染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法
染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及刑侦领域的毒物检测方法，特别涉及染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦 含量的检测方法。
【背景技术】
[0002] 唑吡坦（Zolpidem):商品名思诺思，为咪唑并吡啶类催眠药。化学名N，N，6-三甲 基-2-(4-甲苯基）咪唑并[l，2_a]_吡啶-3-乙酰胺，化学结构如下：
[0004] 一般将唑吡坦制成酒石酸盐，为无色无臭黄白色结晶性固体，微溶于水、乙醇和丙 二醇，呈弱碱性，pKa值为6. 2。口服吸收迅速，具有很高的血浆蛋白结合率（92. 5% )，可通 过血脑屏障，脑脊液浓度为血浓度的30~50%，其代谢产物无药理活性，只有不到1 %的原 药从尿中排出。与苯二氮卓类催眠药相比，对受体结合部位有高度选择性，服药后产生明 显的催眠镇静作用，而副作用和不良反应则小的多。虽然唑吡坦安全范围较大，但大剂量 服用也致中毒。中毒表现为不同程度的嗜睡、头昏、乏力，共济失调，恶心，呕吐，个别表现为 兴奋，多语。严重者可引起昏迷，血压下降，休克，呼吸循环抑制，死亡等。口服大量唑吡坦 急性中毒死亡的，往往可同时检出其它镇静安眠药或抗抑郁药物或乙醇。因此不能确定此 类药物确切的中毒量和致死量数据。
[0005] 近年来在毒物分析鉴定中出现一些利用唑吡坦实施自杀、麻醉抢劫、麻醉凶杀、麻 醉强奸的刑事案件。由于该药起效快消除快的代谢特点，给痕量检测提出了较高的要求。但 是，目前尚无人体或其它动物体内唑吡坦的染毒分布数据，特别是固体组织（如心、肝、肾、 脾、肺、脑或肌肉组织）中的染毒分布数据，急需建立动物体（包括人体）内唑吡坦的染毒 分布数据，唑吡坦的刑侦技术检测提供参考。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明在于提供一种染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方 法，建立动染毒大鼠固体组织，尤其是心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织中唑吡坦的染毒分布 数据，为唑吡坦的刑侦技术检测提供参考。
[0007] 本发明是通过如下技术方案实现的：染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测 方法，包括如下步骤：
[0008] (1)样品萃取：取剪碎的心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织样品，采用液液萃取，将 心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织样品中的唑吡坦萃取出来；
[0009] (2)仪器检测：利用GC/NH)仪、GC/MS仪或LC-MS/MS仪对萃取物进行定性和定量 检测，确定心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织样品中唑吡坦的含量。
[0010] 上述染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，在步骤（1)中的液液萃取 包括如下步骤：加入有机溶剂和缓冲溶液，振荡混匀，分离有机相，再加入有机相进行第二 次提取，合并两次有机相，置于50°C浓缩仪上挥干；残渣用甲醇定容，转移至进样瓶内，供 气相色谱或气相色谱-质谱仪分析；若供液相色谱-串联质谱仪分析，则残渣用甲醇定容， 用微孔有机滤膜过滤并转移至进样瓶内，供液相色谱-串联质谱仪分析检测。
[0011] 上述染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，在步骤（1)中的液液萃取 包括如下步骤：
[0012] 向心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织样品中加入甲醇，每克固体组织中加入0.2mL 甲醇，混旋，再加入硼砂-氢氧化钠缓冲液或氢氧化钠溶液调节pH为9~10,振荡混匀； 每1克固体组织样品加入5mL~10mL的有机溶剂，振荡10min，8000rpm离心lOmin;分离 有机相后，再加入5mL~10mL的有机溶剂进行第二次提取，分离，合并两次有机相；残渣加 入50yL~100yL甲醇定容，转移至进样瓶内，供气相色谱和气相色谱-质谱仪分析；若供 液相色谱-串联质谱仪分析，则残渣用200yL~1000yL甲醇定容，用微孔有机滤膜过滤 并转移至进样瓶内，供供液相色谱-串联质谱仪分析检测。
[0013] 上述染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，所述有机溶剂为二氯甲 烷；或乙酸乙酯；或者二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶液，二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为 1 :4 ;或乙酸乙酯、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚的混合溶液，乙酸乙酯、乙基甲基酮和丁基 乙烯基醚体积比为2:1:1 ;或二氯甲烷、乙酸乙酯、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚的混合溶 液，二氯甲烷、乙酸乙酯、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚的体积比为1:2:1: 1。
[0014] 上述染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，在步骤（2)中，GC/NPD 仪条件：a)色谱柱：DB-1柱，30mX0. 32mmX0. 25ym;b)色谱柱温程：200°C保持lmin，以 10°C/min速率升温至280°C，保持lOmin;c)进样口温度：280°C;d)检测器温度：300°C;e) 载气：氮气，纯度 > 99. 999%;f)分流比：5:1 ~50:1 ;g)柱流量：1.OmL/min~2.OmL/min。
[0015] 上述染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，在步骤（2)中，GC/MS仪 条件：a)色谱柱：DB-1MS柱，30mX0. 32mmX0. 25ym;b)色谱柱温程：100°C保持2min，以 15°C/min速率升温至280°C，保持17min;c)进样口温度：280°C;d)传输线温度：230°C;e) 离子源温度：200°C;f)载气：高纯氦气，纯度> 99. 999%;g)柱流量：lmL/min~2mL/min; h)分流比：5:1~50:1 ;i)质量扫描范围：40amu~450amu;j)扫描方式：全扫描SCAN。
[0016] 上述染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，在步骤（2)中：液相色 谱-串联质谱仪配有电喷雾离子源（ESI)和三重四极杆质量分析器，扫描方式：正离子扫 描ESI+ ;检测方式：多反应监测MRM;电喷雾电压：5500KV;离子源温度：650°C;雾化气压 力：55psi;气帘气压力：30psi;辅助气压力：50psi;色谱柱为ZORBAXEclipsePlusC18， 2.1_^10〇111111，1.8 11111;流动相六为含0.1%甲酸的51111醋酸铵，流动相8为乙腈；以流动相 B的比例进行说明梯度洗脱条件如下：初始体积10%保持0.lmin后，1.Omin增至60%保持 1.Omin，2.lmin下降至 10%并保持 1. 9min。
[0017] 本发明的有益效果是：本发明染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法， 建立动染毒大鼠固体组织，尤其是心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织中唑吡坦的染毒分布数 据，可以为唑吡坦的刑侦技术检测提供参考。
【附图说明】
[0018] 图1灌注唑吡坦大鼠的实验设计图；
[0019] 图2血样中唑吡坦色谱图；
[0020] 图3肝组织中唑吡坦色谱图；
[0021] 图4血添加工作曲线；
[0022] 图5肝添加工作曲线；
[0023] 图6 0. 5h急性染毒大鼠体内各组织及血液中唑吡坦含量；
[0024] 图7急性染毒大鼠体内血药浓度唑吡坦变化趋势；
[0025] 图8急性染毒大鼠体内肝药浓度唑吡坦变化趋势；
[0026] 图9唑吡坦的平均血药浓度-时间曲线（n= 6);
[0027] 图10唑吡坦的总离子流图（RT12. 7);
[0028] 图 11 唑吡坦的质谱图（m/z235, 236, 307);
[0029] 图12唑吡坦的液相色谱-串联质谱提取离子流图（RT1. 66)。
【具体实施方式】
[0030] 为清楚说明本发明中的方案，下面给出优选的实施例并结合附图详细说明。
[0031] 一、试剂
[0032] a)二氯甲烷、乙酸乙酯、乙基甲基酮、丁基乙烯基醚、硼砂、磷酸二氢钠、磷酸氢二 钠、氢氧化钠等溶剂均为分析纯；唑吡坦购于国家麻醉品实验室；灌胃液的配制：称量唑吡 坦600mg溶于60mL生理盐水中，混勾，配制成10mg/mL的灌胃液；
[0033] b)甲醇、乙腈、甲酸、醋酸铵等溶剂均为色谱纯；
[0034] c)磷酸盐缓冲液（pH= 6):取磷酸氢二钠（Na2HP04 ? 12H20)8. 812g，磷酸二氢钠 (NaH2P04 ? 2H20)27. 37g，加入一定量的一级水溶解并稀释至lOOOmL;
[0035] d)硼砂-氢氧化钠缓冲液（pH= 10):取硼砂（Na2B407 ? 10H20)试剂2. 38g，氢 氧化钠试剂0. 86g,加入100mL-级水溶解并稀释至500mL;
[0036] e)含0. 1%甲酸的5mM醋酸铵：称取0. 192g的醋酸铵，加入一定量的一级水溶 解，并加入〇. 5mL甲酸混匀，将混合液用一级水稀释至500mL;
[0037] f)标准储备液：精确称取唑吡坦标准品50mg于50mL容量瓶中，加一定量甲醇溶 解并稀释至刻度，摇匀，配制成l.Omg/mL唑吡坦标准储备液，置于冰箱中冷冻保存6个月；
[0038] g)标准工作液：精确量取唑吡坦标准储备液1.OmL于10mL容量瓶中，用甲醇稀释 至刻度，配制成100.0yg/mL的唑吡坦标准工作液。4°C冷藏保存3个月。试验中所用其它 浓度的标准溶液均从上述标准储备溶液中用甲醇稀释制备，并冷藏保存3个月。
[0039] 二、仪器和材料
[0040] a)气相色谱仪：配有氮磷检测器（NPD);
[0041] b)气相色谱-质谱仪：配有电子轰击源（EI);
[0042] c)液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI)和三重四极杆质量分析器；
[0043] d)电子天平：感量0?lmg;
[0044]e)高速离心机；
[0045]f)振荡器；
[0046]g)浓缩仪；
[0047]h)固相萃取柱：0a.SisWlILB柱（3CC, 60mg)，购自water s公司；
[0048]i)pH试纸：范围1~14 ;
[0049]j)移液器：100yL和 1000uL;
[0050] k)微孔有机滤膜：0? 22ym;
[0051] 1)实验动物雄性SD大鼠72只，体重180g±30g。购于山西医科大学实验动物中 心，适应性喂养3天。饲养环境：温度17°C，湿度45%~65%，通风换气良好，光照合理，笼 具和垫料卫生、无毒。喂营养颗粒饲料和高压消毒灭菌水。
[0052]二、检验
[0053] 3. 1大鼠分组、染毒与检材的采取：72只SD雄性大鼠随机分为9组，禁食12h。其中 1组作为空白对照组，给予生理盐水灌胃，余给予唑吡坦溶液灌胃。实验组大鼠灌胃褪黑 素溶液，剂量为l〇〇mg/kg(根据人与大鼠体表面积换算）；分别于灌胃0. 5h、lh、2h、3h、4h、 6h、15h、24h不同时间间隔后脱臼处死，立即解剖取心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、血液，-20°C 冰冻保存，待萃取检测。具体见图1。
[0054] 3. 2样品的处理方法
[0055] 3. 2. 1血液提取-固相萃取
[0056] 血样预处理：lmL血加pH为6的磷酸缓冲液3mL，充分混旋，振荡20min，8000r/min 离心20min，上清液待过柱；
[0057] 柱活化：取固相柱HLB柱，依次以3mL甲醇、3mL水活化；
[0058] 过柱：各检材离心液分别过柱，流速1.OmL/min~1. 5mL/min;
[0059] 淋洗：甲醇-水3mL淋洗（甲醇的体积分数为5 % );
[0060] 洗脱：用4mL二氯甲烷洗脱，收集洗脱液；
[0061] 挥干定容：60°C空气吹干仪上吹干，残留物用100yL乙醇溶解供分析。
[0062] 3. 2. 2固体组织提取-液液萃取
[0063] 取lg固体组织剪碎，加入0. 2mL甲醇充分混旋，加入硼砂-氢氧化钠缓冲液调节 pH为9,振荡混勾；加入9mL二氯甲烧，振荡10min，8000rpm离心lOmin;分离有机相后，加 二氯甲烷9mL进行第二次提取，合并两次有机相。置于50°C快速浓缩仪上挥干。残渣加入 100yL甲醇定容，转移至进样瓶内供GC/NH)分析。
[0064] 3. 3 仪器
[0065] GC/NH)仪条件：a)色谱柱：DB-1 柱，30mX0. 32mmX0. 25ym;b)色谱柱温程： 200°C保持lmin，以10°C/min速率升温至280°C，保持lOmin;c)进样口温度：280°C;d)检测 器温度：300°C;e)载气：氮气，纯度> 99. 999%;f)分流比：5:1~50:1 ;g)柱流量：1.0mL/ min~2.OmL/min〇
[0066]GC/MS仪条件：a)色谱柱：DB-1MS柱，30mX0.32mmX0.25ym;b)色谱柱温程： 100°C保持2min，以15°C/min速率升温至280°C，保持17min;c)进样口温度：280°C;d)传 输线温度：230°C;e)离子源温度：200°C;f)载气：高纯氦气，纯度> 99. 999% ;g)柱流量： 1ml,/min~2mT,/min;h)分流比：5:1 ~50:1 ;i)质量扫描范围：40amu~450amu;j)扫描 方式：全扫描SCAN。
[0067] 液相色谱-串联质谱仪配有电喷雾离子源（ESI)和三重四极杆质量分析器，扫 描方式：正离子扫描ESI+ ;检测方式：多反应监测MRM;电喷雾电压：5500KV;离子源温 度：650°C;雾化气压力：55psi;气帘气压力：30psi;辅助气压力：50psi;色谱柱为Z0RBAX EclipsePlusC18, 2. 1_X100mm，1.8ym;流动相A为含0.1 %甲酸的5mM醋酸按溶液，流 动相B为乙腈；以流动相B的比例进行说明梯度洗脱条件如下表所示：初始体积10%保持 0?lmin后，1.Omin增至 60%保持 1.Omin，2.lmin下降至 10%并保持 1. 9min。
[0068] 流动相和梯度洗脱条件
[0070] 监测离子对、去簇电压、碰撞能如下表所示：
[0071] 监测离子对、锥孔电压、碰撞能
[0073] 3. 4 结果
[0074] 3. 4. 1唑吡坦急性中毒表现
[0075] 对照组大鼠在生理盐水灌胃后至处死的2h内，状态良好，反应灵敏，易惊，行动 迅速。实验组大鼠在给药约5min-20min左右陆续出现行为迟缓，反应迟钝，昏睡等现象， 2h时仍处于睡眠状态，持续4-6h陆续苏醒，但行为仍较迟缓。12h组处死时，反应较前灵 敏，过激，甚至出现攻击人的现象。
[0076] 3. 4. 2样品的色谱图
[0077] 按GC/NPD仪条件进样，唑吡坦保留时间为13.Omin。血样中唑吡坦色谱图见图2。 肝组织中唑吡坦色谱图见图3。
[0078] 按GC/NPD仪条件进样，唑吡坦具有良好的色谱峰，分离完全，保留时间为 12. 722min，离子峰为235. 301 ;具体参见图10和图11。
[0079] 按液相色谱-串联质谱条件进样，唑吡坦的液相色谱-串联质谱提取离子流图参 见图12。
[0080] 3. 5唑吡坦工作曲线
[0081] 取 1ml空白大鼠血 7 份，分别添加 0? 03yg、0. 06yg、0. 1yg、0. 5yg、1yg、5yg、 lOyg的唑吡坦甲醇工作液混匀，按3. 2. 1中固相萃取方法进行提取，残渣用100yL甲醇定 容，供GC/NH)分析。以唑吡坦浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做线性回归。血中唑吡坦工 作曲线为Y= 380066. 2X-22367. 4,线性范围0. 03~10yg/mL，R2= 0. 9997。血添加工作 曲线参见图4。
[0082] 取lg空白大鼠肝5份，剪碎，分别加入0? 1yg、0. 5yg、lyg、5yg、10yg的挫P比 坦甲醇工作液混匀，然后按3. 2. 2中液液萃取方法进行提取，残渣用100yL甲醇定容，GC/ NH)测定。以唑吡坦浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做线性回归。肝脏的唑吡坦工作曲线为 Y= 196156X-8833. 48,线性范围0. 1~10yg/g，R2= 0. 9986。肝添加工作曲线参见图5。
[0083] 3. 6唑吡坦在急性中毒大鼠体内的分布
[0084] 将冰冻保存的血液及组织（心血、肝、肾、胃、心、肺、脑、脾、肌肉）于室温下解冻， 按前述方法提取、挥干，经GC/NPD检测唑吡坦含量。结果见表1。从表1唑吡坦在急性染 毒大鼠体内分布数据中，可表明唑吡坦广泛分布于各组织体液中。图6显示0. 5h时染毒大 鼠体内血液中唑吡坦浓度低于大部分组织脏器肾、肝、脾、肺，表明组织脏器为唑吡坦的主 要储存器官。图7显示大鼠在急性染毒后血药浓度很快吸收至高峰，之后呈快速下降趋势， 24h时趋势于0。图8显示大鼠在急性染毒后肝药浓度很快吸收至高峰，之后呈快速下降趋 势，24h时已完全代谢完。其它组织脏器的药物浓度也呈相似的变化。数据表明低剂量染毒 的唑吡坦吸收快，代谢快，24h时几乎检测不到。
[0085] 表1唑吡坦在染毒大鼠体内分布数据
[0086]
[0087] 将表1中平均血药浓度-时间数据采用WinNonlin代谢动力学软件处理。结果显 示（见图9)，唑吡坦的毒代动力学行为均符合一室开放模型，即体内药物很快在各部位达 到平衡，即血液浓度和全身各组织器官部位浓度迅速达到平衡。代谢动力参数如下所示：
[0088]
[0089] 3. 7 讨论
[0090] 3. 7. 1唑吡坦中毒反应
[0091] 唑吡坦为新型催眠药非苯二氮卓类，人体的口服治疗量一般为10mg-20mg。唑吡 坦的安全范围也很大，至今未见其中毒量和致死量的数据报到。本研宄按照人口服剂量的 100倍灌胃，根据大鼠与人体体表面积折算确定大鼠的给药剂量为l〇〇mg/kg。空白对照组 大鼠在等量生理盐水灌胃后至处死时，表现反应灵敏，行为敏捷，食欲和饮水旺盛，处死时 反抗激烈。实验组大鼠在给药约5min-20min左右陆续出现行为迟缓，反应迟钝、昏睡、触之 不醒等症状，l_2h时触之可醒，但很快入睡，4-6h陆续醒来，但进食饮水较少，活动较少，反 应和行动显迟钝，6h之后活动及进食增多，反应和行动较前灵敏，持续到脱白处死时。本发 明的测试结果表明，较大剂量的唑吡坦灌胃后在较短时间内由消化道吸收入体，很快到达 中枢发挥作用，代谢同样很快，6h后即渐渐恢复。
[0092] 3. 7. 2动物模型的建立
[0093] 本发明建立了唑吡坦在染毒大鼠体内的动态分布模型，研宄发现在染毒大鼠模型 中，给药后很快出现睡眠抑制状态，呼吸频率减慢，胸式呼吸渐弱，腹式呼吸增强，肌肉松 弛，触之不动等反应。本发明所建立动物模型的表现和生命体征符合唑吡坦中毒的表现，可 应用于唑吡坦案件的法医学鉴定的实验研宄。
[0094] 3. 7. 3染毒大鼠体内的唑吡坦分布
[0095] 唑吡坦是弱碱性亲脂性药物，从消化道很快吸收入血。从实验结果可见急性染毒 大鼠在0. 5h时血药浓度达到高峰，说明唑吡坦吸收很快，短时间内达到高峰。此时体内各 组织和血液中唑吡坦浓度大小依次是：肝〉肺〉脾〉肾〉心〉心血〉脑〉肌肉，其中肝、肺 中唑吡坦浓度分别是血药浓度的3. 43倍、2. 17倍。说明唑吡坦随血流到达组织后，更容易 与组织蛋白结合，而且对组织器官无特异选择性，广泛分布于肝、肾、心、肺、脾组织上。0. 5h 时各组织中的唑吡坦浓度和血药浓度均达到高峰值，之后各组织脏器与血液中血药浓度呈 逐渐下降趋势，24h时除血液和肾脏有微量的唑吡坦外均检不出来，说明唑吡坦吸收快，降 解也快，很快在体内消失无踪。另外，从数据上看褪黑素很容易通过血脑屏障，进入大脑，从 而发挥中枢抑制作用。
[00 96] 3. 7. 4法医学意义
[0097]目前，作为一种新型非苯二氮卓类催眠药，唑吡坦被自杀者、不法分子所利用，在 法庭科学中出现。鉴于以上唑吡坦的分布代谢特点，建议法医师们在涉及唑吡坦的麻抢案 例中，尽早提取生物检材，以免错过最佳检测时机。在死亡案件中，若缺少合适的血液检材 时，也可选取脾、肺、肝、脑等组织为检验材料，结合病理报告综合分析做出结论。而且，唑吡 坦安全范围较大，较少直接引发死亡，在死因的判定中，注意多药物协同作用或其它原因导 致的死亡。
[0098] 3. 7. 5液液萃取条件的优化
[0099] 分别三份空白肝，每份lg，分别添加标准工作液，分别配制成肝添加浓度为 10yg/g、1yg/g、〇. 1yg/g的含唑吡坦肝组织样品溶液，每种浓度平行做3份。分别按照如 下液液萃取条件一至液液萃取条件五萃取后供GC/NH)分析，所得峰面积与相应标准的峰 面积进行比较，评价不同液液萃取条件的萃取回收率。
[0100] 液液萃取条件一
[0101] 分别加入pH为10的硼砂-氢氧化钠缓冲液2mL，振荡混匀；再加入10mL二氯甲 烧，振荡10min，8000rpm离心lOmin，分离有机相后，再加二氯甲烧10mL进行第二次提取， 合并两次有机相，置于50°C浓缩仪上挥干；残渣加入100yL甲醇定容，转移至进样瓶内，供 GC/NH)分析。萃取回收率如下表所示：
[0102] 液液萃取条件一的平均萃取回收率
[0104] 液液萃取条件二
[0105] 分别加入硼砂-氢氧化钠缓冲液，调节含唑吡坦肝组织样品溶液的pH为9,振荡混 匀；加入10mL的乙酸乙醋，振荡lOmin，离心lOmin;分离有机相后，再加入10mL的乙酸乙酯 进行第二次提取，分离，合并两次有机相；残渣加入100UL甲醇定容，转移至进样瓶内，供 GC/NH)分析。萃取回收率如下表所示：
[0106] 液液萃取条件二的平均萃取回收率
[0107]
[0108] 液液萃取条件三
[0109] 分别加入硼砂-氢氧化钠缓冲液，调节含唑吡坦肝组织样品溶液的pH为9,振荡混 匀；加入10mL乙酸乙酯、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚的混合溶液，乙酸乙酯、乙基甲基酮和 丁基乙烯基醚体积比为2 :1:1，振荡1〇1^11，离心1〇1^11;分离有机相后，再加入1〇 1^乙酸乙 酯、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚的混合溶液，乙酸乙酯、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚体积比 为2:1:1，进行第二次提取，分离，合并两次有机相；残渣加入100yL甲醇定容，转移至进样 瓶内，供GC/NPD分析。萃取回收率如下表所示：
[0110] 液液萃取条件二的平均萃取回收率
[0112] 液液萃取条件四
[0113] 分别加入硼砂-氢氧化钠缓冲液，调节含唑吡坦肝组织样品溶液的pH为9,振荡混 匀；加入10mL二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶液，二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为1 :4,振荡 lOmin，离心lOmin;分离有机相后，再加入10mL二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶液，二氯甲烷 和乙酸乙酯的体积比为1 :4,进行第二次提取，分离，合并两次有机相；残渣加入lOOyL甲 醇定容，转移至进样瓶内，供GC/NH)分析。萃取回收率如下表所示：
[0114] 液液萃取条件四的平均萃取回收率
[0116] 液液萃取条件五
[0117] 分别加入硼砂-氢氧化钠缓冲液，调节含唑吡坦肝组织样品溶液的pH为9,振荡混 匀；加入10mL二氯甲烷、乙酸乙酯、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚的混合溶液，二氯甲烷、乙 酸乙醋、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚的体积比为1:2:1: 1，振荡lOmin，离心lOmin;分离有 机相后，再加入10mL二氯甲烷、乙酸乙酯、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚的混合溶液，二氯甲 烷、乙酸乙酯、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚的体积比为1:2:1:1，进行第二次提取，分离，合 并两次有机相；残渣加入100UL甲醇定容，转移至进样瓶内，供GC/NH)分析。萃取回收率 如下表所示：
[0118] 液液萃取条件五的平均萃取回收率
[0120] 3. 7. 6检测方法比较
[0121] 气相色谱法、气相色谱-质谱法以及液相色谱-串联质谱法的检测限如下表所 示：
[0122] 生物样品中唑吡坦的检测限
[0124] 上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明创造所作的举例，而并非对本发明创造具 体实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出 其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的 精神和原则之内所引伸出的任何显而易见的变化或变动仍处于本发明创造权利要求的保 护范围之中。
【主权项】
1. 染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 样品萃取：取剪碎的心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织样品，采用液液萃取，将心、 肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织样品中的唑吡坦萃取出来； (2) 仪器检测：利用GC/Nro仪、GC/MS仪或LC-MS/MS仪对萃取物进行定性和定量检测， 确定心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织样品中唑吡坦的含量。2. 根据权利要求1所述的染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，其特征在 于，在步骤（1)中的液液萃取包括如下步骤：加入有机溶剂和缓冲溶液，振荡混匀，分离有 机相，再加入有机相进行第二次提取，合并两次有机相，置于50°C浓缩仪上挥干；残渣用甲 醇定容，转移至进样瓶内，供气相色谱或气相色谱-质谱仪分析；若供液相色谱-串联质谱 仪分析，则残渣用甲醇定容，用微孔有机滤膜过滤并转移至进样瓶内，供液相色谱_串联质 谱仪分析检测。3. 根据权利要求2所述的染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，其特征在 于，在步骤（1)中的液液萃取包括如下步骤： 向心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织样品中加入甲醇，每克固体组织中加入〇.2mL甲醇， 混旋，再加入硼砂-氢氧化钠缓冲液或氢氧化钠溶液调节pH为9~10,振荡混匀；每1克 固体组织样品加入5mL~IOmL的有机溶剂，振荡10min，8000rpm离心IOmin ;分离有机 相后，再加入5mL~IOmL的有机溶剂进行第二次提取，分离，合并两次有机相；残渣加入 50 y L~100 y L甲醇定容，转移至进样瓶内，供气相色谱和气相色谱-质谱仪分析；若供液 相色谱-串联质谱仪分析，则残渣用200yL~1000yL甲醇定容，用微孔有机滤膜过滤并 转移至进样瓶内，供供液相色谱-串联质谱仪分析检测。4. 根据权利要求3所述的染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，其特征 在于，所述有机溶剂为二氯甲烷；或乙酸乙酯；或者二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶液，二氯 甲烷和乙酸乙酯的体积比为1 :4 ;或乙酸乙酯、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚的混合溶液，乙 酸乙酯、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚体积比为2:1:1 ;或二氯甲烷、乙酸乙酯、乙基甲基酮 和丁基乙烯基醚的混合溶液，二氯甲烷、乙酸乙酯、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚的体积比为5.根据权利要求1-4任一所述的染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，其 特征在于，在步骤⑵中，GC/NH)仪条件：a)色谱柱：DB-1柱，30mX0. 32mmX0. 25 ym ;b) 色谱柱温程：200°C保持lmin，以10°C /min速率升温至280°C，保持IOmin ;c)进样口温度： 280°C ;d)检测器温度：300°C ;e)载气：氮气，纯度>99. 999% ;f)分流比：5:1~50:1 ;g) 柱流量：1. OmT ,/mi n~2. OmT ,/mi n 〇6. 根据权利要求1-4任一所述的染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法， 其特征在于，在步骤⑵中，GC/MS仪条件：a)色谱柱：DB-1MS柱，30mX0. 32mmX0. 25 ym ; b)色谱柱温程：100°C保持2min，以15°C /min速率升温至280°C，保持17min;c)进样 口温度：280°C ;d)传输线温度：230°C ;e)离子源温度：200°C ;f)载气：高纯氦气，纯度 >99. 999% ;g)柱流量：lmL/min~2mL/min ;h)分流比：5:1~50:1 ;i)质量扫描范围： 40amu~450amu ; j)扫描方式：全扫描SCAN。7. 根据权利要求1-4任一所述的染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，其 特征在于，在步骤（2)中：液相色谱-串联质谱仪配有电喷雾离子源（ESI)和三重四极杆质 量分析器，扫描方式：正离子扫描ESI+ ;检测方式：多反应监测MRM;电喷雾电压：5500KV; 离子源温度：650°C;雾化气压力：55psi;气帘气压力：30psi;辅助气压力：50psi;色谱柱 为ZORBAXEclipsePlusC18, 2.ImmX100mm，1.8ym;流动相A为含 0.1 % 甲酸的 5mM醋 酸按，流动相B为乙腈；以流动相B的比例进行说明梯度洗脱条件如下：初始体积10%保持 0?Imin后，I.Omin增至 60%保持I.Omin，2.Imin下降至 10%并保持I. 9min。
【专利摘要】本发明公开染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，包括如下步骤：(1)样品萃取：取剪碎的心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织样品，采用液液萃取，将心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织样品中的唑吡坦萃取出来；(2)仪器检测：利用GC/NPD仪、GC/MS仪或LC-MS/MS仪对萃取物进行定性和定量检测，确定心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织样品中唑吡坦的含量。
【IPC分类】G01N30/06, G01N30/02
【公开号】CN104897803
【申请号】CN201510223568
【发明人】张蕾萍, 栾玉静, 杜鸿雁, 董颖, 张云峰, 崔冠峰, 何毅, 于忠山
【申请人】公安部物证鉴定中心
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月5日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及刑侦领域的毒物检测方法，特别涉及染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦 含量的检测方法。
【背景技术】
[0002] 唑吡坦（Zolpidem):商品名思诺思，为咪唑并吡啶类催眠药。化学名N，N，6-三甲 基-2-(4-甲苯基）咪唑并[l，2_a]_吡啶-3-乙酰胺，化学结构如下：
[0004] 一般将唑吡坦制成酒石酸盐，为无色无臭黄白色结晶性固体，微溶于水、乙醇和丙 二醇，呈弱碱性，pKa值为6. 2。口服吸收迅速，具有很高的血浆蛋白结合率（92. 5% )，可通 过血脑屏障，脑脊液浓度为血浓度的30~50%，其代谢产物无药理活性，只有不到1 %的原 药从尿中排出。与苯二氮卓类催眠药相比，对受体结合部位有高度选择性，服药后产生明 显的催眠镇静作用，而副作用和不良反应则小的多。虽然唑吡坦安全范围较大，但大剂量 服用也致中毒。中毒表现为不同程度的嗜睡、头昏、乏力，共济失调，恶心，呕吐，个别表现为 兴奋，多语。严重者可引起昏迷，血压下降，休克，呼吸循环抑制，死亡等。口服大量唑吡坦 急性中毒死亡的，往往可同时检出其它镇静安眠药或抗抑郁药物或乙醇。因此不能确定此 类药物确切的中毒量和致死量数据。
[0005] 近年来在毒物分析鉴定中出现一些利用唑吡坦实施自杀、麻醉抢劫、麻醉凶杀、麻 醉强奸的刑事案件。由于该药起效快消除快的代谢特点，给痕量检测提出了较高的要求。但 是，目前尚无人体或其它动物体内唑吡坦的染毒分布数据，特别是固体组织（如心、肝、肾、 脾、肺、脑或肌肉组织）中的染毒分布数据，急需建立动物体（包括人体）内唑吡坦的染毒 分布数据，唑吡坦的刑侦技术检测提供参考。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明在于提供一种染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方 法，建立动染毒大鼠固体组织，尤其是心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织中唑吡坦的染毒分布 数据，为唑吡坦的刑侦技术检测提供参考。
[0007] 本发明是通过如下技术方案实现的：染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测 方法，包括如下步骤：
[0008] (1)样品萃取：取剪碎的心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织样品，采用液液萃取，将 心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织样品中的唑吡坦萃取出来；
[0009] (2)仪器检测：利用GC/NH)仪、GC/MS仪或LC-MS/MS仪对萃取物进行定性和定量 检测，确定心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织样品中唑吡坦的含量。
[0010] 上述染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，在步骤（1)中的液液萃取 包括如下步骤：加入有机溶剂和缓冲溶液，振荡混匀，分离有机相，再加入有机相进行第二 次提取，合并两次有机相，置于50°C浓缩仪上挥干；残渣用甲醇定容，转移至进样瓶内，供 气相色谱或气相色谱-质谱仪分析；若供液相色谱-串联质谱仪分析，则残渣用甲醇定容， 用微孔有机滤膜过滤并转移至进样瓶内，供液相色谱-串联质谱仪分析检测。
[0011] 上述染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，在步骤（1)中的液液萃取 包括如下步骤：
[0012] 向心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织样品中加入甲醇，每克固体组织中加入0.2mL 甲醇，混旋，再加入硼砂-氢氧化钠缓冲液或氢氧化钠溶液调节pH为9~10,振荡混匀； 每1克固体组织样品加入5mL~10mL的有机溶剂，振荡10min，8000rpm离心lOmin;分离 有机相后，再加入5mL~10mL的有机溶剂进行第二次提取，分离，合并两次有机相；残渣加 入50yL~100yL甲醇定容，转移至进样瓶内，供气相色谱和气相色谱-质谱仪分析；若供 液相色谱-串联质谱仪分析，则残渣用200yL~1000yL甲醇定容，用微孔有机滤膜过滤 并转移至进样瓶内，供供液相色谱-串联质谱仪分析检测。
[0013] 上述染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，所述有机溶剂为二氯甲 烷；或乙酸乙酯；或者二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶液，二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为 1 :4 ;或乙酸乙酯、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚的混合溶液，乙酸乙酯、乙基甲基酮和丁基 乙烯基醚体积比为2:1:1 ;或二氯甲烷、乙酸乙酯、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚的混合溶 液，二氯甲烷、乙酸乙酯、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚的体积比为1:2:1: 1。
[0014] 上述染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，在步骤（2)中，GC/NPD 仪条件：a)色谱柱：DB-1柱，30mX0. 32mmX0. 25ym;b)色谱柱温程：200°C保持lmin，以 10°C/min速率升温至280°C，保持lOmin;c)进样口温度：280°C;d)检测器温度：300°C;e) 载气：氮气，纯度 > 99. 999%;f)分流比：5:1 ~50:1 ;g)柱流量：1.OmL/min~2.OmL/min。
[0015] 上述染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，在步骤（2)中，GC/MS仪 条件：a)色谱柱：DB-1MS柱，30mX0. 32mmX0. 25ym;b)色谱柱温程：100°C保持2min，以 15°C/min速率升温至280°C，保持17min;c)进样口温度：280°C;d)传输线温度：230°C;e) 离子源温度：200°C;f)载气：高纯氦气，纯度> 99. 999%;g)柱流量：lmL/min~2mL/min; h)分流比：5:1~50:1 ;i)质量扫描范围：40amu~450amu;j)扫描方式：全扫描SCAN。
[0016] 上述染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，在步骤（2)中：液相色 谱-串联质谱仪配有电喷雾离子源（ESI)和三重四极杆质量分析器，扫描方式：正离子扫 描ESI+ ;检测方式：多反应监测MRM;电喷雾电压：5500KV;离子源温度：650°C;雾化气压 力：55psi;气帘气压力：30psi;辅助气压力：50psi;色谱柱为ZORBAXEclipsePlusC18， 2.1_^10〇111111，1.8 11111;流动相六为含0.1%甲酸的51111醋酸铵，流动相8为乙腈；以流动相 B的比例进行说明梯度洗脱条件如下：初始体积10%保持0.lmin后，1.Omin增至60%保持 1.Omin，2.lmin下降至 10%并保持 1. 9min。
[0017] 本发明的有益效果是：本发明染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法， 建立动染毒大鼠固体组织，尤其是心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织中唑吡坦的染毒分布数 据，可以为唑吡坦的刑侦技术检测提供参考。
【附图说明】
[0018] 图1灌注唑吡坦大鼠的实验设计图；
[0019] 图2血样中唑吡坦色谱图；
[0020] 图3肝组织中唑吡坦色谱图；
[0021] 图4血添加工作曲线；
[0022] 图5肝添加工作曲线；
[0023] 图6 0. 5h急性染毒大鼠体内各组织及血液中唑吡坦含量；
[0024] 图7急性染毒大鼠体内血药浓度唑吡坦变化趋势；
[0025] 图8急性染毒大鼠体内肝药浓度唑吡坦变化趋势；
[0026] 图9唑吡坦的平均血药浓度-时间曲线（n= 6);
[0027] 图10唑吡坦的总离子流图（RT12. 7);
[0028] 图 11 唑吡坦的质谱图（m/z235, 236, 307);
[0029] 图12唑吡坦的液相色谱-串联质谱提取离子流图（RT1. 66)。
【具体实施方式】
[0030] 为清楚说明本发明中的方案，下面给出优选的实施例并结合附图详细说明。
[0031] 一、试剂
[0032] a)二氯甲烷、乙酸乙酯、乙基甲基酮、丁基乙烯基醚、硼砂、磷酸二氢钠、磷酸氢二 钠、氢氧化钠等溶剂均为分析纯；唑吡坦购于国家麻醉品实验室；灌胃液的配制：称量唑吡 坦600mg溶于60mL生理盐水中，混勾，配制成10mg/mL的灌胃液；
[0033] b)甲醇、乙腈、甲酸、醋酸铵等溶剂均为色谱纯；
[0034] c)磷酸盐缓冲液（pH= 6):取磷酸氢二钠（Na2HP04 ? 12H20)8. 812g，磷酸二氢钠 (NaH2P04 ? 2H20)27. 37g，加入一定量的一级水溶解并稀释至lOOOmL;
[0035] d)硼砂-氢氧化钠缓冲液（pH= 10):取硼砂（Na2B407 ? 10H20)试剂2. 38g，氢 氧化钠试剂0. 86g,加入100mL-级水溶解并稀释至500mL;
[0036] e)含0. 1%甲酸的5mM醋酸铵：称取0. 192g的醋酸铵，加入一定量的一级水溶 解，并加入〇. 5mL甲酸混匀，将混合液用一级水稀释至500mL;
[0037] f)标准储备液：精确称取唑吡坦标准品50mg于50mL容量瓶中，加一定量甲醇溶 解并稀释至刻度，摇匀，配制成l.Omg/mL唑吡坦标准储备液，置于冰箱中冷冻保存6个月；
[0038] g)标准工作液：精确量取唑吡坦标准储备液1.OmL于10mL容量瓶中，用甲醇稀释 至刻度，配制成100.0yg/mL的唑吡坦标准工作液。4°C冷藏保存3个月。试验中所用其它 浓度的标准溶液均从上述标准储备溶液中用甲醇稀释制备，并冷藏保存3个月。
[0039] 二、仪器和材料
[0040] a)气相色谱仪：配有氮磷检测器（NPD);
[0041] b)气相色谱-质谱仪：配有电子轰击源（EI);
[0042] c)液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI)和三重四极杆质量分析器；
[0043] d)电子天平：感量0?lmg;
[0044]e)高速离心机；
[0045]f)振荡器；
[0046]g)浓缩仪；
[0047]h)固相萃取柱：0a.SisWlILB柱（3CC, 60mg)，购自water s公司；
[0048]i)pH试纸：范围1~14 ;
[0049]j)移液器：100yL和 1000uL;
[0050] k)微孔有机滤膜：0? 22ym;
[0051] 1)实验动物雄性SD大鼠72只，体重180g±30g。购于山西医科大学实验动物中 心，适应性喂养3天。饲养环境：温度17°C，湿度45%~65%，通风换气良好，光照合理，笼 具和垫料卫生、无毒。喂营养颗粒饲料和高压消毒灭菌水。
[0052]二、检验
[0053] 3. 1大鼠分组、染毒与检材的采取：72只SD雄性大鼠随机分为9组，禁食12h。其中 1组作为空白对照组，给予生理盐水灌胃，余给予唑吡坦溶液灌胃。实验组大鼠灌胃褪黑 素溶液，剂量为l〇〇mg/kg(根据人与大鼠体表面积换算）；分别于灌胃0. 5h、lh、2h、3h、4h、 6h、15h、24h不同时间间隔后脱臼处死，立即解剖取心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、血液，-20°C 冰冻保存，待萃取检测。具体见图1。
[0054] 3. 2样品的处理方法
[0055] 3. 2. 1血液提取-固相萃取
[0056] 血样预处理：lmL血加pH为6的磷酸缓冲液3mL，充分混旋，振荡20min，8000r/min 离心20min，上清液待过柱；
[0057] 柱活化：取固相柱HLB柱，依次以3mL甲醇、3mL水活化；
[0058] 过柱：各检材离心液分别过柱，流速1.OmL/min~1. 5mL/min;
[0059] 淋洗：甲醇-水3mL淋洗（甲醇的体积分数为5 % );
[0060] 洗脱：用4mL二氯甲烷洗脱，收集洗脱液；
[0061] 挥干定容：60°C空气吹干仪上吹干，残留物用100yL乙醇溶解供分析。
[0062] 3. 2. 2固体组织提取-液液萃取
[0063] 取lg固体组织剪碎，加入0. 2mL甲醇充分混旋，加入硼砂-氢氧化钠缓冲液调节 pH为9,振荡混勾；加入9mL二氯甲烧，振荡10min，8000rpm离心lOmin;分离有机相后，加 二氯甲烷9mL进行第二次提取，合并两次有机相。置于50°C快速浓缩仪上挥干。残渣加入 100yL甲醇定容，转移至进样瓶内供GC/NH)分析。
[0064] 3. 3 仪器
[0065] GC/NH)仪条件：a)色谱柱：DB-1 柱，30mX0. 32mmX0. 25ym;b)色谱柱温程： 200°C保持lmin，以10°C/min速率升温至280°C，保持lOmin;c)进样口温度：280°C;d)检测 器温度：300°C;e)载气：氮气，纯度> 99. 999%;f)分流比：5:1~50:1 ;g)柱流量：1.0mL/ min~2.OmL/min〇
[0066]GC/MS仪条件：a)色谱柱：DB-1MS柱，30mX0.32mmX0.25ym;b)色谱柱温程： 100°C保持2min，以15°C/min速率升温至280°C，保持17min;c)进样口温度：280°C;d)传 输线温度：230°C;e)离子源温度：200°C;f)载气：高纯氦气，纯度> 99. 999% ;g)柱流量： 1ml,/min~2mT,/min;h)分流比：5:1 ~50:1 ;i)质量扫描范围：40amu~450amu;j)扫描 方式：全扫描SCAN。
[0067] 液相色谱-串联质谱仪配有电喷雾离子源（ESI)和三重四极杆质量分析器，扫 描方式：正离子扫描ESI+ ;检测方式：多反应监测MRM;电喷雾电压：5500KV;离子源温 度：650°C;雾化气压力：55psi;气帘气压力：30psi;辅助气压力：50psi;色谱柱为Z0RBAX EclipsePlusC18, 2. 1_X100mm，1.8ym;流动相A为含0.1 %甲酸的5mM醋酸按溶液，流 动相B为乙腈；以流动相B的比例进行说明梯度洗脱条件如下表所示：初始体积10%保持 0?lmin后，1.Omin增至 60%保持 1.Omin，2.lmin下降至 10%并保持 1. 9min。
[0068] 流动相和梯度洗脱条件
[0070] 监测离子对、去簇电压、碰撞能如下表所示：
[0071] 监测离子对、锥孔电压、碰撞能
[0073] 3. 4 结果
[0074] 3. 4. 1唑吡坦急性中毒表现
[0075] 对照组大鼠在生理盐水灌胃后至处死的2h内，状态良好，反应灵敏，易惊，行动 迅速。实验组大鼠在给药约5min-20min左右陆续出现行为迟缓，反应迟钝，昏睡等现象， 2h时仍处于睡眠状态，持续4-6h陆续苏醒，但行为仍较迟缓。12h组处死时，反应较前灵 敏，过激，甚至出现攻击人的现象。
[0076] 3. 4. 2样品的色谱图
[0077] 按GC/NPD仪条件进样，唑吡坦保留时间为13.Omin。血样中唑吡坦色谱图见图2。 肝组织中唑吡坦色谱图见图3。
[0078] 按GC/NPD仪条件进样，唑吡坦具有良好的色谱峰，分离完全，保留时间为 12. 722min，离子峰为235. 301 ;具体参见图10和图11。
[0079] 按液相色谱-串联质谱条件进样，唑吡坦的液相色谱-串联质谱提取离子流图参 见图12。
[0080] 3. 5唑吡坦工作曲线
[0081] 取 1ml空白大鼠血 7 份，分别添加 0? 03yg、0. 06yg、0. 1yg、0. 5yg、1yg、5yg、 lOyg的唑吡坦甲醇工作液混匀，按3. 2. 1中固相萃取方法进行提取，残渣用100yL甲醇定 容，供GC/NH)分析。以唑吡坦浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做线性回归。血中唑吡坦工 作曲线为Y= 380066. 2X-22367. 4,线性范围0. 03~10yg/mL，R2= 0. 9997。血添加工作 曲线参见图4。
[0082] 取lg空白大鼠肝5份，剪碎，分别加入0? 1yg、0. 5yg、lyg、5yg、10yg的挫P比 坦甲醇工作液混匀，然后按3. 2. 2中液液萃取方法进行提取，残渣用100yL甲醇定容，GC/ NH)测定。以唑吡坦浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做线性回归。肝脏的唑吡坦工作曲线为 Y= 196156X-8833. 48,线性范围0. 1~10yg/g，R2= 0. 9986。肝添加工作曲线参见图5。
[0083] 3. 6唑吡坦在急性中毒大鼠体内的分布
[0084] 将冰冻保存的血液及组织（心血、肝、肾、胃、心、肺、脑、脾、肌肉）于室温下解冻， 按前述方法提取、挥干，经GC/NPD检测唑吡坦含量。结果见表1。从表1唑吡坦在急性染 毒大鼠体内分布数据中，可表明唑吡坦广泛分布于各组织体液中。图6显示0. 5h时染毒大 鼠体内血液中唑吡坦浓度低于大部分组织脏器肾、肝、脾、肺，表明组织脏器为唑吡坦的主 要储存器官。图7显示大鼠在急性染毒后血药浓度很快吸收至高峰，之后呈快速下降趋势， 24h时趋势于0。图8显示大鼠在急性染毒后肝药浓度很快吸收至高峰，之后呈快速下降趋 势，24h时已完全代谢完。其它组织脏器的药物浓度也呈相似的变化。数据表明低剂量染毒 的唑吡坦吸收快，代谢快，24h时几乎检测不到。
[0085] 表1唑吡坦在染毒大鼠体内分布数据
[0086]
[0087] 将表1中平均血药浓度-时间数据采用WinNonlin代谢动力学软件处理。结果显 示（见图9)，唑吡坦的毒代动力学行为均符合一室开放模型，即体内药物很快在各部位达 到平衡，即血液浓度和全身各组织器官部位浓度迅速达到平衡。代谢动力参数如下所示：
[0088]
[0089] 3. 7 讨论
[0090] 3. 7. 1唑吡坦中毒反应
[0091] 唑吡坦为新型催眠药非苯二氮卓类，人体的口服治疗量一般为10mg-20mg。唑吡 坦的安全范围也很大，至今未见其中毒量和致死量的数据报到。本研宄按照人口服剂量的 100倍灌胃，根据大鼠与人体体表面积折算确定大鼠的给药剂量为l〇〇mg/kg。空白对照组 大鼠在等量生理盐水灌胃后至处死时，表现反应灵敏，行为敏捷，食欲和饮水旺盛，处死时 反抗激烈。实验组大鼠在给药约5min-20min左右陆续出现行为迟缓，反应迟钝、昏睡、触之 不醒等症状，l_2h时触之可醒，但很快入睡，4-6h陆续醒来，但进食饮水较少，活动较少，反 应和行动显迟钝，6h之后活动及进食增多，反应和行动较前灵敏，持续到脱白处死时。本发 明的测试结果表明，较大剂量的唑吡坦灌胃后在较短时间内由消化道吸收入体，很快到达 中枢发挥作用，代谢同样很快，6h后即渐渐恢复。
[0092] 3. 7. 2动物模型的建立
[0093] 本发明建立了唑吡坦在染毒大鼠体内的动态分布模型，研宄发现在染毒大鼠模型 中，给药后很快出现睡眠抑制状态，呼吸频率减慢，胸式呼吸渐弱，腹式呼吸增强，肌肉松 弛，触之不动等反应。本发明所建立动物模型的表现和生命体征符合唑吡坦中毒的表现，可 应用于唑吡坦案件的法医学鉴定的实验研宄。
[0094] 3. 7. 3染毒大鼠体内的唑吡坦分布
[0095] 唑吡坦是弱碱性亲脂性药物，从消化道很快吸收入血。从实验结果可见急性染毒 大鼠在0. 5h时血药浓度达到高峰，说明唑吡坦吸收很快，短时间内达到高峰。此时体内各 组织和血液中唑吡坦浓度大小依次是：肝〉肺〉脾〉肾〉心〉心血〉脑〉肌肉，其中肝、肺 中唑吡坦浓度分别是血药浓度的3. 43倍、2. 17倍。说明唑吡坦随血流到达组织后，更容易 与组织蛋白结合，而且对组织器官无特异选择性，广泛分布于肝、肾、心、肺、脾组织上。0. 5h 时各组织中的唑吡坦浓度和血药浓度均达到高峰值，之后各组织脏器与血液中血药浓度呈 逐渐下降趋势，24h时除血液和肾脏有微量的唑吡坦外均检不出来，说明唑吡坦吸收快，降 解也快，很快在体内消失无踪。另外，从数据上看褪黑素很容易通过血脑屏障，进入大脑，从 而发挥中枢抑制作用。
[00 96] 3. 7. 4法医学意义
[0097]目前，作为一种新型非苯二氮卓类催眠药，唑吡坦被自杀者、不法分子所利用，在 法庭科学中出现。鉴于以上唑吡坦的分布代谢特点，建议法医师们在涉及唑吡坦的麻抢案 例中，尽早提取生物检材，以免错过最佳检测时机。在死亡案件中，若缺少合适的血液检材 时，也可选取脾、肺、肝、脑等组织为检验材料，结合病理报告综合分析做出结论。而且，唑吡 坦安全范围较大，较少直接引发死亡，在死因的判定中，注意多药物协同作用或其它原因导 致的死亡。
[0098] 3. 7. 5液液萃取条件的优化
[0099] 分别三份空白肝，每份lg，分别添加标准工作液，分别配制成肝添加浓度为 10yg/g、1yg/g、〇. 1yg/g的含唑吡坦肝组织样品溶液，每种浓度平行做3份。分别按照如 下液液萃取条件一至液液萃取条件五萃取后供GC/NH)分析，所得峰面积与相应标准的峰 面积进行比较，评价不同液液萃取条件的萃取回收率。
[0100] 液液萃取条件一
[0101] 分别加入pH为10的硼砂-氢氧化钠缓冲液2mL，振荡混匀；再加入10mL二氯甲 烧，振荡10min，8000rpm离心lOmin，分离有机相后，再加二氯甲烧10mL进行第二次提取， 合并两次有机相，置于50°C浓缩仪上挥干；残渣加入100yL甲醇定容，转移至进样瓶内，供 GC/NH)分析。萃取回收率如下表所示：
[0102] 液液萃取条件一的平均萃取回收率
[0104] 液液萃取条件二
[0105] 分别加入硼砂-氢氧化钠缓冲液，调节含唑吡坦肝组织样品溶液的pH为9,振荡混 匀；加入10mL的乙酸乙醋，振荡lOmin，离心lOmin;分离有机相后，再加入10mL的乙酸乙酯 进行第二次提取，分离，合并两次有机相；残渣加入100UL甲醇定容，转移至进样瓶内，供 GC/NH)分析。萃取回收率如下表所示：
[0106] 液液萃取条件二的平均萃取回收率
[0107]
[0108] 液液萃取条件三
[0109] 分别加入硼砂-氢氧化钠缓冲液，调节含唑吡坦肝组织样品溶液的pH为9,振荡混 匀；加入10mL乙酸乙酯、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚的混合溶液，乙酸乙酯、乙基甲基酮和 丁基乙烯基醚体积比为2 :1:1，振荡1〇1^11，离心1〇1^11;分离有机相后，再加入1〇 1^乙酸乙 酯、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚的混合溶液，乙酸乙酯、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚体积比 为2:1:1，进行第二次提取，分离，合并两次有机相；残渣加入100yL甲醇定容，转移至进样 瓶内，供GC/NPD分析。萃取回收率如下表所示：
[0110] 液液萃取条件二的平均萃取回收率
[0112] 液液萃取条件四
[0113] 分别加入硼砂-氢氧化钠缓冲液，调节含唑吡坦肝组织样品溶液的pH为9,振荡混 匀；加入10mL二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶液，二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为1 :4,振荡 lOmin，离心lOmin;分离有机相后，再加入10mL二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶液，二氯甲烷 和乙酸乙酯的体积比为1 :4,进行第二次提取，分离，合并两次有机相；残渣加入lOOyL甲 醇定容，转移至进样瓶内，供GC/NH)分析。萃取回收率如下表所示：
[0114] 液液萃取条件四的平均萃取回收率
[0116] 液液萃取条件五
[0117] 分别加入硼砂-氢氧化钠缓冲液，调节含唑吡坦肝组织样品溶液的pH为9,振荡混 匀；加入10mL二氯甲烷、乙酸乙酯、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚的混合溶液，二氯甲烷、乙 酸乙醋、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚的体积比为1:2:1: 1，振荡lOmin，离心lOmin;分离有 机相后，再加入10mL二氯甲烷、乙酸乙酯、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚的混合溶液，二氯甲 烷、乙酸乙酯、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚的体积比为1:2:1:1，进行第二次提取，分离，合 并两次有机相；残渣加入100UL甲醇定容，转移至进样瓶内，供GC/NH)分析。萃取回收率 如下表所示：
[0118] 液液萃取条件五的平均萃取回收率
[0120] 3. 7. 6检测方法比较
[0121] 气相色谱法、气相色谱-质谱法以及液相色谱-串联质谱法的检测限如下表所 示：
[0122] 生物样品中唑吡坦的检测限
[0124] 上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明创造所作的举例，而并非对本发明创造具 体实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出 其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的 精神和原则之内所引伸出的任何显而易见的变化或变动仍处于本发明创造权利要求的保 护范围之中。
【主权项】
1. 染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 样品萃取：取剪碎的心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织样品，采用液液萃取，将心、 肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织样品中的唑吡坦萃取出来； (2) 仪器检测：利用GC/Nro仪、GC/MS仪或LC-MS/MS仪对萃取物进行定性和定量检测， 确定心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织样品中唑吡坦的含量。2. 根据权利要求1所述的染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，其特征在 于，在步骤（1)中的液液萃取包括如下步骤：加入有机溶剂和缓冲溶液，振荡混匀，分离有 机相，再加入有机相进行第二次提取，合并两次有机相，置于50°C浓缩仪上挥干；残渣用甲 醇定容，转移至进样瓶内，供气相色谱或气相色谱-质谱仪分析；若供液相色谱-串联质谱 仪分析，则残渣用甲醇定容，用微孔有机滤膜过滤并转移至进样瓶内，供液相色谱_串联质 谱仪分析检测。3. 根据权利要求2所述的染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，其特征在 于，在步骤（1)中的液液萃取包括如下步骤： 向心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织样品中加入甲醇，每克固体组织中加入〇.2mL甲醇， 混旋，再加入硼砂-氢氧化钠缓冲液或氢氧化钠溶液调节pH为9~10,振荡混匀；每1克 固体组织样品加入5mL~IOmL的有机溶剂，振荡10min，8000rpm离心IOmin ;分离有机 相后，再加入5mL~IOmL的有机溶剂进行第二次提取，分离，合并两次有机相；残渣加入 50 y L~100 y L甲醇定容，转移至进样瓶内，供气相色谱和气相色谱-质谱仪分析；若供液 相色谱-串联质谱仪分析，则残渣用200yL~1000yL甲醇定容，用微孔有机滤膜过滤并 转移至进样瓶内，供供液相色谱-串联质谱仪分析检测。4. 根据权利要求3所述的染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，其特征 在于，所述有机溶剂为二氯甲烷；或乙酸乙酯；或者二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶液，二氯 甲烷和乙酸乙酯的体积比为1 :4 ;或乙酸乙酯、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚的混合溶液，乙 酸乙酯、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚体积比为2:1:1 ;或二氯甲烷、乙酸乙酯、乙基甲基酮 和丁基乙烯基醚的混合溶液，二氯甲烷、乙酸乙酯、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚的体积比为5.根据权利要求1-4任一所述的染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，其 特征在于，在步骤⑵中，GC/NH)仪条件：a)色谱柱：DB-1柱，30mX0. 32mmX0. 25 ym ;b) 色谱柱温程：200°C保持lmin，以10°C /min速率升温至280°C，保持IOmin ;c)进样口温度： 280°C ;d)检测器温度：300°C ;e)载气：氮气，纯度>99. 999% ;f)分流比：5:1~50:1 ;g) 柱流量：1. OmT ,/mi n~2. OmT ,/mi n 〇6. 根据权利要求1-4任一所述的染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法， 其特征在于，在步骤⑵中，GC/MS仪条件：a)色谱柱：DB-1MS柱，30mX0. 32mmX0. 25 ym ; b)色谱柱温程：100°C保持2min，以15°C /min速率升温至280°C，保持17min;c)进样 口温度：280°C ;d)传输线温度：230°C ;e)离子源温度：200°C ;f)载气：高纯氦气，纯度 >99. 999% ;g)柱流量：lmL/min~2mL/min ;h)分流比：5:1~50:1 ;i)质量扫描范围： 40amu~450amu ; j)扫描方式：全扫描SCAN。7. 根据权利要求1-4任一所述的染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，其 特征在于，在步骤（2)中：液相色谱-串联质谱仪配有电喷雾离子源（ESI)和三重四极杆质 量分析器，扫描方式：正离子扫描ESI+ ;检测方式：多反应监测MRM;电喷雾电压：5500KV; 离子源温度：650°C;雾化气压力：55psi;气帘气压力：30psi;辅助气压力：50psi;色谱柱 为ZORBAXEclipsePlusC18, 2.ImmX100mm，1.8ym;流动相A为含 0.1 % 甲酸的 5mM醋 酸按，流动相B为乙腈；以流动相B的比例进行说明梯度洗脱条件如下：初始体积10%保持 0?Imin后，I.Omin增至 60%保持I.Omin，2.Imin下降至 10%并保持I. 9min。
【专利摘要】本发明公开染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，包括如下步骤：(1)样品萃取：取剪碎的心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织样品，采用液液萃取，将心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织样品中的唑吡坦萃取出来；(2)仪器检测：利用GC/NPD仪、GC/MS仪或LC-MS/MS仪对萃取物进行定性和定量检测，确定心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织样品中唑吡坦的含量。
【IPC分类】G01N30/06, G01N30/02
【公开号】CN104897803
【申请号】CN201510223568
【发明人】张蕾萍, 栾玉静, 杜鸿雁, 董颖, 张云峰, 崔冠峰, 何毅, 于忠山
【申请人】公安部物证鉴定中心
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月5日
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