一种中药药代动力学的曲线模拟与预测方法
一种中药药代动力学的曲线模拟与预测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种中药药代动力学的曲线模拟与预测方法及其系统，具体而言，涉 及模拟单味药和复方中的一种成分的AUC(时间曲线下面积）-时间曲线，并预测另一种成 分在单味药和复方中的AUC-时间曲线。
【背景技术】
[0002] 中药是复杂的化学体系，存在复杂的药物-药物相互作用，口服单体成分与口服 中药复方制剂，即使其口服剂量完全一样，两者之间会存在很大的差别。然而，ADME相关的 性质预测均是来源于高通量的单体化合物，用它们建模用来预测单体化合物的ADME性质。 但是，因为中药复方存在复杂的药物-药物相互作用，所以这些预测模型对于中药复杂体 系不适用，需要新的研宄思路，建立新的预测模型和方法。
[0003] 公开于该【背景技术】部分的信息仅仅旨在加深对本发明的一般【背景技术】的理解，而 不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。
【发明内容】
[0004] 在本发明中，提出一种新的预测策略和预测模型，主要如下：把中药复方化合物， 根据化学结构相似性打分，分为不同的类别，同一类的化合物，被认为结构类似。化合物结 构类似的化合物，可能作用于相同的靶标，表现相似的理化性质、药代动力学性质和药理活 性，为此，提出一个假说，即：口服中药复方制剂，其中，结构类似的化合物，可能相似的代 谢风险，所以，对于中药复方制剂，可以通过获得一个或者少数几个化合物在体内的血药浓 度-时间曲线，从而预测其他化合物在体内的血药浓度-时间曲线，从而获得相关药代动力 学参数，为中药复方药代动力学提供新思路。
[0005] 为此，本发明提供了一种中药药代动力学的曲线模拟与预测方法，可用于单味药 或者中药复方的结构类似化合物的药代动力学的预测，其通过一些步骤，发现和证实化学 结构相似的成分在口服中药方剂的复杂体系后具有相似的药代动力学变化，即相似的r+ 值；然后，在已知成分A在各时刻的r+值，预测其他结构类似成分的auc-时间曲线，从而 建立药代动力学预测新思路和方法。
[0006] 具体地，该方法包括：
[0007] 步骤1.对成分A分别获得其在单味药和复方药中的血药浓度-时间曲线；
[0008] 步骤2.计算成分A在单味药和复方药中各测量时刻的血药浓度-时间曲线下的 面积AUC，进而获得其AUC-时间变化曲线；
[0009] 步骤3.计算成分A在单味药和复方药中各时刻的AUC之和与平均值的比值r+， 其计算公式如下：
[0011] 其中，xjtihyjti)分别为成分A在复方药及单味药中第i个时刻的AUC;
[0012] 步骤4.对成份B做基于化学结构相似性的聚类分析；
[0013] 步骤5.根据聚类分析结果若成分B与成分A同属一类，则可在已知成分A在各时 刻的r+值，成分B在单味药（或复方药）中的AUC值及其在复方药（或单味药）中第3小 时（即t7时刻）的AUC值的情况下，预测成分B在复方药（或单味药）中第4小时（即18 时刻）及以后的AUC-时间曲线，亦即
[0017]其中，xB(ti)、yB(ti)分别为成分B在复方药及单味药中第i个时刻的AUC。
[0018] 在所述步骤1中，通过高效液相色谱质谱/质谱联用来获得单味药和复方中成分 A的血药浓度-时间曲线。
[0019] 在测试血药浓度时，选择甲酸水-甲醇作为流动相，并且采用电喷雾离子化源 ESI，正离子模式检测，以及多反应检测MRM模式对药物离子浓度进行测定。
[0020] 在测试血药浓度时，于样品前处理采用沉淀蛋白方法。
[0021] 所述步骤2中通过梯形法来计算单味药和复方中成分A在各个时间点的血药浓 度-时间曲线下面积，所述梯形法计算公式如下：
[0023] 其中，A(ti)为复方和单味药中成分A在第i时刻的AUC值，C(ti)为复方和单味 药中成分A在第i时刻的血药浓度，并且、=0，々(0) =0，C(0) =0。
[0024] 本发明的方法和装置具有其它特征和优点，这些其它特征和优点将从结合于此的 附图和以下【具体实施方式】中显而易见，或在附图和【具体实施方式】中详细陈述，附图和具体 实施方式共同用于解释本发明的某些原理。
【附图说明】
[0025] 本发明的其它特征和优点将通过下面的参考附图进行的描述而得以显现，在所述 附图中：
[0026] 图1A、图1B和图1C分别显示紫堇碱（I)、a-别隐品碱（II)、延胡索乙素（III)、 四氢小檗碱（IV)、欧前胡素（V)、异欧前胡素（VI)、白当归素（VII)、华法林钠（麗，IS) 和盐酸异丙嗪（IX，IS)的空白血浆样品色谱图、空白血浆标准添加LL0Q色谱图以及给药2 小时后的血浆样品色谱图；
[0027] 图2为SD大鼠口服不同提取物后a-别隐品碱的平均血药浓度-时间曲线图（n =6)；
[0028] 图3为SD大鼠口服不同提取物后延胡索乙素的平均血药浓度-时间曲线图（n= 6);
[0029] 图4为SD大鼠口服不同提取物后四氢小檗碱的平均血药浓度-时间曲线图（n= 6)；
[0030] 图5为SD大鼠口服不同提取物后紫堇碱的平均血药浓度-时间曲线图（n= 6);
[0031] 图6为SD大鼠口服不同提取物后白当归素的平均血药浓度-时间曲线图（n= 6)；
[0032] 图7为SD大鼠口服不同提取物后欧前胡素的平均血药浓度-时间曲线图（n= 6)；
[0033] 图8为SD大鼠口服不同提取物后异欧前胡素的平均血药浓度-时间曲线图（n= 6)；
[0034] 图9显示基于两两之间化学结构相似性打分的元胡止痛方中的7个成分聚类分析 结果；
[0035] 图10显示7个成分在单味药和复方中的AUC-时间变化曲线；
[0036] 图11显示基于AUC-时间曲线变化的元胡止痛方中的7个成分聚类分析的结果； [0037] 图12显示7个成分的r+值的散点图。
【具体实施方式】
[0038] 现在将具体参考本发明的各个实施方案，在附图中和以下的描述中示出这些实施 方案的实例。虽然本发明与示例性实施方案相结合进行描述，但应当了解，本说明书并非旨 在将本发明限制为那些示例性实施方案。相反，本发明旨在不但覆盖这些示例性实施方案， 而且覆盖可以被包括在由所附权利要求所限定的本发明的精神和范围之内的各种替换、修 改、等效形式以及其它实施方案。
[0039] 在本发明的中药药代动力学的曲线模拟与预测方法中，首先建立元胡止痛方中7 个主要活性成分体内分析方法。
[0040] 元胡止痛方主要有延胡索和白芷两味药组成，延胡索中主要成分为生物碱类化合 物，而白芷中主要成分为香豆素类化合物，对两药的药代动力学研宄方面，国内外文献大多 集中在对延胡索乙素的含量测定，但是中药的特点是多成分共同发挥作用，考察其他成分 在体内的含量也是十分有必要的。为了更好的理解元胡止痛方的药理作用机理、体内过程， 有必要建立一种灵敏而又准确的分析方法，以测定生物样品（如血浆、组织匀浆及尿液）中 主要成分的含量。
[0041] 在本发明中将建立同时测定大鼠血浆样品中的a-别隐品碱、延胡索乙素、四氢 小檗碱、紫堇碱、白当归素、欧前胡素、异欧前胡素等7种主要成分的LC-MS-MS方法。
[0042] 本发明所使用的实验仪器：
[0043] WatersAcquityUPLCSystem,WatersQuattroPremierXE，沃特世科技有限公 司）；MIKR0 220R型离心机，德国Hettich公司；
[0044] MX-S型涡旋混合器，美国SCIL0GEX公司；
[0045] XS205型分析天平，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司。
[0046] 本发明所使用的药品与试剂：
[0047] 乙腈（色谱纯，Merck公司）；
[0048] 甲醇（色谱纯，Merck公司）；
[0049]a_别隐品碱（深圳市美荷生物科技有限公司，批号：20100318,纯度：98% ); [0050] 延胡索乙素（中国食品药品检定研宄院，批号：110726-201011，纯度99.9% );
[0051] 紫堇碱（sigma，批号：S449121，纯度：98% );
[0052] 四氢小檗碱（上海融禾医药科技发展有限公司，批号：100516,纯度：98% );
[0053] 白当归素（成都普思生物科技有限公司，批号：RFS-B-100610-04,纯度99. 9% );
[0054] 异欧前胡素（中国食品药品检定研宄院，批号：110827-200407,纯度：98% );
[0055] 欧前胡素（中国食品药品检定研宄院，批号：110826-200712,纯度：99. 9% )。
[0056] 本发明所使用的药材：
[0057] 白]E(AngelicaDahurica(Fisch.exHoffm. )Benth.etHook.f.)产自河北省；
[0058] 延胡索（CorydalisyanhusuoW.T.Wang)产自杭州，
[0059] 均购于河北省安国中药材有限公司，由中国中医科学院中药研宄所何希荣药师鉴 定为药材正品。
[0060] 本发明所使用的实验动物：
[0061] SD大鼠，雄性，体重230±20g，由北京大学医学部实验动物科学部提供，合格证 号：SCXK(京）2009-0017。在温度20-22°C，相对湿度45% -65%，光照/黑暗12h/12h条 件下饲养，自由饮食、饮水，适应性饲养3天后开始实验。
[0062] 发本明所使用的标准品溶液的配制：
[0063] 分别精密称取a_别隐品碱、延胡索乙素、四氢小檗碱、紫堇碱、白当归素、欧前胡 素和异欧前胡素溶于甲醇中，配成储备液浓度分别为lmg/mL，将储备液用甲醇稀释成不同 浓度的混合溶液 ，分别含a-别隐品碱，四氢小檗碱0. 5,1，2. 5, 5, 25, 50,100和250ng/ml， 含延胡索乙素和紫堇碱1，2, 5,10, 50,100, 200和500ng/ml，含白当归素、欧前胡素和异欧 前胡素2,4,10, 20,100, 200和400和1000ng/ml的标准溶液，用于标准曲线的制备。
[0064] 精密称取内标华法林钠和盐酸异丙嗪溶于甲醇配制成100yg/mL的储备液，分别 稀释为50ng/mL和25ng/mL标准溶液。所有溶液置于-20°C冰箱保存备用。
[0065] 本发明所使用的血浆样品标准曲线和质控（QC)样品的配制：
[0066] 取大鼠空白血浆50y1，加入混合标准系列溶液50y1，配制成相当于a-别隐品 碱与四氢小檗碱的终浓度为〇. 5、1、2. 5、5、25、50、100和250ng/ml，延胡索乙素与紫堇碱的 终浓度为1、2、5、10、50、100、200和500ng/ml，白当归素、欧前胡素与异欧前胡素的终浓度 为2、4、10、20、100、200、400和1000ng/ml的校正样品，除不加甲醇外，其余按"血浆样品前 处理"项下操作。
[0067] QC样品同法稀释配制，浓度分别如下：a-别隐品碱与四氢小檗碱为1、1〇〇、 200ng/ml，延胡索乙素与紫堇碱为2、200、400ng/ml，白当归素、欧前胡素与异欧前胡素为 4、400、800ng/ml〇
[0068] 色谱质谱分析条件：
[0069] 色谱柱：ACQMTYUPLCBH1 (：18柱（2.lmmX50mm，1. 7ym)，流动相：0? 1 % 甲酸 水-甲醇，洗脱程序见表3-1-1，流速：0. 3ml/min，柱温：50°C，进样量：5y1。
[0070] 表1梯度洗脱
[0071]
[0072] 采用电喷雾离子化源（ESI)，正离子模式检测，脱溶剂气为氮气，脱溶剂气温度： 350°C，流速：650L/h，离子源温度：120°C，采用多反应监测（MRM)模式对药物离子浓度进行 测定，7种分析成分及内标的最优MRM参数见表2。
[0073] 表2元胡止痛方中7个成分及2个内标的MS参数
[0076] 血浆样品前处理：
[0077] 取大鼠血浆50y1，依次加入50y1甲醇，150y1含内标（华法林钠50ng/mL和盐 酸异丙嗪25ng/mL)的甲醇溶液，涡旋震荡3min，15000r/min离心lOmin，取上清液200y1， 氮气吹干，用100U1 50%甲醇复溶，祸旋lmin，15000离心5min，取上清液5y1进样，进行 LC-MS分析。
[0078] 对本发明进行的体内分析方法学验证包括：
[0079] (1)方法的专属性考察：
[0080] 将6个不同个体的空白血浆及标准添加血浆（a-别隐品碱与四氢小檗碱为 0. 5ng/ml，延胡索乙素与紫堇碱为lng/ml，白当归素、欧前胡素与异欧前胡素为2ng/ml)， 除不加内标外，其他按"血浆样品前处理"项下的方法操作后进行UPLC-MS/MS分析，比较不 同空白血浆和标准添加血浆的色谱图，以考察空白血浆中的内源性成分是否存在干扰。
[0081] ⑵线性范围与定量下限（LLO? :
[0082] 在方法学确证的三天内每天配制3套标准曲线，以待测物浓度为横坐标，待测物 与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权（W= 1/x2)最小二乘法进行回归运算，求得线性 回归方程即为标准曲线。
[0083] 在方法确证的第三天对标准曲线最低点浓度配制6个样本进行分析，并根据当 日标准曲线计算每一样本测定浓度，LL0Q是标准曲线上的最低浓度点，其响应值应为空白 生物基质干扰物响应值的5倍以上（S/N彡5)，且精密度表示为相对标准偏差（relative standarddeviation，RSD)应<20%，准确度表示为偏倚（bias)，应在±20%范围内。
[0084] (3)精密度与准确度：
[0085] 取空白大鼠血浆50yL，按"血浆样品标准曲线和质控（QC)样品的配制"项同法操 作，配制高、中、低三个浓度（a-别隐品碱与四氢小檗碱为1、100、2001^/1111，延胡索乙素与 紫堇碱为2、200、400ng/ml，白当归素、欧前胡素与异欧前胡素为4、400、800ng/ml)的质控 样品，每一浓度每天进行6样本分析，连续测定三天，根据当日标准曲线计算质控样品的测 得浓度。根据质控样品测定结果计算本法的日内、日间精密度与准确度。
[0086] (4)提取回收率与基质效应：
[0087] 考察待测组分在不同浓度下基质效应的影响，以及该条件下的血浆提取回收率。 配制待测组分的标准添加血浆样品（低、中、高QC浓度，同"血浆样品标准曲线和质控（QC) 样品的配制"项下方法的操作），按照"血浆样品前处理"方法操作后测定浓度（set3样 品）；将空白血浆蛋白沉淀后标准添加待测组分测定浓度（set2样品）；用流动相配制相 应浓度不含基质的纯样品溶液测定浓度（set1样品）。基质效应的计算值为set2样品 与set1样品的色谱峰面积比；提取回收率的计算值为set3样品与set2样品的色谱峰 面积比。同时考察内标华法林钠（50ng/mL)和盐酸异丙嘆（25ng/mL)的基质效应和提取回 收率。
[0088] (5)样品稳定性：
[0089] 方法学验证过程中，对分析样品的稳定性进行考察，包括1次、3次冻融循环后的 稳定性，室温下25°C放置4h的短期稳定性，-20°C冷冻条件下保存2周的长期稳定性，以 及处理后的血浆样品在自动进样器中（4°C)放置12h的稳定性。稳定性考察时，取空白血 浆50yL，按照"血浆样品标准曲线和质控（QC)样品的配制"项下方法制备低、中、高三个浓 度的质控（QC)样品，按1:10加入空白血浆中，每一浓度进行3样本分析，以测定值与标示 浓度相比，以相对偏差（RE)表示。
[0090] 体内分析方法学验证结果如下：
[0091] (1)专属性：
[0092] 空白大鼠血浆，空白血浆外加标准溶液以及大鼠给药后血浆样品色谱图见图1A 至图1C。待测组分和内标的保留时间具体如下：a-别隐品碱为3. 55min、延胡索乙素 为3. 54min、四氢小檗碱为3. 64min、紫堇碱为3. 68min、白当归素为4. 63min、欧前胡素为 5. 76min和异欧前胡素为6. 12min，四氢小檗碱为6. 85min，华法林钠（IS)为4. 49min，盐酸 异丙嘆（IS)为5. 67min，空白血衆中的内源性成分对测定不造成干扰。
[0093] (2)标准曲线与定量下限：
[0094] 3条标准曲线在考察的下列浓度范围内均显示良好的线性关系，a-别隐品碱和 四氢小檗碱：〇. 5-500ng/mL，延胡索乙素和紫堇碱：l-1000ng/mL、白当归素、欧前胡素和异 欧前胡素：2-2000ng/mL，各成分标准曲线相关系数（R2)均大于0.99。定量下限实验结果 显示，在测定浓度下，7种待测成分的日内精密度（RSD)分别为2. 4%、2. 8%、1. 9%、1. 9%、 8. 1 %、3. 9%、1. 7%，准确度（RE)分别为 4. 0%、3. 0%、4. 0%、4. 0%、-9. 0%、-3. 0%、 5.0%。待测成分的线性回归方程见表3。
[0095] 表3 7种成分的线性回归方程
[0098] (3)精密度与准确度：
[0099] 如表4所示，在高、中、低三个浓度下，日内与日间精密度（RSD)分别为1.0%~ 5. 3%与1. 5%~6. 1%，日内与日间准确度（RE)分别为-3. 2%~7. 1%与-7. 0%~7. 5%， 数据表明待测组分在大鼠血浆中的精密度和准确度均符合生物样品的分析要求。
[0100] 表4a-别隐品碱、延胡索乙素、四氢小檗碱、紫堇碱、白当归素、欧前胡素和异欧 前胡素在大鼠血浆中的精密度和准确度（n= 6)
[0102] (4)回收率与基质效应：
[0103] 表5列出了低、中、高3个浓度的待测组分和内标（华法林钠50ng/mL;盐酸异丙 嗪25ng/mL)的基质效应和提取回收率考察结果。提取回收率结果表明，在此血浆前处理方 法下，蛋白沉淀法对7个待测成分的提取回收率均在88. 8%以上。基质效应考察结果显示， 本方法测定条件下血浆中的内源性物质的离子抑制或增强作用可忽略不计，对7种待测成 分的质谱响应没有影响。
[0104] 表5a-别隐品碱、延胡索乙素、四氢小檗碱、紫堇碱、白当归素、欧前胡素和异欧 前胡素在大鼠血浆中的提取回收率和基质效应（n= 6)
[0106] ⑶稳定性：
[0107] 表6a_别隐品碱、延胡索乙素、四氢小檗碱、紫堇碱、白当归素、欧前胡素和异欧 前胡素在大鼠血浆中的稳定性（n= 6)
[0108]
[0109]
[0110] 稳定性考察结果表明7种成分血浆样品经过三次冻融循环 (RE:-10. 4% -10. 9% )，室温下 25°C放置 4h(RE:-5. 5% -I3. 0% )，_2〇°C冷冻条件下保存 2周（RE:-10. 3% -10. 5% )后均稳定，处理后的血浆样品在自动进样器中（4°C)放置12h 稳定（RE:-9. 2% -12. 1% )具体结果见表6〇
[0111] 由以上的表可见，7种成分在储存、处理和测定过程中均保持稳定。
[0112] 经过验证，该分析方法符合生物样品测定的要求。
[0113] 接下来，进行UPLC-MS/MS条件优化、内标的选择以及血浆样品前处理方法的优 化。
[0114] 首先考察流动相，甲醇和乙腈作为流动相色谱峰形都比较好，但是乙腈作为流动 相时，白当归素的响应值是甲醇作为流动相的十分之一，所以，选择甲醇作为流动相。在质 谱分析中，流动相中加入甲酸等酸性成分，可以显著地改善色谱峰形。本文考察了甲酸在水 相中的加入量，发现随着甲酸加入量增加，从0. 05% 、0. 1%和0. 2%，但生物碱类成分的响 应显著增强，而且其峰形也有所改善，因此我们选择了一个合适的甲酸浓度（0. 1% )来兼 顾到所有待测组分的色谱峰形和质谱响应。
[0115] 在对生物样品进行分析时，通常加入内标以校正样品预处理和分析时可能产生的 误差，并且方便样品预处理，提高处理速度。对于以质谱这种高灵敏低稳定性的仪器作为检 测器，内标的加入尤其必要。考虑到我们所分析的为香豆素和生物碱两类化合物，首先通 过分析相似性软件计算候选化合物和待测化合物的结构相似性，大量筛选结构相似的化合 物，通过油水分配系数进一步筛选候选化合物，每一类成分选出3个候选化合物作为内标， 然后根据色谱和质谱的检测结果，选择出最佳的内标，最后我们选择了华法林钠（为香豆 素类成分）和盐酸异丙嗪（为生物碱类成分）两个药物作为这两类成分的内标，分别对其 进行校正。
[0116] 在试验中，我们尝试比较了蛋白沉淀（包括甲醇沉淀，乙腈沉淀和甲醇：乙腈= 1:1沉淀）、液液萃取和固相萃取。蛋白沉淀中，甲醇沉淀方法的回收率要高于乙腈沉淀和 甲醇：乙腈=1:1沉淀，且基质效应比较小；液液萃取分别考察了乙酸乙酯加入12. 5%氨水 和0. 2MNaOH，加入12. 5%氨水的回收率要高于加入0. 2MNaOH，由于液液萃取加碱的方法 基质效应比较大，且蛋白沉淀方法的回收率要高于液液萃取，考虑到后续实验大量的样品， SPE费用高且较费，因此，本实验最终选择了甲醇沉淀蛋白的前处理方法。发现由于样品中 的有机相比例高于流动相中的有机相比例，采取两种方法：一是上清液氮气吹干后以50% 甲醇复溶，二是上清液以等体积水稀释。经过考察发现上清液氮气吹干优于上清液以水稀 释的方法，同时我们还考察了 3,4, 5倍体积的甲醇沉淀血浆蛋白后的质谱响应值，发现3倍 体积的甲醇处理，能将待测组分提取较为完全而稀释较少，从而获得最大的质谱响应。
[0117] 由上可见，在本发明中建立了简单、灵敏而准确的LC-ESI-MS分析方法，用于同时 定量测定大鼠血浆中的a-别隐品碱、延胡索乙素、四氢小檗碱、紫堇碱、白当归素、欧前胡 素和异欧前胡素。样品前处理采用沉淀蛋白方法，简单快捷。本方法专属性好，灵敏度高，其 定量下限分别为〇? 5ng/mL(紫堇碱和延胡索乙素），lng/mL(四氢小檗碱和a-别隐品碱） 和2ng/mL(白当归素、欧前胡素和异欧前胡素），为后续的药代动力学研宄提供了可靠的分 析方法。
[0118] 在下文中，对元胡止痛方7个主要活性成分在大鼠血浆中的药代动力学进行研 宄。
[0119] 为了比较单味药和元胡止痛方对大鼠口服给药后主要活性成分的药代动力学是 否发生变化，我们将延胡索提取物、白芷提取物和元胡止痛方提取物（延胡索：白芷= 2:1)分别对大鼠灌胃，通过单味药和元胡止痛方的药代动力学行为比较，推测两者合并用 药后的相互作用趋势，为元胡止痛方配伍应用提供合理依据和指导。
[0120] 取白芷药材1kg，粉碎过6号筛。浸泡lh，用4倍量70%乙醇回流提取，提取时间 为2h，依次提取2次，合并过滤液，70°C减压干燥至粉末，提取率为9. 52% ;取延胡索药材 lkg，粉碎过6号筛。浸泡lh，用4倍量70%乙醇回流提取，提取时间为2h，依次提取2次， 合并过滤液，70°C减压干燥至粉末，提取率为8. 15%。
[0121] 分别测定延胡索与白芷提取物中主要活性成分的含量，结果表明延胡索提取物中 主要活性成分的含量如下：a-别隐品碱为3. 20mg/kg，紫堇碱为11. 59mg/kg，延胡索乙素 为4. 19mg/kg，四氢小檗碱为1. 13mg/kg，白芷提取物中主要活性成分的含量如下：白当归 素为0? 69mg/kg，欧前胡素为3. 78mg/kg，异欧前胡素为1. 90mg/kg。
[0122] 取一支肝素，每支lg，置于100mL的容量瓶中，用生理盐水定容至刻度，配成1 %的 肝素溶液，共配制500ml，置于4°C储存备用。
[0123] 分别称取延胡索提取物6. 52g，白芷提取物3. 81g，元胡止痛方（延胡索提取物 6. 52g，白芷提取物3. 81g)，加50ml的水溶液研磨成混悬溶液，供大鼠灌胃使用。药液临用 前配制。
[0124] 18只SD大鼠，体重230±20g，随机分为3组，每组6只，雌雄各半，给药前12h禁 食，自由饮水，分别灌胃给予元胡止痛方提取物、白芷提取物和延胡索提取物，给药4h后喂 以饲料。于给药前及给药后〇. 17、0. 33、0. 67、1、1. 5、2、3、4、6、8、12、24、36、48h由眼眶静脉 丛取血约为0. 5mL，肝素抗凝，3500Xg离心lOmin后取血浆，于-20°C保存待测。
[0125] 采用DAS2. 0数据处理软件（中国药理学会数学药理学专业委员会）的非房室模 型法（统计矩法）进行药代动力学参数Cmax、Tmax、t1/2、AUC、MRT、CL/F等的计算。
[0126] 实验中雌性大鼠口服延胡索提取物后，血浆样品药物浓度远远高于雄性大鼠血 药浓度，导致个别血浆样品中紫堇碱的浓度超出了标准曲线的线性范围，对于浓度超出线 性范围的血浆样品，用空白血浆进行稀释后重新测定，考察了样品的稀释效应，实验结果表 明，采用空白血浆稀释高浓度样品后分析，对回收率、血药浓度没有显著影响。
[0127] 对3组SD大鼠灌胃各提取物后，采用上述建立的方法对各时间点血浆进行分析， 血药浓度-时间数据见表7至20,平均血药浓度-时间数据见表21。采用非房室模型法计 算药代动力学参数，结果见表22和23。
[0128] 表7大鼠灌胃给予元延胡索提取物后a-别隐品碱的血药浓度-时间数据（ng/ ml，n= 6)
[0130] n.d?未检测出，在LL0Q以下
[0131] 表8大鼠灌胃给予元胡止痛方提取物后a-别隐品碱的血药浓度-时间数据 (ng/ml，n= 6)
[0133] 表9大鼠灌胃给予延胡索提取物后延胡索乙素的血药浓度-时间数据（ng/ml，n=6)
[0136] n.d.未检测出，在LL0Q以下
[0137] 表10大鼠口服元胡止痛方提取物后延胡索乙素的血药浓度-时间数据（ng/ml， n= 6)
[0138]
[0139] 表11大鼠灌胃给予延胡索提取物后四氢小檗碱的血药浓度-时间数据（ng/ml，n= 6)
[0141] 表12大鼠灌胃给予元胡止痛方提取物后四氢小檗碱的血药浓度-时间数据（ng/ ml,n= 6)
[0142]
[0143] 表13大鼠灌胃给予延胡索提取物后紫堇碱的血药浓度-时间数据（ng/ml，n=6)
[0145] n.d.未检测出，在LL0Q以下
[0146] 表14大鼠灌胃给予元胡止痛方提取物后紫堇碱的血药浓度-时间数据（ng/ml，n =6)
[0148]
[0149]表15大鼠灌胃给予白芷提取物后白当归素的血药浓度-时间数据（ng/ml，n=6)
[0151]表16大鼠灌胃给予元胡止痛方提取物后白当归素的血药浓度-时间数据（ng/ml,n= 6)
[0153]表17大鼠灌胃给予白芷提取物后欧前胡素的血药浓度-时间数据（ng/ml，n= 6)
[0155]表18大鼠灌胃给予元胡止痛方提取物后欧前胡素的血药浓度-时间数据（ng/ml,n= 6)
[0157] 表19大鼠灌胃给予白芷提取物后异欧前胡素的血药浓度-时间数据（ng/ml，n= 6)
[0158]
[0160] 表20大鼠灌胃给予元胡止痛方提取物后异欧前胡素的血药浓度-时间数据（ng/ ml,n= 6)
[0162] 表21平均血药浓度-时间数据
[0163]
[0165] 表22延胡索单用及元胡止痛方口服给药后主要药代动力学参数（n= 6)
[0166]
[0167] **P〈0.01，*P〈0.05 对于延胡索
[0168] 表23白芷单用及元胡止痛方口服给药后主要药代动力学参数（n= 6)
[0170]
[0171] **P〈0.01，*P〈0.05 对于白芷
[0172] 药代动力学参数计算结果表明：如图2所示，SD大鼠灌胃元胡止痛方组和延胡索 组相比，a-别隐品碱的达峰时间有所延长，体内平均驻留时间延长了 〇. 8倍，具有显著性 差异，P〈0. 01，AUC^t和AUC^^与之相比都有所增大，但是不具有统计学意义。
[0173] 如图3所示，元胡止痛方组和延胡索组相比，延胡索乙素的AUC^ t、 MRTft^都有显著性提高，P〈0. 01，达峰时间延长了 3. 8倍，P〈0. 05。
[0174] 如图4所示，元胡止痛方组和延胡索组相比，四氢小檗碱峰浓度提高了 2倍，达峰 时间延长了 4倍，体内平均驻留时间延长了 0. 8倍，P〈0. 01，AUC^ ,和AUC 都显著增大， 具有统计学意义。
[0175] 如图5所示，元胡止痛方组和延胡索组相比，紫堇碱峰浓度有所提高，达峰时间延 长了 2倍，具有统计学意义，体内平均驻留时间延长了 0. 65倍，具有统计学意义，P〈0. 05。
[0176] 图6至图8,分别为来源于白芷中成分白当归素、欧前胡素、异欧前胡素3个成分的 血药浓度-时间曲线图。从图中可以看出，相对于单味药，复方中该3个成分的AUC^ ^口AUCp^都明显减少。同时，从化学成分分类来看，当归素、欧前胡素、异欧前胡素3个成分属 于香豆素成分，与4个生物碱类成分不一样，该3个成分AUC^t和AUC 都明显减少，生 物利用度降低，表示不是同一类成分，化学成分的AUChdPAUC。^^变化不一样，同一类成 分的AUC^ 变化趋势具有一致性。而且，根据文献，香豆素类成分具有肝损伤作 用，上述结果为配伍减毒提供依据。
[0177] 元胡止痛方中延胡索中的生物碱成分是镇痛作用的主要成分，延胡索配伍白芷， 白芷可以延长延胡索中主要生物碱成分的达峰时间，保持有效血药浓度的时间延长，同时 AUC^ ,和AUC ^^显著增大，使血药浓度更长时间处于有效浓度范围内，更好的发挥药效，从 药代动力学的角度，解释了延胡索和白芷伍用的原理。同时，我们从实验结果发现，白芷配 伍延胡索之后，延胡索明显降低了白芷中主要香豆素成分的血药浓度，表明延胡索和白芷 两味中药存在药物-药物相互作用，为元胡止痛方的体内过程研宄奠定了基础。
[0178] 接下来，计算及拟合7个主要成分的AUC-时间曲线。
[0179] 根据如下的梯形法计算公式来计算元胡止痛方中的7个成分的AUC-时间曲线：
[0181]其中，t〇= 0，A(0) = 0，C(0) = 0。
[0182] 由上述公式可得下表：
[0183] 表24药物AUC-时间数据
[0185]
[0186] 对7个主要成分在单味药和复方的AUC-时间曲线变化与化合物结构之间关联性 分析：
[0187]MedChemStudio软件，作为一个可视化化学信息学研宄平台，以Tanimoto系数， 对7个化合物进行结构相似性评价。化合物两两之间的相似性打分见表23.利用SPSS软 件，通过聚类分析（PCA)对两两之间化学结构相似性打分进行分析，结果见图9。
[0188] 从结果中可以看出，a_别隐性碱、紫堇碱、延胡索乙素和四氢小檗碱属于生物碱 类化合物，以结构相似性打分进行聚类分析结果显示，从被分为同一类；欧前胡素、异欧前 胡素和白当归素属于香豆素类化合物，以结构相似性打分进行聚类分析结果显示，从被分 为另一类。
[0189] 表25 7个成分两两之间的化学结构相似性打分
[0190]
[0191] 7个主要成分在单味药和复方的AUC-时间变化曲线计算函数如下：
[0193] 其中，AUCV$在不同时间点，单味药与复方之间成分I的AUC变化；AUCdi为在不 同时间点的单味药的AUC;AUCfi不同时间点的复方的AUC，C_为单味药和复方之间最大的 浓度。
[0194] 在元胡止痛方和单味药中，7个成分AUC-时间变化曲线见图10,从图中可见，随着 时间的延长，香豆素类成分（欧前胡素、异欧前胡素和白当归素）AUCviF断增大，然而，生物 碱类成分（a-别隐性碱、紫堇碱、延胡索乙素和四氢小檗碱）AUCviF断减少。进一步对变 化曲线进行聚类分析，结果显示，3个香豆素类成分（欧前胡素、异欧前胡素和白当归素）被 聚到同一类，4个生物碱类成分（a-别隐性碱、紫堇碱、延胡索乙素和四氢小檗碱），说明化 学结构类似的成分，具有相似的AUCvi变化曲线。
[0195] 通过聚类分析对两两之间化学结构相似性打分进行分析，结果见图11。
[0196] 接下来，利用1个化合物在单味药和复方的AUC-时间曲线变化规律预测其他化合 物在复方中AUC-时间曲线。
[0197] 通过计算各成分在元胡止痛方与延胡索（或白芷）中的AUC之和与其平均值的比 值发现可以将7种成分分为两类，并由此提出一种新的预测方法。
[0198] 首先，计算各个成分在复方和单味药中的AUC之和与其平均值的比值r+，该比值 r+的计算公式如下：
[0200] 其中，x(ti)为在复方中成分I在i时刻的AUC，b(ti)为在单味药中成为I在i时 刻的AUC。
[0201] 各个成分在各个时刻的比值r+见表24。
[0202] 表26各成分在各个时刻的比值r+
[0204] 根据上表做出如图12所示的散点图。
[0205] 由图12可以看出，按接近程度可将上述七条曲线分为两类，S卩a_别隐性碱、延胡 索乙素-S、四氢小檗碱-S与紫堇碱为一类，白当归素、欧前胡素与异欧前胡素-S为另一类。
[0206] 下表为延胡索乙素-S、四氢小檗碱-S、紫堇碱与a_别隐性碱以及欧前胡素、异欧 前胡素-S与白当归素相应r+值间的比值。
[0207] 表27延胡索乙素-S、四氢小檗碱-S、紫堇碱与a-别隐性碱以及欧前胡素、异欧 前胡素-S与白当归素相应r+值间的比值
[0208]
[0209] 通过上表可以看出，在3小时以后相应r+值间的比值全部分布在区间（0.84， 1. 11)中。
[0210] 基于上述理论推测，我们可以采用如下的方法在已知成分A在各时刻的r+值
，成分B在单味药（复方）中的AUC值
及其在复方（单味药）中第 3小时的AUC值x(t7)的情况下，预测成分B在复方（单味药）中4小时及以后的AUC值
[0211] 下面，为叙述方便，简记
，i=0，l，2,… ，n-l。由（1)一（3)可得如下的线形方程组。
[0213]解此方程组，可得如下解：
[0215]亦即
[0217] 实施例1由成分a_别隐性碱的r+值预测成分延胡索乙素-S在元胡止痛方中4 小时后的AUC值
[0218] 此时成分a_别隐性碱对应于时刻&的r+值a(tJ以及延胡索乙素-S在延胡 索中对应于时刻&的AUC值b(t)(i= 7, 8,…，13)如下表。
[0219] 表28a-别隐性碱的r+值a(t)及延胡索乙素-S在延胡索中的AUC值
[0221] 另外x(t7) = 971. 4730917。据（10)(n= 14)可算得延胡索乙素-S在元胡止痛 方中对应于时刻&的AUC值x(t)(i= 8, 9,…，13)。现将相关结果列于下表。
[0222] 表29延胡索乙素-S在元胡止痛方中的AUC实验值与预测值比较情况
[0224] 实施例2由成分a_别隐性碱的r+值预测成分四氢小檗碱-S在元胡止痛方中4 小时后的AUC值
[0225] 根据如上所述的方法，可以得到如下结果：
[0226] 表30四氢小檗碱-S在元胡止痛方中的AUC实验值与预测值比较情况
[0227]
[0228] 实施例3由成分a_别隐性碱的r+值预测成分紫堇碱在元胡止痛方中4小时后 的AUC值
[0229] 根据如上所述的方法，可以得到如下结果：
[0230] 表31紫堇碱在元胡止痛方中的AUC实验值与预测值比较情况
[0232] 实施例4由成分白当归素的r+值预测成分欧前胡素在元胡止痛方中4小时后的 AUC值
[0233] 根据如上所述的方法，可以得到如下结果：
[0234] 表32欧前胡素在元胡止痛方中的AUC实验值与预测值比较情况
[0236]
[0237] 实施例5由成分白当归素的r+值预测成分异欧前胡素-S在元胡止痛方中4小 时后的AUC值
[0238] 根据如上所述的方法，可以得到如下结果：
[0239] 表33欧前胡素在元胡止痛方中的AUC实验值与预测值比较情况
【主权项】
1. 一种中药药代动力学的曲线模拟与预测方法，其在口服中药方剂的复杂体系后，发 现和证实化学结构相似的成分具有相似的药代动力学变化，从而通过已知成分在各时刻的 药代动力学参数来预测其他结构类似成分的药代动力学参数，所述方法包括： 步骤1.对成分A分别获得其在单味药和复方药中的血药浓度-时间曲线； 步骤2.计算成分A在单味药和复方药中各测量时刻的血药浓度-时间曲线下的面积 AUC，进而获得其AUC-时间变化曲线； 步骤3.计算成分A在单味药和复方药中各时刻的AUC之和与平均值的比值Γ+，其计 算公式如下：其中，xA(ti)、yA(ti)分别为成分A在复方药及单味药中第i个时刻的AUC ; 步骤4.对成份B做基于化学结构相似性的聚类分析。 步骤5.根据聚类分析结果若成分B与成分A同属一类，则可在已知成分A在各时刻的 Γ +值，成分B在单味药或复方药中的AUC值及其在复方药或单味药中第3小时的AUC值的 情况下，预测成分B在复方药或单味药中第4小时及以后的AUC-时间曲线，其中第3小时 即t7时刻，第4小时即18时刻，亦即其中，xB Ui)、yBUi)分别为成分B在复方药及单味药中第i个时刻的AUC。2. 根据权利要求1所述的中药药代动力学的曲线模拟与预测方法，其中所述步骤1中 通过高效液相色谱质谱/质谱联用来获得单味药和复方药中成分A的血药浓度-时间曲 线。3. 根据权利要求2所述的中药药代动力学的曲线模拟与预测方法，其中选择甲酸 水-甲醇作为流动相，并且采用电喷雾离子化源ESI，正离子模式检测，以及多反应检测MRM 模式对药物离子浓度进行测定。4. 根据权利要求2所述中药药代动力学的曲线模拟与预测方法，其中于样品前处理采 用沉淀蛋白方法。5. 根据权利要求1所述的中药药代动力学的曲线模拟与预测方法，其中所述步骤2中 通过梯形法来计算单味药和复方药中成分A在各个时间点的血药浓度-时间曲线下面积， 所述梯形法计算公式如下：其中，Aai)为复方和单味药中成分A在第i时刻的AUC值，Cai)为复方和单味药中 成分A在第i时刻的血药浓度，并且、=0，八(0) =0, C(O) =0。
【专利摘要】一种中药药代动力学的曲线模拟与预测方法。其通过一些步骤，发现和证实化学结构相似的成分在口服中药方剂的复杂体系后具有相似的药代动力学变化，即相似的Γ+值；然后，在已知成分A在各时刻的Γ+值，预测其他结构类似成分的AUC-时间曲线，从而建立药代动力学预测新思路和方法,该方法可用于单味药或者中药复方的结构类似化合物的药代动力学的预测。具体包括以下步骤：1、对成分A分别获得其在单味药和复方药中的血药浓度-时间曲线；2、获得其AUC-时间变化曲线；3、计算各时刻的AUC之和与平均值的比值Γ+；4、对成份B做基于化学结构相似性的聚类分析；5、根据聚类分析结果若成分B与成分A同属一类，则可预测成分B的AUC-时间曲线。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN104897791
【申请号】CN201510132249
【发明人】许海玉, 李珂, 杨洪军, 陶野
【申请人】中国中医科学院中药研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年3月25日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种中药药代动力学的曲线模拟与预测方法及其系统，具体而言，涉 及模拟单味药和复方中的一种成分的AUC(时间曲线下面积）-时间曲线，并预测另一种成 分在单味药和复方中的AUC-时间曲线。
【背景技术】
[0002] 中药是复杂的化学体系，存在复杂的药物-药物相互作用，口服单体成分与口服 中药复方制剂，即使其口服剂量完全一样，两者之间会存在很大的差别。然而，ADME相关的 性质预测均是来源于高通量的单体化合物，用它们建模用来预测单体化合物的ADME性质。 但是，因为中药复方存在复杂的药物-药物相互作用，所以这些预测模型对于中药复杂体 系不适用，需要新的研宄思路，建立新的预测模型和方法。
[0003] 公开于该【背景技术】部分的信息仅仅旨在加深对本发明的一般【背景技术】的理解，而 不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。
【发明内容】
[0004] 在本发明中，提出一种新的预测策略和预测模型，主要如下：把中药复方化合物， 根据化学结构相似性打分，分为不同的类别，同一类的化合物，被认为结构类似。化合物结 构类似的化合物，可能作用于相同的靶标，表现相似的理化性质、药代动力学性质和药理活 性，为此，提出一个假说，即：口服中药复方制剂，其中，结构类似的化合物，可能相似的代 谢风险，所以，对于中药复方制剂，可以通过获得一个或者少数几个化合物在体内的血药浓 度-时间曲线，从而预测其他化合物在体内的血药浓度-时间曲线，从而获得相关药代动力 学参数，为中药复方药代动力学提供新思路。
[0005] 为此，本发明提供了一种中药药代动力学的曲线模拟与预测方法，可用于单味药 或者中药复方的结构类似化合物的药代动力学的预测，其通过一些步骤，发现和证实化学 结构相似的成分在口服中药方剂的复杂体系后具有相似的药代动力学变化，即相似的r+ 值；然后，在已知成分A在各时刻的r+值，预测其他结构类似成分的auc-时间曲线，从而 建立药代动力学预测新思路和方法。
[0006] 具体地，该方法包括：
[0007] 步骤1.对成分A分别获得其在单味药和复方药中的血药浓度-时间曲线；
[0008] 步骤2.计算成分A在单味药和复方药中各测量时刻的血药浓度-时间曲线下的 面积AUC，进而获得其AUC-时间变化曲线；
[0009] 步骤3.计算成分A在单味药和复方药中各时刻的AUC之和与平均值的比值r+， 其计算公式如下：
[0011] 其中，xjtihyjti)分别为成分A在复方药及单味药中第i个时刻的AUC;
[0012] 步骤4.对成份B做基于化学结构相似性的聚类分析；
[0013] 步骤5.根据聚类分析结果若成分B与成分A同属一类，则可在已知成分A在各时 刻的r+值，成分B在单味药（或复方药）中的AUC值及其在复方药（或单味药）中第3小 时（即t7时刻）的AUC值的情况下，预测成分B在复方药（或单味药）中第4小时（即18 时刻）及以后的AUC-时间曲线，亦即
[0017]其中，xB(ti)、yB(ti)分别为成分B在复方药及单味药中第i个时刻的AUC。
[0018] 在所述步骤1中，通过高效液相色谱质谱/质谱联用来获得单味药和复方中成分 A的血药浓度-时间曲线。
[0019] 在测试血药浓度时，选择甲酸水-甲醇作为流动相，并且采用电喷雾离子化源 ESI，正离子模式检测，以及多反应检测MRM模式对药物离子浓度进行测定。
[0020] 在测试血药浓度时，于样品前处理采用沉淀蛋白方法。
[0021] 所述步骤2中通过梯形法来计算单味药和复方中成分A在各个时间点的血药浓 度-时间曲线下面积，所述梯形法计算公式如下：
[0023] 其中，A(ti)为复方和单味药中成分A在第i时刻的AUC值，C(ti)为复方和单味 药中成分A在第i时刻的血药浓度，并且、=0，々(0) =0，C(0) =0。
[0024] 本发明的方法和装置具有其它特征和优点，这些其它特征和优点将从结合于此的 附图和以下【具体实施方式】中显而易见，或在附图和【具体实施方式】中详细陈述，附图和具体 实施方式共同用于解释本发明的某些原理。
【附图说明】
[0025] 本发明的其它特征和优点将通过下面的参考附图进行的描述而得以显现，在所述 附图中：
[0026] 图1A、图1B和图1C分别显示紫堇碱（I)、a-别隐品碱（II)、延胡索乙素（III)、 四氢小檗碱（IV)、欧前胡素（V)、异欧前胡素（VI)、白当归素（VII)、华法林钠（麗，IS) 和盐酸异丙嗪（IX，IS)的空白血浆样品色谱图、空白血浆标准添加LL0Q色谱图以及给药2 小时后的血浆样品色谱图；
[0027] 图2为SD大鼠口服不同提取物后a-别隐品碱的平均血药浓度-时间曲线图（n =6)；
[0028] 图3为SD大鼠口服不同提取物后延胡索乙素的平均血药浓度-时间曲线图（n= 6);
[0029] 图4为SD大鼠口服不同提取物后四氢小檗碱的平均血药浓度-时间曲线图（n= 6)；
[0030] 图5为SD大鼠口服不同提取物后紫堇碱的平均血药浓度-时间曲线图（n= 6);
[0031] 图6为SD大鼠口服不同提取物后白当归素的平均血药浓度-时间曲线图（n= 6)；
[0032] 图7为SD大鼠口服不同提取物后欧前胡素的平均血药浓度-时间曲线图（n= 6)；
[0033] 图8为SD大鼠口服不同提取物后异欧前胡素的平均血药浓度-时间曲线图（n= 6)；
[0034] 图9显示基于两两之间化学结构相似性打分的元胡止痛方中的7个成分聚类分析 结果；
[0035] 图10显示7个成分在单味药和复方中的AUC-时间变化曲线；
[0036] 图11显示基于AUC-时间曲线变化的元胡止痛方中的7个成分聚类分析的结果； [0037] 图12显示7个成分的r+值的散点图。
【具体实施方式】
[0038] 现在将具体参考本发明的各个实施方案，在附图中和以下的描述中示出这些实施 方案的实例。虽然本发明与示例性实施方案相结合进行描述，但应当了解，本说明书并非旨 在将本发明限制为那些示例性实施方案。相反，本发明旨在不但覆盖这些示例性实施方案， 而且覆盖可以被包括在由所附权利要求所限定的本发明的精神和范围之内的各种替换、修 改、等效形式以及其它实施方案。
[0039] 在本发明的中药药代动力学的曲线模拟与预测方法中，首先建立元胡止痛方中7 个主要活性成分体内分析方法。
[0040] 元胡止痛方主要有延胡索和白芷两味药组成，延胡索中主要成分为生物碱类化合 物，而白芷中主要成分为香豆素类化合物，对两药的药代动力学研宄方面，国内外文献大多 集中在对延胡索乙素的含量测定，但是中药的特点是多成分共同发挥作用，考察其他成分 在体内的含量也是十分有必要的。为了更好的理解元胡止痛方的药理作用机理、体内过程， 有必要建立一种灵敏而又准确的分析方法，以测定生物样品（如血浆、组织匀浆及尿液）中 主要成分的含量。
[0041] 在本发明中将建立同时测定大鼠血浆样品中的a-别隐品碱、延胡索乙素、四氢 小檗碱、紫堇碱、白当归素、欧前胡素、异欧前胡素等7种主要成分的LC-MS-MS方法。
[0042] 本发明所使用的实验仪器：
[0043] WatersAcquityUPLCSystem,WatersQuattroPremierXE，沃特世科技有限公 司）；MIKR0 220R型离心机，德国Hettich公司；
[0044] MX-S型涡旋混合器，美国SCIL0GEX公司；
[0045] XS205型分析天平，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司。
[0046] 本发明所使用的药品与试剂：
[0047] 乙腈（色谱纯，Merck公司）；
[0048] 甲醇（色谱纯，Merck公司）；
[0049]a_别隐品碱（深圳市美荷生物科技有限公司，批号：20100318,纯度：98% ); [0050] 延胡索乙素（中国食品药品检定研宄院，批号：110726-201011，纯度99.9% );
[0051] 紫堇碱（sigma，批号：S449121，纯度：98% );
[0052] 四氢小檗碱（上海融禾医药科技发展有限公司，批号：100516,纯度：98% );
[0053] 白当归素（成都普思生物科技有限公司，批号：RFS-B-100610-04,纯度99. 9% );
[0054] 异欧前胡素（中国食品药品检定研宄院，批号：110827-200407,纯度：98% );
[0055] 欧前胡素（中国食品药品检定研宄院，批号：110826-200712,纯度：99. 9% )。
[0056] 本发明所使用的药材：
[0057] 白]E(AngelicaDahurica(Fisch.exHoffm. )Benth.etHook.f.)产自河北省；
[0058] 延胡索（CorydalisyanhusuoW.T.Wang)产自杭州，
[0059] 均购于河北省安国中药材有限公司，由中国中医科学院中药研宄所何希荣药师鉴 定为药材正品。
[0060] 本发明所使用的实验动物：
[0061] SD大鼠，雄性，体重230±20g，由北京大学医学部实验动物科学部提供，合格证 号：SCXK(京）2009-0017。在温度20-22°C，相对湿度45% -65%，光照/黑暗12h/12h条 件下饲养，自由饮食、饮水，适应性饲养3天后开始实验。
[0062] 发本明所使用的标准品溶液的配制：
[0063] 分别精密称取a_别隐品碱、延胡索乙素、四氢小檗碱、紫堇碱、白当归素、欧前胡 素和异欧前胡素溶于甲醇中，配成储备液浓度分别为lmg/mL，将储备液用甲醇稀释成不同 浓度的混合溶液 ，分别含a-别隐品碱，四氢小檗碱0. 5,1，2. 5, 5, 25, 50,100和250ng/ml， 含延胡索乙素和紫堇碱1，2, 5,10, 50,100, 200和500ng/ml，含白当归素、欧前胡素和异欧 前胡素2,4,10, 20,100, 200和400和1000ng/ml的标准溶液，用于标准曲线的制备。
[0064] 精密称取内标华法林钠和盐酸异丙嗪溶于甲醇配制成100yg/mL的储备液，分别 稀释为50ng/mL和25ng/mL标准溶液。所有溶液置于-20°C冰箱保存备用。
[0065] 本发明所使用的血浆样品标准曲线和质控（QC)样品的配制：
[0066] 取大鼠空白血浆50y1，加入混合标准系列溶液50y1，配制成相当于a-别隐品 碱与四氢小檗碱的终浓度为〇. 5、1、2. 5、5、25、50、100和250ng/ml，延胡索乙素与紫堇碱的 终浓度为1、2、5、10、50、100、200和500ng/ml，白当归素、欧前胡素与异欧前胡素的终浓度 为2、4、10、20、100、200、400和1000ng/ml的校正样品，除不加甲醇外，其余按"血浆样品前 处理"项下操作。
[0067] QC样品同法稀释配制，浓度分别如下：a-别隐品碱与四氢小檗碱为1、1〇〇、 200ng/ml，延胡索乙素与紫堇碱为2、200、400ng/ml，白当归素、欧前胡素与异欧前胡素为 4、400、800ng/ml〇
[0068] 色谱质谱分析条件：
[0069] 色谱柱：ACQMTYUPLCBH1 (：18柱（2.lmmX50mm，1. 7ym)，流动相：0? 1 % 甲酸 水-甲醇，洗脱程序见表3-1-1，流速：0. 3ml/min，柱温：50°C，进样量：5y1。
[0070] 表1梯度洗脱
[0071]
[0072] 采用电喷雾离子化源（ESI)，正离子模式检测，脱溶剂气为氮气，脱溶剂气温度： 350°C，流速：650L/h，离子源温度：120°C，采用多反应监测（MRM)模式对药物离子浓度进行 测定，7种分析成分及内标的最优MRM参数见表2。
[0073] 表2元胡止痛方中7个成分及2个内标的MS参数
[0076] 血浆样品前处理：
[0077] 取大鼠血浆50y1，依次加入50y1甲醇，150y1含内标（华法林钠50ng/mL和盐 酸异丙嗪25ng/mL)的甲醇溶液，涡旋震荡3min，15000r/min离心lOmin，取上清液200y1， 氮气吹干，用100U1 50%甲醇复溶，祸旋lmin，15000离心5min，取上清液5y1进样，进行 LC-MS分析。
[0078] 对本发明进行的体内分析方法学验证包括：
[0079] (1)方法的专属性考察：
[0080] 将6个不同个体的空白血浆及标准添加血浆（a-别隐品碱与四氢小檗碱为 0. 5ng/ml，延胡索乙素与紫堇碱为lng/ml，白当归素、欧前胡素与异欧前胡素为2ng/ml)， 除不加内标外，其他按"血浆样品前处理"项下的方法操作后进行UPLC-MS/MS分析，比较不 同空白血浆和标准添加血浆的色谱图，以考察空白血浆中的内源性成分是否存在干扰。
[0081] ⑵线性范围与定量下限（LLO? :
[0082] 在方法学确证的三天内每天配制3套标准曲线，以待测物浓度为横坐标，待测物 与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权（W= 1/x2)最小二乘法进行回归运算，求得线性 回归方程即为标准曲线。
[0083] 在方法确证的第三天对标准曲线最低点浓度配制6个样本进行分析，并根据当 日标准曲线计算每一样本测定浓度，LL0Q是标准曲线上的最低浓度点，其响应值应为空白 生物基质干扰物响应值的5倍以上（S/N彡5)，且精密度表示为相对标准偏差（relative standarddeviation，RSD)应<20%，准确度表示为偏倚（bias)，应在±20%范围内。
[0084] (3)精密度与准确度：
[0085] 取空白大鼠血浆50yL，按"血浆样品标准曲线和质控（QC)样品的配制"项同法操 作，配制高、中、低三个浓度（a-别隐品碱与四氢小檗碱为1、100、2001^/1111，延胡索乙素与 紫堇碱为2、200、400ng/ml，白当归素、欧前胡素与异欧前胡素为4、400、800ng/ml)的质控 样品，每一浓度每天进行6样本分析，连续测定三天，根据当日标准曲线计算质控样品的测 得浓度。根据质控样品测定结果计算本法的日内、日间精密度与准确度。
[0086] (4)提取回收率与基质效应：
[0087] 考察待测组分在不同浓度下基质效应的影响，以及该条件下的血浆提取回收率。 配制待测组分的标准添加血浆样品（低、中、高QC浓度，同"血浆样品标准曲线和质控（QC) 样品的配制"项下方法的操作），按照"血浆样品前处理"方法操作后测定浓度（set3样 品）；将空白血浆蛋白沉淀后标准添加待测组分测定浓度（set2样品）；用流动相配制相 应浓度不含基质的纯样品溶液测定浓度（set1样品）。基质效应的计算值为set2样品 与set1样品的色谱峰面积比；提取回收率的计算值为set3样品与set2样品的色谱峰 面积比。同时考察内标华法林钠（50ng/mL)和盐酸异丙嘆（25ng/mL)的基质效应和提取回 收率。
[0088] (5)样品稳定性：
[0089] 方法学验证过程中，对分析样品的稳定性进行考察，包括1次、3次冻融循环后的 稳定性，室温下25°C放置4h的短期稳定性，-20°C冷冻条件下保存2周的长期稳定性，以 及处理后的血浆样品在自动进样器中（4°C)放置12h的稳定性。稳定性考察时，取空白血 浆50yL，按照"血浆样品标准曲线和质控（QC)样品的配制"项下方法制备低、中、高三个浓 度的质控（QC)样品，按1:10加入空白血浆中，每一浓度进行3样本分析，以测定值与标示 浓度相比，以相对偏差（RE)表示。
[0090] 体内分析方法学验证结果如下：
[0091] (1)专属性：
[0092] 空白大鼠血浆，空白血浆外加标准溶液以及大鼠给药后血浆样品色谱图见图1A 至图1C。待测组分和内标的保留时间具体如下：a-别隐品碱为3. 55min、延胡索乙素 为3. 54min、四氢小檗碱为3. 64min、紫堇碱为3. 68min、白当归素为4. 63min、欧前胡素为 5. 76min和异欧前胡素为6. 12min，四氢小檗碱为6. 85min，华法林钠（IS)为4. 49min，盐酸 异丙嘆（IS)为5. 67min，空白血衆中的内源性成分对测定不造成干扰。
[0093] (2)标准曲线与定量下限：
[0094] 3条标准曲线在考察的下列浓度范围内均显示良好的线性关系，a-别隐品碱和 四氢小檗碱：〇. 5-500ng/mL，延胡索乙素和紫堇碱：l-1000ng/mL、白当归素、欧前胡素和异 欧前胡素：2-2000ng/mL，各成分标准曲线相关系数（R2)均大于0.99。定量下限实验结果 显示，在测定浓度下，7种待测成分的日内精密度（RSD)分别为2. 4%、2. 8%、1. 9%、1. 9%、 8. 1 %、3. 9%、1. 7%，准确度（RE)分别为 4. 0%、3. 0%、4. 0%、4. 0%、-9. 0%、-3. 0%、 5.0%。待测成分的线性回归方程见表3。
[0095] 表3 7种成分的线性回归方程
[0098] (3)精密度与准确度：
[0099] 如表4所示，在高、中、低三个浓度下，日内与日间精密度（RSD)分别为1.0%~ 5. 3%与1. 5%~6. 1%，日内与日间准确度（RE)分别为-3. 2%~7. 1%与-7. 0%~7. 5%， 数据表明待测组分在大鼠血浆中的精密度和准确度均符合生物样品的分析要求。
[0100] 表4a-别隐品碱、延胡索乙素、四氢小檗碱、紫堇碱、白当归素、欧前胡素和异欧 前胡素在大鼠血浆中的精密度和准确度（n= 6)
[0102] (4)回收率与基质效应：
[0103] 表5列出了低、中、高3个浓度的待测组分和内标（华法林钠50ng/mL;盐酸异丙 嗪25ng/mL)的基质效应和提取回收率考察结果。提取回收率结果表明，在此血浆前处理方 法下，蛋白沉淀法对7个待测成分的提取回收率均在88. 8%以上。基质效应考察结果显示， 本方法测定条件下血浆中的内源性物质的离子抑制或增强作用可忽略不计，对7种待测成 分的质谱响应没有影响。
[0104] 表5a-别隐品碱、延胡索乙素、四氢小檗碱、紫堇碱、白当归素、欧前胡素和异欧 前胡素在大鼠血浆中的提取回收率和基质效应（n= 6)
[0106] ⑶稳定性：
[0107] 表6a_别隐品碱、延胡索乙素、四氢小檗碱、紫堇碱、白当归素、欧前胡素和异欧 前胡素在大鼠血浆中的稳定性（n= 6)
[0108]
[0109]
[0110] 稳定性考察结果表明7种成分血浆样品经过三次冻融循环 (RE:-10. 4% -10. 9% )，室温下 25°C放置 4h(RE:-5. 5% -I3. 0% )，_2〇°C冷冻条件下保存 2周（RE:-10. 3% -10. 5% )后均稳定，处理后的血浆样品在自动进样器中（4°C)放置12h 稳定（RE:-9. 2% -12. 1% )具体结果见表6〇
[0111] 由以上的表可见，7种成分在储存、处理和测定过程中均保持稳定。
[0112] 经过验证，该分析方法符合生物样品测定的要求。
[0113] 接下来，进行UPLC-MS/MS条件优化、内标的选择以及血浆样品前处理方法的优 化。
[0114] 首先考察流动相，甲醇和乙腈作为流动相色谱峰形都比较好，但是乙腈作为流动 相时，白当归素的响应值是甲醇作为流动相的十分之一，所以，选择甲醇作为流动相。在质 谱分析中，流动相中加入甲酸等酸性成分，可以显著地改善色谱峰形。本文考察了甲酸在水 相中的加入量，发现随着甲酸加入量增加，从0. 05% 、0. 1%和0. 2%，但生物碱类成分的响 应显著增强，而且其峰形也有所改善，因此我们选择了一个合适的甲酸浓度（0. 1% )来兼 顾到所有待测组分的色谱峰形和质谱响应。
[0115] 在对生物样品进行分析时，通常加入内标以校正样品预处理和分析时可能产生的 误差，并且方便样品预处理，提高处理速度。对于以质谱这种高灵敏低稳定性的仪器作为检 测器，内标的加入尤其必要。考虑到我们所分析的为香豆素和生物碱两类化合物，首先通 过分析相似性软件计算候选化合物和待测化合物的结构相似性，大量筛选结构相似的化合 物，通过油水分配系数进一步筛选候选化合物，每一类成分选出3个候选化合物作为内标， 然后根据色谱和质谱的检测结果，选择出最佳的内标，最后我们选择了华法林钠（为香豆 素类成分）和盐酸异丙嗪（为生物碱类成分）两个药物作为这两类成分的内标，分别对其 进行校正。
[0116] 在试验中，我们尝试比较了蛋白沉淀（包括甲醇沉淀，乙腈沉淀和甲醇：乙腈= 1:1沉淀）、液液萃取和固相萃取。蛋白沉淀中，甲醇沉淀方法的回收率要高于乙腈沉淀和 甲醇：乙腈=1:1沉淀，且基质效应比较小；液液萃取分别考察了乙酸乙酯加入12. 5%氨水 和0. 2MNaOH，加入12. 5%氨水的回收率要高于加入0. 2MNaOH，由于液液萃取加碱的方法 基质效应比较大，且蛋白沉淀方法的回收率要高于液液萃取，考虑到后续实验大量的样品， SPE费用高且较费，因此，本实验最终选择了甲醇沉淀蛋白的前处理方法。发现由于样品中 的有机相比例高于流动相中的有机相比例，采取两种方法：一是上清液氮气吹干后以50% 甲醇复溶，二是上清液以等体积水稀释。经过考察发现上清液氮气吹干优于上清液以水稀 释的方法，同时我们还考察了 3,4, 5倍体积的甲醇沉淀血浆蛋白后的质谱响应值，发现3倍 体积的甲醇处理，能将待测组分提取较为完全而稀释较少，从而获得最大的质谱响应。
[0117] 由上可见，在本发明中建立了简单、灵敏而准确的LC-ESI-MS分析方法，用于同时 定量测定大鼠血浆中的a-别隐品碱、延胡索乙素、四氢小檗碱、紫堇碱、白当归素、欧前胡 素和异欧前胡素。样品前处理采用沉淀蛋白方法，简单快捷。本方法专属性好，灵敏度高，其 定量下限分别为〇? 5ng/mL(紫堇碱和延胡索乙素），lng/mL(四氢小檗碱和a-别隐品碱） 和2ng/mL(白当归素、欧前胡素和异欧前胡素），为后续的药代动力学研宄提供了可靠的分 析方法。
[0118] 在下文中，对元胡止痛方7个主要活性成分在大鼠血浆中的药代动力学进行研 宄。
[0119] 为了比较单味药和元胡止痛方对大鼠口服给药后主要活性成分的药代动力学是 否发生变化，我们将延胡索提取物、白芷提取物和元胡止痛方提取物（延胡索：白芷= 2:1)分别对大鼠灌胃，通过单味药和元胡止痛方的药代动力学行为比较，推测两者合并用 药后的相互作用趋势，为元胡止痛方配伍应用提供合理依据和指导。
[0120] 取白芷药材1kg，粉碎过6号筛。浸泡lh，用4倍量70%乙醇回流提取，提取时间 为2h，依次提取2次，合并过滤液，70°C减压干燥至粉末，提取率为9. 52% ;取延胡索药材 lkg，粉碎过6号筛。浸泡lh，用4倍量70%乙醇回流提取，提取时间为2h，依次提取2次， 合并过滤液，70°C减压干燥至粉末，提取率为8. 15%。
[0121] 分别测定延胡索与白芷提取物中主要活性成分的含量，结果表明延胡索提取物中 主要活性成分的含量如下：a-别隐品碱为3. 20mg/kg，紫堇碱为11. 59mg/kg，延胡索乙素 为4. 19mg/kg，四氢小檗碱为1. 13mg/kg，白芷提取物中主要活性成分的含量如下：白当归 素为0? 69mg/kg，欧前胡素为3. 78mg/kg，异欧前胡素为1. 90mg/kg。
[0122] 取一支肝素，每支lg，置于100mL的容量瓶中，用生理盐水定容至刻度，配成1 %的 肝素溶液，共配制500ml，置于4°C储存备用。
[0123] 分别称取延胡索提取物6. 52g，白芷提取物3. 81g，元胡止痛方（延胡索提取物 6. 52g，白芷提取物3. 81g)，加50ml的水溶液研磨成混悬溶液，供大鼠灌胃使用。药液临用 前配制。
[0124] 18只SD大鼠，体重230±20g，随机分为3组，每组6只，雌雄各半，给药前12h禁 食，自由饮水，分别灌胃给予元胡止痛方提取物、白芷提取物和延胡索提取物，给药4h后喂 以饲料。于给药前及给药后〇. 17、0. 33、0. 67、1、1. 5、2、3、4、6、8、12、24、36、48h由眼眶静脉 丛取血约为0. 5mL，肝素抗凝，3500Xg离心lOmin后取血浆，于-20°C保存待测。
[0125] 采用DAS2. 0数据处理软件（中国药理学会数学药理学专业委员会）的非房室模 型法（统计矩法）进行药代动力学参数Cmax、Tmax、t1/2、AUC、MRT、CL/F等的计算。
[0126] 实验中雌性大鼠口服延胡索提取物后，血浆样品药物浓度远远高于雄性大鼠血 药浓度，导致个别血浆样品中紫堇碱的浓度超出了标准曲线的线性范围，对于浓度超出线 性范围的血浆样品，用空白血浆进行稀释后重新测定，考察了样品的稀释效应，实验结果表 明，采用空白血浆稀释高浓度样品后分析，对回收率、血药浓度没有显著影响。
[0127] 对3组SD大鼠灌胃各提取物后，采用上述建立的方法对各时间点血浆进行分析， 血药浓度-时间数据见表7至20,平均血药浓度-时间数据见表21。采用非房室模型法计 算药代动力学参数，结果见表22和23。
[0128] 表7大鼠灌胃给予元延胡索提取物后a-别隐品碱的血药浓度-时间数据（ng/ ml，n= 6)
[0130] n.d?未检测出，在LL0Q以下
[0131] 表8大鼠灌胃给予元胡止痛方提取物后a-别隐品碱的血药浓度-时间数据 (ng/ml，n= 6)
[0133] 表9大鼠灌胃给予延胡索提取物后延胡索乙素的血药浓度-时间数据（ng/ml，n=6)
[0136] n.d.未检测出，在LL0Q以下
[0137] 表10大鼠口服元胡止痛方提取物后延胡索乙素的血药浓度-时间数据（ng/ml， n= 6)
[0138]
[0139] 表11大鼠灌胃给予延胡索提取物后四氢小檗碱的血药浓度-时间数据（ng/ml，n= 6)
[0141] 表12大鼠灌胃给予元胡止痛方提取物后四氢小檗碱的血药浓度-时间数据（ng/ ml,n= 6)
[0142]
[0143] 表13大鼠灌胃给予延胡索提取物后紫堇碱的血药浓度-时间数据（ng/ml，n=6)
[0145] n.d.未检测出，在LL0Q以下
[0146] 表14大鼠灌胃给予元胡止痛方提取物后紫堇碱的血药浓度-时间数据（ng/ml，n =6)
[0148]
[0149]表15大鼠灌胃给予白芷提取物后白当归素的血药浓度-时间数据（ng/ml，n=6)
[0151]表16大鼠灌胃给予元胡止痛方提取物后白当归素的血药浓度-时间数据（ng/ml,n= 6)
[0153]表17大鼠灌胃给予白芷提取物后欧前胡素的血药浓度-时间数据（ng/ml，n= 6)
[0155]表18大鼠灌胃给予元胡止痛方提取物后欧前胡素的血药浓度-时间数据（ng/ml,n= 6)
[0157] 表19大鼠灌胃给予白芷提取物后异欧前胡素的血药浓度-时间数据（ng/ml，n= 6)
[0158]
[0160] 表20大鼠灌胃给予元胡止痛方提取物后异欧前胡素的血药浓度-时间数据（ng/ ml,n= 6)
[0162] 表21平均血药浓度-时间数据
[0163]
[0165] 表22延胡索单用及元胡止痛方口服给药后主要药代动力学参数（n= 6)
[0166]
[0167] **P〈0.01，*P〈0.05 对于延胡索
[0168] 表23白芷单用及元胡止痛方口服给药后主要药代动力学参数（n= 6)
[0170]
[0171] **P〈0.01，*P〈0.05 对于白芷
[0172] 药代动力学参数计算结果表明：如图2所示，SD大鼠灌胃元胡止痛方组和延胡索 组相比，a-别隐品碱的达峰时间有所延长，体内平均驻留时间延长了 〇. 8倍，具有显著性 差异，P〈0. 01，AUC^t和AUC^^与之相比都有所增大，但是不具有统计学意义。
[0173] 如图3所示，元胡止痛方组和延胡索组相比，延胡索乙素的AUC^ t、 MRTft^都有显著性提高，P〈0. 01，达峰时间延长了 3. 8倍，P〈0. 05。
[0174] 如图4所示，元胡止痛方组和延胡索组相比，四氢小檗碱峰浓度提高了 2倍，达峰 时间延长了 4倍，体内平均驻留时间延长了 0. 8倍，P〈0. 01，AUC^ ,和AUC 都显著增大， 具有统计学意义。
[0175] 如图5所示，元胡止痛方组和延胡索组相比，紫堇碱峰浓度有所提高，达峰时间延 长了 2倍，具有统计学意义，体内平均驻留时间延长了 0. 65倍，具有统计学意义，P〈0. 05。
[0176] 图6至图8,分别为来源于白芷中成分白当归素、欧前胡素、异欧前胡素3个成分的 血药浓度-时间曲线图。从图中可以看出，相对于单味药，复方中该3个成分的AUC^ ^口AUCp^都明显减少。同时，从化学成分分类来看，当归素、欧前胡素、异欧前胡素3个成分属 于香豆素成分，与4个生物碱类成分不一样，该3个成分AUC^t和AUC 都明显减少，生 物利用度降低，表示不是同一类成分，化学成分的AUChdPAUC。^^变化不一样，同一类成 分的AUC^ 变化趋势具有一致性。而且，根据文献，香豆素类成分具有肝损伤作 用，上述结果为配伍减毒提供依据。
[0177] 元胡止痛方中延胡索中的生物碱成分是镇痛作用的主要成分，延胡索配伍白芷， 白芷可以延长延胡索中主要生物碱成分的达峰时间，保持有效血药浓度的时间延长，同时 AUC^ ,和AUC ^^显著增大，使血药浓度更长时间处于有效浓度范围内，更好的发挥药效，从 药代动力学的角度，解释了延胡索和白芷伍用的原理。同时，我们从实验结果发现，白芷配 伍延胡索之后，延胡索明显降低了白芷中主要香豆素成分的血药浓度，表明延胡索和白芷 两味中药存在药物-药物相互作用，为元胡止痛方的体内过程研宄奠定了基础。
[0178] 接下来，计算及拟合7个主要成分的AUC-时间曲线。
[0179] 根据如下的梯形法计算公式来计算元胡止痛方中的7个成分的AUC-时间曲线：
[0181]其中，t〇= 0，A(0) = 0，C(0) = 0。
[0182] 由上述公式可得下表：
[0183] 表24药物AUC-时间数据
[0185]
[0186] 对7个主要成分在单味药和复方的AUC-时间曲线变化与化合物结构之间关联性 分析：
[0187]MedChemStudio软件，作为一个可视化化学信息学研宄平台，以Tanimoto系数， 对7个化合物进行结构相似性评价。化合物两两之间的相似性打分见表23.利用SPSS软 件，通过聚类分析（PCA)对两两之间化学结构相似性打分进行分析，结果见图9。
[0188] 从结果中可以看出，a_别隐性碱、紫堇碱、延胡索乙素和四氢小檗碱属于生物碱 类化合物，以结构相似性打分进行聚类分析结果显示，从被分为同一类；欧前胡素、异欧前 胡素和白当归素属于香豆素类化合物，以结构相似性打分进行聚类分析结果显示，从被分 为另一类。
[0189] 表25 7个成分两两之间的化学结构相似性打分
[0190]
[0191] 7个主要成分在单味药和复方的AUC-时间变化曲线计算函数如下：
[0193] 其中，AUCV$在不同时间点，单味药与复方之间成分I的AUC变化；AUCdi为在不 同时间点的单味药的AUC;AUCfi不同时间点的复方的AUC，C_为单味药和复方之间最大的 浓度。
[0194] 在元胡止痛方和单味药中，7个成分AUC-时间变化曲线见图10,从图中可见，随着 时间的延长，香豆素类成分（欧前胡素、异欧前胡素和白当归素）AUCviF断增大，然而，生物 碱类成分（a-别隐性碱、紫堇碱、延胡索乙素和四氢小檗碱）AUCviF断减少。进一步对变 化曲线进行聚类分析，结果显示，3个香豆素类成分（欧前胡素、异欧前胡素和白当归素）被 聚到同一类，4个生物碱类成分（a-别隐性碱、紫堇碱、延胡索乙素和四氢小檗碱），说明化 学结构类似的成分，具有相似的AUCvi变化曲线。
[0195] 通过聚类分析对两两之间化学结构相似性打分进行分析，结果见图11。
[0196] 接下来，利用1个化合物在单味药和复方的AUC-时间曲线变化规律预测其他化合 物在复方中AUC-时间曲线。
[0197] 通过计算各成分在元胡止痛方与延胡索（或白芷）中的AUC之和与其平均值的比 值发现可以将7种成分分为两类，并由此提出一种新的预测方法。
[0198] 首先，计算各个成分在复方和单味药中的AUC之和与其平均值的比值r+，该比值 r+的计算公式如下：
[0200] 其中，x(ti)为在复方中成分I在i时刻的AUC，b(ti)为在单味药中成为I在i时 刻的AUC。
[0201] 各个成分在各个时刻的比值r+见表24。
[0202] 表26各成分在各个时刻的比值r+
[0204] 根据上表做出如图12所示的散点图。
[0205] 由图12可以看出，按接近程度可将上述七条曲线分为两类，S卩a_别隐性碱、延胡 索乙素-S、四氢小檗碱-S与紫堇碱为一类，白当归素、欧前胡素与异欧前胡素-S为另一类。
[0206] 下表为延胡索乙素-S、四氢小檗碱-S、紫堇碱与a_别隐性碱以及欧前胡素、异欧 前胡素-S与白当归素相应r+值间的比值。
[0207] 表27延胡索乙素-S、四氢小檗碱-S、紫堇碱与a-别隐性碱以及欧前胡素、异欧 前胡素-S与白当归素相应r+值间的比值
[0208]
[0209] 通过上表可以看出，在3小时以后相应r+值间的比值全部分布在区间（0.84， 1. 11)中。
[0210] 基于上述理论推测，我们可以采用如下的方法在已知成分A在各时刻的r+值
，成分B在单味药（复方）中的AUC值
及其在复方（单味药）中第 3小时的AUC值x(t7)的情况下，预测成分B在复方（单味药）中4小时及以后的AUC值
[0211] 下面，为叙述方便，简记
，i=0，l，2,… ，n-l。由（1)一（3)可得如下的线形方程组。
[0213]解此方程组，可得如下解：
[0215]亦即
[0217] 实施例1由成分a_别隐性碱的r+值预测成分延胡索乙素-S在元胡止痛方中4 小时后的AUC值
[0218] 此时成分a_别隐性碱对应于时刻&的r+值a(tJ以及延胡索乙素-S在延胡 索中对应于时刻&的AUC值b(t)(i= 7, 8,…，13)如下表。
[0219] 表28a-别隐性碱的r+值a(t)及延胡索乙素-S在延胡索中的AUC值
[0221] 另外x(t7) = 971. 4730917。据（10)(n= 14)可算得延胡索乙素-S在元胡止痛 方中对应于时刻&的AUC值x(t)(i= 8, 9,…，13)。现将相关结果列于下表。
[0222] 表29延胡索乙素-S在元胡止痛方中的AUC实验值与预测值比较情况
[0224] 实施例2由成分a_别隐性碱的r+值预测成分四氢小檗碱-S在元胡止痛方中4 小时后的AUC值
[0225] 根据如上所述的方法，可以得到如下结果：
[0226] 表30四氢小檗碱-S在元胡止痛方中的AUC实验值与预测值比较情况
[0227]
[0228] 实施例3由成分a_别隐性碱的r+值预测成分紫堇碱在元胡止痛方中4小时后 的AUC值
[0229] 根据如上所述的方法，可以得到如下结果：
[0230] 表31紫堇碱在元胡止痛方中的AUC实验值与预测值比较情况
[0232] 实施例4由成分白当归素的r+值预测成分欧前胡素在元胡止痛方中4小时后的 AUC值
[0233] 根据如上所述的方法，可以得到如下结果：
[0234] 表32欧前胡素在元胡止痛方中的AUC实验值与预测值比较情况
[0236]
[0237] 实施例5由成分白当归素的r+值预测成分异欧前胡素-S在元胡止痛方中4小 时后的AUC值
[0238] 根据如上所述的方法，可以得到如下结果：
[0239] 表33欧前胡素在元胡止痛方中的AUC实验值与预测值比较情况
【主权项】
1. 一种中药药代动力学的曲线模拟与预测方法，其在口服中药方剂的复杂体系后，发 现和证实化学结构相似的成分具有相似的药代动力学变化，从而通过已知成分在各时刻的 药代动力学参数来预测其他结构类似成分的药代动力学参数，所述方法包括： 步骤1.对成分A分别获得其在单味药和复方药中的血药浓度-时间曲线； 步骤2.计算成分A在单味药和复方药中各测量时刻的血药浓度-时间曲线下的面积 AUC，进而获得其AUC-时间变化曲线； 步骤3.计算成分A在单味药和复方药中各时刻的AUC之和与平均值的比值Γ+，其计 算公式如下：其中，xA(ti)、yA(ti)分别为成分A在复方药及单味药中第i个时刻的AUC ; 步骤4.对成份B做基于化学结构相似性的聚类分析。 步骤5.根据聚类分析结果若成分B与成分A同属一类，则可在已知成分A在各时刻的 Γ +值，成分B在单味药或复方药中的AUC值及其在复方药或单味药中第3小时的AUC值的 情况下，预测成分B在复方药或单味药中第4小时及以后的AUC-时间曲线，其中第3小时 即t7时刻，第4小时即18时刻，亦即其中，xB Ui)、yBUi)分别为成分B在复方药及单味药中第i个时刻的AUC。2. 根据权利要求1所述的中药药代动力学的曲线模拟与预测方法，其中所述步骤1中 通过高效液相色谱质谱/质谱联用来获得单味药和复方药中成分A的血药浓度-时间曲 线。3. 根据权利要求2所述的中药药代动力学的曲线模拟与预测方法，其中选择甲酸 水-甲醇作为流动相，并且采用电喷雾离子化源ESI，正离子模式检测，以及多反应检测MRM 模式对药物离子浓度进行测定。4. 根据权利要求2所述中药药代动力学的曲线模拟与预测方法，其中于样品前处理采 用沉淀蛋白方法。5. 根据权利要求1所述的中药药代动力学的曲线模拟与预测方法，其中所述步骤2中 通过梯形法来计算单味药和复方药中成分A在各个时间点的血药浓度-时间曲线下面积， 所述梯形法计算公式如下：其中，Aai)为复方和单味药中成分A在第i时刻的AUC值，Cai)为复方和单味药中 成分A在第i时刻的血药浓度，并且、=0，八(0) =0, C(O) =0。
【专利摘要】一种中药药代动力学的曲线模拟与预测方法。其通过一些步骤，发现和证实化学结构相似的成分在口服中药方剂的复杂体系后具有相似的药代动力学变化，即相似的Γ+值；然后，在已知成分A在各时刻的Γ+值，预测其他结构类似成分的AUC-时间曲线，从而建立药代动力学预测新思路和方法,该方法可用于单味药或者中药复方的结构类似化合物的药代动力学的预测。具体包括以下步骤：1、对成分A分别获得其在单味药和复方药中的血药浓度-时间曲线；2、获得其AUC-时间变化曲线；3、计算各时刻的AUC之和与平均值的比值Γ+；4、对成份B做基于化学结构相似性的聚类分析；5、根据聚类分析结果若成分B与成分A同属一类，则可预测成分B的AUC-时间曲线。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN104897791
【申请号】CN201510132249
【发明人】许海玉, 李珂, 杨洪军, 陶野
【申请人】中国中医科学院中药研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年3月25日
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