电化学发光电极阵列的制备和修饰方法
电化学发光电极阵列的制备和修饰方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及在生物检测技术领域中使用的一种电化学发光微阵列芯片的电极制 备以及表面修饰方法。
【背景技术】
[0002] 电化学发光（electrochemiluminescence)是在电化学反应和化学发光现象的结 合产物。在化学反应过程中，分子由于吸收了化学反应所释放的能量而产生所谓"能量跃 迀"，由基态转化为不稳定的激发态。当分子从激发态重新衰变成基态时释放出光子即产生 化学发光现象。电化学发光又被称为电至化学发光，与普通化学发光不同的是，电化学发光 依赖在激发电极表面产生的氧化还原反应。在目前最常用的三丙胺-吡啶钌电化学发光体 系中，化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2 +和电子供体三丙胺（TPA)在阳极表面分别被氧 化成[Ru(bpy)3]3+和TPA+'TPA+?很不稳定，很容易失去一个质子（H+)而形成强还原剂 TPA?。当[Ru(bpy)3]3+和TPA?发生氧化还原反应时，[Ru(bpy) 3]3+被TPA?还原形成激 发态的二价[Ru(bpy)3]2+-，TPA?被氧化成二丙胺和丙醛。接着激发态的[Ru(bpy)3]2+?衰 减成基态的[Ru(bpy)3]2+，同时发射一个波长为614nm的光子。在三丙胺-吡啶钌电化学 发光体系中，发光分子三联吡啶钌在电极表面周而复始地进行基态_激发态-基态的能量 转移，产生大量光子。
[0003] 反应电极是参与电化学发光反应的主要控制因素之一。目前最常用的电化学发光 检测电极主要采用金、银、碳、导电玻璃等导电材质，通过对电极进行复杂的表面修饰来增 强电极对发生在其表面附近的化学反应的催化能力，从而提高光信号强度。
[0004] 与普通化学发光相比，电化学发光具有试剂稳定性好、反应容易控制、试验结果重 复性好等优点，但是电化学发光相对而言反应更加复杂，尤其是对于激发电极的制作和修 饰对于检测数值的稳定性异常重要。为提高检测灵敏度和降低变异系数（Coefficientof Variation)，通常需要对电极表面做许多修饰以改善捕获探针装载密度、均匀度、以及自由 度等参数。
[0005] 在微阵列芯片领域针式点样法和液珠喷点法是目前最常用的捕获探针加载方法， 然而，对于电化学发光微阵列而言，上述方法常常导致所加载的试剂在电极表面分布不均 匀，并且这些方法均需要采购昂贵的专用微阵列点样设备。这导致目前电化学发光微阵列 检测方法无法向普通化学发光微阵列检测方法那样被广泛应用。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是在电化学发光微阵列电极制备和修饰领域提供一 种简易高效的电极阵列制备和修饰方法。其具有设备制作使用简单、耗材成本低、操作方 便、检测结果重复性好等优点。
[0007] 本发明采用的技术方案为：（1)在电极阵列中，采用带圆弧顶角的方形电极结构 使电极表面积最大化并减少尖角效应；（2 )采用同步法用配体或接枝分子修饰电极阵列中 的每一个电极表面以获得均一的电极表面；（3)使用印痕法在电极表面加载捕获探针分 子，加载捕获探针印痕时，可采用逐次加载法或并行加载法；（4)采用较大的电极表面和相 对较小的相似形印模，使每个电极表面均可获得一个完整的捕获探针印痕，以提高反应的 均一性。（5)对电极进行充分的封闭处理以降低非特异性吸附。（电极阵列及捕获探针印痕 样式参见图1、图2)。
[0008] 当固定在电极表面的探针捕捉住待检目标分子-电化学发光标记物复合物时，电 化学发光反应体系在反应电极表面进行电化学发光反应产生光信号，用光电倍增管（PMT) 检测所产生的光信号。
[0009] 所述的电极阵列是指：由多个带圆弧顶角的方形电极纵横整齐排列形成的电极组 阵列，其中每个电极的表面积为〇. 25~25mm2,各电极之间的间距为0. 2~2mm。
[0010] 所述的同步法电极表面修饰是指：将电极阵列用同一批次试剂同时进行修饰处 理。
[0011] 所述的配体包括：生物素、亲和素、链霉亲和素、抗抗体、以及分子印迹聚合物 (MolecularImprintedPolymer，MIP)〇
[0012] 所述的接枝分子组分包括：马来酸酐（Maleicanhydride)，2-丙稀酰胺基-2-甲 基丙横酸（2Acrylamido-2-MethylPropaneSulfonicAcid)，纤维素，聚乙稀醇 (Polyvinylalcohol)，聚乙二醇二稀丙基酿（PolyethyleneGlycolDiallylEther)，聚乙 稀P比略烧酮-醋酸乙稀醋共聚物（Polyvinylpyrrolidone-vinylacetatecopolymer)，聚 丙稀酸（Polyacrylicacid)、聚甲基丙稀酸缩水甘油醋（Glycidylmethacrylate)。
[0013] 所述的捕获探针分子包括：生物素、亲和素、捕获抗体、肽核酸（P印tideNucleic Acid)探针或核酸探针。其中核酸探针包括基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、cRNA探 针以及寡核苷酸探针。
[0014] 所述的逐次加载法或并行加载法为：在电极阵列的每个电极表面依次逐个加载捕 获探针印痕或采用与整个电极阵列对应的印模一次性在每个电极上同时加载捕获探针印 痕。
[0015] 所述的电化学发光标记物为鲁米诺及其衍生物或三联吡啶钌衍生物。
[0016] 所述的电化学发光反应体系包括：鲁米诺体系、吡啶钌体系。鲁米诺体系中电化学 发光标记物为鲁米诺及其衍生物，缓冲溶液含：1.〇mM3. 0mMH202,0. 05MNa2C03-NaHC03， pH811。吡啶钌体系中电化学发光标记物为三联吡啶钌衍生物，缓冲溶液含：0. 03mM2.0 mM二丁基乙醇胺（DBAE)，0. 05M磷酸缓冲液，pH69。
[0017] 本发明的原理如下： 在电化学发光检测过程中，电化学发光反应体系在电极表面产生电至氧化_还原反 应，进而通过"跃迀-衰变"过程产生电化学发光。在其它条件相同的情况下，发光强度与 电极表面有效面积和所加载的捕获探针分子密度呈正相关性。所以电极表面有效面积大小 和捕获探针分子密度的变化将导致发光值的变化，从而导致检测结果不稳定。
[0018] 现在常用的微阵列点阵方法，无论是针式点样法还是喷液式点样法，均无法保证 电极表面有效面积的均一性。针式点样法由于点样面与电极表面产生刚性接触，比较容易 受到电极表面平整度和表面糙度的影响，同时针式点样法不适合面积较大的电极。喷液式 点样法易受温、湿度的影响，同时，由于在电极表面的流动性较大，容易受电极表面浸润性 的影响，从而导致试剂在电极表面分布不均匀。
[0019] 相对而言，本发明由于采用与电极表面形状相似且小于电极表面的柔性点样面， 所以具有以下优点：（1)点样面与电极表面接触紧密，受电极表面形状影响小；（2)点样 面的大小确定电极有效面积的大小，从而确保电极有效面积的一致性；（3 )由于点样面与 电极表面形状相似且小于电极表面，因此对于点样过程中的印痕位置具有较好的容错度； (4)点样面与电极表面可以有较长的接触时间，可有效降低试液在电极表面的流动性，提 高试剂在电极表面分布的均匀度。此外，采用同步法用配体或接枝分子修饰微阵列中的每 一个电极表面不仅可以获得均一的电极表面性状，还可提高捕获探针在电极表面的加载密 度，从而提高检测灵敏度。
[0020] 本发明所采用的方法不仅可以提高电化学发光检测结果的稳定性和灵敏度，而且 不需要购买昂贵的设备，操作简单易行，使用成本大大降低。
【附图说明】
[0021] 图1是加载捕获探针印痕前的电极阵列样式示意图。
[0022] 图2是加载捕获探针印痕后的电极阵列样式示意图。
【具体实施方式】
[0023] 具体实施例一 电极阵列的制备：电极电路采用单层或多层印刷电路板制备，电极可以用金浆、银浆、 或碳浆材料，采用低温丝网印刷方法制备电极阵列。以下用超细银浆低温银浆低温丝网印 刷法为例，陈述电极阵列的制备方法： (1) 基板的制备：按照设计的电路布线采用单层或多层印刷电路板工艺制备； (2) 超细银粉的制备：用离子水溶解硝酸银，使硝酸银浓度为100g/L;加入碳酸钠溶 液沉淀出Ag2C03;室温下调节pH值至8. 5左右、在搅拌下加入甲醛还原，得超细银粉；将银 粉用去离子水清洗干净，添加分散剂，在低温下烘干、筛滤备用； (3)银粉的表面处理：以多元醇为分散剂，按质量比配备相应数量的钢球，用卧式球磨 机球磨72~96小时，得到片状银粉，将片状银粉用去离子水清洗干净，添加分散剂，在低温 下烘干、筛滤备用； (4) 低温银浆制备：以聚氨酯为固化树脂，将聚氨酯溶解于适量溶剂中，配制成浓度为 25%的树脂溶液；将银粉与树脂溶液按照6: 1的比例（重量比）混合；加入溶剂和助剂，其中 溶剂包括：丁基溶酐乙酸酯、二乙二醇丁醚醋酸酯、二甘醇乙醚醋酸酯、异佛尔酮，助剂为常 见防氧化剂和稳定剂；于三辊机上混炼至浆料细度为2~4ym; (5) 低温银浆丝网印刷：采用300~420目聚酯丝网或不锈钢丝网网板，网板乳胶厚度 10~12ym，胶刮硬度60至70度；采用高温固化，110°C烘烤30~60分钟； (6) 电极阵列切割：按照设计尺寸制备电极阵列，电极阵列中的每个电极均为大小、形 状相同的带圆弧顶角的正方形或长方形，单个电极的表面积为〇. 25~25mm2,相邻电极之 间的间距为0. 2~2mm;印制好的电极阵列用模具精确切割备用。
[0024] 具体实施例二 印模制备： 用表面接枝改性的聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS)软硅胶材料，按 照设计模式（pattern)和尺寸，通过软光刻技术制备印模。印模形状与对应的微阵列电极 相似，尺寸小于对应的电极，其中点与对应的电极中点精确重合；印模表面积为〇. 20~20 mm2； (1) 印模制备流程：绘制掩膜版图一用激光打印机（12000dpi)在透明胶片上打印光 刻掩膜板一通过高精度光刻制作SU-8模具一进行PDMS预聚体和固化剂的混合、浇注、 固化、键合一表面接枝改性； (2) SU-8 2100光刻步骤：清洗衬底；将衬底在200°C烘干30分钟；在基片表面旋涂 1~5mm的SU-8 2100胶；用热板对SU-8胶进行前烘处理，然后在热板上缓慢冷却；在紫 外光刻机上进行接触式曝光；经过曝光处理的SU-8 2100胶在热板上进行后烘热处理，由 于交联的SU-8胶内应力较大，所以加热必须缓慢，冷却应在热板上随热板冷却到室温；将 交联的SU-8 2100胶结构进行超声显影，得到光刻胶图形；将SU-8 2100胶结构在150°C~ 200°C下在热板上进行固化； (3)PDMS印模制备：将PDMS预聚体和固化剂以10 : 1的比例充分混合，抽真空除气； 将混合的PDMS预聚体胶液浇注于SU-8 2100模具上；置85°C热板或烘箱中加热60分钟 进行固化；将固化的PDMS从模具上揭下，放入等离子清洗机中进行等离子处理（待接枝 改性面向上），处理参数为：抽真空5分钟，处理时间45秒；将等离子处理后的PDMS芯 片马上置于水或极性有机溶剂环境中保存可以长期保持PDMS芯片表面的亲水性； (4) PDMS印模亲水性表面接枝改性：TOMS印模采用等离子体处理在硅橡胶表面形成 反应性官能团；将PDMS印模待接枝表面浸入聚乙二醇接枝交联剂聚乙二醇二烯丙基醚 (PolyethyleneGlycolDiallylEther)，并放入85°C热板或烘箱中加热30~60分钟； 取出PDMS印模，在140°C烘箱中热处理5~30分钟；用去离子水清洗干净备用。
[0025] 具体实施例三 电化学发光电极阵列亲和素和链霉亲和素修饰方法：采用所制备的电化学发光电极阵 列，在碱性条件下将亲和素或链霉亲和素通过物理吸附固定在微阵列电极表面，具体步骤 如下：（1)用天平分别秤取Na2C03 1. 5克，NaHC03 2. 93克，用蒸馏水稀释至1000毫升， 配置成〇? 05摩尔/升pH9. 6碳酸缓冲液，4°C，保存。（2)用0? 05摩尔/升pH9. 6碳酸 缓冲液稀释亲和素或链霉亲和素，至终浓度为1~10微克/微升。（3)在微阵列反应腔 中加入200~400微升稀释后的亲和素或链霉亲和素溶液，37°C温育1小时，4°C冰箱放置 8~12小时。（4)用纯净水反复清洗微阵列反应腔三次，最后用吸水纸吸干残留液体，4°C 备用。
[0026] 具体实施例四 电化学发光微阵列寡核苷酸探针修饰方法：采用紫外交联将寡核苷酸探针固定在微阵 列电极表面，具体步骤如下：（1)探针稀释：将5'端带多聚胸腺嘧啶结构的寡核苷酸探针溶 于50%二甲基桠楓缓冲液(寡核苷酸探针终浓度为10~20微摩尔）。（2)按照设计模式， 用PDMS印模将稀释后的单链寡核苷酸DNA探针印痕加载到相应的电极表面，50摄氏度烘 干。（3)将烘干的微阵列放入254纳米波长紫外交联设备中反应3~5min进行探针固定。 (4)用纯净水加满反应孔，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上吸干残留 液体，50摄氏度烘干后备用。
[0027] 具体实施例五 生物素法电化学发光抗原检测：将待检抗原用0.05摩尔/升pH7. 6磷酸盐缓冲液按 1:1稀释；分别取100微升稀释的待检抗原、50微升联吡啶钌标记的二抗、50微升生物素标 记的一抗加入用亲和素或链霉亲和素预修饰的电化学发光电极阵列反应腔中，37°C温育2 小时；用纯净水清洗三次，最后用吸水纸吸干残留液体；在微阵列反应腔中加入200~400 微升吡啶钌电化学发光反应体系缓冲溶（0.03mM2.0mM二丁基乙醇胺，0.05M磷酸缓冲 液，pH69)，放入电化学发光检测设备检测电化学发光值。
[0028] 具体实施例六 PCR产物的电化学发光检测步骤： (1)PCR扩增体系： 在0. 2mLPCR反应管中加入下列成分至终体积50yL: 10yL模板DNA5yL10XPCR缓冲液 1.5yL50mMMgC12 1yL10mMdNTP混合物 1yL标记联吡啶钌的上游混合扩增引物（10yM) 1yL标记联吡啶钌的下游混合扩增引物（10yM) 0.5ylTaqDNA聚合酶（5U/yL) 加灭菌蒸馏水至总体积50yL; (2) PCR反应条件： 94°C，2分钟 94°C，25 秒
72。。，40 秒 72°C，5 分钟； (3) 杂交体系： 杂交缓冲液：20XSSC(3.0MNaCl，0.3M柠檬酸钠，pH7.08.0); 0. 1微摩尔PCR扩增产物55ML20XSSC 25ML 1%SDS 10ML 总反应体积 100ML (4) 杂交程序： a. 取经过寡核苷酸探针修饰的电化学发光电极阵列，在反应腔中加入上述杂交体系 反应液200400ML，100°C加热5分钟，然后快速冷却至室温。58°C保温1小时； b. 在反应腔中加200400ML0. 2XSSC和0. 1%SDS，置42°C5分钟清洗2次； c. 倒尽板孔中溶液，用纯净水加满反应孔，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置 在吸水纸上吸干残留液体； d.每孔加入200微升吡啶钌电化学发光反应体系缓冲溶（0. 03mM2. 0mM二丁基乙醇 胺，0.05M磷酸缓冲液，pH69)，放入采用悬浮式电极的电化学发光检测设备检测电化学 发光值。
【主权项】
1. 本发明涉及在生物检测技术领域中使用的一种电化学发光微阵列芯片的电极制备 以及修饰方法，其特征在于：电极阵列中的每个电极均为大小、形状相同的带圆弧顶角的正 方形或长方形，单个电极的表面积为0. 25~25 mm2,相邻电极之间的间距为0. 2~2 mm。2. 根据权利要求1所述的电化学发光检测方法，其特征在于：采用同步法用配体或 接枝交联分子修饰微阵列中的每一个电极表面以获得简单、快速、高效的加工工艺流程和 均一的电极表面一一所述的同步法是指将电极阵列用同一批次试剂同时进行修饰处理， 所述的配体包括生物素、亲和素、链霉亲和素、抗抗体、以及分子印迹聚合物（Molecular ImprintedPolymer，MIP)〇3. 根据权利要求I、2所述的电化学发光检测方法，其特征在于：使用印痕法在电极表 面加载捕获探针分子，加载印痕时，可采用逐次加载法或并行加载法。4. 所述的捕获探针分子包括：生物素、亲和素、捕获抗体、受体、分子印迹聚合物、肽核 酸（Peptide Nucleic Acid)探针或核酸探针。5.其中核酸探针包括基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、cRNA探针以及寡核苷酸 探针。6. 根据权利要求1、2所述的电化学发光检测方法，其特征在于：使用经过表面接枝改 性的聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS)印模，以印痕法在电极表面上加载捕 获探针印痕，印模形状与对应的微阵列电极相似，尺寸小于对应的电极，其中点与对应的电 极中点重合，使每个电极表面均可获得一个完整的捕获探针印痕。
【专利摘要】本发明所要解决的技术问题是提供一种简易高效的电化学发光电极阵列的制备以及电极表面修饰方法，它采用带圆弧顶角的方形电极结构使电极表面积最大化并减少尖角效应，用同步法以配体或接枝分子修饰电极阵列中的每一个电极表面，用印痕法在电极表面加载捕获探针分子，使电极阵列具有更好的一致性，本发明具有设备制作使用简单、耗材成本低、操作方便、检测结果重复性好等优点。
【IPC分类】G01N27/327
【公开号】CN104897758
【申请号】CN201510360195
【发明人】王利兵, 彭梓, 吴志鹏
【申请人】王利兵, 吴志鹏
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月26日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及在生物检测技术领域中使用的一种电化学发光微阵列芯片的电极制 备以及表面修饰方法。
【背景技术】
[0002] 电化学发光（electrochemiluminescence)是在电化学反应和化学发光现象的结 合产物。在化学反应过程中，分子由于吸收了化学反应所释放的能量而产生所谓"能量跃 迀"，由基态转化为不稳定的激发态。当分子从激发态重新衰变成基态时释放出光子即产生 化学发光现象。电化学发光又被称为电至化学发光，与普通化学发光不同的是，电化学发光 依赖在激发电极表面产生的氧化还原反应。在目前最常用的三丙胺-吡啶钌电化学发光体 系中，化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2 +和电子供体三丙胺（TPA)在阳极表面分别被氧 化成[Ru(bpy)3]3+和TPA+'TPA+?很不稳定，很容易失去一个质子（H+)而形成强还原剂 TPA?。当[Ru(bpy)3]3+和TPA?发生氧化还原反应时，[Ru(bpy) 3]3+被TPA?还原形成激 发态的二价[Ru(bpy)3]2+-，TPA?被氧化成二丙胺和丙醛。接着激发态的[Ru(bpy)3]2+?衰 减成基态的[Ru(bpy)3]2+，同时发射一个波长为614nm的光子。在三丙胺-吡啶钌电化学 发光体系中，发光分子三联吡啶钌在电极表面周而复始地进行基态_激发态-基态的能量 转移，产生大量光子。
[0003] 反应电极是参与电化学发光反应的主要控制因素之一。目前最常用的电化学发光 检测电极主要采用金、银、碳、导电玻璃等导电材质，通过对电极进行复杂的表面修饰来增 强电极对发生在其表面附近的化学反应的催化能力，从而提高光信号强度。
[0004] 与普通化学发光相比，电化学发光具有试剂稳定性好、反应容易控制、试验结果重 复性好等优点，但是电化学发光相对而言反应更加复杂，尤其是对于激发电极的制作和修 饰对于检测数值的稳定性异常重要。为提高检测灵敏度和降低变异系数（Coefficientof Variation)，通常需要对电极表面做许多修饰以改善捕获探针装载密度、均匀度、以及自由 度等参数。
[0005] 在微阵列芯片领域针式点样法和液珠喷点法是目前最常用的捕获探针加载方法， 然而，对于电化学发光微阵列而言，上述方法常常导致所加载的试剂在电极表面分布不均 匀，并且这些方法均需要采购昂贵的专用微阵列点样设备。这导致目前电化学发光微阵列 检测方法无法向普通化学发光微阵列检测方法那样被广泛应用。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是在电化学发光微阵列电极制备和修饰领域提供一 种简易高效的电极阵列制备和修饰方法。其具有设备制作使用简单、耗材成本低、操作方 便、检测结果重复性好等优点。
[0007] 本发明采用的技术方案为：（1)在电极阵列中，采用带圆弧顶角的方形电极结构 使电极表面积最大化并减少尖角效应；（2 )采用同步法用配体或接枝分子修饰电极阵列中 的每一个电极表面以获得均一的电极表面；（3)使用印痕法在电极表面加载捕获探针分 子，加载捕获探针印痕时，可采用逐次加载法或并行加载法；（4)采用较大的电极表面和相 对较小的相似形印模，使每个电极表面均可获得一个完整的捕获探针印痕，以提高反应的 均一性。（5)对电极进行充分的封闭处理以降低非特异性吸附。（电极阵列及捕获探针印痕 样式参见图1、图2)。
[0008] 当固定在电极表面的探针捕捉住待检目标分子-电化学发光标记物复合物时，电 化学发光反应体系在反应电极表面进行电化学发光反应产生光信号，用光电倍增管（PMT) 检测所产生的光信号。
[0009] 所述的电极阵列是指：由多个带圆弧顶角的方形电极纵横整齐排列形成的电极组 阵列，其中每个电极的表面积为〇. 25~25mm2,各电极之间的间距为0. 2~2mm。
[0010] 所述的同步法电极表面修饰是指：将电极阵列用同一批次试剂同时进行修饰处 理。
[0011] 所述的配体包括：生物素、亲和素、链霉亲和素、抗抗体、以及分子印迹聚合物 (MolecularImprintedPolymer，MIP)〇
[0012] 所述的接枝分子组分包括：马来酸酐（Maleicanhydride)，2-丙稀酰胺基-2-甲 基丙横酸（2Acrylamido-2-MethylPropaneSulfonicAcid)，纤维素，聚乙稀醇 (Polyvinylalcohol)，聚乙二醇二稀丙基酿（PolyethyleneGlycolDiallylEther)，聚乙 稀P比略烧酮-醋酸乙稀醋共聚物（Polyvinylpyrrolidone-vinylacetatecopolymer)，聚 丙稀酸（Polyacrylicacid)、聚甲基丙稀酸缩水甘油醋（Glycidylmethacrylate)。
[0013] 所述的捕获探针分子包括：生物素、亲和素、捕获抗体、肽核酸（P印tideNucleic Acid)探针或核酸探针。其中核酸探针包括基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、cRNA探 针以及寡核苷酸探针。
[0014] 所述的逐次加载法或并行加载法为：在电极阵列的每个电极表面依次逐个加载捕 获探针印痕或采用与整个电极阵列对应的印模一次性在每个电极上同时加载捕获探针印 痕。
[0015] 所述的电化学发光标记物为鲁米诺及其衍生物或三联吡啶钌衍生物。
[0016] 所述的电化学发光反应体系包括：鲁米诺体系、吡啶钌体系。鲁米诺体系中电化学 发光标记物为鲁米诺及其衍生物，缓冲溶液含：1.〇mM3. 0mMH202,0. 05MNa2C03-NaHC03， pH811。吡啶钌体系中电化学发光标记物为三联吡啶钌衍生物，缓冲溶液含：0. 03mM2.0 mM二丁基乙醇胺（DBAE)，0. 05M磷酸缓冲液，pH69。
[0017] 本发明的原理如下： 在电化学发光检测过程中，电化学发光反应体系在电极表面产生电至氧化_还原反 应，进而通过"跃迀-衰变"过程产生电化学发光。在其它条件相同的情况下，发光强度与 电极表面有效面积和所加载的捕获探针分子密度呈正相关性。所以电极表面有效面积大小 和捕获探针分子密度的变化将导致发光值的变化，从而导致检测结果不稳定。
[0018] 现在常用的微阵列点阵方法，无论是针式点样法还是喷液式点样法，均无法保证 电极表面有效面积的均一性。针式点样法由于点样面与电极表面产生刚性接触，比较容易 受到电极表面平整度和表面糙度的影响，同时针式点样法不适合面积较大的电极。喷液式 点样法易受温、湿度的影响，同时，由于在电极表面的流动性较大，容易受电极表面浸润性 的影响，从而导致试剂在电极表面分布不均匀。
[0019] 相对而言，本发明由于采用与电极表面形状相似且小于电极表面的柔性点样面， 所以具有以下优点：（1)点样面与电极表面接触紧密，受电极表面形状影响小；（2)点样 面的大小确定电极有效面积的大小，从而确保电极有效面积的一致性；（3 )由于点样面与 电极表面形状相似且小于电极表面，因此对于点样过程中的印痕位置具有较好的容错度； (4)点样面与电极表面可以有较长的接触时间，可有效降低试液在电极表面的流动性，提 高试剂在电极表面分布的均匀度。此外，采用同步法用配体或接枝分子修饰微阵列中的每 一个电极表面不仅可以获得均一的电极表面性状，还可提高捕获探针在电极表面的加载密 度，从而提高检测灵敏度。
[0020] 本发明所采用的方法不仅可以提高电化学发光检测结果的稳定性和灵敏度，而且 不需要购买昂贵的设备，操作简单易行，使用成本大大降低。
【附图说明】
[0021] 图1是加载捕获探针印痕前的电极阵列样式示意图。
[0022] 图2是加载捕获探针印痕后的电极阵列样式示意图。
【具体实施方式】
[0023] 具体实施例一 电极阵列的制备：电极电路采用单层或多层印刷电路板制备，电极可以用金浆、银浆、 或碳浆材料，采用低温丝网印刷方法制备电极阵列。以下用超细银浆低温银浆低温丝网印 刷法为例，陈述电极阵列的制备方法： (1) 基板的制备：按照设计的电路布线采用单层或多层印刷电路板工艺制备； (2) 超细银粉的制备：用离子水溶解硝酸银，使硝酸银浓度为100g/L;加入碳酸钠溶 液沉淀出Ag2C03;室温下调节pH值至8. 5左右、在搅拌下加入甲醛还原，得超细银粉；将银 粉用去离子水清洗干净，添加分散剂，在低温下烘干、筛滤备用； (3)银粉的表面处理：以多元醇为分散剂，按质量比配备相应数量的钢球，用卧式球磨 机球磨72~96小时，得到片状银粉，将片状银粉用去离子水清洗干净，添加分散剂，在低温 下烘干、筛滤备用； (4) 低温银浆制备：以聚氨酯为固化树脂，将聚氨酯溶解于适量溶剂中，配制成浓度为 25%的树脂溶液；将银粉与树脂溶液按照6: 1的比例（重量比）混合；加入溶剂和助剂，其中 溶剂包括：丁基溶酐乙酸酯、二乙二醇丁醚醋酸酯、二甘醇乙醚醋酸酯、异佛尔酮，助剂为常 见防氧化剂和稳定剂；于三辊机上混炼至浆料细度为2~4ym; (5) 低温银浆丝网印刷：采用300~420目聚酯丝网或不锈钢丝网网板，网板乳胶厚度 10~12ym，胶刮硬度60至70度；采用高温固化，110°C烘烤30~60分钟； (6) 电极阵列切割：按照设计尺寸制备电极阵列，电极阵列中的每个电极均为大小、形 状相同的带圆弧顶角的正方形或长方形，单个电极的表面积为〇. 25~25mm2,相邻电极之 间的间距为0. 2~2mm;印制好的电极阵列用模具精确切割备用。
[0024] 具体实施例二 印模制备： 用表面接枝改性的聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS)软硅胶材料，按 照设计模式（pattern)和尺寸，通过软光刻技术制备印模。印模形状与对应的微阵列电极 相似，尺寸小于对应的电极，其中点与对应的电极中点精确重合；印模表面积为〇. 20~20 mm2； (1) 印模制备流程：绘制掩膜版图一用激光打印机（12000dpi)在透明胶片上打印光 刻掩膜板一通过高精度光刻制作SU-8模具一进行PDMS预聚体和固化剂的混合、浇注、 固化、键合一表面接枝改性； (2) SU-8 2100光刻步骤：清洗衬底；将衬底在200°C烘干30分钟；在基片表面旋涂 1~5mm的SU-8 2100胶；用热板对SU-8胶进行前烘处理，然后在热板上缓慢冷却；在紫 外光刻机上进行接触式曝光；经过曝光处理的SU-8 2100胶在热板上进行后烘热处理，由 于交联的SU-8胶内应力较大，所以加热必须缓慢，冷却应在热板上随热板冷却到室温；将 交联的SU-8 2100胶结构进行超声显影，得到光刻胶图形；将SU-8 2100胶结构在150°C~ 200°C下在热板上进行固化； (3)PDMS印模制备：将PDMS预聚体和固化剂以10 : 1的比例充分混合，抽真空除气； 将混合的PDMS预聚体胶液浇注于SU-8 2100模具上；置85°C热板或烘箱中加热60分钟 进行固化；将固化的PDMS从模具上揭下，放入等离子清洗机中进行等离子处理（待接枝 改性面向上），处理参数为：抽真空5分钟，处理时间45秒；将等离子处理后的PDMS芯 片马上置于水或极性有机溶剂环境中保存可以长期保持PDMS芯片表面的亲水性； (4) PDMS印模亲水性表面接枝改性：TOMS印模采用等离子体处理在硅橡胶表面形成 反应性官能团；将PDMS印模待接枝表面浸入聚乙二醇接枝交联剂聚乙二醇二烯丙基醚 (PolyethyleneGlycolDiallylEther)，并放入85°C热板或烘箱中加热30~60分钟； 取出PDMS印模，在140°C烘箱中热处理5~30分钟；用去离子水清洗干净备用。
[0025] 具体实施例三 电化学发光电极阵列亲和素和链霉亲和素修饰方法：采用所制备的电化学发光电极阵 列，在碱性条件下将亲和素或链霉亲和素通过物理吸附固定在微阵列电极表面，具体步骤 如下：（1)用天平分别秤取Na2C03 1. 5克，NaHC03 2. 93克，用蒸馏水稀释至1000毫升， 配置成〇? 05摩尔/升pH9. 6碳酸缓冲液，4°C，保存。（2)用0? 05摩尔/升pH9. 6碳酸 缓冲液稀释亲和素或链霉亲和素，至终浓度为1~10微克/微升。（3)在微阵列反应腔 中加入200~400微升稀释后的亲和素或链霉亲和素溶液，37°C温育1小时，4°C冰箱放置 8~12小时。（4)用纯净水反复清洗微阵列反应腔三次，最后用吸水纸吸干残留液体，4°C 备用。
[0026] 具体实施例四 电化学发光微阵列寡核苷酸探针修饰方法：采用紫外交联将寡核苷酸探针固定在微阵 列电极表面，具体步骤如下：（1)探针稀释：将5'端带多聚胸腺嘧啶结构的寡核苷酸探针溶 于50%二甲基桠楓缓冲液(寡核苷酸探针终浓度为10~20微摩尔）。（2)按照设计模式， 用PDMS印模将稀释后的单链寡核苷酸DNA探针印痕加载到相应的电极表面，50摄氏度烘 干。（3)将烘干的微阵列放入254纳米波长紫外交联设备中反应3~5min进行探针固定。 (4)用纯净水加满反应孔，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上吸干残留 液体，50摄氏度烘干后备用。
[0027] 具体实施例五 生物素法电化学发光抗原检测：将待检抗原用0.05摩尔/升pH7. 6磷酸盐缓冲液按 1:1稀释；分别取100微升稀释的待检抗原、50微升联吡啶钌标记的二抗、50微升生物素标 记的一抗加入用亲和素或链霉亲和素预修饰的电化学发光电极阵列反应腔中，37°C温育2 小时；用纯净水清洗三次，最后用吸水纸吸干残留液体；在微阵列反应腔中加入200~400 微升吡啶钌电化学发光反应体系缓冲溶（0.03mM2.0mM二丁基乙醇胺，0.05M磷酸缓冲 液，pH69)，放入电化学发光检测设备检测电化学发光值。
[0028] 具体实施例六 PCR产物的电化学发光检测步骤： (1)PCR扩增体系： 在0. 2mLPCR反应管中加入下列成分至终体积50yL: 10yL模板DNA5yL10XPCR缓冲液 1.5yL50mMMgC12 1yL10mMdNTP混合物 1yL标记联吡啶钌的上游混合扩增引物（10yM) 1yL标记联吡啶钌的下游混合扩增引物（10yM) 0.5ylTaqDNA聚合酶（5U/yL) 加灭菌蒸馏水至总体积50yL; (2) PCR反应条件： 94°C，2分钟 94°C，25 秒
72。。，40 秒 72°C，5 分钟； (3) 杂交体系： 杂交缓冲液：20XSSC(3.0MNaCl，0.3M柠檬酸钠，pH7.08.0); 0. 1微摩尔PCR扩增产物55ML20XSSC 25ML 1%SDS 10ML 总反应体积 100ML (4) 杂交程序： a. 取经过寡核苷酸探针修饰的电化学发光电极阵列，在反应腔中加入上述杂交体系 反应液200400ML，100°C加热5分钟，然后快速冷却至室温。58°C保温1小时； b. 在反应腔中加200400ML0. 2XSSC和0. 1%SDS，置42°C5分钟清洗2次； c. 倒尽板孔中溶液，用纯净水加满反应孔，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置 在吸水纸上吸干残留液体； d.每孔加入200微升吡啶钌电化学发光反应体系缓冲溶（0. 03mM2. 0mM二丁基乙醇 胺，0.05M磷酸缓冲液，pH69)，放入采用悬浮式电极的电化学发光检测设备检测电化学 发光值。
【主权项】
1. 本发明涉及在生物检测技术领域中使用的一种电化学发光微阵列芯片的电极制备 以及修饰方法，其特征在于：电极阵列中的每个电极均为大小、形状相同的带圆弧顶角的正 方形或长方形，单个电极的表面积为0. 25~25 mm2,相邻电极之间的间距为0. 2~2 mm。2. 根据权利要求1所述的电化学发光检测方法，其特征在于：采用同步法用配体或 接枝交联分子修饰微阵列中的每一个电极表面以获得简单、快速、高效的加工工艺流程和 均一的电极表面一一所述的同步法是指将电极阵列用同一批次试剂同时进行修饰处理， 所述的配体包括生物素、亲和素、链霉亲和素、抗抗体、以及分子印迹聚合物（Molecular ImprintedPolymer，MIP)〇3. 根据权利要求I、2所述的电化学发光检测方法，其特征在于：使用印痕法在电极表 面加载捕获探针分子，加载印痕时，可采用逐次加载法或并行加载法。4. 所述的捕获探针分子包括：生物素、亲和素、捕获抗体、受体、分子印迹聚合物、肽核 酸（Peptide Nucleic Acid)探针或核酸探针。5.其中核酸探针包括基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、cRNA探针以及寡核苷酸 探针。6. 根据权利要求1、2所述的电化学发光检测方法，其特征在于：使用经过表面接枝改 性的聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS)印模，以印痕法在电极表面上加载捕 获探针印痕，印模形状与对应的微阵列电极相似，尺寸小于对应的电极，其中点与对应的电 极中点重合，使每个电极表面均可获得一个完整的捕获探针印痕。
【专利摘要】本发明所要解决的技术问题是提供一种简易高效的电化学发光电极阵列的制备以及电极表面修饰方法，它采用带圆弧顶角的方形电极结构使电极表面积最大化并减少尖角效应，用同步法以配体或接枝分子修饰电极阵列中的每一个电极表面，用印痕法在电极表面加载捕获探针分子，使电极阵列具有更好的一致性，本发明具有设备制作使用简单、耗材成本低、操作方便、检测结果重复性好等优点。
【IPC分类】G01N27/327
【公开号】CN104897758
【申请号】CN201510360195
【发明人】王利兵, 彭梓, 吴志鹏
【申请人】王利兵, 吴志鹏
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月26日
最新回复(0)