041] 1. 0g卡那霉素、0. 3g邻苯二甲酸酐和2ml吡啶在10mlDMF中的混合液，室温下搅 拌反应12小时，减压蒸除溶剂，乙醇中重结晶得到邻苯二甲酸单卡那霉素酰胺，得率53%。
[0042] 取上述产物经核磁共振氢谱测定，如图2所示，8.Oppm左右的芳香烃信号和 11.Oppm羧基峰信号的出现说明半抗原合成成功。
[0043] (2)免疫原（卡那霉素-BSA)的合成
[0044] 取20mg半抗原，溶解于lmLDMF中，取30mgEDC和NHS用0. 2ml水充分溶解后 于加入⑴中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A。称取BSA50mg，使之充分溶解在3. 8mL PBS(PH7. 2)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用0.Olmol/ 1PBS4度透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。分装，于-20°C保存备 用。
[0045] 称取半抗原20mg和OVA50mg，按上述步骤反应制备包被抗原，供酶标用。
[0046] (3)卡那霉素单克隆抗体的制备
[0047] A，动物免疫：用上述制备出的免疫原（卡那霉素-BSA)按100yg/只，以生理盐水 溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6~8周龄Balb/c雌鼠，初 次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3 天以免疫复合物100Ug/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。
[0048] B，细胞融合：按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨 髓瘤细胞（SP2/0)混合，然后在45秒内缓慢加入预热的融合剂（PEG4000)进行融合，用HAT 培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37°C，5 %C02培养箱中培 养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。
[0049] C，杂交瘤细胞的筛选：细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛 选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接ELISA方法，以包被抗原（预先用方阵法常规滴定其 最佳包被浓度和阳性血清稀释度）包被化学发光板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加 入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，OPD进行显色反应。筛选出的阳性孔再用间接竞争ELISA方 法筛选，先将细胞上清与l〇〇yg/mL的卡那霉素等体积混合，37°C水浴作用30min，再加入 到包被好的化学发光板中。同时用PBS取代卡那霉素作对照，其余步骤同上。若经卡那霉 素阻断后的〇D45(lnm值下降到对照孔的50%以下，则判为阳性，经2~3次检测都为阳性的 孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化。
[0050] D，单克隆抗体制备：将2~3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液 用间接ELISA测定效价，冻存；并取8~10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0. 5mL/只， 7~10日后腹腔注射杂交瘤细胞1~2X106/只，7~10日后抽取小鼠腹水，离心取上清， 测定效价，并冻存备用。
[0051] 实施例2 :酶标抗原的制备
[0052] A，称取2mgHRP溶解于0. 5mL双蒸水中；加入0. 5mL新配制的0. 06mol/L恥104溶 液，4°C避光作用30min;
[0053] B，加入 160mmol/L的乙二醇 0? 5mL，室温作用 30min;
[0054] C，加入卡那霉素-OVA2mg，混勾后装入处理过的透析袋中，置1000mL的0. 05m mol/L碳酸钠缓冲液中透析，4°C过夜；
[0055] D，透析液吸至10mL的离心管中，加0. 25 mL新配的5g/LNaBHjf，混匀后置4°C2h; 加入等体积的饱和硫酸按溶液，4°C作用30min，在4°C下3000rpm离心25min，弃上清；
[0056] E，将沉淀溶于 1. 5mL0? 02mol/LpH7. 4PBS中，吸入透析袋内，在 0? 02mol/LpH 7. 4PBS透析，4°C过夜（中途更换PBS3次）；
[0057] F，将透析液中液体吸至微量离心管中，4°C下lOOOOrpm离心30min，将上清液吸 出，加等量甘油，混匀，-20°C保存备用。
[0058] 实施例3 :CLEIA检测方法的建立
[0059] (1)包被抗体与酶标抗原浓度的优选（方阵法）
[0060] 纵向用每种包被抗体按 80. 0、40. 0、20. 0、10. 0、5. 0、2. 5、1. 25、0. 625yg/mL的系 列稀释度包被化学发光板，100yL/孔，置于37°C恒温箱2h后，拍干；以150yL/孔封闭溶 液封闭，37°C恒温箱放置2小时，洗板一次，拍干；加入50yL/孔一系列稀释的酶标卡那霉 素抗原（1:1000至1:512000)，室温（20~25°C)孵育15min，洗板五次，最后一次拍干；分 别加入50yL/孔的化学发光A、B液，测定发光强度值。以发光强度值随酶标抗原的浓度有 明显梯度变化的包被抗体浓度和酶标抗原稀释度为最佳浓度进行特异性测定。
[0061] ⑵抗体灵敏度的测定
[0062] 根据上述对包被抗体及酶标抗原浓度的优选实验，申请人选择并确定酶标抗原浓 度为1:4000,包被抗体浓度为5. 0yg/mL进行抗体的灵敏度的测定：
[0063] A，包被：用0. 05MpH= 9. 6的碳酸盐包被溶液将抗卡那霉素抗体配成5. 0yg/mL 的溶液，每个聚苯乙烯板化学发光板反应孔中加100uL，37°C恒温箱2h。弃去孔内溶液，拍 干。
[0064] B，封闭：用封闭溶液封闭上述已包被的化学发光板，150yL/孔，37°C恒温箱2h然 后洗板一次，拍干。
[0065]C，加样：加不同浓度的卡那霉素标准品溶液50yL/孔，再加入50yL/孔稀释的酶 标卡那霉素抗原（1:4000)于上述已封闭的反应孔中，室温（20~25°C)避光孵育15min， 然后洗板五次，最后一次拍干。
[0066] D，发光：于各反应孔中加入临时配制的化学发光溶液100yL/孔，反应3min后用 化学发光免疫分析仪检测。
[0067] E，检测结果以抑制率计算：
[0068] 相对发光强度（％ ) =RLU/RLU。，RLU是标准品或者样品溶液测定的发光强度值， RL%是空白（浓度为0的标准溶液）的发光强度值。
[0069] 计算50%抑制率时药物的浓度即为该抗体的灵敏度。
[0070] 实施例4 :检测卡那霉素的化学发光试剂盒
[0071] (1)检测卡那霉素的化学发光试剂盒的组成
[0072] A，包被有卡那霉素单克隆抗体的固相载体（化学发光板）；
[0073] B，卡那霉素标准品溶液：0、0? 05、0. 15、0. 45、1. 35、4. 05ng/mL。
[0074] C，浓缩酶标卡那霉素-OVA溶液：用人工抗原（卡那霉素-OVA)与辣根过氧化物酶 偶联制备得到，使用时用稀释液稀释至工作浓度。
[0075] D，酶标卡那霉素-OVA稀释液：磷酸钠、NaCl缓冲溶液。
[0076] E，发光溶液:A液为鲁米诺、对甲苯酚溶液，B液过氧化氢脲溶液，使用时A液、B液 等体积混匀，现配现用。
[0077] F，2倍浓缩复溶液，使用时用双蒸水稀释至工作浓度。
[0078] G，20倍浓缩洗涤溶液：使用时用双蒸水稀释至工作浓度。
[0079] (2)化学发光板的制备
[0080] 用包被液将抗卡那霉素单克隆抗体稀释成5.0yg/mL，每孔加入100yL，37°C恒 温箱放置2h，倾去包被液，拍干，然后每孔加入封闭液150yL，37°C恒温箱放置2h，倾去孔 内液体，洗涤液洗涤一次，拍干，用锡箔纸真空密封保存。
[0081] 实施例5 :检测卡那霉素的化学发光试剂盒的应用
[0082] (1)试剂的配制
[0083] A，洗涤溶液：将试剂盒中提供的浓缩洗涤液用去离子水按1:19倍稀释后使用。
[0084] B，复溶工作液：将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲液用去离子水按1:1倍稀释后 使用。
[0085] C，化学发光溶液：使用前将A液与B液按体积比1:1混匀。
[0086] D，酶标抗原工作液：将酶标抗原稀释液和酶标抗原浓缩液按10:1体积比混合并 混匀。
[0087] (2)样品前处理
[0088] A，牛奶
[0089] 取50ul鲜牛奶样本加入950ul复溶工作液，涡动混匀。
[0090] B，奶粉
[0091] 称0. 5g+0. 05g奶粉样本，加入2. 5ml复溶工作液，涡动混匀；移取300ul加入 900ul复溶工作液，涡动混匀。
[0092] (3)检测步骤
[0093] A，加样：加标准品/样本50yL到对应的微孔中，再加入酶标抗原工作液50yL/ 孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应15min。
[0094] B，洗涤：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250yL/孔，充分洗涤5 次，每次间隔l〇s，用吸水纸拍干；
[0095] C，加发光溶液：每孔加入新配制的发光底物A、B液各100yL，震荡约30秒左右， 用盖板膜盖板后室温放置3min。
[0096] D，检测：直接放入微孔板发光分析仪内测量读数。
[0097] (4)结果判断
[0098] 所获得的标准品和样品发光强度值的平均值除以第一个标准（0标准）的发光强 度值再乘以100,以抑制率为纵坐标，卡那霉素浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样 品的浓度可以从标准曲线上读出。
[0099] 相对发光强度（％ ) =RLU/RL%，RLU是标准品或者样品溶液测定的发光强度值， RL%是空白（浓度为0的标准溶液）的发光强度值。
[0100] 实施例6 :试剂盒特异性试验
[0101] 以卡那霉素作为标准，设卡那霉素的交叉反应率为1〇〇%，用于抗体交叉反应性研 宄的药物均为与卡那霉素结构或者功能相似的药物：卡那霉素、链霉素、双氢链霉素、新霉 素。按试剂盒步骤操作，但加入的竞争物分别为不同的卡那霉素类似物，制作抑制曲线，根 据线性方程计算各竞争物50%抑制浓度（IC5(I)。交叉反应率（％CR)即为抗体对卡那霉素 的IC5(I与抗体对卡那霉素竞争物的1C5(|之比的百分数，按下式进行计算：
[0103] 结果列于表1 :
[0104] 表1卡那霉素试剂盒特异性试验
[0106] 实施例7 :试剂盒精密度和准确度试验
[0107] 分别以不同浓度的卡那霉素添加牛奶、奶粉样本进行添加回收试验，计算不同药 物在不同样本中得回收率，从而确定试剂盒的准确度，每个样本添加3个浓度，每个浓度添 加5个样本，抽取3个批次试剂盒进行试验。
[0108] 根据制定的标准曲线的线性方程进行回收率的定量计算，结果见下表2。
[0109] 表2卡那霉素试剂盒准确度试验
[0112] 从上述测定结果看，牛奶样本的回收率在89. 0%~100. 3%之间；奶粉样本的回 收率在81. 0%~105. 3%之间。总体批内变异系数在4. 9%~8. 0%之间，批间变异系数在 7. 3%~8. 6%之间。表明本试剂盒有很好的精密度和准确度。
【主权项】
1. 一种卡那霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的化学发光 板和设在盒体内的试剂；其特征在于，所述化学发光板的各孔包被有抗卡那霉素抗体；所 述试剂包括：酶标卡那霉素抗原浓缩液，酶标卡那霉素抗原稀释液，卡那霉素系列标准品溶 液，化学发光底物A、B液，浓缩洗涤液，浓缩复溶液。2. 根据权利要求1所述卡那霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述 化学发光板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光板。3. 根据权利要求1所述卡那霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述 酶标抗原是由卡那霉素半抗原与载体蛋白偶联得到，卡那霉素半抗原由卡那霉素和邻苯二 甲酸酐反应得到。4. 根据权利要求1所述卡那霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述 抗体包被浓度为5.Oyg/mL。5. 根据权利要求1所述卡那霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述 酶标卡那霉素抗原的工作浓度为1:4000。6. 根据权利要求1所述卡那霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述 卡那霉素抗体是由卡那霉素与牛血清蛋白偶合制成的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠 制备获得。7. 根据权利要求1所述卡那霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述 卡那霉素系列标准品溶液浓度分别为：〇、〇. 05、0. 15、0. 45、1. 35、4. 05ng/mL。8. 根据权利要求1所述卡那霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所 述浓缩复溶液具体为浓缩磷酸盐缓冲液，是每升含NaH2PO4 ? 2H20 5. 74g、Na2HPO4 ? 12H20 32. 6g的水溶液。9. 根据权利要求1所述卡那霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述 浓缩洗涤溶液是含有体积分数〇. 05%吐温-20的pH= 7. 4,0.lmol/L磷酸盐缓冲液。10. 根据权利要求1所述卡那霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述 化学发光液A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.OOlMpH= 8.8的三（羟甲基） 氨基甲烷溶液；B液为每IOOmL溶液含柠檬酸2.lg，无水Na2HPO4 2. 82g，0. 75 %的过氧化氢 脲0. 64mL的水溶液，所述百分比为质量百分比。
【专利摘要】本发明公开了一种卡那霉素的化学发光酶联免疫(CLEIA)检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的化学发光板和设在盒体内的试剂；其特征在于，所述化学发光板的各孔包被有抗卡那霉素抗体；所述试剂包括：酶标卡那霉素抗原浓缩液，酶标卡那霉素抗原稀释液，卡那霉素系列标准品溶液，化学发光底物A、B液，浓缩洗涤液，浓缩复溶液；本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有高灵敏度、简便快速、准确度高的特点，与传统的ELISA法比较，操作时间大幅度减少。可用作检测牛奶、奶粉中卡那霉素残留检测。
【IPC分类】G01N21/76, G01N33/577, G01N33/543
【公开号】CN104897650
【申请号】CN201410822130
【发明人】罗晓琴, 崔海峰, 王亚男, 陈超, 贾芳芳, 杨昌松, 彭鸽
【申请人】北京勤邦生物技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年12月25日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测卡那霉素的化学发光免疫检测试剂盒，用于检测牛奶、奶粉 中的卡那霉素含量或残留量。属于免疫学检测领域。
【背景技术】
[0002] 卡那霉素是一种高效、广谱的氨基糖苷类抗生素，在治疗由革兰氏菌引起的感染 方面具有许多优点，其在动物中广泛应用的一个主要后果就是在动物性食品中抗生素的非 法残留。如果长期摄入含有药物残留的动物性食品，这些药物就可在体内蓄积，产生慢性毒 害作用，氨基糖苷类抗生素均有潜在的耳毒性，可引起前庭功能障碍和听力永久丧失。
[0003] 目前，测定卡那霉素的主要方法是微生物法、高效液相色谱、酶联免疫吸附法等。 色谱技术是非常有效、准确、敏感的方法，但是待检样品需经一系列的预处理，繁琐费时，从 样品预处理到得出检验结果需要较长时间，检测费用很高；另一方面这种检测方法还必须 有昂贵的仪器设备，只有特定的专业人员才能应用，而且每次检测的样品有限，不适应大批 样品的筛查，严重阻碍了该检测方法的推广应用，更不适合于现场检验。与之相比，化学发 光免疫法具有快速、灵敏、方便、检测成本较低等特点，能最大限度地减少操作误差和工作 强度，是一种非常适合基层检测牛奶、奶粉中卡那霉素的筛选方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种卡那霉素的化学发光检测试剂盒。该试剂盒具有检测灵 敏度高、应用灵活、方便的特点，可用于牛奶、奶粉等样品中卡那霉素的残留量检测。
[0005] 为实现上述目的，本发明主要是利用抗原与抗体的特异性免疫反应的基本原理来 实现的。化学发光免疫分析法是化学发光法和免疫分析法结合的产物，因此同时具有化学 发光法的高灵敏性和免疫分析法的高特异性。在整个反应过程中，样品中卡那霉素含量越 高，反应体系中发光强度越弱；反之，样品中卡那霉素含量越少，发光强度越高。
[0006] 本发明的检测卡那霉素的化学发光免疫检测试剂盒含有盒体，设在盒体内的化学 发光板和设在盒体内的试剂。具体含有以下成分：
[0007] 包被有抗卡那霉素抗体的白色不透明96孔可拆卸或不可拆卸的聚苯乙烯化学发 光板。
[0008] 应用pH= 7. 4 0. 05mol/L的PBS溶液稀释卡那霉素纯品得到的卡那霉素系列标 准品溶液，浓度范围至少包含了 〇. 05~4. 05ng/mL的浓度区间。
[0009] 酶标抗原浓缩液：由卡那霉素与卵清蛋白偶合制成的人工抗原与辣根过氧化物酶 偶联制备得到。
[0010] 酶标抗原稀释液：pH7. 6的0. 01M的磷酸钠、0. 25M的NaCl溶液。
[0011] 发光底物液：发光底物液分为A、B液。A液为化学发光底物-鲁米诺和发光增强 剂-对甲苯酚溶液，B液为过氧化氢脲溶液。
[0012] 浓缩复溶液：浓缩复溶液具体为2倍浓缩磷酸盐缓冲液，使用前用双蒸水稀释至 工作浓度后使用，用于样品前处理。
[0013] 浓缩洗涤液：浓缩洗涤溶液具体为含有吐温-20 (Tween-20)缓冲液的20倍浓缩磷 酸盐缓冲液，使用前用双蒸水稀释至工作浓度后使用，用于实验过程中洗涤化学发光板。 [0014] 本发明溶液的配制：
[0015] 本发明试剂盒中涉及的卡那霉素标准品溶液、酶标卡那霉素抗原溶液、化学发光 溶液及洗涤溶液及其配方对本发明试剂盒检测的灵敏度影响很大；其中各溶液的主要成分 及其配制方法是：
[0016] 1、卡那霉素标准溶液：以常规方法将卡那霉素纯品用0. 05mol/L，pH= 7. 4的PBS 配制成浓度分别为〇、〇. 05、0. 15、0. 45、1. 35、4. 05ng/mL的卡那霉素标准溶液。
[0017] 2、酶标卡那霉素抗原溶液：用卡那霉素与偶联蛋白偶联制备的人工抗原与辣根过 氧化物酶偶联制备得到，将所得酶标卡那霉素抗原用酶标卡那霉素稀释液稀释成1:4000 的工作浓度。
[0018] 3、酶标抗原稀释液：为pH7. 6的磷酸钠为0? 01M、NaCl为0? 25M的缓冲溶液。
[0019] 4、化学发光溶液:A液为鲁米诺含量为0. 01M、对甲苯酚含量为0. 001MpH= 8. 8 的三（羟甲基）氨基甲烷溶液，B液为每100mL溶液含柠檬酸2.lg，无水Na2HP042. 82g， 0. 75%的过氧化氢脲0. 64mL的水溶液。
[0020] 5、浓缩复溶工作液：NaH2P04 ? 2H20 5. 74g、Na2HP04 ? 12H20 32. 6g溶于 1L的去离子 水中。
[0021] 6、浓缩洗涤溶液：按体积分数0. 05 %将吐温-20添加至pH= 7. 4,0.lmol/L磷酸 盐缓冲液中。
[0022] 7、包被溶液：1. 59g碳酸钠和2. 53g碳酸氢钠溶于1L水中，调节pH= 9. 5。
[0023] 8、封闭溶液配制：10gBSA溶于1L洗涤溶液中，再加入重量比为5%。的NaN3。
[0024] 本发明化学发光板的包被：
[0025] 本发明中包被化学发光板采用将抗卡那霉素抗体置于设定的包被溶液中，以设定 的浓度，在37 °C恒温箱中反应包被。
[0026] 本发明采用的是pH= 9. 5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液。本发明中微孔板中所 包被的抗卡那霉素抗体在碱性环境下可以很好的结合在微孔板塑料表面上，可以经受多次 洗板，采用的抗体包被浓度为5. 0yg/mL。
[0027] 包被好的微孔板可以用封闭溶液封闭，封闭液中惰性蛋白优选BSA，需加入似％防 止变质。
[0028] 酶标卡那霉素抗原溶液的制备：
[0029] 本发明中酶标卡那霉素抗原溶液浓度是决定本发明中卡那霉素化学发光检测试 剂盒测定范围及灵敏度的重要因素。
[0030] 本发明中涉及的酶标卡那霉素抗原溶液可以用酶标卡那霉素稀释液稀释成 1:4000的工作浓度。
[0031] 按照上述酶标卡那霉素抗原溶液浓度制备的试剂盒可以达到很好的线性范围 (标准线范围可以达到0. 05~4. 05ng/mL)和很好的灵敏度（IC5Q为0. 065ng/mL)。
[0032] 化学发光溶液的配制：
[0033] 所述化学发光液A液为鲁米诺含量为0. 01M、对甲苯酚含量为0. 001MpH= 8. 8的 三（羟甲基）氨基甲烷溶液，B液为lOOmL溶液含柠檬酸2.lg，无水Na2HP042. 82g，0. 75% 的过氧化氢脲0. 64mL的水溶液。所述鲁米诺为化学发光底物，对甲苯酚为发光增强剂。 [0034] 本发明的原理是将抗体-抗原反应的高度特异性与酶催化的高度灵敏性结合起 来，利用酶催化底物的化学发光反应检测产物浓度。
[0035] 本发明的化学发光检测试剂盒具有灵敏度高、简便快速、准确的特点，与传统的比 色ELISA法比较，灵敏度可以提高一个数量级。有望在牛奶、奶粉中的卡那霉素残留检测中 发挥重要作用。
【附图说明】
[0036] 图1为卡那霉素半抗原合成反应式。
[0037] 图2为卡那霉素半抗原核磁共振氢谱图。
[0038] 图3为本发明化学发光试剂盒工作曲线。
【具体实施方式】
[0039] 实施例1 :半抗原、抗原及单克隆抗体的制备
[0040] (1)卡那霉素半抗原合成
[0041] 1. 0g卡那霉素、0. 3g邻苯二甲酸酐和2ml吡啶在10mlDMF中的混合液，室温下搅 拌反应12小时，减压蒸除溶剂，乙醇中重结晶得到邻苯二甲酸单卡那霉素酰胺，得率53%。
[0042] 取上述产物经核磁共振氢谱测定，如图2所示，8.Oppm左右的芳香烃信号和 11.Oppm羧基峰信号的出现说明半抗原合成成功。
[0043] (2)免疫原（卡那霉素-BSA)的合成
[0044] 取20mg半抗原，溶解于lmLDMF中，取30mgEDC和NHS用0. 2ml水充分溶解后 于加入⑴中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A。称取BSA50mg，使之充分溶解在3. 8mL PBS(PH7. 2)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用0.Olmol/ 1PBS4度透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。分装，于-20°C保存备 用。
[0045] 称取半抗原20mg和OVA50mg，按上述步骤反应制备包被抗原，供酶标用。
[0046] (3)卡那霉素单克隆抗体的制备
[0047] A，动物免疫：用上述制备出的免疫原（卡那霉素-BSA)按100yg/只，以生理盐水 溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6~8周龄Balb/c雌鼠，初 次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3 天以免疫复合物100Ug/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。
[0048] B，细胞融合：按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨 髓瘤细胞（SP2/0)混合，然后在45秒内缓慢加入预热的融合剂（PEG4000)进行融合，用HAT 培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37°C，5 %C02培养箱中培 养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。
[0049] C，杂交瘤细胞的筛选：细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛 选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接ELISA方法，以包被抗原（预先用方阵法常规滴定其 最佳包被浓度和阳性血清稀释度）包被化学发光板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加 入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，OPD进行显色反应。筛选出的阳性孔再用间接竞争ELISA方 法筛选，先将细胞上清与l〇〇yg/mL的卡那霉素等体积混合，37°C水浴作用30min，再加入 到包被好的化学发光板中。同时用PBS取代卡那霉素作对照，其余步骤同上。若经卡那霉 素阻断后的〇D45(lnm值下降到对照孔的50%以下，则判为阳性，经2~3次检测都为阳性的 孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化。
[0050] D，单克隆抗体制备：将2~3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液 用间接ELISA测定效价，冻存；并取8~10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0. 5mL/只， 7~10日后腹腔注射杂交瘤细胞1~2X106/只，7~10日后抽取小鼠腹水，离心取上清， 测定效价，并冻存备用。
[0051] 实施例2 :酶标抗原的制备
[0052] A，称取2mgHRP溶解于0. 5mL双蒸水中；加入0. 5mL新配制的0. 06mol/L恥104溶 液，4°C避光作用30min;
[0053] B，加入 160mmol/L的乙二醇 0? 5mL，室温作用 30min;
[0054] C，加入卡那霉素-OVA2mg，混勾后装入处理过的透析袋中，置1000mL的0. 05m mol/L碳酸钠缓冲液中透析，4°C过夜；
[0055] D，透析液吸至10mL的离心管中，加0. 25 mL新配的5g/LNaBHjf，混匀后置4°C2h; 加入等体积的饱和硫酸按溶液，4°C作用30min，在4°C下3000rpm离心25min，弃上清；
[0056] E，将沉淀溶于 1. 5mL0? 02mol/LpH7. 4PBS中，吸入透析袋内，在 0? 02mol/LpH 7. 4PBS透析，4°C过夜（中途更换PBS3次）；
[0057] F，将透析液中液体吸至微量离心管中，4°C下lOOOOrpm离心30min，将上清液吸 出，加等量甘油，混匀，-20°C保存备用。
[0058] 实施例3 :CLEIA检测方法的建立
[0059] (1)包被抗体与酶标抗原浓度的优选（方阵法）
[0060] 纵向用每种包被抗体按 80. 0、40. 0、20. 0、10. 0、5. 0、2. 5、1. 25、0. 625yg/mL的系 列稀释度包被化学发光板，100yL/孔，置于37°C恒温箱2h后，拍干；以150yL/孔封闭溶 液封闭，37°C恒温箱放置2小时，洗板一次，拍干；加入50yL/孔一系列稀释的酶标卡那霉 素抗原（1:1000至1:512000)，室温（20~25°C)孵育15min，洗板五次，最后一次拍干；分 别加入50yL/孔的化学发光A、B液，测定发光强度值。以发光强度值随酶标抗原的浓度有 明显梯度变化的包被抗体浓度和酶标抗原稀释度为最佳浓度进行特异性测定。
[0061] ⑵抗体灵敏度的测定
[0062] 根据上述对包被抗体及酶标抗原浓度的优选实验，申请人选择并确定酶标抗原浓 度为1:4000,包被抗体浓度为5. 0yg/mL进行抗体的灵敏度的测定：
[0063] A，包被：用0. 05MpH= 9. 6的碳酸盐包被溶液将抗卡那霉素抗体配成5. 0yg/mL 的溶液，每个聚苯乙烯板化学发光板反应孔中加100uL，37°C恒温箱2h。弃去孔内溶液，拍 干。
[0064] B，封闭：用封闭溶液封闭上述已包被的化学发光板，150yL/孔，37°C恒温箱2h然 后洗板一次，拍干。
[0065]C，加样：加不同浓度的卡那霉素标准品溶液50yL/孔，再加入50yL/孔稀释的酶 标卡那霉素抗原（1:4000)于上述已封闭的反应孔中，室温（20~25°C)避光孵育15min， 然后洗板五次，最后一次拍干。
[0066] D，发光：于各反应孔中加入临时配制的化学发光溶液100yL/孔，反应3min后用 化学发光免疫分析仪检测。
[0067] E，检测结果以抑制率计算：
[0068] 相对发光强度（％ ) =RLU/RLU。，RLU是标准品或者样品溶液测定的发光强度值， RL%是空白（浓度为0的标准溶液）的发光强度值。
[0069] 计算50%抑制率时药物的浓度即为该抗体的灵敏度。
[0070] 实施例4 :检测卡那霉素的化学发光试剂盒
[0071] (1)检测卡那霉素的化学发光试剂盒的组成
[0072] A，包被有卡那霉素单克隆抗体的固相载体（化学发光板）；
[0073] B，卡那霉素标准品溶液：0、0? 05、0. 15、0. 45、1. 35、4. 05ng/mL。
[0074] C，浓缩酶标卡那霉素-OVA溶液：用人工抗原（卡那霉素-OVA)与辣根过氧化物酶 偶联制备得到，使用时用稀释液稀释至工作浓度。
[0075] D，酶标卡那霉素-OVA稀释液：磷酸钠、NaCl缓冲溶液。
[0076] E，发光溶液:A液为鲁米诺、对甲苯酚溶液，B液过氧化氢脲溶液，使用时A液、B液 等体积混匀，现配现用。
[0077] F，2倍浓缩复溶液，使用时用双蒸水稀释至工作浓度。
[0078] G，20倍浓缩洗涤溶液：使用时用双蒸水稀释至工作浓度。
[0079] (2)化学发光板的制备
[0080] 用包被液将抗卡那霉素单克隆抗体稀释成5.0yg/mL，每孔加入100yL，37°C恒 温箱放置2h，倾去包被液，拍干，然后每孔加入封闭液150yL，37°C恒温箱放置2h，倾去孔 内液体，洗涤液洗涤一次，拍干，用锡箔纸真空密封保存。
[0081] 实施例5 :检测卡那霉素的化学发光试剂盒的应用
[0082] (1)试剂的配制
[0083] A，洗涤溶液：将试剂盒中提供的浓缩洗涤液用去离子水按1:19倍稀释后使用。
[0084] B，复溶工作液：将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲液用去离子水按1:1倍稀释后 使用。
[0085] C，化学发光溶液：使用前将A液与B液按体积比1:1混匀。
[0086] D，酶标抗原工作液：将酶标抗原稀释液和酶标抗原浓缩液按10:1体积比混合并 混匀。
[0087] (2)样品前处理
[0088] A，牛奶
[0089] 取50ul鲜牛奶样本加入950ul复溶工作液，涡动混匀。
[0090] B，奶粉
[0091] 称0. 5g+0. 05g奶粉样本，加入2. 5ml复溶工作液，涡动混匀；移取300ul加入 900ul复溶工作液，涡动混匀。
[0092] (3)检测步骤
[0093] A，加样：加标准品/样本50yL到对应的微孔中，再加入酶标抗原工作液50yL/ 孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应15min。
[0094] B，洗涤：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250yL/孔，充分洗涤5 次，每次间隔l〇s，用吸水纸拍干；
[0095] C，加发光溶液：每孔加入新配制的发光底物A、B液各100yL，震荡约30秒左右， 用盖板膜盖板后室温放置3min。
[0096] D，检测：直接放入微孔板发光分析仪内测量读数。
[0097] (4)结果判断
[0098] 所获得的标准品和样品发光强度值的平均值除以第一个标准（0标准）的发光强 度值再乘以100,以抑制率为纵坐标，卡那霉素浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样 品的浓度可以从标准曲线上读出。
[0099] 相对发光强度（％ ) =RLU/RL%，RLU是标准品或者样品溶液测定的发光强度值， RL%是空白（浓度为0的标准溶液）的发光强度值。
[0100] 实施例6 :试剂盒特异性试验
[0101] 以卡那霉素作为标准，设卡那霉素的交叉反应率为1〇〇%，用于抗体交叉反应性研 宄的药物均为与卡那霉素结构或者功能相似的药物：卡那霉素、链霉素、双氢链霉素、新霉 素。按试剂盒步骤操作，但加入的竞争物分别为不同的卡那霉素类似物，制作抑制曲线，根 据线性方程计算各竞争物50%抑制浓度（IC5(I)。交叉反应率（％CR)即为抗体对卡那霉素 的IC5(I与抗体对卡那霉素竞争物的1C5(|之比的百分数，按下式进行计算：
[0103] 结果列于表1 :
[0104] 表1卡那霉素试剂盒特异性试验
[0106] 实施例7 :试剂盒精密度和准确度试验
[0107] 分别以不同浓度的卡那霉素添加牛奶、奶粉样本进行添加回收试验，计算不同药 物在不同样本中得回收率，从而确定试剂盒的准确度，每个样本添加3个浓度，每个浓度添 加5个样本，抽取3个批次试剂盒进行试验。
[0108] 根据制定的标准曲线的线性方程进行回收率的定量计算，结果见下表2。
[0109] 表2卡那霉素试剂盒准确度试验
[0112] 从上述测定结果看，牛奶样本的回收率在89. 0%~100. 3%之间；奶粉样本的回 收率在81. 0%~105. 3%之间。总体批内变异系数在4. 9%~8. 0%之间，批间变异系数在 7. 3%~8. 6%之间。表明本试剂盒有很好的精密度和准确度。
【主权项】
1. 一种卡那霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的化学发光 板和设在盒体内的试剂；其特征在于，所述化学发光板的各孔包被有抗卡那霉素抗体；所 述试剂包括：酶标卡那霉素抗原浓缩液，酶标卡那霉素抗原稀释液，卡那霉素系列标准品溶 液，化学发光底物A、B液，浓缩洗涤液，浓缩复溶液。2. 根据权利要求1所述卡那霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述 化学发光板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光板。3. 根据权利要求1所述卡那霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述 酶标抗原是由卡那霉素半抗原与载体蛋白偶联得到，卡那霉素半抗原由卡那霉素和邻苯二 甲酸酐反应得到。4. 根据权利要求1所述卡那霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述 抗体包被浓度为5.Oyg/mL。5. 根据权利要求1所述卡那霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述 酶标卡那霉素抗原的工作浓度为1:4000。6. 根据权利要求1所述卡那霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述 卡那霉素抗体是由卡那霉素与牛血清蛋白偶合制成的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠 制备获得。7. 根据权利要求1所述卡那霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述 卡那霉素系列标准品溶液浓度分别为：〇、〇. 05、0. 15、0. 45、1. 35、4. 05ng/mL。8. 根据权利要求1所述卡那霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所 述浓缩复溶液具体为浓缩磷酸盐缓冲液，是每升含NaH2PO4 ? 2H20 5. 74g、Na2HPO4 ? 12H20 32. 6g的水溶液。9. 根据权利要求1所述卡那霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述 浓缩洗涤溶液是含有体积分数〇. 05%吐温-20的pH= 7. 4,0.lmol/L磷酸盐缓冲液。10. 根据权利要求1所述卡那霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述 化学发光液A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.OOlMpH= 8.8的三（羟甲基） 氨基甲烷溶液；B液为每IOOmL溶液含柠檬酸2.lg，无水Na2HPO4 2. 82g，0. 75 %的过氧化氢 脲0. 64mL的水溶液，所述百分比为质量百分比。
【专利摘要】本发明公开了一种卡那霉素的化学发光酶联免疫(CLEIA)检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的化学发光板和设在盒体内的试剂；其特征在于，所述化学发光板的各孔包被有抗卡那霉素抗体；所述试剂包括：酶标卡那霉素抗原浓缩液，酶标卡那霉素抗原稀释液，卡那霉素系列标准品溶液，化学发光底物A、B液，浓缩洗涤液，浓缩复溶液；本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有高灵敏度、简便快速、准确度高的特点，与传统的ELISA法比较，操作时间大幅度减少。可用作检测牛奶、奶粉中卡那霉素残留检测。
【IPC分类】G01N21/76, G01N33/577, G01N33/543
【公开号】CN104897650
【申请号】CN201410822130
【发明人】罗晓琴, 崔海峰, 王亚男, 陈超, 贾芳芳, 杨昌松, 彭鸽
【申请人】北京勤邦生物技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年12月25日
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