一种同时测定比卡鲁胺中6种有关物质的uplc方法
一种同时测定比卡鲁胺中6种有关物质的uplc方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种化学药物有关物质的检测，具体涉及一种同时测定比卡鲁胺中6 种有关物质的UPLC方法。
【背景技术】
[0002] 比卡鲁胺（bicalutamide，BCT)是英国AstraZeneca公司开发研制的一种新型非 甾体类抗雄激素药，1995年在英国批准上市，1999年在我国获准进口，化学名为N-[4-氰 基_3_(二氟甲基）苯基]_3_[ (4-氟苯基）横酰基]_2_羟基-2-甲基丙酰胺，商品名为康 士得。比卡鲁胺可阻断肾上腺产生的雄性激素作用，抑制雄性激素在细胞核受体部位的结 合或吸收，导致前列腺肿瘤萎缩，临床上用于治疗晚期前列腺癌。比卡鲁胺在生产和贮存过 程中会产生系列降解产物和相关杂质，美国药典（35版）明确了其中6个已知杂质（见图 1)，其中4-氨基_2_(三氟甲基）苯甲腈是合成比卡鲁胺的原料之一同时也是降解产物，比 卡鲁胺硫化物为合成中间体，杂质A、去氟同系物、2-氟异构体和去羟基同系物为合成过程 中的副产物。本品在英国药典（2013版）中有收载，采用HPLC法仅对少数有关物质进行 测定，美国药典32版至35版均有收载，采用HPLC法对有关物质进行测定，每个样品分析时 间为35分钟，流速为1.0ml?mirT1。但本品未被中国药典（2010版）收载。国内对比卡鲁 胺的研宄很少，主要针对比卡鲁胺HPLC法含量测定的研宄报道，对于比卡鲁胺有关物质的 报道更少，仅有一篇有关比卡鲁胺相关物质B的合成和表征及理化性质的研宄报道，未见 关于比卡鲁胺中其他有关物质测定的报道。而药品中的有关物质往往是引起过敏反应的根 源，所以对于有关物质的检测控制非常重要。
【发明内容】
[0003] 为了弥补国内没有测定比卡鲁胺中6种有关物质方法的空白，本发明采用超高效 液相色谱法（UltraPerformanceLiquidChromatography，UPLC)建立了比卡鲁胺有关物 质的检查测定方法，同时测定了比卡鲁胺及其中6种有关物质，弥补目前国内没有比卡鲁 胺有关物质检测方法的空白，能更好的控制比卡鲁胺及其相关制剂的质量，确保安全用药。 该方法分析比卡鲁胺样品中6种有关物质只需要10分钟，相比美国药典中分析一个样品 需要35分钟分析时间大大缩短，该方法中流速为0. 5ml?mirT1，相比美国药典方法流速为 1.0ml?mirT1，大大的减少了试剂消耗，更为环保、经济、快速和简便。目前国内报道的测定 比卡鲁胺含量的方法不适合同时测定6种有关物质，且流动相中添加有磷酸盐，也不利于 色谱柱的使用和保护。本发明经多次反复试验和优化而建立的超高效液相色谱法测定比卡 鲁胺有关物质的方法专属性强、准确、灵敏度高、快速，能有效控制比卡鲁胺及其相关制剂 的质量。
[0004] 本发明涉及一种同时测定比卡鲁胺中6种有关物质的UPLC方法，该方法包括以下 步骤：
[0005] (1)样品溶液制备：取比卡鲁胺待测样品适量，精密称定，用稀释剂溶解并定量稀 释制成每lmL中约含lmg的溶液，作为供试品溶液。
[0006] ⑵对照品溶液制备：取比卡鲁胺、4-氨基-2-(三氟甲基）苯甲腈、杂质A、去氟 同系物、2-氟异构体、去羟基同系物和比卡鲁胺硫化物对照品各适量，用稀释剂溶解并稀释 制成每lmL中约含比卡鲁胺50yg、其他成分各5yg的混合溶液。
[0007] (3)超高效液相色谱测定：取对照品溶液和样品溶液在以下色谱条件下进行测定 分析，色谱柱为40〇仍1丫诎1^：8￡11(： 18(1.7 11111，2.1111111\50臟）；流动相六为0.01%卜八）三 氟乙酸的水溶液，流动相B为0.01% (v/v)三氟乙酸的乙腈溶液，按下表进行梯度洗脱；流 速0. 5ml?mirT1;柱温25°C;检测波长270nm。取样品溶液和对照品溶液各1. 5yL，注入超 高效液相色谱仪，记录色谱图，杂质A峰与比卡鲁胺峰分离度不小于6. 5,理论塔板数按比 卡鲁胺峰计算不低于5000。
[0008] 表1流动相梯度洗脱程序
[0010] 本发明采用UPLC法同时测定比卡鲁胺及其6种有关物质，比卡鲁胺及其6种有关 物质得到了有效分离，分离度均大于1.5,方法学结果均符合分析测定要求。本发明所建立 的同时测定比卡鲁胺及其6种有关物质的UPLC方法，可快速准确地检测出比卡鲁胺的杂质 及降解产物，操作简单，重现性好，灵敏度高，可更好地控制比卡鲁胺及其制剂的质量，弥补 了国内没有比卡鲁胺有关物质检测方法的空白。
【附图说明】
[0011] 图1比卡鲁胺及其有关物质的化学结构图（A. 4-氨基-2-(三氟甲基）苯甲腈 B.杂质AC.去氟同系物D. 2-氟异构体E.去羟基同系物F.比卡鲁胺硫化物G.比卡鲁 胺）
[0012] 图2混合对照品溶液色谱图（1. 4-氨基_2_(三氟甲基）苯甲腈2.杂质A3.去 氟同系物4. 2-氟异构体5.比卡鲁胺6.去羟基同系物7.比卡鲁胺硫化物）
[0013] 图3比卡鲁胺样品溶液色谱图（1.去氟同系物2. 2-氟异构体3.比卡鲁胺 4?比卡鲁胺硫化物）
【具体实施方式】
[0014] 通过以下实施例，进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
[0015] 实施例1比卡鲁胺原料药中6种有关物质的测定
[0016] 1仪器与试药
[0017] WatersACQUITY超高效液相色谱仪，所用试药均为色谱纯，水为超纯水。比卡鲁 胺原料药三批，每批46g;比卡鲁胺对照品200mg;4_氨基_2_(三氟甲基）苯甲腈对照品 20mg;杂质A对照品20mg;去氟同系物对照品20mg;2_氟异构体对照品20mg;去羟基同系 物对照品20mg;比卡鲁胺硫化物对照品20mg。
[0018] 2方法与结果
[0019] 2. 1色谱条件与系统适用性
[0020] 色谱柱：ACQMTYUPLCBH1C18(l. 7ym，2.lX50mm);流动相A为 0? 01% (v/v)三 氟乙酸的水溶液，流动相B为0.01% (v/v)三氟乙酸的乙腈溶液，按表1进行梯度洗脱；流 速0. 5ml?mirT1;柱温25°C;检测波长270nm。取比卡鲁胺与杂质A对照品各适量，以流动 相A-流动相B1 : 2作为稀释剂溶解并稀释制成每lmL中约含比卡鲁胺50yg和杂质A 5yg的混合溶液，作为系统适用性溶液。精密量取系统适用性溶液1. 5yL，注入液相色谱 仪，记录色谱图，杂质A峰与比卡鲁胺峰分离度不小于6. 5,理论塔板数按比卡鲁胺峰计算 不低于5000。
[0021] 2. 2专属性考察
[0022] 2. 2. 1各成分的分离情况
[0023] 取比卡鲁胺、4-氨基_2_(三氟甲基）苯甲腈、杂质A、去氟同系物、2-氟异构体、去 羟基同系物和比卡鲁胺硫化物对照品各适量，用稀释剂溶解并稀释制成每lmL中约含比卡 鲁胺50yg、其他成分各5yg的混合溶液，在上述色谱条件下进样1. 5yL，记录色谱图，各 杂质峰均与比卡鲁胺完全分离。
[0024] 2. 2. 2破坏性试验降解产物的检出情况
[0025] 取比卡鲁胺对照品约50mg，共7份，分别置50mL量瓶中进行酸、碱、光照、氧化、还 原、水解和高温破坏，酸、碱破坏溶液用相应溶液中和，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，精密量 取1. 5yL，进入色谱仪分析，结果显示比卡鲁胺在光照、酸、碱、还原和水解降解条件下质量 稳定，未产生明显的降解产物，在高温条件下轻微降解产生4-氨基-2-(三氟甲基）苯甲 腈，在氧化条件下降解明显，降解 产物与主峰分离完全（峰纯度角度小于纯度阈值）。
[0026] 2. 3杂质峰的相对保留时间与校正因子
[0027] 采用单浓度点法测定校正因子，取比卡鲁胺、4-氨基_2_(三氟甲基）苯甲腈、杂 质A、去氟同系物、2-氟异构体、去羟基同系物和比卡鲁胺硫化物对照品各适量，精密称定， 用稀释剂溶解并稀释制成每lmL中约含各1yg的混合溶液，取1. 5yL进入色谱仪分析，记 录色谱图，计算各杂质峰相对保留时间和校正因子见表2。
[0028] 表2各杂质峰的相对保留时间与校正因子
[0030] 2. 4线性关系考察
[0031] 精密称取比卡鲁胺对照品0.01271g，置50mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻 度，摇匀，精密量取10mL，置100mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，再分别精密量取 0. 5,1，2,4,6,8,10mL，置50mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，制得系列浓度的对照品 溶液。取对照品溶液进入色谱仪分析测定，以峰面积A对浓度C(yg^!/1)进行线性回归， 回归方程为：A= 29913C+788(r= 0. 9999)。比卡鲁胺浓度在0. 253~5. 06yg.mr1范围 内与峰面积呈良好的线性关系。
[0032] 2. 5检测限与定量限
[0033] 取比卡鲁胺对照品适量，精密称定，用稀释剂溶解并稀释制成浓度为 OJSSyg.mr1的溶液，进样1.5yL，记录色谱图，按信噪比3 : 1计算最低检测限为 0.26ng，按信噪比10 : 1计算定量限为0.87ng。
[0034] 2. 6稳定性试验
[0035] 取混合对照品溶液，于室温下放置0, 2,4,6,8,10h，精密吸取1. 5yL进样分析，记 录色谱图，比卡鲁胺、4-氨基_2_(三氟甲基）苯甲腈、杂质A、去氟同系物、2-氟异构体、 去羟基同系物和比卡鲁胺硫化物峰面积的RSD分别为0. 61 %，0. 45 %，0. 68 %，0. 92 %， 0. 23%，0. 32%和0. 78%，表明供试品溶液在10h内稳定。
[0036] 2. 7样品测定
[0037] 取比卡鲁胺原料药适量，精密称定，用稀释剂溶解并定量稀释制成每lmL中约含 lmg的溶液，作为供试品溶液。取比卡鲁胺对照品适量，精密称定，用稀释剂溶解并定量稀释 制成每lmL中约含1yg的溶液，作为对照品溶液。精密量取对照品溶液1. 5yL注入液相 色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10 %，再精密量取供试品溶 液与对照品溶液各1. 5yL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，各杂质的相对保留时间、校 正因子见表2。各杂质的峰面积分别乘以相应的校正因子后与对照品溶液主成分的峰面积 比较计算含量，其他未知杂质的校正因子按1. 〇计。三批原料药样品测定的结果见表3。
[0038] 表3样品有关物质测定结果
[0040] 实施例2比卡鲁胺片中6种有关物质的测定
[0041] 2. 7样品测定
[0042] 分别取三批已知含量的比卡鲁胺片（规格：50mg/片）20片，精密称定，研钵研细， 精密称取适量，加稀释剂超声30min溶解并定量稀释制成每lmL中约含lmg的溶液，摇勾， 用微孔滤膜（〇.22ym)滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取比卡鲁胺对照品适量，精密称 定，用稀释剂溶解并定量稀释制成每lmL中约含1yg的溶液，作为对照品溶液。精密量取 对照品溶液1. 5yL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程 的10%，再精密量取供试品溶液与对照品溶液各1. 5yL，分别注入液相色谱仪，记录色谱 图，各杂质的峰面积分别乘以相应的校正因子后与对照品溶液主成分的峰面积比较计算含 量，其他未知杂质的校正因子按1. 〇计。三批比卡鲁胺片测定的结果见表4。
[0043] 表4比卡鲁胺片有关物质测定结果
[0045] 其余操作同实施例1。
[0046] 实施例3比卡鲁胺胶囊中6种有关物质的测定
[0047] 2. 7样品测定
[0048] 分别取三批已知含量的比卡鲁胺胶囊（规格：50mg/粒）20粒的内容物，精密称 定，精密称取适量，加稀释剂超声30min溶解并定量稀释制成每lmL中约含lmg的溶液，摇 匀，用微孔滤膜（0.22ym)滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取比卡鲁胺对照品适量，精密 称定，用稀释剂溶解并定量稀释制成每lmL中约含1yg的溶液，作为对照品溶液。精密量 取对照品溶液1. 5yL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量 程的10%，再精密量取供试品溶液与对照品溶液各L5yL，分别注入液相色谱仪，记录色 谱图，各杂质的峰面积分别乘以相应的校正因子后与对照品溶液主成分的峰面积比较计算 含量，其他未知杂质的校正因子按1. 〇计。三批比卡鲁胺胶囊测定的结果见表5。
[0049] 表5比卡鲁胺胶囊有关物质测定结果
[0051] 其余操作同实施例1。
【主权项】
1. 一种同时测定比卡鲁胺中6种有关物质的UPLC方法，其特征在于包括下列步骤： (1) 样品溶液制备：取比卡鲁胺待测样品适量，精密称定，用0.01%三氟乙酸的水溶液 和0. 01 %三氟乙酸的乙腈溶液按比例1 : 2作为稀释剂溶解并定量稀释制成每ImL中约含 Img的溶液，作为供试品溶液； (2) 对照品溶液制备：分别精密称取比卡鲁胺、4-氨基-2-(三氟甲基）苯甲腈、杂质A、 去氟同系物、2-氟异构体、去羟基同系物和比卡鲁胺硫化物对照品各适量，用0.01%三氟 乙酸的水溶液：0.01%三氟乙酸的乙腈溶液按比例1 : 2作为稀释剂溶解并定量稀释制成 每ImL中约含比卡鲁胺50 μ g、其他成分各5 μ g的混合溶液； (3) 超高效液相色谱测定：将对照品溶液和样品溶液进行超高效液相色谱测定，色谱 柱：ACQUITY UPLC BEH C18;流动相A为0. 01 %三氟乙酸的水溶液，流动相B为0. 01 %三氟 乙酸的乙腈溶液，按下表进行梯度洗脱，流速0. 5ml · mirT1，柱温25°C，检测波长270nm，对 照品溶液和样品溶液各进样1. 5 μ L，色谱图记录与处理由工作站完成，理论塔板数按比卡 鲁胺峰计算不低于5000。 流动相梯度洗脱程序2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述比卡鲁胺待测样品包括比卡鲁胺原料 药、比卡鲁胺片和比卡鲁胺胶囊。
【专利摘要】本发明涉及一种同时测定比卡鲁胺中6种有关物质的UPLC方法，该方法包括以下步骤：(1)样品溶液制备(2)对照品溶液制备(3)超高效液相色谱测定：取对照品溶液和样品溶液在以下色谱条件下进行测定分析，色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，2.1mm×50mm)；流动相A为0.01％(v/v)三氟乙酸的水溶液，流动相B为0.01％(v/v)三氟乙酸的乙腈溶液，进行梯度洗脱；流速0.5ml.min-1；柱温25℃；检测波长270nm。在该方法条件下，比卡鲁胺及其6种有关物质同时得到了有效分离，方法学结果均符合分析测定要求。本发明建立了同时测定比卡鲁胺及其6种有关物质的UPLC方法，可快速准确地检测出比卡鲁胺的杂质及降解产物，操作简单，重现性好，灵敏度高，可更好地控制比卡鲁胺产品的质量。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN104897818
【申请号】CN201510353609
【发明人】杨林, 何丹
【申请人】重庆医药高等专科学校
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月19日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种化学药物有关物质的检测，具体涉及一种同时测定比卡鲁胺中6 种有关物质的UPLC方法。
【背景技术】
[0002] 比卡鲁胺（bicalutamide，BCT)是英国AstraZeneca公司开发研制的一种新型非 甾体类抗雄激素药，1995年在英国批准上市，1999年在我国获准进口，化学名为N-[4-氰 基_3_(二氟甲基）苯基]_3_[ (4-氟苯基）横酰基]_2_羟基-2-甲基丙酰胺，商品名为康 士得。比卡鲁胺可阻断肾上腺产生的雄性激素作用，抑制雄性激素在细胞核受体部位的结 合或吸收，导致前列腺肿瘤萎缩，临床上用于治疗晚期前列腺癌。比卡鲁胺在生产和贮存过 程中会产生系列降解产物和相关杂质，美国药典（35版）明确了其中6个已知杂质（见图 1)，其中4-氨基_2_(三氟甲基）苯甲腈是合成比卡鲁胺的原料之一同时也是降解产物，比 卡鲁胺硫化物为合成中间体，杂质A、去氟同系物、2-氟异构体和去羟基同系物为合成过程 中的副产物。本品在英国药典（2013版）中有收载，采用HPLC法仅对少数有关物质进行 测定，美国药典32版至35版均有收载，采用HPLC法对有关物质进行测定，每个样品分析时 间为35分钟，流速为1.0ml?mirT1。但本品未被中国药典（2010版）收载。国内对比卡鲁 胺的研宄很少，主要针对比卡鲁胺HPLC法含量测定的研宄报道，对于比卡鲁胺有关物质的 报道更少，仅有一篇有关比卡鲁胺相关物质B的合成和表征及理化性质的研宄报道，未见 关于比卡鲁胺中其他有关物质测定的报道。而药品中的有关物质往往是引起过敏反应的根 源，所以对于有关物质的检测控制非常重要。
【发明内容】
[0003] 为了弥补国内没有测定比卡鲁胺中6种有关物质方法的空白，本发明采用超高效 液相色谱法（UltraPerformanceLiquidChromatography，UPLC)建立了比卡鲁胺有关物 质的检查测定方法，同时测定了比卡鲁胺及其中6种有关物质，弥补目前国内没有比卡鲁 胺有关物质检测方法的空白，能更好的控制比卡鲁胺及其相关制剂的质量，确保安全用药。 该方法分析比卡鲁胺样品中6种有关物质只需要10分钟，相比美国药典中分析一个样品 需要35分钟分析时间大大缩短，该方法中流速为0. 5ml?mirT1，相比美国药典方法流速为 1.0ml?mirT1，大大的减少了试剂消耗，更为环保、经济、快速和简便。目前国内报道的测定 比卡鲁胺含量的方法不适合同时测定6种有关物质，且流动相中添加有磷酸盐，也不利于 色谱柱的使用和保护。本发明经多次反复试验和优化而建立的超高效液相色谱法测定比卡 鲁胺有关物质的方法专属性强、准确、灵敏度高、快速，能有效控制比卡鲁胺及其相关制剂 的质量。
[0004] 本发明涉及一种同时测定比卡鲁胺中6种有关物质的UPLC方法，该方法包括以下 步骤：
[0005] (1)样品溶液制备：取比卡鲁胺待测样品适量，精密称定，用稀释剂溶解并定量稀 释制成每lmL中约含lmg的溶液，作为供试品溶液。
[0006] ⑵对照品溶液制备：取比卡鲁胺、4-氨基-2-(三氟甲基）苯甲腈、杂质A、去氟 同系物、2-氟异构体、去羟基同系物和比卡鲁胺硫化物对照品各适量，用稀释剂溶解并稀释 制成每lmL中约含比卡鲁胺50yg、其他成分各5yg的混合溶液。
[0007] (3)超高效液相色谱测定：取对照品溶液和样品溶液在以下色谱条件下进行测定 分析，色谱柱为40〇仍1丫诎1^：8￡11(： 18(1.7 11111，2.1111111\50臟）；流动相六为0.01%卜八）三 氟乙酸的水溶液，流动相B为0.01% (v/v)三氟乙酸的乙腈溶液，按下表进行梯度洗脱；流 速0. 5ml?mirT1;柱温25°C;检测波长270nm。取样品溶液和对照品溶液各1. 5yL，注入超 高效液相色谱仪，记录色谱图，杂质A峰与比卡鲁胺峰分离度不小于6. 5,理论塔板数按比 卡鲁胺峰计算不低于5000。
[0008] 表1流动相梯度洗脱程序
[0010] 本发明采用UPLC法同时测定比卡鲁胺及其6种有关物质，比卡鲁胺及其6种有关 物质得到了有效分离，分离度均大于1.5,方法学结果均符合分析测定要求。本发明所建立 的同时测定比卡鲁胺及其6种有关物质的UPLC方法，可快速准确地检测出比卡鲁胺的杂质 及降解产物，操作简单，重现性好，灵敏度高，可更好地控制比卡鲁胺及其制剂的质量，弥补 了国内没有比卡鲁胺有关物质检测方法的空白。
【附图说明】
[0011] 图1比卡鲁胺及其有关物质的化学结构图（A. 4-氨基-2-(三氟甲基）苯甲腈 B.杂质AC.去氟同系物D. 2-氟异构体E.去羟基同系物F.比卡鲁胺硫化物G.比卡鲁 胺）
[0012] 图2混合对照品溶液色谱图（1. 4-氨基_2_(三氟甲基）苯甲腈2.杂质A3.去 氟同系物4. 2-氟异构体5.比卡鲁胺6.去羟基同系物7.比卡鲁胺硫化物）
[0013] 图3比卡鲁胺样品溶液色谱图（1.去氟同系物2. 2-氟异构体3.比卡鲁胺 4?比卡鲁胺硫化物）
【具体实施方式】
[0014] 通过以下实施例，进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
[0015] 实施例1比卡鲁胺原料药中6种有关物质的测定
[0016] 1仪器与试药
[0017] WatersACQUITY超高效液相色谱仪，所用试药均为色谱纯，水为超纯水。比卡鲁 胺原料药三批，每批46g;比卡鲁胺对照品200mg;4_氨基_2_(三氟甲基）苯甲腈对照品 20mg;杂质A对照品20mg;去氟同系物对照品20mg;2_氟异构体对照品20mg;去羟基同系 物对照品20mg;比卡鲁胺硫化物对照品20mg。
[0018] 2方法与结果
[0019] 2. 1色谱条件与系统适用性
[0020] 色谱柱：ACQMTYUPLCBH1C18(l. 7ym，2.lX50mm);流动相A为 0? 01% (v/v)三 氟乙酸的水溶液，流动相B为0.01% (v/v)三氟乙酸的乙腈溶液，按表1进行梯度洗脱；流 速0. 5ml?mirT1;柱温25°C;检测波长270nm。取比卡鲁胺与杂质A对照品各适量，以流动 相A-流动相B1 : 2作为稀释剂溶解并稀释制成每lmL中约含比卡鲁胺50yg和杂质A 5yg的混合溶液，作为系统适用性溶液。精密量取系统适用性溶液1. 5yL，注入液相色谱 仪，记录色谱图，杂质A峰与比卡鲁胺峰分离度不小于6. 5,理论塔板数按比卡鲁胺峰计算 不低于5000。
[0021] 2. 2专属性考察
[0022] 2. 2. 1各成分的分离情况
[0023] 取比卡鲁胺、4-氨基_2_(三氟甲基）苯甲腈、杂质A、去氟同系物、2-氟异构体、去 羟基同系物和比卡鲁胺硫化物对照品各适量，用稀释剂溶解并稀释制成每lmL中约含比卡 鲁胺50yg、其他成分各5yg的混合溶液，在上述色谱条件下进样1. 5yL，记录色谱图，各 杂质峰均与比卡鲁胺完全分离。
[0024] 2. 2. 2破坏性试验降解产物的检出情况
[0025] 取比卡鲁胺对照品约50mg，共7份，分别置50mL量瓶中进行酸、碱、光照、氧化、还 原、水解和高温破坏，酸、碱破坏溶液用相应溶液中和，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，精密量 取1. 5yL，进入色谱仪分析，结果显示比卡鲁胺在光照、酸、碱、还原和水解降解条件下质量 稳定，未产生明显的降解产物，在高温条件下轻微降解产生4-氨基-2-(三氟甲基）苯甲 腈，在氧化条件下降解明显，降解 产物与主峰分离完全（峰纯度角度小于纯度阈值）。
[0026] 2. 3杂质峰的相对保留时间与校正因子
[0027] 采用单浓度点法测定校正因子，取比卡鲁胺、4-氨基_2_(三氟甲基）苯甲腈、杂 质A、去氟同系物、2-氟异构体、去羟基同系物和比卡鲁胺硫化物对照品各适量，精密称定， 用稀释剂溶解并稀释制成每lmL中约含各1yg的混合溶液，取1. 5yL进入色谱仪分析，记 录色谱图，计算各杂质峰相对保留时间和校正因子见表2。
[0028] 表2各杂质峰的相对保留时间与校正因子
[0030] 2. 4线性关系考察
[0031] 精密称取比卡鲁胺对照品0.01271g，置50mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻 度，摇匀，精密量取10mL，置100mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，再分别精密量取 0. 5,1，2,4,6,8,10mL，置50mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，制得系列浓度的对照品 溶液。取对照品溶液进入色谱仪分析测定，以峰面积A对浓度C(yg^!/1)进行线性回归， 回归方程为：A= 29913C+788(r= 0. 9999)。比卡鲁胺浓度在0. 253~5. 06yg.mr1范围 内与峰面积呈良好的线性关系。
[0032] 2. 5检测限与定量限
[0033] 取比卡鲁胺对照品适量，精密称定，用稀释剂溶解并稀释制成浓度为 OJSSyg.mr1的溶液，进样1.5yL，记录色谱图，按信噪比3 : 1计算最低检测限为 0.26ng，按信噪比10 : 1计算定量限为0.87ng。
[0034] 2. 6稳定性试验
[0035] 取混合对照品溶液，于室温下放置0, 2,4,6,8,10h，精密吸取1. 5yL进样分析，记 录色谱图，比卡鲁胺、4-氨基_2_(三氟甲基）苯甲腈、杂质A、去氟同系物、2-氟异构体、 去羟基同系物和比卡鲁胺硫化物峰面积的RSD分别为0. 61 %，0. 45 %，0. 68 %，0. 92 %， 0. 23%，0. 32%和0. 78%，表明供试品溶液在10h内稳定。
[0036] 2. 7样品测定
[0037] 取比卡鲁胺原料药适量，精密称定，用稀释剂溶解并定量稀释制成每lmL中约含 lmg的溶液，作为供试品溶液。取比卡鲁胺对照品适量，精密称定，用稀释剂溶解并定量稀释 制成每lmL中约含1yg的溶液，作为对照品溶液。精密量取对照品溶液1. 5yL注入液相 色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10 %，再精密量取供试品溶 液与对照品溶液各1. 5yL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，各杂质的相对保留时间、校 正因子见表2。各杂质的峰面积分别乘以相应的校正因子后与对照品溶液主成分的峰面积 比较计算含量，其他未知杂质的校正因子按1. 〇计。三批原料药样品测定的结果见表3。
[0038] 表3样品有关物质测定结果
[0040] 实施例2比卡鲁胺片中6种有关物质的测定
[0041] 2. 7样品测定
[0042] 分别取三批已知含量的比卡鲁胺片（规格：50mg/片）20片，精密称定，研钵研细， 精密称取适量，加稀释剂超声30min溶解并定量稀释制成每lmL中约含lmg的溶液，摇勾， 用微孔滤膜（〇.22ym)滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取比卡鲁胺对照品适量，精密称 定，用稀释剂溶解并定量稀释制成每lmL中约含1yg的溶液，作为对照品溶液。精密量取 对照品溶液1. 5yL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程 的10%，再精密量取供试品溶液与对照品溶液各1. 5yL，分别注入液相色谱仪，记录色谱 图，各杂质的峰面积分别乘以相应的校正因子后与对照品溶液主成分的峰面积比较计算含 量，其他未知杂质的校正因子按1. 〇计。三批比卡鲁胺片测定的结果见表4。
[0043] 表4比卡鲁胺片有关物质测定结果
[0045] 其余操作同实施例1。
[0046] 实施例3比卡鲁胺胶囊中6种有关物质的测定
[0047] 2. 7样品测定
[0048] 分别取三批已知含量的比卡鲁胺胶囊（规格：50mg/粒）20粒的内容物，精密称 定，精密称取适量，加稀释剂超声30min溶解并定量稀释制成每lmL中约含lmg的溶液，摇 匀，用微孔滤膜（0.22ym)滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取比卡鲁胺对照品适量，精密 称定，用稀释剂溶解并定量稀释制成每lmL中约含1yg的溶液，作为对照品溶液。精密量 取对照品溶液1. 5yL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量 程的10%，再精密量取供试品溶液与对照品溶液各L5yL，分别注入液相色谱仪，记录色 谱图，各杂质的峰面积分别乘以相应的校正因子后与对照品溶液主成分的峰面积比较计算 含量，其他未知杂质的校正因子按1. 〇计。三批比卡鲁胺胶囊测定的结果见表5。
[0049] 表5比卡鲁胺胶囊有关物质测定结果
[0051] 其余操作同实施例1。
【主权项】
1. 一种同时测定比卡鲁胺中6种有关物质的UPLC方法，其特征在于包括下列步骤： (1) 样品溶液制备：取比卡鲁胺待测样品适量，精密称定，用0.01%三氟乙酸的水溶液 和0. 01 %三氟乙酸的乙腈溶液按比例1 : 2作为稀释剂溶解并定量稀释制成每ImL中约含 Img的溶液，作为供试品溶液； (2) 对照品溶液制备：分别精密称取比卡鲁胺、4-氨基-2-(三氟甲基）苯甲腈、杂质A、 去氟同系物、2-氟异构体、去羟基同系物和比卡鲁胺硫化物对照品各适量，用0.01%三氟 乙酸的水溶液：0.01%三氟乙酸的乙腈溶液按比例1 : 2作为稀释剂溶解并定量稀释制成 每ImL中约含比卡鲁胺50 μ g、其他成分各5 μ g的混合溶液； (3) 超高效液相色谱测定：将对照品溶液和样品溶液进行超高效液相色谱测定，色谱 柱：ACQUITY UPLC BEH C18;流动相A为0. 01 %三氟乙酸的水溶液，流动相B为0. 01 %三氟 乙酸的乙腈溶液，按下表进行梯度洗脱，流速0. 5ml · mirT1，柱温25°C，检测波长270nm，对 照品溶液和样品溶液各进样1. 5 μ L，色谱图记录与处理由工作站完成，理论塔板数按比卡 鲁胺峰计算不低于5000。 流动相梯度洗脱程序2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述比卡鲁胺待测样品包括比卡鲁胺原料 药、比卡鲁胺片和比卡鲁胺胶囊。
【专利摘要】本发明涉及一种同时测定比卡鲁胺中6种有关物质的UPLC方法，该方法包括以下步骤：(1)样品溶液制备(2)对照品溶液制备(3)超高效液相色谱测定：取对照品溶液和样品溶液在以下色谱条件下进行测定分析，色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，2.1mm×50mm)；流动相A为0.01％(v/v)三氟乙酸的水溶液，流动相B为0.01％(v/v)三氟乙酸的乙腈溶液，进行梯度洗脱；流速0.5ml.min-1；柱温25℃；检测波长270nm。在该方法条件下，比卡鲁胺及其6种有关物质同时得到了有效分离，方法学结果均符合分析测定要求。本发明建立了同时测定比卡鲁胺及其6种有关物质的UPLC方法，可快速准确地检测出比卡鲁胺的杂质及降解产物，操作简单，重现性好，灵敏度高，可更好地控制比卡鲁胺产品的质量。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN104897818
【申请号】CN201510353609
【发明人】杨林, 何丹
【申请人】重庆医药高等专科学校
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月19日
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