一种检测弓形虫急性感染的方法及其靶标蛋白的制作方法
一种检测弓形虫急性感染的方法及其靶标蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种检测弓形虫急性感染的方法及其靶 标蛋白。
【背景技术】
[0002] 弓形虫是一种世界范围内寄生的原虫，可导致人畜流产、死胎和免疫抑制患者死 亡，其临床表现复杂，确诊困难，给公共卫生和畜牧业带来极大危害。在过去，免疫学检测方 法是弓形虫病的主要检测方法，但是抗弓形虫IgG的检测难以区分急性感染和既往感染， IgM和IgA阳性也不能作为急性感染的标志。因此，弓形虫急性感染的早期检测标志物有待 进一步寻找确定。
[0003] 弓形虫循环抗原（CirculatingAntigens，CAg)是弓形虫急性感染期虫体自身排 泄和裂解产物，动物感染弓形虫1-2天即可检出CAg，2周后滴度显著降低，CAg阳性提示弓 形虫病急性、活动性感染，是病原体存在的重要标志，是早期感染的可靠指标。排泄-分泌 抗原（Excretory/SecretoryAntigens，ESA)为CAg的主要成分，现有研宄大多是提取ESA 抗原或者表达某个分泌蛋白制备多抗来检测血清中的CAg，由于CAg抗原的含量较少，且成 分复杂，从而使得这些方法的特异性、灵敏度有限。因此，目前尚缺少一种特异性和灵敏度 都较高的检测弓形虫的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是克服了目前检测弓形虫感染的方法难以区分急性 感染和既往感染、利用循环抗原来检测急性感染的方法因循环抗原含量低、成分复杂等原 因特异性和灵敏度有限的问题，提供了一种适用于弓形虫早期急性感染检测的高特异性、 高敏感性的检测方法，用所述检测方法能够快速检测弓形虫急性感染，并具有较高的特异 性和灵敏度。
[0005] 本发明技术方案之一：一种非疾病诊断治疗目的的检测弓形虫急性感染的方法， 其包括下述步骤：使待检测样本与弓形虫ELMO蛋白或所述弓形虫ELMO蛋白的抗体发生反 应。
[0006] 本发明中，所述待检测样本可以为本领域常规所指被弓形虫感染的样本，较佳地 为被弓形虫感染后的血清样本。
[0007] 本发明中，所述弓形虫ELMO蛋白可以为本领域常规所指，较佳地为氨基酸序列如 GenBank收录号为EPT30320. 1的序列所示，所述弓形虫ELMO蛋白的制备方法可以为本领 域常规的方法，如合成法或表达纯化法，较佳地为原核表达纯化法。所述原核表达纯化方法 较佳地包括下述步骤：培养含有所述弓形虫ELMO基因的原核表达载体的原核表达菌株，破 碎细胞，从裂解液中提取所述弓形虫ELMO蛋白。所述原核表达的菌株可以为本领域常规的 表达菌株，较佳地为大肠杆菌表达菌株，更佳地为大肠杆菌BL21菌株。所述原核表达的载 体可以为本领域常规的表达载体，较佳地为pET系列表达载体，最佳地为pET28a载体。所 述提取方法可以为本领域常规，较佳地为层析法，更佳地为亲和层析法，最佳地为镍离子-6 组氨酸亲和层析法。
[0008] 本发明中，所述弓形虫ELMO蛋白的抗体可以为本领域常规所指的抗体，如单克隆 抗体或多克隆抗体。所述弓形虫ELMO蛋白的抗体的制备方法可以为本领域常规的制备方 法，较佳地包括下述步骤：将所述弓形虫ELMO蛋白免疫动物后制得所述抗体，更佳地包括： 将所述弓形虫ELMO蛋白免疫动物，二次免疫后采集血液分离含有所述抗体的血清。所述动 物可以为本领域常规使用到的动物，较佳地为兔或小鼠，更佳地为小鼠。所述免疫注射可以 为本领域常规的注射方式，如直接将所述弓形虫ELMO蛋白注射到动物体内，较佳地为将所 述弓形虫ELMO蛋白与弗氏佐剂一起注射到所述动物体内。所述二次免疫的间隔时间较佳 地为2周，所述采集血液较佳地为从所述动物的尾静脉采集。
[0009] 本发明中，所述反应可以为本领域常规所指，较佳地包括下述步骤：（1)将所述弓 形虫ELMO蛋白或所述弓形虫ELMO蛋白的抗体包被于基质上；（2)向步骤（1)中包被有所 述弓形虫ELMO蛋白或所述弓形虫ELMO蛋白的抗体的基质上加入待检测样本，使其与所述 弓形虫ELMO蛋白或所述弓形虫ELMO蛋白的抗体发生反应。
[0010] 本发明中，较佳地还可以包括步骤（3):检测步骤（2)所述反应的结果。所述检测 可以为本领域常规的检测方法，较佳地为检测抗原与抗体反应的检测方法，例如当基质上 包被的为ELMO蛋白时，在步骤（2)过后加入辣根过氧化物酶（HRP)标记的抗IgG的抗体后 孵育、显色并测定化学发光值；当基质上包被的是所述检测弓形虫急性感染的抗体时，在步 骤（2)后加入与所述检测弓形虫急性感染的抗体异源的ELMO抗体，孵育后再加入辣根过氧 化物酶（HRP)标记的抗IgG的抗体后再孵育、显色并测定化学发光值。
[0011] 本发明技术方案之二：一种检测弓形虫急性感染的抗体，其是通过包括如下步骤 的制备方法所制得的：将弓形虫ELMO蛋白免疫动物后制得所述抗体。
[0012] 本发明中，所述检测弓形虫急性感染的抗体可以为本领域常规所指的抗体，如单 克隆抗体或多克隆抗体。所述检测弓形虫急性感染的抗体的制备方法可以为本领域常规的 制备方法，较佳地包括下述步骤：将前述弓形虫ELMO蛋白免疫注射动物，二次免疫后采集 血液分离含有所述抗体的血清。所述动物可以为本领域常规使用到的动物，较佳地为兔或 小鼠，更佳地为小鼠。所述免疫注射可以为本领域常规的注射方式，如直接将所述弓形虫 ELMO蛋白注射到动物体内，较佳地为将所述ELMO蛋白与弗氏佐剂一起注射到动物体内。所 述二次免疫的间隔时间较佳地为2周，所述采集血液较佳地为从动物的尾静脉采集血液。
[0013] 本发明技术方案之三：一种检测弓形虫急性感染的试剂盒，其包括前述ELMO蛋白 和/或前述检测弓形虫急性感染的抗体。
[0014] 本发明中，所述检测弓形虫急性感染的试剂盒较佳地还可以包括免疫反应封闭 液、免疫反应洗绦液、免疫反应终止液和偶联有显色反应酶的抗IgG的抗体。
[0015] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0016] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0017] 本发明的积极进步效果在于：本发明所提供的一种检测弓形虫急性感染的靶标 蛋白及其抗体，以及一种利用所述靶标蛋白及其抗体的检测弓形虫急性感染的方法能够有 效、快速地检测弓形虫早期急性感染，并具有较高的特异性和灵敏度。
【附图说明】
[0018] 图1、不同物种ELMO氨基酸序列的进化树分析表明。
[0019] 图2、弓形虫ELMO基因的RT-PCR结果。
[0020] 图3、弓形虫ELMO蛋白His?Bind柱纯化结果。1 :流穿液；2 :漂洗液；3和4 :洗 脱液。
[0021] 图4、弓形虫ELMO蛋白的组织定位。
【具体实施方式】
[0022] 下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注 明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述 的"室温"是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。
[0023] 下述实施例中的实验材料、仪器和试剂的来源如下：
[0024] 实验动物与微生物：昆明小鼠和BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司； 比格犬购自上海新闪试验动物场；弓形虫RH株购自国家兽医微生物菌种保藏管理中心；大 肠杆菌BL21(DE3)和大肠杆菌TOP10感受态细胞购自北京康为世纪生物科技有限公司。
[0025] 实验细胞与试剂：Vero细胞购自中科院上海生化与细胞研宄所；DMEM、胰酶购 自Gibco公司；BSA、弗氏佐剂购自Sigma公司；复合型蛋白酶抑制剂购自Merck公司； NormalMouseIgG、ProteinA琼脂糖微球、DAPI购自碧云天生物技术有限公司；Alexa Fluor488标记的驴抗鼠IgG购自Jackson公司；HisBandResin试剂盒购自默克公司； BCA蛋白定量试剂盒和二硫苏糖醇（DTT)购自Bio-Rad公司；总RNA反转录试剂盒购自 ThermoScientific公司；pMD19T质粒购自宝生物工程（大连）有限公司；pET28a质粒购 自Novagen公司；氨苄青霉素和卡那霉素购自生工生物工程股份有限公司；3, 3'，5, 5' -四 甲基联苯胺、多聚甲醛和Triton-X100购自国药集团化学试剂有限公司；引物由苏州金唯 智生物技术有限公司合成；DNA测序由宝生物工程（大连）有限公司进行。
[0026] 实验仪器：色谱柱RP-C18购自ColumnTechnologyInc.;色谱仪 Zorbax300SB_C18peptidetraps购自AgilentTechnologies,Wilmington,DE；QExactive 质谱仪购自ThermoFisherScientific;激光共聚焦显微镜NikoneclipseCl_Si购自尼 康（Nikon)公司。
[0027] 实施例1获得弓形虫ESA抗原并制备多抗
[0028] 1、ESA的制备
[0029] 将昆明小鼠腹腔无菌接种弓形虫RH株，三天后收集腹水中的虫体，用20号针头的 注射器抽吸两次以破碎腹腔巨噬细胞，虫体稀释后以5ym滤器过滤，所得纯化后的虫体用 无血清DMEM清洗两次后以无血清DMEM按照1X108/毫升浓度悬浮虫体，重提悬液5 %二氧 化碳培养箱37°C培养2h以使虫体分泌ESA，lOOOrpm离心10min除去虫体并收集上清，将上 清中添加复合型蛋白酶抑制剂后利用3KDa蛋白浓缩管20倍浓缩，将浓缩后的蛋白在4°C条 件下无菌PBS透析后测定ESA蛋白浓度并分装，-80°C保存。
[0030] 2、多克隆抗体的制备
[0031] 将1中所述ESA加同体积弗氏佐剂乳化后，按照100yg/只免疫BALB/c小鼠，每 次免疫间隔2周，首次免疫十天后尾静脉采集血液分离血清用于抗体滴度ELISA检测。
[0032] 实施例2
[0033] 不同感染天数的急性感染弓形虫犬血清样本的制备
[0034] 选择清洁级比格犬，试验组和对照组各3只，试验组腹腔无菌接种1X109个新鲜 收集的纯化后的无菌PBS重悬的实施例1所述弓形虫RH株虫体，对照组接种无菌PBS，检测 体温变化并每天采集血液至感染后7天，分离血清后用作弓形虫急性感染动物血清。
[0035] 实施例3
[0036] 弓形虫急性感染不同天数的血清中循环抗原的免疫亲和层析
[0037] 1、犬血清IgG的去除
[0038] 将实施例2中所述感染弓形虫RH株3天内的犬血清60yl加至540yl无菌 PBS(pH= 7. 2)中，加入100y1 25% (v/v)的ProteinA琼脂糖微球，4°C缓慢搅拌2h后 离心收集上清，上清即为除去大部分IgG的稀释血清。
[0039] 2、去除非特异性结合
[0040] 将上述收集的上清中加入5y1NormalMouseIgG和100y1 25%的ProteinG 琼脂糖微球，4°C缓慢搅拌2h后离心收集上清。
[0041] 3、免疫沉淀富集目的蛋白
[0042] 将上述收集的上清中加入5y1实施例1中制得的ESA多抗后4°C搅拌过夜，加入 100y1 25%的ProteinG琼脂糖微球，4°C搅拌3h后离心收集琼脂糖微球，将微球清洗3次 后加入60y1 2XSDS-PAGE上样缓冲液，100°C煮沸5min后2500rpm离心5min收集上清。
[0043] 4、膜辅助蛋白质组制备（FASP)样品的酶解
[0044] 将3中所获得的富集的蛋白加入DTT至终浓度为lOOmM，沸水浴5min，冷却至室 温。加入200yL尿素buffer(8M尿素，150mMTrisHClpH8.0)混匀，转入10kD超滤离心管， 14000g离心 15min。加入 200yL尿素bufTerl4000g离心 15min，弃滤液。加入 100yL50mM 碘乙酰胺，所述碘乙酰胺溶于8M尿素，该8M尿素由150mMTris-HCl，pH8. 0配制成（这里 请您确认或修改），600rpm振荡lmin，避光室温30min，14000g离心10min。加入100yL前述 尿素缓冲液，14000g离心10min重复2次。加入100yL溶解缓冲液（Dissolutionbuffer)， 所述溶解缓冲液为25mMNH4HC03,140 00g离心10min重复2次。加入40y1Trypsin缓冲 液（2ygTrypsin加入到40yL溶解缓冲液配成），600rpm振荡lmin，37°C16-18h。换新 收集管，14000g离心10min，取滤液，准备进行液相色谱偶联质谱分析。
[0045] 5、毛细管高效液相色谱
[0046] 液相A液为0.1 % (v/v)甲酸水溶液，B液为0.1 % (v/v)甲酸乙腈水溶液，其中 乙腈为84% (v/v)。
[0047] 色谱柱 0? 15mm*150mm(RP-C18)(ColumnTechnologyInc.)以 95% (v/v)的A液 平衡。将4中所得样品由自动进样器上样到Zorbax300SB_C18peptidetraps，再经色谱柱 分离，相关液相梯度如下：〇分钟-50分钟，B液线性梯度从4%到50% ;50分钟-54分钟， B液线性梯度从50 %到100% ;54分钟-60分钟，B液维持在100%。
[0048] 6、ESI质谱鉴定
[0049] 将5中的经过毛细管高效液相色谱分离到的产物再经毛细管高效液相色谱脱盐 及分离后用QExactive质谱仪进行质谱分析。检测方式：正离子。多肽和多肽的碎片的质 量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描（fullscan)后采集10个碎片图谱（MS2scan)。
[0050] 7、ESI质谱数据分析
[0051] 原始文件（rawfile)用用Mascot2. 2软件搜索相应的数据库。最后得到鉴 定的蛋白质结果。相关参数如下：Enzyme=Trypsin、Missedcleavage= 2、Fixed modification：Carbamidomethyl(C),Variablemodification：0xidation(M)搜索使用 Uniprot数据库：uniprot_Toxoplasma_gondii_26517_20140612.fasta蛋白质库（收录序 列 26517 条，下载于 201406013)。Peptidestolerance:20ppm，MS/MStolerance:0?IDa， Mascot结果过滤参数为：Mascotscore多20。搜库结果表明ELMO蛋白的蛋白序列覆盖率 为0. 71 %，唯一肽段数为2,唯一肽段数多2即为成功鉴定。
[0052] 实施例4序列分析
[0053] ELMO基因核苷酸序列及蛋白安氨基酸序列以NCBI在线数据库和DNAstar软件进 行分析。不同物种ELMO氨基酸序列的进化树分析表明，弓形虫ELMO重组蛋白除了与猫寄 生的非致病性的哈氏哈蒙德虫（Hammondiahammondi)ELMO同源性较高外，与其他物种同源 性较低，结果见图1。
[0054] 实施例5
[0055] 原核表达与弓形虫早期检测相关的标志蛋白
[0056] 1、引物的设计与合成
[0057]根据刚地弓形虫ELMO基因的已知序列（Gen-Bank收录号：XM_002367397. 1)，利用 Primer5. 0针对其开放阅读框设计引物，预期扩增基因的长度为930bp，在上、下游引物5' 端分别引入BamHI和XhoI酶切位点，上游引物FP: 5'TCTGGATCCGGGTCTCCGAGGTA3'，下游 引物RP: 5'AAGGTCGACTAGACCGGACGGAG3'，
[0058] 2、弓形虫RH株的收集及RNA的提取
[0059] 从液氮中取出保种的弓形虫RH株复苏，腹腔接种小鼠，3d后用灭菌生理盐水冲洗 腹腔，收集腹腔液，l〇〇〇rpm离心15min，弃上清液，所得弓形虫RH株虫体用PBS洗3次，采 用Trizol法提取RNA。总RNA保存于-70°C备用。
[0060]3、ELMO基因的RT-PCR扩增
[0061] 将提取的总RNA按反转录试剂盒说明书反转录得到cDNA，并以此为模板进行PCR 扩增。反应体系（25yL) :2XTaqMix12. 5yL，上、下游引物及cDNA模板各lyL，加入dd H20 补至 25yL。反应条件：94°C4min;94°C45s，58°C50s，72°C50s，30 个循环；最后 72°C 延伸10min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，如图2 所示。将回收纯化的PCR产物与pMD19T载体连接，连接产物转化至大肠杆菌TOP10感受 态细胞，氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆。经菌落PCR鉴定后，将阳性质粒送。阳性质粒被命 名为PMD19T-ELM0。
[0062] 4、重组表达质粒的构建和鉴定
[0063] pMD19T-ELM0和pET-28a表达载体均用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切， 酶切后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，回收产物连接并转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细 胞，挑取单个菌落培养提取质粒，进行PCR和酶切鉴定。
[0064] 5、重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达
[0065] 重组质粒的表达及可溶性分析：将筛选的阳性重组菌接种于10mL含卡那霉素 70yg/mL的LB液体培养基，于37°C、200rpm振摇培养8h后，接种于250mlLB卡那霉素培 养基中，相同条件扩大培养至〇D600nm值为0. 6-0. 8时，加入0. 5mmol/LIPTG，20°C诱导表 达12h。8000rpm离心lOmin收集菌体，将离心收集的诱导表达菌体用1/10原培养液体积 的1X结合缓冲液重悬，于冰浴上超声破碎，12000rpm离心lOmin，分别收集上清液和沉淀， 通过SDS-PAGE分析重组蛋白的存在形式并纯化。
[0066] 6、重组蛋白ELMO的纯化
[0067] 将诱导表达后收集的菌体，用 IX结合缓冲液重悬，经超声破碎，收集上清，经 0. 22ym滤膜过滤后，按照His?BindResin纯化试剂盒步骤纯化并收集蛋白，纯化结果如 图3所示，主纯化产物分子量大小为41kD，与目的蛋白大小符合。纯化后的产物用BCA蛋白 定量试剂盒测定蛋白的质量浓度。
[0068] 实施例6
[0069] 重组蛋白ELMO的抗体的制备
[0070] 将重组蛋白加同体积弗氏佐剂乳化后，按照100yg/只免疫BALB/c小鼠，每次免 疫间隔2周，二免十天后尾静脉采集血液分离血清用于抗体滴度ELISA检测。
[0071] 效果实施例1
[0072] 抗ELMO蛋白抗体用于弓形虫虫体的组织定位
[0073] 1)细胞爬片上的Vero细胞长满单层后接种弓形虫，48h后用预冷的PBS清洗3 次；
[0074] 2)以4%多聚甲醛4°C固定20min，PBS清洗3次；
[0075] 3)以含有 0? 5%Triton-X100 的PBS穿孔 30min，PBS清洗 3 次；
[0076] 4)上述爬片用含有1 %BSA的PBS37°C封闭30min，PBS清洗3次；
[0077] 5)加以1%BSA按照1 :4000(v/v)稀释的ELMO鼠多抗血清，37°C孵育1. 5h，PBS 清洗3次；
[0078] 6)AlexaFluor488 标记的驴抗鼠IgG以 1%BSA按照 1 :200(v/v)稀释后，37°C 孵育2h，PBS清洗3次；
[0079] 7)DAPI复染后PBS清洗3次，激光共聚焦显微镜100X油镜镜检并采集图像（图 4)〇
[0080] 由图4可以看出，ELMO蛋白主要集中在虫体的表面，这可能与ELMO家族蛋白参与 虫体的吞噬和运动有关，同时证实了抗ELMO抗体能够识别弓形虫天然抗原。
[0081] 效果实施例2
[0082] 评价重组蛋白ELMO检测弓形虫急性感染的效果
[0083] 将实施例5所制的重组蛋白按梯度包被96孔板，4°C包被过夜。1%明胶封闭，PBST 洗3次后，将人工感染前述弓形虫RH株第18d的阳性血清按照1:10、1:50、1:100、1:200梯 度作为一抗，同时添加阴性犬血清作为对照，37°C反应lh，洗涤后加入HRP标记兔抗犬IgG， 37°〇反应比，洗涤；显色：加入10(^17孔3,3'，5,5'-四甲基联苯胺〇1?)显色液，37°〇孵 育显色15min左右；终止：加入终止液2MH2S0450yL/孔，终止后显色。结果显示在每孔包 被200ng重组蛋白ELMO且阳性血清按照1:100稀释的条件下仍能有效监测弓形虫阳性犬 血清中的抗体，如表1所示。
[0084] 表1利用重组蛋白ELMO检测弓形虫阳性犬血清中的抗体
[0087] 注：*表示抗原包被浓度和抗体稀释比例最佳。
[0088] 由表1可以看出，当重组蛋白按照50ng/孔包被，待检血清样本100倍稀释时， ELISA检测效果最优。
[0089] 效果实施例3
[0090] 比较重组蛋白ELMO与进口试剂盒检测弓形虫急性感染的效果
[0091] 为检验ELMO重组蛋白的临床检测效果，将临床采集的90份犬的血清进行检测， 并与进口 试剂盒（IDScreen⑧Toxoplasmosisindirectmulti-speciesELISAkit， IDVET,France)检测结果进行比较，如表2所示。
[0092] 表2利用重组蛋白和进口试剂盒检测犬弓形虫感染结果
[0094] 由表2可以看出，利用重组蛋白ELMO检测犬弓形虫感染的特异性达97. 14%，敏感 性为70?00%，观察一致率（Po)为94?44%，机遇一致率（Pe)为66?05%，K=(po-pe)/ (1-Pe) = 0. 84,k> 〇. 6表示利用重组蛋白ELMO检测犬弓形虫感染的结果一致可靠。
[0095] 结果表明该重组蛋白检测犬弓形虫感染具有较高的敏感性和特异性，与进口试剂 盒的一致性高。
[0096] 效果实施例4
[0097] 改良双抗夹心ELISA进行犬弓形虫急性感染的检测
[0098] 1)ELMO兔多抗血清以1 : 500 (v/v)比例稀释后取100yl加入ELISA板，4°C包被 8h，同时设阴、阳性（500ng/ml重组蛋白）对照孔，每个样品两个重复；
[0099] 2)弃去血清，用PBST洗涤液洗涤3次，以1 %的明胶37 °C封闭2_3h;
[0100] 3)弃去封闭液，用PBST洗涤液洗涤3次，加入1 : 100 (v/v)稀释待检血清，37°C孵育1. 5h;
[0101] 4)弃去封闭液，用PBST洗涤液洗涤3次，加入1 : 1000 (v/v)稀释的ELMO鼠多抗 血清，37°C孵育1. 5h;
[0102] 5)弃去抗体稀释液，用PBST洗涤液洗涤3次，加酶结合物，用稀释液按工作浓度稀 释，l〇〇y1/孔，37°C孵育1小时；
[0103] 6)弃去酶标抗体，用洗涤液洗涤6次，甩干；
[0104] 7)加显色液：于各反应孔内加TMB显色液100y1/孔，37°C，避光3-5分钟；
[0105] 8)加终止液于每反应孔，50y1/孔，酶标仪0D= 450nm检测吸光值，
[0106] 9)结果判定：检测孔0D值/阴性孔0D值彡2. 1判定为弓形虫急性感染。
[0107] 表3利用重组蛋白ELMO抗体检测弓形虫急性感染
[0109] 由表3可以看出，急性感染犬0D值/阴性对照孔0D值> 2. 1，可有效检测犬弓形 虫的急性感染。
[0110] 应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明的相关 条件作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 一种非疾病诊断或治疗目的的检测弓形虫急性感染的方法，其特征在于，所述方法 包括下述步骤：使待检测样本与弓形虫ELMO蛋白或所述弓形虫ELMO蛋白的抗体发生反应。2. 如权利要求1所述检测弓形虫急性感染的方法，其特征在于，所述弓形虫ELMO蛋白 的制备方法为原核表达纯化法；和/或，所述弓形虫ELMO蛋白的抗体的制备方法包括下述 步骤：将弓形虫ELMO蛋白免疫动物后制得所述弓形虫ELMO蛋白的抗体。3. 如权利要求2所述检测弓形虫急性感染的方法，其特征在于，所述弓形虫ELMO蛋白 的抗体的制备方法包括下述步骤：将所述弓形虫ELMO蛋白免疫动物，二次免疫后采集血液 分离含有所述抗体的血清。4. 如权利要求2或3所述检测弓形虫急性感染的方法，其特征在于，所述动物为兔或小 鼠；和/或，所述免疫为将所述弓形虫ELMO蛋白与弗氏佐剂一起注射到所述动物体内。5. 如权利要求3或4所述检测弓形虫急性感染的方法，其特征在于，所述二次免疫的间 隔时间为2周；和/或，所述采集血液为从所述动物的尾静脉采集。6. 如权利要求1所述检测弓形虫急性感染的方法，其特征在于，所述反应包括下述步 骤： (1) 将所述弓形虫ELMO蛋白或所述弓形虫ELMO蛋白的抗体包被于基质上； (2) 向步骤（1)中包被有所述弓形虫ELMO蛋白或所述弓形虫ELMO蛋白的抗体的基质 上加入待检测样本，使其与所述弓形虫ELMO蛋白或所述弓形虫ELMO蛋白的抗体发生反应。7. 如权利要求6所述检测弓形虫急性感染的方法，其特征在于，所述反应还包括步骤 (3):检测步骤⑵所述反应的结果。8. -种检测弓形虫急性感染的抗体，其特征在于，其是通过包括如下步骤的制备方法 所制得的：将弓形虫ELMO蛋白免疫动物后制得所述抗体。9. 如权利要求8所述检测弓形虫急性感染的抗体，其特征在于，其是根据权利要求2-5 中任一项所述方法所制得的。10. -种检测弓形虫急性感染的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1-2任一项所 述ELMO蛋白和/或如权利要求8-9任一项所述检测弓形虫急性感染的抗体。11. 如权利要求10所述检测弓形虫急性感染的试剂盒，其特征在于，其包括免疫反应 封闭液、免疫反应终止液、偶联有显色反应酶的抗IgG的抗体、如权利要求1-2任一项所述 ELMO蛋白和/或如权利要求8-9任一项所述检测弓形虫急性感染的抗体。
【专利摘要】本发明公开了一种非疾病诊断或治疗目的的检测弓形虫急性感染的方法、其试剂盒及其用到的抗体。所述方法包括下述步骤：使待检测样本与弓形虫ELMO蛋白或所述弓形虫ELMO蛋白的抗体发生反应。本发明所提供的检测方法能够快速检测弓形虫急性感染，并具有较高的特异性和灵敏度。
【IPC分类】G01N30/88, G01N33/569
【公开号】CN104897834
【申请号】CN201510271816
【发明人】薛俊欣, 王权, 蒋蔚, 陈永军, 刘迎春, 宫枫举, 曾鹏, 王民燕, 夏灿, 陈军霞
【申请人】中国农业科学院上海兽医研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月25日
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种检测弓形虫急性感染的方法及其靶 标蛋白。
【背景技术】
[0002] 弓形虫是一种世界范围内寄生的原虫，可导致人畜流产、死胎和免疫抑制患者死 亡，其临床表现复杂，确诊困难，给公共卫生和畜牧业带来极大危害。在过去，免疫学检测方 法是弓形虫病的主要检测方法，但是抗弓形虫IgG的检测难以区分急性感染和既往感染， IgM和IgA阳性也不能作为急性感染的标志。因此，弓形虫急性感染的早期检测标志物有待 进一步寻找确定。
[0003] 弓形虫循环抗原（CirculatingAntigens，CAg)是弓形虫急性感染期虫体自身排 泄和裂解产物，动物感染弓形虫1-2天即可检出CAg，2周后滴度显著降低，CAg阳性提示弓 形虫病急性、活动性感染，是病原体存在的重要标志，是早期感染的可靠指标。排泄-分泌 抗原（Excretory/SecretoryAntigens，ESA)为CAg的主要成分，现有研宄大多是提取ESA 抗原或者表达某个分泌蛋白制备多抗来检测血清中的CAg，由于CAg抗原的含量较少，且成 分复杂，从而使得这些方法的特异性、灵敏度有限。因此，目前尚缺少一种特异性和灵敏度 都较高的检测弓形虫的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是克服了目前检测弓形虫感染的方法难以区分急性 感染和既往感染、利用循环抗原来检测急性感染的方法因循环抗原含量低、成分复杂等原 因特异性和灵敏度有限的问题，提供了一种适用于弓形虫早期急性感染检测的高特异性、 高敏感性的检测方法，用所述检测方法能够快速检测弓形虫急性感染，并具有较高的特异 性和灵敏度。
[0005] 本发明技术方案之一：一种非疾病诊断治疗目的的检测弓形虫急性感染的方法， 其包括下述步骤：使待检测样本与弓形虫ELMO蛋白或所述弓形虫ELMO蛋白的抗体发生反 应。
[0006] 本发明中，所述待检测样本可以为本领域常规所指被弓形虫感染的样本，较佳地 为被弓形虫感染后的血清样本。
[0007] 本发明中，所述弓形虫ELMO蛋白可以为本领域常规所指，较佳地为氨基酸序列如 GenBank收录号为EPT30320. 1的序列所示，所述弓形虫ELMO蛋白的制备方法可以为本领 域常规的方法，如合成法或表达纯化法，较佳地为原核表达纯化法。所述原核表达纯化方法 较佳地包括下述步骤：培养含有所述弓形虫ELMO基因的原核表达载体的原核表达菌株，破 碎细胞，从裂解液中提取所述弓形虫ELMO蛋白。所述原核表达的菌株可以为本领域常规的 表达菌株，较佳地为大肠杆菌表达菌株，更佳地为大肠杆菌BL21菌株。所述原核表达的载 体可以为本领域常规的表达载体，较佳地为pET系列表达载体，最佳地为pET28a载体。所 述提取方法可以为本领域常规，较佳地为层析法，更佳地为亲和层析法，最佳地为镍离子-6 组氨酸亲和层析法。
[0008] 本发明中，所述弓形虫ELMO蛋白的抗体可以为本领域常规所指的抗体，如单克隆 抗体或多克隆抗体。所述弓形虫ELMO蛋白的抗体的制备方法可以为本领域常规的制备方 法，较佳地包括下述步骤：将所述弓形虫ELMO蛋白免疫动物后制得所述抗体，更佳地包括： 将所述弓形虫ELMO蛋白免疫动物，二次免疫后采集血液分离含有所述抗体的血清。所述动 物可以为本领域常规使用到的动物，较佳地为兔或小鼠，更佳地为小鼠。所述免疫注射可以 为本领域常规的注射方式，如直接将所述弓形虫ELMO蛋白注射到动物体内，较佳地为将所 述弓形虫ELMO蛋白与弗氏佐剂一起注射到所述动物体内。所述二次免疫的间隔时间较佳 地为2周，所述采集血液较佳地为从所述动物的尾静脉采集。
[0009] 本发明中，所述反应可以为本领域常规所指，较佳地包括下述步骤：（1)将所述弓 形虫ELMO蛋白或所述弓形虫ELMO蛋白的抗体包被于基质上；（2)向步骤（1)中包被有所 述弓形虫ELMO蛋白或所述弓形虫ELMO蛋白的抗体的基质上加入待检测样本，使其与所述 弓形虫ELMO蛋白或所述弓形虫ELMO蛋白的抗体发生反应。
[0010] 本发明中，较佳地还可以包括步骤（3):检测步骤（2)所述反应的结果。所述检测 可以为本领域常规的检测方法，较佳地为检测抗原与抗体反应的检测方法，例如当基质上 包被的为ELMO蛋白时，在步骤（2)过后加入辣根过氧化物酶（HRP)标记的抗IgG的抗体后 孵育、显色并测定化学发光值；当基质上包被的是所述检测弓形虫急性感染的抗体时，在步 骤（2)后加入与所述检测弓形虫急性感染的抗体异源的ELMO抗体，孵育后再加入辣根过氧 化物酶（HRP)标记的抗IgG的抗体后再孵育、显色并测定化学发光值。
[0011] 本发明技术方案之二：一种检测弓形虫急性感染的抗体，其是通过包括如下步骤 的制备方法所制得的：将弓形虫ELMO蛋白免疫动物后制得所述抗体。
[0012] 本发明中，所述检测弓形虫急性感染的抗体可以为本领域常规所指的抗体，如单 克隆抗体或多克隆抗体。所述检测弓形虫急性感染的抗体的制备方法可以为本领域常规的 制备方法，较佳地包括下述步骤：将前述弓形虫ELMO蛋白免疫注射动物，二次免疫后采集 血液分离含有所述抗体的血清。所述动物可以为本领域常规使用到的动物，较佳地为兔或 小鼠，更佳地为小鼠。所述免疫注射可以为本领域常规的注射方式，如直接将所述弓形虫 ELMO蛋白注射到动物体内，较佳地为将所述ELMO蛋白与弗氏佐剂一起注射到动物体内。所 述二次免疫的间隔时间较佳地为2周，所述采集血液较佳地为从动物的尾静脉采集血液。
[0013] 本发明技术方案之三：一种检测弓形虫急性感染的试剂盒，其包括前述ELMO蛋白 和/或前述检测弓形虫急性感染的抗体。
[0014] 本发明中，所述检测弓形虫急性感染的试剂盒较佳地还可以包括免疫反应封闭 液、免疫反应洗绦液、免疫反应终止液和偶联有显色反应酶的抗IgG的抗体。
[0015] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0016] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0017] 本发明的积极进步效果在于：本发明所提供的一种检测弓形虫急性感染的靶标 蛋白及其抗体，以及一种利用所述靶标蛋白及其抗体的检测弓形虫急性感染的方法能够有 效、快速地检测弓形虫早期急性感染，并具有较高的特异性和灵敏度。
【附图说明】
[0018] 图1、不同物种ELMO氨基酸序列的进化树分析表明。
[0019] 图2、弓形虫ELMO基因的RT-PCR结果。
[0020] 图3、弓形虫ELMO蛋白His?Bind柱纯化结果。1 :流穿液；2 :漂洗液；3和4 :洗 脱液。
[0021] 图4、弓形虫ELMO蛋白的组织定位。
【具体实施方式】
[0022] 下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注 明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述 的"室温"是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。
[0023] 下述实施例中的实验材料、仪器和试剂的来源如下：
[0024] 实验动物与微生物：昆明小鼠和BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司； 比格犬购自上海新闪试验动物场；弓形虫RH株购自国家兽医微生物菌种保藏管理中心；大 肠杆菌BL21(DE3)和大肠杆菌TOP10感受态细胞购自北京康为世纪生物科技有限公司。
[0025] 实验细胞与试剂：Vero细胞购自中科院上海生化与细胞研宄所；DMEM、胰酶购 自Gibco公司；BSA、弗氏佐剂购自Sigma公司；复合型蛋白酶抑制剂购自Merck公司； NormalMouseIgG、ProteinA琼脂糖微球、DAPI购自碧云天生物技术有限公司；Alexa Fluor488标记的驴抗鼠IgG购自Jackson公司；HisBandResin试剂盒购自默克公司； BCA蛋白定量试剂盒和二硫苏糖醇（DTT)购自Bio-Rad公司；总RNA反转录试剂盒购自 ThermoScientific公司；pMD19T质粒购自宝生物工程（大连）有限公司；pET28a质粒购 自Novagen公司；氨苄青霉素和卡那霉素购自生工生物工程股份有限公司；3, 3'，5, 5' -四 甲基联苯胺、多聚甲醛和Triton-X100购自国药集团化学试剂有限公司；引物由苏州金唯 智生物技术有限公司合成；DNA测序由宝生物工程（大连）有限公司进行。
[0026] 实验仪器：色谱柱RP-C18购自ColumnTechnologyInc.;色谱仪 Zorbax300SB_C18peptidetraps购自AgilentTechnologies,Wilmington,DE；QExactive 质谱仪购自ThermoFisherScientific;激光共聚焦显微镜NikoneclipseCl_Si购自尼 康（Nikon)公司。
[0027] 实施例1获得弓形虫ESA抗原并制备多抗
[0028] 1、ESA的制备
[0029] 将昆明小鼠腹腔无菌接种弓形虫RH株，三天后收集腹水中的虫体，用20号针头的 注射器抽吸两次以破碎腹腔巨噬细胞，虫体稀释后以5ym滤器过滤，所得纯化后的虫体用 无血清DMEM清洗两次后以无血清DMEM按照1X108/毫升浓度悬浮虫体，重提悬液5 %二氧 化碳培养箱37°C培养2h以使虫体分泌ESA，lOOOrpm离心10min除去虫体并收集上清，将上 清中添加复合型蛋白酶抑制剂后利用3KDa蛋白浓缩管20倍浓缩，将浓缩后的蛋白在4°C条 件下无菌PBS透析后测定ESA蛋白浓度并分装，-80°C保存。
[0030] 2、多克隆抗体的制备
[0031] 将1中所述ESA加同体积弗氏佐剂乳化后，按照100yg/只免疫BALB/c小鼠，每 次免疫间隔2周，首次免疫十天后尾静脉采集血液分离血清用于抗体滴度ELISA检测。
[0032] 实施例2
[0033] 不同感染天数的急性感染弓形虫犬血清样本的制备
[0034] 选择清洁级比格犬，试验组和对照组各3只，试验组腹腔无菌接种1X109个新鲜 收集的纯化后的无菌PBS重悬的实施例1所述弓形虫RH株虫体，对照组接种无菌PBS，检测 体温变化并每天采集血液至感染后7天，分离血清后用作弓形虫急性感染动物血清。
[0035] 实施例3
[0036] 弓形虫急性感染不同天数的血清中循环抗原的免疫亲和层析
[0037] 1、犬血清IgG的去除
[0038] 将实施例2中所述感染弓形虫RH株3天内的犬血清60yl加至540yl无菌 PBS(pH= 7. 2)中，加入100y1 25% (v/v)的ProteinA琼脂糖微球，4°C缓慢搅拌2h后 离心收集上清，上清即为除去大部分IgG的稀释血清。
[0039] 2、去除非特异性结合
[0040] 将上述收集的上清中加入5y1NormalMouseIgG和100y1 25%的ProteinG 琼脂糖微球，4°C缓慢搅拌2h后离心收集上清。
[0041] 3、免疫沉淀富集目的蛋白
[0042] 将上述收集的上清中加入5y1实施例1中制得的ESA多抗后4°C搅拌过夜，加入 100y1 25%的ProteinG琼脂糖微球，4°C搅拌3h后离心收集琼脂糖微球，将微球清洗3次 后加入60y1 2XSDS-PAGE上样缓冲液，100°C煮沸5min后2500rpm离心5min收集上清。
[0043] 4、膜辅助蛋白质组制备（FASP)样品的酶解
[0044] 将3中所获得的富集的蛋白加入DTT至终浓度为lOOmM，沸水浴5min，冷却至室 温。加入200yL尿素buffer(8M尿素，150mMTrisHClpH8.0)混匀，转入10kD超滤离心管， 14000g离心 15min。加入 200yL尿素bufTerl4000g离心 15min，弃滤液。加入 100yL50mM 碘乙酰胺，所述碘乙酰胺溶于8M尿素，该8M尿素由150mMTris-HCl，pH8. 0配制成（这里 请您确认或修改），600rpm振荡lmin，避光室温30min，14000g离心10min。加入100yL前述 尿素缓冲液，14000g离心10min重复2次。加入100yL溶解缓冲液（Dissolutionbuffer)， 所述溶解缓冲液为25mMNH4HC03,140 00g离心10min重复2次。加入40y1Trypsin缓冲 液（2ygTrypsin加入到40yL溶解缓冲液配成），600rpm振荡lmin，37°C16-18h。换新 收集管，14000g离心10min，取滤液，准备进行液相色谱偶联质谱分析。
[0045] 5、毛细管高效液相色谱
[0046] 液相A液为0.1 % (v/v)甲酸水溶液，B液为0.1 % (v/v)甲酸乙腈水溶液，其中 乙腈为84% (v/v)。
[0047] 色谱柱 0? 15mm*150mm(RP-C18)(ColumnTechnologyInc.)以 95% (v/v)的A液 平衡。将4中所得样品由自动进样器上样到Zorbax300SB_C18peptidetraps，再经色谱柱 分离，相关液相梯度如下：〇分钟-50分钟，B液线性梯度从4%到50% ;50分钟-54分钟， B液线性梯度从50 %到100% ;54分钟-60分钟，B液维持在100%。
[0048] 6、ESI质谱鉴定
[0049] 将5中的经过毛细管高效液相色谱分离到的产物再经毛细管高效液相色谱脱盐 及分离后用QExactive质谱仪进行质谱分析。检测方式：正离子。多肽和多肽的碎片的质 量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描（fullscan)后采集10个碎片图谱（MS2scan)。
[0050] 7、ESI质谱数据分析
[0051] 原始文件（rawfile)用用Mascot2. 2软件搜索相应的数据库。最后得到鉴 定的蛋白质结果。相关参数如下：Enzyme=Trypsin、Missedcleavage= 2、Fixed modification：Carbamidomethyl(C),Variablemodification：0xidation(M)搜索使用 Uniprot数据库：uniprot_Toxoplasma_gondii_26517_20140612.fasta蛋白质库（收录序 列 26517 条，下载于 201406013)。Peptidestolerance:20ppm，MS/MStolerance:0?IDa， Mascot结果过滤参数为：Mascotscore多20。搜库结果表明ELMO蛋白的蛋白序列覆盖率 为0. 71 %，唯一肽段数为2,唯一肽段数多2即为成功鉴定。
[0052] 实施例4序列分析
[0053] ELMO基因核苷酸序列及蛋白安氨基酸序列以NCBI在线数据库和DNAstar软件进 行分析。不同物种ELMO氨基酸序列的进化树分析表明，弓形虫ELMO重组蛋白除了与猫寄 生的非致病性的哈氏哈蒙德虫（Hammondiahammondi)ELMO同源性较高外，与其他物种同源 性较低，结果见图1。
[0054] 实施例5
[0055] 原核表达与弓形虫早期检测相关的标志蛋白
[0056] 1、引物的设计与合成
[0057]根据刚地弓形虫ELMO基因的已知序列（Gen-Bank收录号：XM_002367397. 1)，利用 Primer5. 0针对其开放阅读框设计引物，预期扩增基因的长度为930bp，在上、下游引物5' 端分别引入BamHI和XhoI酶切位点，上游引物FP: 5'TCTGGATCCGGGTCTCCGAGGTA3'，下游 引物RP: 5'AAGGTCGACTAGACCGGACGGAG3'，
[0058] 2、弓形虫RH株的收集及RNA的提取
[0059] 从液氮中取出保种的弓形虫RH株复苏，腹腔接种小鼠，3d后用灭菌生理盐水冲洗 腹腔，收集腹腔液，l〇〇〇rpm离心15min，弃上清液，所得弓形虫RH株虫体用PBS洗3次，采 用Trizol法提取RNA。总RNA保存于-70°C备用。
[0060]3、ELMO基因的RT-PCR扩增
[0061] 将提取的总RNA按反转录试剂盒说明书反转录得到cDNA，并以此为模板进行PCR 扩增。反应体系（25yL) :2XTaqMix12. 5yL，上、下游引物及cDNA模板各lyL，加入dd H20 补至 25yL。反应条件：94°C4min;94°C45s，58°C50s，72°C50s，30 个循环；最后 72°C 延伸10min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，如图2 所示。将回收纯化的PCR产物与pMD19T载体连接，连接产物转化至大肠杆菌TOP10感受 态细胞，氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆。经菌落PCR鉴定后，将阳性质粒送。阳性质粒被命 名为PMD19T-ELM0。
[0062] 4、重组表达质粒的构建和鉴定
[0063] pMD19T-ELM0和pET-28a表达载体均用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切， 酶切后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，回收产物连接并转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细 胞，挑取单个菌落培养提取质粒，进行PCR和酶切鉴定。
[0064] 5、重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达
[0065] 重组质粒的表达及可溶性分析：将筛选的阳性重组菌接种于10mL含卡那霉素 70yg/mL的LB液体培养基，于37°C、200rpm振摇培养8h后，接种于250mlLB卡那霉素培 养基中，相同条件扩大培养至〇D600nm值为0. 6-0. 8时，加入0. 5mmol/LIPTG，20°C诱导表 达12h。8000rpm离心lOmin收集菌体，将离心收集的诱导表达菌体用1/10原培养液体积 的1X结合缓冲液重悬，于冰浴上超声破碎，12000rpm离心lOmin，分别收集上清液和沉淀， 通过SDS-PAGE分析重组蛋白的存在形式并纯化。
[0066] 6、重组蛋白ELMO的纯化
[0067] 将诱导表达后收集的菌体，用 IX结合缓冲液重悬，经超声破碎，收集上清，经 0. 22ym滤膜过滤后，按照His?BindResin纯化试剂盒步骤纯化并收集蛋白，纯化结果如 图3所示，主纯化产物分子量大小为41kD，与目的蛋白大小符合。纯化后的产物用BCA蛋白 定量试剂盒测定蛋白的质量浓度。
[0068] 实施例6
[0069] 重组蛋白ELMO的抗体的制备
[0070] 将重组蛋白加同体积弗氏佐剂乳化后，按照100yg/只免疫BALB/c小鼠，每次免 疫间隔2周，二免十天后尾静脉采集血液分离血清用于抗体滴度ELISA检测。
[0071] 效果实施例1
[0072] 抗ELMO蛋白抗体用于弓形虫虫体的组织定位
[0073] 1)细胞爬片上的Vero细胞长满单层后接种弓形虫，48h后用预冷的PBS清洗3 次；
[0074] 2)以4%多聚甲醛4°C固定20min，PBS清洗3次；
[0075] 3)以含有 0? 5%Triton-X100 的PBS穿孔 30min，PBS清洗 3 次；
[0076] 4)上述爬片用含有1 %BSA的PBS37°C封闭30min，PBS清洗3次；
[0077] 5)加以1%BSA按照1 :4000(v/v)稀释的ELMO鼠多抗血清，37°C孵育1. 5h，PBS 清洗3次；
[0078] 6)AlexaFluor488 标记的驴抗鼠IgG以 1%BSA按照 1 :200(v/v)稀释后，37°C 孵育2h，PBS清洗3次；
[0079] 7)DAPI复染后PBS清洗3次，激光共聚焦显微镜100X油镜镜检并采集图像（图 4)〇
[0080] 由图4可以看出，ELMO蛋白主要集中在虫体的表面，这可能与ELMO家族蛋白参与 虫体的吞噬和运动有关，同时证实了抗ELMO抗体能够识别弓形虫天然抗原。
[0081] 效果实施例2
[0082] 评价重组蛋白ELMO检测弓形虫急性感染的效果
[0083] 将实施例5所制的重组蛋白按梯度包被96孔板，4°C包被过夜。1%明胶封闭，PBST 洗3次后，将人工感染前述弓形虫RH株第18d的阳性血清按照1:10、1:50、1:100、1:200梯 度作为一抗，同时添加阴性犬血清作为对照，37°C反应lh，洗涤后加入HRP标记兔抗犬IgG， 37°〇反应比，洗涤；显色：加入10(^17孔3,3'，5,5'-四甲基联苯胺〇1?)显色液，37°〇孵 育显色15min左右；终止：加入终止液2MH2S0450yL/孔，终止后显色。结果显示在每孔包 被200ng重组蛋白ELMO且阳性血清按照1:100稀释的条件下仍能有效监测弓形虫阳性犬 血清中的抗体，如表1所示。
[0084] 表1利用重组蛋白ELMO检测弓形虫阳性犬血清中的抗体
[0087] 注：*表示抗原包被浓度和抗体稀释比例最佳。
[0088] 由表1可以看出，当重组蛋白按照50ng/孔包被，待检血清样本100倍稀释时， ELISA检测效果最优。
[0089] 效果实施例3
[0090] 比较重组蛋白ELMO与进口试剂盒检测弓形虫急性感染的效果
[0091] 为检验ELMO重组蛋白的临床检测效果，将临床采集的90份犬的血清进行检测， 并与进口 试剂盒（IDScreen⑧Toxoplasmosisindirectmulti-speciesELISAkit， IDVET,France)检测结果进行比较，如表2所示。
[0092] 表2利用重组蛋白和进口试剂盒检测犬弓形虫感染结果
[0094] 由表2可以看出，利用重组蛋白ELMO检测犬弓形虫感染的特异性达97. 14%，敏感 性为70?00%，观察一致率（Po)为94?44%，机遇一致率（Pe)为66?05%，K=(po-pe)/ (1-Pe) = 0. 84,k> 〇. 6表示利用重组蛋白ELMO检测犬弓形虫感染的结果一致可靠。
[0095] 结果表明该重组蛋白检测犬弓形虫感染具有较高的敏感性和特异性，与进口试剂 盒的一致性高。
[0096] 效果实施例4
[0097] 改良双抗夹心ELISA进行犬弓形虫急性感染的检测
[0098] 1)ELMO兔多抗血清以1 : 500 (v/v)比例稀释后取100yl加入ELISA板，4°C包被 8h，同时设阴、阳性（500ng/ml重组蛋白）对照孔，每个样品两个重复；
[0099] 2)弃去血清，用PBST洗涤液洗涤3次，以1 %的明胶37 °C封闭2_3h;
[0100] 3)弃去封闭液，用PBST洗涤液洗涤3次，加入1 : 100 (v/v)稀释待检血清，37°C孵育1. 5h;
[0101] 4)弃去封闭液，用PBST洗涤液洗涤3次，加入1 : 1000 (v/v)稀释的ELMO鼠多抗 血清，37°C孵育1. 5h;
[0102] 5)弃去抗体稀释液，用PBST洗涤液洗涤3次，加酶结合物，用稀释液按工作浓度稀 释，l〇〇y1/孔，37°C孵育1小时；
[0103] 6)弃去酶标抗体，用洗涤液洗涤6次，甩干；
[0104] 7)加显色液：于各反应孔内加TMB显色液100y1/孔，37°C，避光3-5分钟；
[0105] 8)加终止液于每反应孔，50y1/孔，酶标仪0D= 450nm检测吸光值，
[0106] 9)结果判定：检测孔0D值/阴性孔0D值彡2. 1判定为弓形虫急性感染。
[0107] 表3利用重组蛋白ELMO抗体检测弓形虫急性感染
[0109] 由表3可以看出，急性感染犬0D值/阴性对照孔0D值> 2. 1，可有效检测犬弓形 虫的急性感染。
[0110] 应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明的相关 条件作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 一种非疾病诊断或治疗目的的检测弓形虫急性感染的方法，其特征在于，所述方法 包括下述步骤：使待检测样本与弓形虫ELMO蛋白或所述弓形虫ELMO蛋白的抗体发生反应。2. 如权利要求1所述检测弓形虫急性感染的方法，其特征在于，所述弓形虫ELMO蛋白 的制备方法为原核表达纯化法；和/或，所述弓形虫ELMO蛋白的抗体的制备方法包括下述 步骤：将弓形虫ELMO蛋白免疫动物后制得所述弓形虫ELMO蛋白的抗体。3. 如权利要求2所述检测弓形虫急性感染的方法，其特征在于，所述弓形虫ELMO蛋白 的抗体的制备方法包括下述步骤：将所述弓形虫ELMO蛋白免疫动物，二次免疫后采集血液 分离含有所述抗体的血清。4. 如权利要求2或3所述检测弓形虫急性感染的方法，其特征在于，所述动物为兔或小 鼠；和/或，所述免疫为将所述弓形虫ELMO蛋白与弗氏佐剂一起注射到所述动物体内。5. 如权利要求3或4所述检测弓形虫急性感染的方法，其特征在于，所述二次免疫的间 隔时间为2周；和/或，所述采集血液为从所述动物的尾静脉采集。6. 如权利要求1所述检测弓形虫急性感染的方法，其特征在于，所述反应包括下述步 骤： (1) 将所述弓形虫ELMO蛋白或所述弓形虫ELMO蛋白的抗体包被于基质上； (2) 向步骤（1)中包被有所述弓形虫ELMO蛋白或所述弓形虫ELMO蛋白的抗体的基质 上加入待检测样本，使其与所述弓形虫ELMO蛋白或所述弓形虫ELMO蛋白的抗体发生反应。7. 如权利要求6所述检测弓形虫急性感染的方法，其特征在于，所述反应还包括步骤 (3):检测步骤⑵所述反应的结果。8. -种检测弓形虫急性感染的抗体，其特征在于，其是通过包括如下步骤的制备方法 所制得的：将弓形虫ELMO蛋白免疫动物后制得所述抗体。9. 如权利要求8所述检测弓形虫急性感染的抗体，其特征在于，其是根据权利要求2-5 中任一项所述方法所制得的。10. -种检测弓形虫急性感染的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1-2任一项所 述ELMO蛋白和/或如权利要求8-9任一项所述检测弓形虫急性感染的抗体。11. 如权利要求10所述检测弓形虫急性感染的试剂盒，其特征在于，其包括免疫反应 封闭液、免疫反应终止液、偶联有显色反应酶的抗IgG的抗体、如权利要求1-2任一项所述 ELMO蛋白和/或如权利要求8-9任一项所述检测弓形虫急性感染的抗体。
【专利摘要】本发明公开了一种非疾病诊断或治疗目的的检测弓形虫急性感染的方法、其试剂盒及其用到的抗体。所述方法包括下述步骤：使待检测样本与弓形虫ELMO蛋白或所述弓形虫ELMO蛋白的抗体发生反应。本发明所提供的检测方法能够快速检测弓形虫急性感染，并具有较高的特异性和灵敏度。
【IPC分类】G01N30/88, G01N33/569
【公开号】CN104897834
【申请号】CN201510271816
【发明人】薛俊欣, 王权, 蒋蔚, 陈永军, 刘迎春, 宫枫举, 曾鹏, 王民燕, 夏灿, 陈军霞
【申请人】中国农业科学院上海兽医研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月25日
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