一种用于细胞原位检测小分子化合物与靶蛋白相互作用的方法
一种用于细胞原位检测小分子化合物与靶蛋白相互作用的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子药理学领域，具体涉及一种用于细胞原位检测小分子化合物与靶 蛋白相互作用的方法。
【背景技术】
[0002] 在药物作用机理研宄过程中，药物都是通过与靶点相互作用来发挥药效作用，其 中蛋白质通常是药物发挥作用的主要靶点，因此在细胞原位水平研宄小分子化合物与靶蛋 白之间的相互作用，不仅有助于从分子水平阐述药物的作用机制，同时也为以特定蛋白为 靶点的先导药物的筛选和开发提供新的方法。通常情况下小分子配体与靶蛋白相互作用后 会导致蛋白质构象发生变化，构象的改变会直接影响蛋白质的功能或代谢（激活、抑制、稳 定或降解），从而引发一系列生理反应，这是药物发挥作用的分子基础。
[0003] 目前，研宄小分子化合物与蛋白质相互作用的通用方法包括平衡透析法、电化学 分析法、X-晶体衍射法、毛细管电泳法、光谱法（荧光光谱、红外光谱、圆二色光谱、红外光 谱、拉曼光谱、紫外-可见吸收光谱）等。此外，有些蛋白激酶是新药研发的重要靶点，利用 其催化特定底物产生化学反应的特征开发成商用试剂盒用于药物筛选，该方法通过检测酶 的活性间接反应小分子化合物与蛋白质的相互作用。但是，这些方法仅适用于小分子化合 物与特定蛋白质在单一环境下的相互作用，对于在细胞原位这种复杂体系的相互作用很难 适用。此外，这些方法分析的结果都是在理想状态下得出的结论，一旦应用于细胞或组织内 呈现很高的脱靶性。因此，开发一种能在细胞原位水平检测小分子化合物与靶蛋白相互作 用的分析方法尤为重要。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种用于细胞原位检测小分子化合物与靶蛋白 相互作用的方法。采用该方法可以在细胞原位水平上检测小分子化合物与靶蛋白之间是否 相互作用，可直接应用于先导药物的靶点验证或者用于以特定蛋白为靶点的先导药物的筛 选，可靠性高，灵敏度高。
[0005] 本发明所述的用于细胞原位检测小分子化合物与靶蛋白相互作用的方法为：以细 胞在非变性条件下裂解时所获得的具有完整生理结构的蛋白质为基础，选用适当的小分子 化合物与靶蛋白孵育形成复合体，通过特异性的抗体诱捕靶蛋白并将与靶蛋白相互作用的 小分子化合物一同捕获，结合质谱分析以实现在细胞原位水平检测小分子化合物与靶蛋白 之间是否具有相互作用。
[0006] 更为具体的方法包括以下步骤：
[0007] (I)选定小分子化合物；
[0008] (II)蛋白质的提取：将细胞在非变性条件下进行裂解以获得具有完整生理结构 的蛋白质；
[0009] (III)复合体的形成：将小分子化合物与蛋白质进行孵育得到小分子化合物与靶 蛋白的复合体；
[0010] (IV)复合体的分离：用与靶蛋白特异性结合的抗体捕获复合体，通过免疫共沉淀 的方法分离；
[0011] (V)复合体的变性：将经步骤（IV)分离后的复合体进行变性处理；
[0012] (VI)质谱分析：将经步骤（V)变性后的复合体进行质谱分析，同时与标准样品 和阴性对照样品对比，检测变性后的复合体中是否有前述选定的小分子化合物析出，并以 此来判断靶蛋白与小分子化合物之间是否相互作用。
[0013] 本发明所述的技术方案中，所述的蛋白质可以是用于肿瘤治疗、炎症治疗、心脑血 管疾病治疗、神经系统疾病治疗或其他类型疾病治疗的靶点（如癌症治疗靶点EGFR、拓扑 异构酶等，炎症治疗靶点Toll样受体、前列腺素合成酶，心脑血管疾病治疗靶点钠泵、钙 泵、钾泵等，神经系统疾病治疗靶点胆碱酯酶、胆碱受体等，镇痛靶点阿片受体等），也可以 是与药物转运、吸收、代谢或排泄相关的蛋白质（如药物转运体、P-糖蛋白、细胞色素P450、 a1-酸性糖蛋白、谷胱甘肽转移酶、葡萄糖醛酸转移酶等）。
[0014] 本发明所述的技术方案中，所述的小分子化合物根据体外活性初筛结果进行确 定。具体来源可以是目前已经上市的药物，如癌症治疗药物吉非替尼、解热镇痛药阿司匹 林、抗高血压药物尼莫地平、抑制胃酸分泌药奥美拉唑等，也可以是自行合成的化合物，或 者是天然的化合物。
[0015] 上述方法的步骤（II)中，将细胞在非变性条件下进行裂解以获得具有完整生理 结构的蛋白质的具体操作与现有技术相同。
[0016] 上述方法的步骤（III)中，所述小分子化合物与蛋白质进行孵育的条件与时间与 现有技术相同，通常是在35~37°C条件下孵育0. 5~lh。本申请中，在孵育时，优选所述 小分子化合物与蛋白质的混合比例为1umol/L:50~100yg。
[0017] 上述方法的步骤（IV)中，根据前序步骤确定的靶蛋白来选择与靶蛋白特异性结 合的抗体，这一选择为本领域技术人员的公知常识，在此不再详述。所述通过免疫共沉淀的 方法分离的操作与现有技术相同，具体可以采用已经商品化的试剂盒（如Millipore公司 生产的CatchandReleasev2.OReversibleImmunoprecipitationSystemkit免疫共沉 淀试剂盒等），也可以根据实验需要自己准备实验材料制备。
[0018] 上述方法的步骤（V)中，所述的变性处理与现有技术相同，具体可以是将经步骤 (IV)分离后的复合体进行超声处理或煮沸处理以达到使蛋白质变性的目的，并最终使与 蛋白质结合的小分子化合物游离出来。
[0019] 上述方法的步骤（VI)中，当变性后的复合体中有前述选定的小分子化合物析出， 则表示在选定的细胞（即步骤（II)中用于在非变性条件下进行裂解以获得具有完整生理 结构的蛋白质的细胞）中，该选定的小分子化合物可以与捕获抗体特异性识别的蛋白质相 互作用；否则则表示不能相互作用。
[0020] 当采用本发明所述方法在细胞原位水平检测在胃癌细胞株MGC-803中，小分子化 合物与P53是否相互作用时，具体包括以下步骤：
[0021] (I)选定下述式（A)所示结构的化合物作为小分子化合物：
[0022]
[0023] 上述式（A)所示结构的小分子化合物的合成方法具体包括：
[0024] 取如下式⑶所示结构的化合物溶于甲醇和/或乙醇中，然后加入3-二甲氨基丙 胺，所得混合物在加热条件下反应，反应结束后，所得反应物冷却，过滤，收集滤饼，即得到 如下式（C)所示结构的中间产物；所得中间产物与正丙胺溶于二甲基亚砜或四氢呋喃中， 于加热条件下反应，反应结束后，将反应物倒入冰水中，有固体析出，收集固体，即得到目标 产物粗品；
[0026] 上述式（A)所示结构的小分子化合物的合成方法中，式（B)所示结构的化合物与 3_二甲氨基丙胺的物质的量之比通常为1 :1~1.2。所述的甲醇和/或乙醇作为溶剂使用， 所述甲醇优选采用体积浓度为90%~100 %甲醇，乙醇优选采用体积浓度为90%~100% 乙醇，也可以是甲醇和乙醇任意比例的混合物。溶剂的用量以可以溶解参加反应的原料的 量为宜。所述式（B)所示结构的化合物与3-二甲氨基丙胺的反应优选是在50~70°C条件 下进行，反应是否完全可采用薄层层析跟踪检测；合成得到的式（C)所示结构的中间产物 可以直接进行下一步反应，也可以经过进一步的硅胶薄层色谱或硅胶柱层析纯化后再进行 下一步反应。式（C)所示结构的中间产物与正丙胺的物质的量之比通常为1 :1~1. 5。所 述的二甲基亚砜或四氢呋喃作为溶剂使用；溶剂的用量以可以溶解参加反应的原料的量为 宜。所述式（C)所示结构的中间产物与正丙胺的反应优选是在110~135°C的条件下进行， 反应是否完全可采用薄层层析跟踪检测。
[0027] 为了提高目标化合物的纯度，可将所得目标产物粗品进行进一步纯化的纯化步 骤，具体是将制得的目标物粗品进行硅胶薄层色谱或硅胶柱层析，得到纯化后的目标物。在 将制得的目标产物粗品硅胶薄层色谱或上硅胶柱层析时，通常用由体积比为100 :1~10的 CH2CldP CH 3OH组成的洗脱剂洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压蒸除溶剂，得到纯化后的目标 产物。所述组成洗脱剂的〇12(：12和CH 3OH的体积比优选为100 :5~1 0。
[0028] (II)蛋白质的提取：将胃癌细胞株MGC-803按现有常规技术在非变性条件下进 行裂解以获得具有完整生理结构的蛋白质；
[0029] (III)复合体的形成：将式（A)所示结构的小分子化合物与蛋白质按现有常规技 术进行孵育得到小分子化合物与靶蛋白的复合体；
[0030] (IV)复合体的分离：用P53抗体捕获复合体，通过免疫共沉淀的方法分离；
[0031] (V)复合体的变性：将经步骤（IV)分离后的复合体进行变性处理，使与蛋白质 结合的式（A)所示结构的小分子化合物游离出来；
[0032] (VI)质谱分析：将经步骤（V)变性后的复合体进行质谱分析，同时与标准样 品（即式（A)所示结构的小分子化合物溶解于二甲基亚砜中所得的溶液）和阴性对照样品 (用p-p53抗体捕获复合体）对比，检测变性后的复合体中是否有上述式（A)所示结构的 小分子化合物析出，并以此来判断靶蛋白与式（A)所述结构小分子化合物之间是否相互作 用；如有，则表示在胃癌细胞株MGC-803中，该选定的式（A)所示结构的小分子化合物可以 与P53相互作用；否则则表示不能相互作用。
[0033] 与现有技术相比，本发明提供了一种用于细胞原位检测小分子化合物与靶蛋白相 互作用的方法，该方法可直接应用于先导药物的靶点验证，也可用于以特定蛋白为靶点的 先导药物的筛选。另一方面，本发明所述方法是在保持细胞内全部蛋白未丢失、未变性的条 件下进行的分析过程，符合体内实际情况，所得试验结果更可靠；再者，本发明结合质谱分 析的高灵敏性，从而可以更真实地反应小分子化合物与靶蛋白在细胞内的相互作用，灵敏 度高、无背景干扰。
【附图说明】
[0034] 图1为本发明实施例2中在细胞原位水平检测实施例1制得的最终产物与p53相 互作用的质谱分析结果，其中，A为实施例1制得的最终产物溶解在DMSO中的质谱分析结 果，B为用p53抗体捕获复合体的质谱分析结果，C为用p-p53抗体捕获复合体的质谱分析 结果。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但 本发明并不限于以下实施例。
[0036] 实施例1 :式（A)所示结构的小分子化合物（以下用NA20表示）的制备
[0037] NA20的合成路线如下所示，其中的试剂和条件：a:3-二甲氨基丙胺，乙醇，70°C， 搅拌反应l〇h;b:丙胺，DMSO, 135°C:
[0038]
[0039] 将式⑶所示结构的化合物（2. 77g，lOmmol)溶于150ml乙醇（100v/v% )中，充 分搅拌，然后加入3-二甲氨基丙胺（1. 02g，lOmmol)，将反应混合物于70°C下搅拌反应10 个小时，反应结束后，将溶液冷却至室温并过滤，收集滤饼，得式（C)所示结构的中间产物， 该中间产物无需进一步纯化，直接用于下一步反应；取式（C)所示结构的中间产物（4. 23g lOmmol)、正丙胺（0. 59g,lOmmol)溶于DMS0中，充分搅拌，混合物在135°C下搅拌反应8个 小时。反应结束后，将反应液倒入冰水中，溶液中有黄色固体析出，收集粗产物并通过硅胶 柱色谱法进行纯化（CH2C12:CH30H= 100:5)，得纯化后的黄色固体（1. 80g，yield53% )。
[0040] 对纯化后的黄色固体进行结构鉴定，确定其为目标产物NA20。具体的氢谱、碳 谱及质谱数据分别如下：屯NMR(400MHz,DMS0-d6)S8. 64 (d,J= 8. 4Hz, 1H)，8. 36 (d,J =7. 3Hz, 1H), 8. 19 (d,J= 8. 5Hz, 1H), 7. 71 (t,J= 5. 2Hz, 1H), 7. 61 (t,J= 7. 8Hz, 1H), 6. 69 (d,J= 8. 6Hz, 1H), 3. 99 (t, 2H), 3. 29 (dd,J= 12. 9, 6. 4Hz, 2H), 2. 25 (t,J =7. 0Hz, 2H) , 2. 11 (s, 6H) , 1. 97 - 1. 55 (m, 4H) , 0. 97 (t,J= 7. 3Hz, 3H) .13C NMR(126MHz,DMS〇-d6) 8 163. 72, 162. 86, 150. 64, 134. 17, 130. 54, 129. 39, 128. 49, 124. 10, 121. 83, 120. 05, 107. 48, 103. 70, 56. 82, 45. 06, 44. 56, 37. 75, 25. 80, 21. 15, 11. 53.ESI-MS m/z: 340. 05 [M+Hr
[0041] 实施例2 :在细胞原位水平检测NA20与p53相互作用
[0042] (一）非变性总蛋白的提取
[0043] 1.将胃癌细胞株MGC-803接种于6孔板，当细胞汇合度达到80 %~90 %时小心移 去培养皿中的培养基，PBS洗两次，用浓度为0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞。加入2mLPBS 溶液，吹散贴壁细胞并收集悬液于15mL离心管中，在离心机上以2000rpm离心10min;
[0044] 2?弃去上清PBS，加适量 1XCoupingBuffer(用PBS稀释 20XCoupingBuffer)， 漂洗细胞一次，2000rpm离心10min;
[0045] 3.加入预冷的IPLysis/WashBuffer(300yL)，吹散悬浮细胞，并将细胞悬液转 至提前标记号的1. 5mLEP管中。冰上孵育5min，期间定时吹散悬浮细胞，防止细胞沉淀；
[0046] 4.充分裂解细胞，将裂解好的细胞悬液转至低温离心机上离心，4°C，13000Xg离 心10min。小心取上清液移至于新的1. 5mL离心管中，防止吸出底部杂质，-80°C储存（尽 量在短时间内进行后续试验）。
[0047] (二）NA20与靶蛋白复合体的形成
[0048] 将步骤（一）中提取的总蛋白与NA20进行孵育，可按照100yg总蛋白配比1yM 药物的比例进行混合，充分混匀后在37°C水浴锅中孵育30min，使药物与蛋白充分进行结 合，进而形成NA20与靶蛋白的复合体。
[0049] (三）NA20与靶蛋白复合体的分离（本步骤中，通过免疫共沉淀的方法分离时采用 Millipore公司生产的Catch and Release v2. OReversible Immunoprecipitation System kit免疫共沉淀试剂盒）
[0050] 1.抗体结合过程
[0051] 1)准备 2mLlXCoupingBuffer(用超纯水稀释 20XCoupingBuffer所得）；
[0052] 2)从 4°C冰箱中取出 Pierce Protein A/G Plus Agarose，室温放置 5min，期间摇 晃振荡，使其成悬浮状态。用一大口径移液器吸取20 y L悬液，加入Pierce上样吸附柱中 (注入柱子底部中间部位），将柱子做好标记，放入收集管中l〇〇〇g离心力离心60s，弃去下 液；
[0053] 3)用 1XCoupingBuffer洗柱子两次，每次 200 yL;
[0054] 4)轻敲柱子底部，移去多余液体并在柱子底部插入胶塞；
[0055] 5)在柱子中配制浓度为1yg/yL抗体混合液，即加入5yL20XCoupingBuffer， 所需免疫共沉淀的蛋白根据要求加入所需的量，最后加适量超纯水补足到100uL，轻轻吹 打混匀混合液；
[0056] 6)柱子盖上胶塞，在室温下在震荡器上孵育30-60min或在4°C冰箱中孵育过夜；
[0057] 7)取出柱子放入一新的收集管中，1000g离心力离心60s，收集下液（若是在振荡 器上孵育，建议重复步聚6过程）；
[0058] 8)打开盖子，加入100yLlXCoupingBuffer，洗一次，1000g离心力离心60s，弃 去下夜；
[0059] 9)再加入 300 yLIXCoupingBuffer，重复洗一次。
[0060] 2.抗体交联过程
[0061] 1)DSS溶液配制：将DSS粉末加入217yLDMS0充分溶解，制成10X(25mM)DSS溶 液。按DSS:DMSO/DMF= 1:10 的量将 10XDSS稀释成IX，即取 100yL10XDSS加 900yL DMS0/DMF稀释；
[0062] 2)将上以过程制得的抗体吸附柱在纸巾上轻敲柱子底部，移去多余液体，然后再 次插入底塞；
[0063] 3)配制交联混合液，即取2. 5yL20XCoupingBuffer加入至柱子底部，然后加入 9yLIXDSS，最后加入38. 5yL超纯水补足为总体积为50yL的混合体系，用移液器轻轻吹 打混合均匀（也可配制成2倍体积量的混合液，增加抗体交联度）；
[0064] 4)盖上盖子，室温下，在振荡器上孵育30-60min;
[0065] 5)取出柱子，弃去底塞，并将柱子再放至一新的收集管中，1000g离心力离心60s， 弃去下夜；
[0066] 6)打开盖子，加入50yLElutionBuffer，1000g离心力离心60s，回收下夜，可用 于检测抗体交联效果；
[0067] 7)再次加入100yLElutionBuffer洗两次，去除没有交联的抗体，结束交联反 应；
[0068] 8)用预冷的IPLysis/WashBuffer洗两次，每次200uL，1000g离心力离心60s， 也可减少至一次。
[0069] 3.蛋白免疫共沉淀过程
[0070] 1)弃去收集管中的离心的IPLysis/WashBuffer，在吸水纸上轻敲底塞并更换新 的底塞；
[0071] 2)控制上样体积在300~600yL，若定量蛋白，则控制上样蛋白总量为 500-1000yg，盖上盖子，室温条件下，在振荡器上温和孵育l-2h或4°C孵育过夜；
[0072] 3)移去底塞，打开盖子，将柱子再次放入一新的收集管中，1000g离心力离心60s， 回收下液（若室温条件下孵育，建议重复步聚2)，直到免疫共沉淀成功）；
[0073] 4)将柱子重新更换至收集废液的收集管，加入200yLIPLysis/WashBuffer洗 一次，lOOOg离心力离心60s，弃去下液；
[0074] 5)再加入 200uLIPLysis/WashBuffer重复洗一次，1000g离心力离心 60s，弃 去下液；
[0075] 6)加入 100yLIXConditioningBuffer洗一次（用超纯水将 100XConditioning Buffer稀释成1X)，1000g离心力离心60s，弃去下液。
[0076] 4.洗脱收集样品过程
[0077] 1)将吸附柱放入做好标记的回收管中，先加入10yLElutionBuffer润洗一次， 1000g离心力离心60s，收集洗脱液；
[0078] 2)再加入50-100yLElutionBuffer室温下孵育5min。重复洗一次，1000g离心 力离心60s，收集洗脱液；
[0079] 3)可进行分析回收蛋白浓度，为得到更多交联蛋白，可再加适量ElutionBuffer 洗脱；
[0080] 4)活化柱子，加入100yLIXCoupingBuffer重复洗两次，1000g离心力离心60s， 弃去下液。再加入200yLlXCoupingBuffer盖上盖子在4°C冰箱中短期保存。
[0081] (四）NA20与靶蛋白复合体的变性
[0082] 将步骤（三）中分离得到的样品用超声处理5min。
[0083] (五）NA20与靶蛋白复合体的质谱检测
[0084]将经步骤（四）处理所得的样品随后进行质谱分析，结果如图1所示。其中，B为 用P53抗体捕获复合体的质谱分析结果，C为用p-p53抗体捕获复合体的质谱分析结果，A 为NA20溶解在DMS0中的质谱分析结果。分析结果显示，在胃癌细胞株MGC-803细胞中NA20 可以与P53直接相互作用，却不能与p-p53相互作用。
【主权项】
1. 一种用于细胞原位检测小分子化合物与靶蛋白相互作用的方法，其特征在于：以细 胞在非变性条件下裂解时所获得的具有完整生理结构的蛋白质为基础，选用适当的小分子 化合物与靶蛋白孵育形成复合体，通过特异性的抗体诱捕靶蛋白并将与靶蛋白相互作用的 小分子化合物一同捕获，结合质谱分析以实现在细胞原位水平检测小分子化合物与靶蛋白 之间是否具有相互作用。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：具体包括以下步骤： (I )选定小分子化合物； (Π )蛋白质的提取：将细胞在非变性条件下进行裂解以获得具有完整生理结构的蛋 白质； (III) 复合体的形成：将小分子化合物与蛋白质进行孵育得到小分子化合物与靶蛋白 的复合体； (IV) 复合体的分离：用与靶蛋白特异性结合的抗体捕获复合体，通过免疫共沉淀的方 法分呙； (V )复合体的变性：将经步骤（IV )分离后的复合体进行变性处理，使与蛋白质结合 的小分子化合物游离出来； (VI)质谱分析：将经步骤（V )变性后的复合体进行质谱分析，同时与标准样品和阴 性对照样品对比，检测变性后的复合体中是否有前述选定的小分子化合物析出，并以此来 判断靶蛋白与小分子化合物之间是否相互作用。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的蛋白质为用于肿瘤治疗、炎症 治疗、心脑血管疾病治疗、神经系统疾病治疗或其他类型疾病治疗的靶点，或者是与药物转 运、吸收、代谢或排泄相关的蛋白质。4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的小分子化合物根据体外活性 初筛结果进行确定。5. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（III)中，所述小分子化合物与 蛋白质的比例为I ymol/L :50~100 μ g。6. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（V )中，所述的变性处理是将 经步骤（IV)分离后的复合体进行超声处理或煮沸处理。7. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的小分子化合物为具有下述式 (A)所示结构的化合物：8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述具有式（A)所示结构的小分子化合 物的合成方法包括： 取如下式（B)所示结构的化合物溶于甲醇和/或乙醇中，然后加入3-二甲氨基丙胺， 所得混合物在加热条件下反应，反应结束后，所得反应物冷却，过滤，收集滤饼，即得到如下 式（C)所示结构的中间产物；所得中间产物与正丙胺溶于二甲基亚砜或四氢呋喃中，于加 热条件下反应，反应结束后，将反应物倒入冰水中，有固体析出，收集固体，即得到目标产物 粗品；9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述具有式（A)所示结构的小分子化合 物的合成方法还包括将所得目标产物粗品进行进一步纯化的纯化步骤。10. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的细胞为胃癌细胞株MGC-803。
【专利摘要】本发明公开了一种用于细胞原位检测小分子化合物与靶蛋白相互作用的方法，具体是以细胞在非变性条件下裂解时所获得的具有完整生理结构的蛋白质为基础，选用适当的小分子化合物与靶蛋白孵育形成复合体，通过特异性的抗体诱捕靶蛋白并将与靶蛋白相互作用的小分子化合物一同捕获，结合质谱分析以实现在细胞原位水平检测小分子化合物与靶蛋白之间是否具有相互作用。本发明所述方法可直接应用于先导药物的靶点验证，也可用于以特定蛋白为靶点的先导药物的筛选。另一方面，本发明所述方法是在保持细胞内全部蛋白未丢失、未变性的条件下进行的分析过程，符合体内实际情况，所得试验结果更可靠；再者，本发明所述方法灵敏度高、无背景干扰。
【IPC分类】G01N30/06, G01N30/72
【公开号】CN104897826
【申请号】CN201510332405
【发明人】张国海, 彭艳, 安运锋, 仲辉, 卢幸
【申请人】广西师范大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月16日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子药理学领域，具体涉及一种用于细胞原位检测小分子化合物与靶 蛋白相互作用的方法。
【背景技术】
[0002] 在药物作用机理研宄过程中，药物都是通过与靶点相互作用来发挥药效作用，其 中蛋白质通常是药物发挥作用的主要靶点，因此在细胞原位水平研宄小分子化合物与靶蛋 白之间的相互作用，不仅有助于从分子水平阐述药物的作用机制，同时也为以特定蛋白为 靶点的先导药物的筛选和开发提供新的方法。通常情况下小分子配体与靶蛋白相互作用后 会导致蛋白质构象发生变化，构象的改变会直接影响蛋白质的功能或代谢（激活、抑制、稳 定或降解），从而引发一系列生理反应，这是药物发挥作用的分子基础。
[0003] 目前，研宄小分子化合物与蛋白质相互作用的通用方法包括平衡透析法、电化学 分析法、X-晶体衍射法、毛细管电泳法、光谱法（荧光光谱、红外光谱、圆二色光谱、红外光 谱、拉曼光谱、紫外-可见吸收光谱）等。此外，有些蛋白激酶是新药研发的重要靶点，利用 其催化特定底物产生化学反应的特征开发成商用试剂盒用于药物筛选，该方法通过检测酶 的活性间接反应小分子化合物与蛋白质的相互作用。但是，这些方法仅适用于小分子化合 物与特定蛋白质在单一环境下的相互作用，对于在细胞原位这种复杂体系的相互作用很难 适用。此外，这些方法分析的结果都是在理想状态下得出的结论，一旦应用于细胞或组织内 呈现很高的脱靶性。因此，开发一种能在细胞原位水平检测小分子化合物与靶蛋白相互作 用的分析方法尤为重要。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种用于细胞原位检测小分子化合物与靶蛋白 相互作用的方法。采用该方法可以在细胞原位水平上检测小分子化合物与靶蛋白之间是否 相互作用，可直接应用于先导药物的靶点验证或者用于以特定蛋白为靶点的先导药物的筛 选，可靠性高，灵敏度高。
[0005] 本发明所述的用于细胞原位检测小分子化合物与靶蛋白相互作用的方法为：以细 胞在非变性条件下裂解时所获得的具有完整生理结构的蛋白质为基础，选用适当的小分子 化合物与靶蛋白孵育形成复合体，通过特异性的抗体诱捕靶蛋白并将与靶蛋白相互作用的 小分子化合物一同捕获，结合质谱分析以实现在细胞原位水平检测小分子化合物与靶蛋白 之间是否具有相互作用。
[0006] 更为具体的方法包括以下步骤：
[0007] (I)选定小分子化合物；
[0008] (II)蛋白质的提取：将细胞在非变性条件下进行裂解以获得具有完整生理结构 的蛋白质；
[0009] (III)复合体的形成：将小分子化合物与蛋白质进行孵育得到小分子化合物与靶 蛋白的复合体；
[0010] (IV)复合体的分离：用与靶蛋白特异性结合的抗体捕获复合体，通过免疫共沉淀 的方法分离；
[0011] (V)复合体的变性：将经步骤（IV)分离后的复合体进行变性处理；
[0012] (VI)质谱分析：将经步骤（V)变性后的复合体进行质谱分析，同时与标准样品 和阴性对照样品对比，检测变性后的复合体中是否有前述选定的小分子化合物析出，并以 此来判断靶蛋白与小分子化合物之间是否相互作用。
[0013] 本发明所述的技术方案中，所述的蛋白质可以是用于肿瘤治疗、炎症治疗、心脑血 管疾病治疗、神经系统疾病治疗或其他类型疾病治疗的靶点（如癌症治疗靶点EGFR、拓扑 异构酶等，炎症治疗靶点Toll样受体、前列腺素合成酶，心脑血管疾病治疗靶点钠泵、钙 泵、钾泵等，神经系统疾病治疗靶点胆碱酯酶、胆碱受体等，镇痛靶点阿片受体等），也可以 是与药物转运、吸收、代谢或排泄相关的蛋白质（如药物转运体、P-糖蛋白、细胞色素P450、 a1-酸性糖蛋白、谷胱甘肽转移酶、葡萄糖醛酸转移酶等）。
[0014] 本发明所述的技术方案中，所述的小分子化合物根据体外活性初筛结果进行确 定。具体来源可以是目前已经上市的药物，如癌症治疗药物吉非替尼、解热镇痛药阿司匹 林、抗高血压药物尼莫地平、抑制胃酸分泌药奥美拉唑等，也可以是自行合成的化合物，或 者是天然的化合物。
[0015] 上述方法的步骤（II)中，将细胞在非变性条件下进行裂解以获得具有完整生理 结构的蛋白质的具体操作与现有技术相同。
[0016] 上述方法的步骤（III)中，所述小分子化合物与蛋白质进行孵育的条件与时间与 现有技术相同，通常是在35~37°C条件下孵育0. 5~lh。本申请中，在孵育时，优选所述 小分子化合物与蛋白质的混合比例为1umol/L:50~100yg。
[0017] 上述方法的步骤（IV)中，根据前序步骤确定的靶蛋白来选择与靶蛋白特异性结 合的抗体，这一选择为本领域技术人员的公知常识，在此不再详述。所述通过免疫共沉淀的 方法分离的操作与现有技术相同，具体可以采用已经商品化的试剂盒（如Millipore公司 生产的CatchandReleasev2.OReversibleImmunoprecipitationSystemkit免疫共沉 淀试剂盒等），也可以根据实验需要自己准备实验材料制备。
[0018] 上述方法的步骤（V)中，所述的变性处理与现有技术相同，具体可以是将经步骤 (IV)分离后的复合体进行超声处理或煮沸处理以达到使蛋白质变性的目的，并最终使与 蛋白质结合的小分子化合物游离出来。
[0019] 上述方法的步骤（VI)中，当变性后的复合体中有前述选定的小分子化合物析出， 则表示在选定的细胞（即步骤（II)中用于在非变性条件下进行裂解以获得具有完整生理 结构的蛋白质的细胞）中，该选定的小分子化合物可以与捕获抗体特异性识别的蛋白质相 互作用；否则则表示不能相互作用。
[0020] 当采用本发明所述方法在细胞原位水平检测在胃癌细胞株MGC-803中，小分子化 合物与P53是否相互作用时，具体包括以下步骤：
[0021] (I)选定下述式（A)所示结构的化合物作为小分子化合物：
[0022]
[0023] 上述式（A)所示结构的小分子化合物的合成方法具体包括：
[0024] 取如下式⑶所示结构的化合物溶于甲醇和/或乙醇中，然后加入3-二甲氨基丙 胺，所得混合物在加热条件下反应，反应结束后，所得反应物冷却，过滤，收集滤饼，即得到 如下式（C)所示结构的中间产物；所得中间产物与正丙胺溶于二甲基亚砜或四氢呋喃中， 于加热条件下反应，反应结束后，将反应物倒入冰水中，有固体析出，收集固体，即得到目标 产物粗品；
[0026] 上述式（A)所示结构的小分子化合物的合成方法中，式（B)所示结构的化合物与 3_二甲氨基丙胺的物质的量之比通常为1 :1~1.2。所述的甲醇和/或乙醇作为溶剂使用， 所述甲醇优选采用体积浓度为90%~100 %甲醇，乙醇优选采用体积浓度为90%~100% 乙醇，也可以是甲醇和乙醇任意比例的混合物。溶剂的用量以可以溶解参加反应的原料的 量为宜。所述式（B)所示结构的化合物与3-二甲氨基丙胺的反应优选是在50~70°C条件 下进行，反应是否完全可采用薄层层析跟踪检测；合成得到的式（C)所示结构的中间产物 可以直接进行下一步反应，也可以经过进一步的硅胶薄层色谱或硅胶柱层析纯化后再进行 下一步反应。式（C)所示结构的中间产物与正丙胺的物质的量之比通常为1 :1~1. 5。所 述的二甲基亚砜或四氢呋喃作为溶剂使用；溶剂的用量以可以溶解参加反应的原料的量为 宜。所述式（C)所示结构的中间产物与正丙胺的反应优选是在110~135°C的条件下进行， 反应是否完全可采用薄层层析跟踪检测。
[0027] 为了提高目标化合物的纯度，可将所得目标产物粗品进行进一步纯化的纯化步 骤，具体是将制得的目标物粗品进行硅胶薄层色谱或硅胶柱层析，得到纯化后的目标物。在 将制得的目标产物粗品硅胶薄层色谱或上硅胶柱层析时，通常用由体积比为100 :1~10的 CH2CldP CH 3OH组成的洗脱剂洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压蒸除溶剂，得到纯化后的目标 产物。所述组成洗脱剂的〇12(：12和CH 3OH的体积比优选为100 :5~1 0。
[0028] (II)蛋白质的提取：将胃癌细胞株MGC-803按现有常规技术在非变性条件下进 行裂解以获得具有完整生理结构的蛋白质；
[0029] (III)复合体的形成：将式（A)所示结构的小分子化合物与蛋白质按现有常规技 术进行孵育得到小分子化合物与靶蛋白的复合体；
[0030] (IV)复合体的分离：用P53抗体捕获复合体，通过免疫共沉淀的方法分离；
[0031] (V)复合体的变性：将经步骤（IV)分离后的复合体进行变性处理，使与蛋白质 结合的式（A)所示结构的小分子化合物游离出来；
[0032] (VI)质谱分析：将经步骤（V)变性后的复合体进行质谱分析，同时与标准样 品（即式（A)所示结构的小分子化合物溶解于二甲基亚砜中所得的溶液）和阴性对照样品 (用p-p53抗体捕获复合体）对比，检测变性后的复合体中是否有上述式（A)所示结构的 小分子化合物析出，并以此来判断靶蛋白与式（A)所述结构小分子化合物之间是否相互作 用；如有，则表示在胃癌细胞株MGC-803中，该选定的式（A)所示结构的小分子化合物可以 与P53相互作用；否则则表示不能相互作用。
[0033] 与现有技术相比，本发明提供了一种用于细胞原位检测小分子化合物与靶蛋白相 互作用的方法，该方法可直接应用于先导药物的靶点验证，也可用于以特定蛋白为靶点的 先导药物的筛选。另一方面，本发明所述方法是在保持细胞内全部蛋白未丢失、未变性的条 件下进行的分析过程，符合体内实际情况，所得试验结果更可靠；再者，本发明结合质谱分 析的高灵敏性，从而可以更真实地反应小分子化合物与靶蛋白在细胞内的相互作用，灵敏 度高、无背景干扰。
【附图说明】
[0034] 图1为本发明实施例2中在细胞原位水平检测实施例1制得的最终产物与p53相 互作用的质谱分析结果，其中，A为实施例1制得的最终产物溶解在DMSO中的质谱分析结 果，B为用p53抗体捕获复合体的质谱分析结果，C为用p-p53抗体捕获复合体的质谱分析 结果。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但 本发明并不限于以下实施例。
[0036] 实施例1 :式（A)所示结构的小分子化合物（以下用NA20表示）的制备
[0037] NA20的合成路线如下所示，其中的试剂和条件：a:3-二甲氨基丙胺，乙醇，70°C， 搅拌反应l〇h;b:丙胺，DMSO, 135°C:
[0038]
[0039] 将式⑶所示结构的化合物（2. 77g，lOmmol)溶于150ml乙醇（100v/v% )中，充 分搅拌，然后加入3-二甲氨基丙胺（1. 02g，lOmmol)，将反应混合物于70°C下搅拌反应10 个小时，反应结束后，将溶液冷却至室温并过滤，收集滤饼，得式（C)所示结构的中间产物， 该中间产物无需进一步纯化，直接用于下一步反应；取式（C)所示结构的中间产物（4. 23g lOmmol)、正丙胺（0. 59g,lOmmol)溶于DMS0中，充分搅拌，混合物在135°C下搅拌反应8个 小时。反应结束后，将反应液倒入冰水中，溶液中有黄色固体析出，收集粗产物并通过硅胶 柱色谱法进行纯化（CH2C12:CH30H= 100:5)，得纯化后的黄色固体（1. 80g，yield53% )。
[0040] 对纯化后的黄色固体进行结构鉴定，确定其为目标产物NA20。具体的氢谱、碳 谱及质谱数据分别如下：屯NMR(400MHz,DMS0-d6)S8. 64 (d,J= 8. 4Hz, 1H)，8. 36 (d,J =7. 3Hz, 1H), 8. 19 (d,J= 8. 5Hz, 1H), 7. 71 (t,J= 5. 2Hz, 1H), 7. 61 (t,J= 7. 8Hz, 1H), 6. 69 (d,J= 8. 6Hz, 1H), 3. 99 (t, 2H), 3. 29 (dd,J= 12. 9, 6. 4Hz, 2H), 2. 25 (t,J =7. 0Hz, 2H) , 2. 11 (s, 6H) , 1. 97 - 1. 55 (m, 4H) , 0. 97 (t,J= 7. 3Hz, 3H) .13C NMR(126MHz,DMS〇-d6) 8 163. 72, 162. 86, 150. 64, 134. 17, 130. 54, 129. 39, 128. 49, 124. 10, 121. 83, 120. 05, 107. 48, 103. 70, 56. 82, 45. 06, 44. 56, 37. 75, 25. 80, 21. 15, 11. 53.ESI-MS m/z: 340. 05 [M+Hr
[0041] 实施例2 :在细胞原位水平检测NA20与p53相互作用
[0042] (一）非变性总蛋白的提取
[0043] 1.将胃癌细胞株MGC-803接种于6孔板，当细胞汇合度达到80 %~90 %时小心移 去培养皿中的培养基，PBS洗两次，用浓度为0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞。加入2mLPBS 溶液，吹散贴壁细胞并收集悬液于15mL离心管中，在离心机上以2000rpm离心10min;
[0044] 2?弃去上清PBS，加适量 1XCoupingBuffer(用PBS稀释 20XCoupingBuffer)， 漂洗细胞一次，2000rpm离心10min;
[0045] 3.加入预冷的IPLysis/WashBuffer(300yL)，吹散悬浮细胞，并将细胞悬液转 至提前标记号的1. 5mLEP管中。冰上孵育5min，期间定时吹散悬浮细胞，防止细胞沉淀；
[0046] 4.充分裂解细胞，将裂解好的细胞悬液转至低温离心机上离心，4°C，13000Xg离 心10min。小心取上清液移至于新的1. 5mL离心管中，防止吸出底部杂质，-80°C储存（尽 量在短时间内进行后续试验）。
[0047] (二）NA20与靶蛋白复合体的形成
[0048] 将步骤（一）中提取的总蛋白与NA20进行孵育，可按照100yg总蛋白配比1yM 药物的比例进行混合，充分混匀后在37°C水浴锅中孵育30min，使药物与蛋白充分进行结 合，进而形成NA20与靶蛋白的复合体。
[0049] (三）NA20与靶蛋白复合体的分离（本步骤中，通过免疫共沉淀的方法分离时采用 Millipore公司生产的Catch and Release v2. OReversible Immunoprecipitation System kit免疫共沉淀试剂盒）
[0050] 1.抗体结合过程
[0051] 1)准备 2mLlXCoupingBuffer(用超纯水稀释 20XCoupingBuffer所得）；
[0052] 2)从 4°C冰箱中取出 Pierce Protein A/G Plus Agarose，室温放置 5min，期间摇 晃振荡，使其成悬浮状态。用一大口径移液器吸取20 y L悬液，加入Pierce上样吸附柱中 (注入柱子底部中间部位），将柱子做好标记，放入收集管中l〇〇〇g离心力离心60s，弃去下 液；
[0053] 3)用 1XCoupingBuffer洗柱子两次，每次 200 yL;
[0054] 4)轻敲柱子底部，移去多余液体并在柱子底部插入胶塞；
[0055] 5)在柱子中配制浓度为1yg/yL抗体混合液，即加入5yL20XCoupingBuffer， 所需免疫共沉淀的蛋白根据要求加入所需的量，最后加适量超纯水补足到100uL，轻轻吹 打混匀混合液；
[0056] 6)柱子盖上胶塞，在室温下在震荡器上孵育30-60min或在4°C冰箱中孵育过夜；
[0057] 7)取出柱子放入一新的收集管中，1000g离心力离心60s，收集下液（若是在振荡 器上孵育，建议重复步聚6过程）；
[0058] 8)打开盖子，加入100yLlXCoupingBuffer，洗一次，1000g离心力离心60s，弃 去下夜；
[0059] 9)再加入 300 yLIXCoupingBuffer，重复洗一次。
[0060] 2.抗体交联过程
[0061] 1)DSS溶液配制：将DSS粉末加入217yLDMS0充分溶解，制成10X(25mM)DSS溶 液。按DSS:DMSO/DMF= 1:10 的量将 10XDSS稀释成IX，即取 100yL10XDSS加 900yL DMS0/DMF稀释；
[0062] 2)将上以过程制得的抗体吸附柱在纸巾上轻敲柱子底部，移去多余液体，然后再 次插入底塞；
[0063] 3)配制交联混合液，即取2. 5yL20XCoupingBuffer加入至柱子底部，然后加入 9yLIXDSS，最后加入38. 5yL超纯水补足为总体积为50yL的混合体系，用移液器轻轻吹 打混合均匀（也可配制成2倍体积量的混合液，增加抗体交联度）；
[0064] 4)盖上盖子，室温下，在振荡器上孵育30-60min;
[0065] 5)取出柱子，弃去底塞，并将柱子再放至一新的收集管中，1000g离心力离心60s， 弃去下夜；
[0066] 6)打开盖子，加入50yLElutionBuffer，1000g离心力离心60s，回收下夜，可用 于检测抗体交联效果；
[0067] 7)再次加入100yLElutionBuffer洗两次，去除没有交联的抗体，结束交联反 应；
[0068] 8)用预冷的IPLysis/WashBuffer洗两次，每次200uL，1000g离心力离心60s， 也可减少至一次。
[0069] 3.蛋白免疫共沉淀过程
[0070] 1)弃去收集管中的离心的IPLysis/WashBuffer，在吸水纸上轻敲底塞并更换新 的底塞；
[0071] 2)控制上样体积在300~600yL，若定量蛋白，则控制上样蛋白总量为 500-1000yg，盖上盖子，室温条件下，在振荡器上温和孵育l-2h或4°C孵育过夜；
[0072] 3)移去底塞，打开盖子，将柱子再次放入一新的收集管中，1000g离心力离心60s， 回收下液（若室温条件下孵育，建议重复步聚2)，直到免疫共沉淀成功）；
[0073] 4)将柱子重新更换至收集废液的收集管，加入200yLIPLysis/WashBuffer洗 一次，lOOOg离心力离心60s，弃去下液；
[0074] 5)再加入 200uLIPLysis/WashBuffer重复洗一次，1000g离心力离心 60s，弃 去下液；
[0075] 6)加入 100yLIXConditioningBuffer洗一次（用超纯水将 100XConditioning Buffer稀释成1X)，1000g离心力离心60s，弃去下液。
[0076] 4.洗脱收集样品过程
[0077] 1)将吸附柱放入做好标记的回收管中，先加入10yLElutionBuffer润洗一次， 1000g离心力离心60s，收集洗脱液；
[0078] 2)再加入50-100yLElutionBuffer室温下孵育5min。重复洗一次，1000g离心 力离心60s，收集洗脱液；
[0079] 3)可进行分析回收蛋白浓度，为得到更多交联蛋白，可再加适量ElutionBuffer 洗脱；
[0080] 4)活化柱子，加入100yLIXCoupingBuffer重复洗两次，1000g离心力离心60s， 弃去下液。再加入200yLlXCoupingBuffer盖上盖子在4°C冰箱中短期保存。
[0081] (四）NA20与靶蛋白复合体的变性
[0082] 将步骤（三）中分离得到的样品用超声处理5min。
[0083] (五）NA20与靶蛋白复合体的质谱检测
[0084]将经步骤（四）处理所得的样品随后进行质谱分析，结果如图1所示。其中，B为 用P53抗体捕获复合体的质谱分析结果，C为用p-p53抗体捕获复合体的质谱分析结果，A 为NA20溶解在DMS0中的质谱分析结果。分析结果显示，在胃癌细胞株MGC-803细胞中NA20 可以与P53直接相互作用，却不能与p-p53相互作用。
【主权项】
1. 一种用于细胞原位检测小分子化合物与靶蛋白相互作用的方法，其特征在于：以细 胞在非变性条件下裂解时所获得的具有完整生理结构的蛋白质为基础，选用适当的小分子 化合物与靶蛋白孵育形成复合体，通过特异性的抗体诱捕靶蛋白并将与靶蛋白相互作用的 小分子化合物一同捕获，结合质谱分析以实现在细胞原位水平检测小分子化合物与靶蛋白 之间是否具有相互作用。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：具体包括以下步骤： (I )选定小分子化合物； (Π )蛋白质的提取：将细胞在非变性条件下进行裂解以获得具有完整生理结构的蛋 白质； (III) 复合体的形成：将小分子化合物与蛋白质进行孵育得到小分子化合物与靶蛋白 的复合体； (IV) 复合体的分离：用与靶蛋白特异性结合的抗体捕获复合体，通过免疫共沉淀的方 法分呙； (V )复合体的变性：将经步骤（IV )分离后的复合体进行变性处理，使与蛋白质结合 的小分子化合物游离出来； (VI)质谱分析：将经步骤（V )变性后的复合体进行质谱分析，同时与标准样品和阴 性对照样品对比，检测变性后的复合体中是否有前述选定的小分子化合物析出，并以此来 判断靶蛋白与小分子化合物之间是否相互作用。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的蛋白质为用于肿瘤治疗、炎症 治疗、心脑血管疾病治疗、神经系统疾病治疗或其他类型疾病治疗的靶点，或者是与药物转 运、吸收、代谢或排泄相关的蛋白质。4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的小分子化合物根据体外活性 初筛结果进行确定。5. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（III)中，所述小分子化合物与 蛋白质的比例为I ymol/L :50~100 μ g。6. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（V )中，所述的变性处理是将 经步骤（IV)分离后的复合体进行超声处理或煮沸处理。7. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的小分子化合物为具有下述式 (A)所示结构的化合物：8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述具有式（A)所示结构的小分子化合 物的合成方法包括： 取如下式（B)所示结构的化合物溶于甲醇和/或乙醇中，然后加入3-二甲氨基丙胺， 所得混合物在加热条件下反应，反应结束后，所得反应物冷却，过滤，收集滤饼，即得到如下 式（C)所示结构的中间产物；所得中间产物与正丙胺溶于二甲基亚砜或四氢呋喃中，于加 热条件下反应，反应结束后，将反应物倒入冰水中，有固体析出，收集固体，即得到目标产物 粗品；9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述具有式（A)所示结构的小分子化合 物的合成方法还包括将所得目标产物粗品进行进一步纯化的纯化步骤。10. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的细胞为胃癌细胞株MGC-803。
【专利摘要】本发明公开了一种用于细胞原位检测小分子化合物与靶蛋白相互作用的方法，具体是以细胞在非变性条件下裂解时所获得的具有完整生理结构的蛋白质为基础，选用适当的小分子化合物与靶蛋白孵育形成复合体，通过特异性的抗体诱捕靶蛋白并将与靶蛋白相互作用的小分子化合物一同捕获，结合质谱分析以实现在细胞原位水平检测小分子化合物与靶蛋白之间是否具有相互作用。本发明所述方法可直接应用于先导药物的靶点验证，也可用于以特定蛋白为靶点的先导药物的筛选。另一方面，本发明所述方法是在保持细胞内全部蛋白未丢失、未变性的条件下进行的分析过程，符合体内实际情况，所得试验结果更可靠；再者，本发明所述方法灵敏度高、无背景干扰。
【IPC分类】G01N30/06, G01N30/72
【公开号】CN104897826
【申请号】CN201510332405
【发明人】张国海, 彭艳, 安运锋, 仲辉, 卢幸
【申请人】广西师范大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月16日
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