检测样品中奎尼酸的方法、试剂盒及其用图
检测样品中奎尼酸的方法、试剂盒及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于分析技术领域，涉及一种检测样品中奎尼酸的方法、试剂盒及其用途。
【背景技术】
[0002] 奎尼酸（quinicacid，QA)是植物进行有氧呼吸过程中，经莽草酸途径形成的一 种环状、多羟基及有光学活性的天然酚酸类化合物，又名1，3, 4, 5-四羟基环己烷-1-羧酸。 奎尼酸的分子式为C6H7(0H)4C00H，结构式如式I所示。
[0004] 奎尼酸广泛存在于各类植物中，例如烟草、金鸡纳树皮、胡萝卜叶、苹果、梨和咖啡 等，而且，少数真菌和细菌中也存在奎尼酸。奎尼酸及其衍生物常被作为食品抗氧化剂使 用；奎尼酸的咖啡酰类衍生物在抗病毒、治疗心血管疾病等方面得到较多关注和应用。因 此，奎尼酸是提取价值极高的精细化工产品和医药中间体。
[0005] 此外，奎尼酸在烟草中的含量较高，在0.05%-1%之间。奎尼酸对人体具有刺激 性，且是有害成分酚类化合物的前体物，因此奎尼酸会对烟草感官品质产生不良影响，且会 损害吸烟者的健康，亟需控制奎尼酸在烟草中的含量。
[0006] 通常采用液相色谱法分析奎尼酸的含量，该法采用二极管阵列检测器。但该方法 的检测时间较长，不利于快速检测。
[0007] 目前尚无快速检测样品尤其是烟草及烟草制品中奎尼酸的方法。
【发明内容】
[0008] 本发明人得到了一种快速检测样品中奎尼酸的方法，尤其适用于对烟草制品进行 检测。该方法快速准确、灵敏度高、选择性好、重现性好。而且，发明人惊奇地发现以乙酸铵 水溶液提取样品中的奎尼酸，前处理步骤简单、快速。此外，发明人还采用液相色谱-质谱 联用法对奎尼酸进行快速分析检测。
[0009] 本发明第一方面涉及一种检测样品中奎尼酸的方法，包括如下步骤：用乙酸铵水 溶液浸润样品，得到提取液。
[0010] 所述浸润指乙酸铵水溶液与样品发生接触时，液体附着在样品表面或渗透到样品 内部的现象。具体地，浸润时，乙酸铵水溶液液面至少为样品高度的1/3或至少为样品高度 的1/2,优选，乙酸铵水溶液完全浸没样品。
[0011] 本发明第一方面任一项的方法中，所述样品为烟草或烟草制品。
[0012] 发明人发现，提取溶剂的选择对奎尼酸分析有显著影响，乙酸铵水溶液能将 样品中的奎尼酸快速提取出来，提取率高且方法简单。而采用其他的磷酸钠缓冲溶液 (NaH2P04-Na2HP04)、磷酸钾缓冲溶液（K2HP04-KH2P04)等无法对样品中的奎尼酸进行有效的 提取分析。
[0013] 根据本发明第一方面的方法，所述检测为定量检测。
[0014] 本发明第一方面任一项的方法中，所述乙酸铵水溶液的浓度为0. 09-0. 15mol/L， 具体为 〇? 1-0. 15mol/L或 0? 12-0. 15mol/L，优选为 0?lmol/L。
[0015] 乙酸铵水溶液的浓度为0. 09-0. 15mol/L，可基本完全提取出样品中的奎尼酸。
[0016] 本发明第一方面任一项的方法中，向每克样品中添加乙酸铵水溶液的量为 250-1000mL，具体为 250-500mL，更具体为 250mL、300mL、500mL、750mL或 1000mL，优选为 500mL〇
[0017] 发明人发现，乙酸铵水溶液添加量过大时，信号微弱，容易受基线噪音的影响；添 加量过小时，对于奎尼酸含量高的样品，容易出现信号值过饱和、测定不准确的问题。将乙 酸铵水溶液添加量控制在250-1000mL/g，尤其是500mL/g，可以保有正常信号值，使测量准 确，同时合适的乙酸铵水溶液添加量能够使奎尼酸被均匀提取出来。
[0018] 本发明第一方面任一项的方法中，所述浸润在超声下进行；具体地，超声功率为最 大功率的40%;更具体地，浸润时间彡1〇111；[11，进一步具体地，浸润时间彡301]1；[11、彡401]1；[11或 多50min，优选为30min。
[0019] 本发明第一方面任一项的方法中，浸润温度为30-60°C，具体为30°C、40°C、50°C 或 60°C，优选 40°C。
[0020] 本发明第一方面任一项的方法中，还包括将提取液进行过滤的步骤；具体地，以水 相滤膜过滤提取液；更具体地，所述水相滤膜的孔径为0. 22ym。
[0021] 本发明第一方面任一项的方法中，还包括用液相色谱-质谱分析提取液的步骤。
[0022] 根据本发明任一的方法，液相色谱条件为如下（1)_(6)中的任意一项或者多项：
[0023] (1)色谱柱为菲罗门（V液相色谱柱；
[0024] (2)进样量为 5yL;
[0025] (3)流动相为0? 1 %醋酸水溶液；
[0026] (4)流速为 0? 8mL/min;
[0027] (5)柱温为 40°C;
[0028] (6)采用等度洗脱程序，洗脱时间5min。
[0029] 发明人发现采用菲罗门C18液相色谱柱分析提取液，得到的色谱峰型较好、响应值 较高；色谱峰响应值随着进样量增加而增加，但发明人发现进样量过高时，奎尼酸色谱峰出 现裂缝，影响了检测的准确性；以0. 1%醋酸水溶液作流动相，色谱峰值较好、响应值较高。
[0030] 根据本发明任一的方法，质谱条件为如下（1)_(7)中的任意一项或者多项：
[0031] (1)扫描方式为负离子扫描；
[0032] (2)定量离子对191/93,定性离子对191/85 ;
[0033] (3)碰撞能为-20V;
[0034](4)离子源为电喷雾电离源；
[0035] (5)检测方式为多反应检测；
[0036] (6)电喷雾电压为-4500V;
[0037] (7)离子源温度为550°C。
[0038] 以负离子方式扫描，碰撞能为-20V，选择定量离子对191/93,定性离子对191/85 进行检测，准确度高、灵敏度高、回收率高、重复性好。选择其他碰撞能和定量离子对检测时 准确度较低。
[0039] 本发明第二方面涉及一种检测样品中奎尼酸的试剂盒，包括乙酸铵水溶液和水相 滤膜。
[0040] 本发明第二方面任一项的试剂盒，包括如下（1)-(5)中的任意一项或者多项：
[0041] (1)所述乙酸铵水溶液的浓度为0.09-0. 15mol/L，具体为0? 1-0. 15mol/L或 0? 12-0. 15mol/L，优选为 0?lmol/L;
[0042] (2)乙酸铵水溶液的量至少为250mL，具体为250-500mL，优选为500mL;
[0043] (3)所述水相滤膜的孔径为0? 22ym;
[0044] (4)所述试剂盒为定量分析试剂盒；
[0045] (5)所述样品为烟草或烟草制品。
[0046] 本发明第三方面涉及所述试剂盒在检测样品中奎尼酸，或者在控制样品质量中的 用途；具体地，所述样品为烟草或烟草制品。
[0047] 发明的有益效果
[0048] (1)本发明以乙酸铵水溶液浸润样品，即能从样品特别是烟草或烟草制品中提取 奎尼酸，方法简单，无需使用有毒性的有机溶剂。
[0049] (2)本发明采用液相色谱-质谱联用法分析样品中的奎尼酸，快速准确、灵敏度 高、操作简单。
[0050] (3)使用本发明方法分析样品中奎尼酸的回收率高、重复性好。在烟草或烟草制品 的样品分析中几乎不存在杂峰，目标物线性相关性较好，将标准溶液稀释一定倍数，以信噪 比S/N= 3计算出奎尼酸的检出限为0.llmg/g，以信噪比S/N= 10计算出奎尼酸的定量限 为0. 35mg/g，平均回收率为93. 8 %~94. 8 %，相对标准偏差RSD〈5 %(n= 6)。
【附图说明】
[0051] 图1 :本发明实施例1中分析方法的流程图。
[0052] 图2 :本发明实施例1中标准溶液的色谱图。
[0053] 图3 :本发明实施例1中提取液的色谱图。
[0054] 图4 :本发明实施例1中奎尼酸的质谱图。
[0055] 图5 :本发明实施例1中奎尼酸的标准曲线图。
[0056] 图6 :本发明实施例2中不同提取溶剂与色谱峰面积的关系图。
[0057] 图7 :本发明实施例3中添加量为25mL乙酸铵水溶液时的色谱图；
[0058] 图8 :本发明实施例3中添加量为100mL乙酸铵水溶液时的色谱图；
[0059] 图9 :本发明实施例4中不同提取时间与测得的奎尼酸含量的关系图。
[0060] 图10 :本发明实施例7中纯水作流动相的色谱图。
【具体实施方式】
[0061] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市购获得的常规产品。
[0062] 实施例1 :对烟草制品中奎尼酸含量的分析
[0063] 分析方法如图1所示：
[0064] (1)配制标准溶液：称取0?lg奎尼酸，精确至0?OOOlg，用0?lmol/L乙酸铵水溶 液溶解后转移至l〇〇mL棕色容量瓶中定容，配制成lmg/mL标准储备液；分别移取0.lmL、 0.51^、11^、21^、31^和51^的标准储备液至10011^容量瓶中，用0.1111〇1/1乙酸铵水溶液定 容，得到奎尼酸浓度分别为 1yg/mL、5yg/mL、10yg/mL、20yg/mL、30yg/mL和 50yg/mL 的标准溶液，避光4°C保存，取用时提前放置于常温下，达到常温后方可使用。每周做一次标 线。
[0065] (2)制备样品的提取液：称取0.lg左右烟丝，置于150mL磨口三角瓶中，准确加入 50mL、0.lmol/L的乙酸铵水溶液，超声提取30min，超声功率为40 %，经0. 22ym水相滤膜过 滤后得到提取液。
[0066] (3)采用LC-MS/ MS方法分别对提取液、标准溶液进行分析。
[0067] 色谱分析条件：采用菲罗门C18液相色谱柱，柱温为40°C;进样量5yL;流动相为 0. 1%醋酸水溶液，流速为0. 8ml/min;采用等度洗脱程序，洗脱时间总共5min。
[0068] 标准溶液的色谱分析结果如图2所示，提取液的色谱分析结果如图3所示。
[0069] 质谱分析条件：离子源：电喷雾电离源（ESI);扫描方式：负离子扫描；检测方式： 多反应监测（MRM);电喷雾电压：-4500V;离子源温度：550°C;辅助气Gasl压力：60psi;辅 助气Gas2压力：50psi;去簇电压（DP) :-40V;碰撞能（CE) :-20V;离子对选择：定量离子对 191/93,定性离子对191/85。提取液的质谱图如图4所示。
[0070] (4)计算结果：
[0071] 以标准溶液中奎尼酸的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线如 图5所示，具体数据见表1。
[0072] 表 1
[0074] 将提取液色谱图中奎尼酸的色谱峰面积，代入以上标准曲线，得到提取液中的奎 尼酸含量，按照下式计算出烟丝中的奎尼酸含量。
[0075] m= 1000X(AXS)/n
[0076] 式中：
[0077] m一烟丝中的奎尼酸含量（mg/g);
[0078] A-提取液中的奎尼酸含量（yg/mL);
[0079]S-提取液体积（mL);
[0080]n-称取烟丝的质量（g)。
[0081] 本实施例烟丝的奎尼酸含量为5. 2mg/g。
[0082]由表1和图4可知，所采用的色谱条件在烟草制品实际样品分析中几乎不存在杂 峰，目标物具有较好的线性相关性，将混合标准溶液稀释一定倍数，以信噪比S/N= 3计算 出奎尼酸的检出限为0.llmg/g。
[0083]实施例2 :不同提取溶剂及不同浓度的比较
[0084]本实施例分别用纯水、磷酸钠缓冲溶液（NaH2P04-Na2HP04)、磷酸钾缓冲溶液 (1(2册04-腿2?0 4)以及0.03111〇1/1、0.09111〇1/1、0.12111〇1/1、0.15111〇1/1的乙酸铵水溶液对烟草 制品进行提取，其他条件参考实施例1。
[0085] 磷酸钠缓冲溶液、磷酸钾缓冲溶液作为提取溶剂提取烟草制品没有检测到色谱 峰。其他提取溶剂色谱分析的峰面积如图6所示。
[0086] 由图6可知，与乙酸铵水溶液相比，纯水提取烟草制品的奎尼酸提取率低。当乙酸 铵水溶液浓度多〇.lmol/L时，奎尼酸的提取率基本达到稳定，说明0.lmol/L乙酸铵水溶液 可基本将烟草制品的奎尼酸完全提取。
[0087]实施例3:乙酸铵水溶液不同添加量的比较
[0088] 本实施例分别向烟草制品中加入25ml、50ml、75ml和100ml的0.lmol/L乙酸铵水 溶液，其他参考实施例1，结果见表2。
[0089] 表2
[0091] 由表2可知，对于不同的乙酸铵水溶液添加量，结果无明显差异。如图7-8所示，当 添加量较大时，如图8的100mL添加量，信号值较小，易受基线噪音影响，而添加量较小时， 如图7的25mL添加量，易出现信号值过饱和，影响测定结果。为了兼顾提取的完全性和检 测的准确性，同时保证取样的均匀性和减少试剂用量，实验选择添加量为50mL。
[0092]实施例4 :不同提取时间的比较
[0093] 本实施例分别以10min、20min、30min、40min和50min作为提取时间，各自测得的 奎尼酸含量如图9所示。当超声时间多30min，测得的奎尼酸含量基本稳定，奎尼酸的提取 率最高。为避免过长时间超声导致样品的温度显著升高，同时为了使不同样品中的奎尼酸 都能被完全提取出来，提取时间采用30min。
[0094]实施例5:不同质谱备件的比较
[0095] 本实施例将质谱碰撞能（CE)设定为-15V，定量离子对为191/127,其他参考实施 例1。得到的提取液色谱峰面积仅为实施例1提取液色谱峰面积的81%。
[0096] 实施例6 :不同色谱梓的比较
[0097] 本实施例分别用Agilent公司生产的色谱柱ZORBAXEclipse C18 (1 00mmX2. 1mm，1. 8ym)、ZORBAXEclipseXDB-C8 (150mmX4. 6mm，5m)、ZORBAX SB-C3 (150mmX2. 1mm，5ym)、ZORBAXSB-C3(lOOmmX3. 0mm，1. 8ym)、ZORBAX XDB-Phenyl(150mmX4. 6mm，3. 5ym)、ZORBAX300-SCX(150mmX2. 1mm，5ym)、热电公司 生产的的色谱柱APS_2Hypersil(100_X2. 1mm, 5ym)和菲罗门Luna5uC18色谱柱 (150. 0_X3. 9mm, 5ym)进行分析测定，其他参考实施例1，结果表明，菲罗门Luna5uC18 色谱柱（150.OmmX3. 9mm, 5ym)的色谱峰型最好，响应值最高。
[0098] 实施例7 :不同流动相的比较
[0099] 本实施例以纯水作为流动相进行分析，其他参考实施例1，得到色谱图如图10所 不〇
[0100] 将图10与图2-3比较可知，以纯水作流动相时，奎尼酸的峰强度较低，而采用 0. 1 %醋酸作为流动相时，色谱峰型较好，响应值较高。
[0101]实施例8:不同讲样量的比较
[0102] 本实施例分别以1^1、2^1、5^1和10^1进样，其他参考实施例1。
[0103] 结果表明，色谱峰响应值会随着进样量的增加而增加，当达到10UL的进样量时， 奎尼酸色谱峰出现裂峰。因此选择5yL进样。
[0104] 实施例9 :重复件和加标回收率的考察
[0105] 分别向样品中加入lmg/g、5mg/g和10mg/g三种不同浓度的标准溶液，进行加标回 收率试验，每个样品分别测定6次，分析方法参考实施例1。根据分析结果计算烟草制品中 奎尼酸的加标回收率，结果如表3所示。
[0106]表3烟草制品中奎尼酸的回收率和重复性（n= 6)
[0107]
[0109] 由表3可以看出，在3个加标水平上，利用此方法分析检测烟草制品中奎尼酸的回 收率在93. 8% -94. 8%之间，样品测试结果的相对标准偏差小于5%，说明本法的回收率较 高，重复性较好。
[0110] 实施例10 :不同烟草制品奎尼酸含量的测宙
[0111] 采用实施例1的分析方法测定不同产地、不同类型烟叶中的奎尼酸含量，结果见 表4。
[0112] 表4不同产地、不同类型烟叶的奎尼酸含量
[0115] 尽管本发明的【具体实施方式】已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根 据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保 护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
【主权项】
1. 一种检测样品中奎尼酸的方法，包括如下步骤： 用乙酸铵水溶液浸润样品，得到提取液。2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品为烟草或烟草制品。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于如下（1)-(6)中的任意一项或者多项： (1)所述检测为定量检测； ⑵所述乙酸铵水溶液浓度为〇? 09-0. 15mol/L，具体为0? 1-0. 15mol/L或 0? 12-0. 15mol/L，优选为 0?lmol/L; (3) 向每克样品中添加乙酸铵水溶液的量为250-1000mL，具体为250-500mL，优选为 500mL； (4) 所述浸润在超声下进行； (5) 浸润时间彡lOmin，具体地，彡30min，优选为30min; (6) 浸润温度为30-60°C;优选40°C。4. 根据权利要求1所述的方法，其中，还包括将提取液进行过滤的步骤；具体地，以水 相滤膜过滤提取液；更具体地，所述水相滤膜的孔径为0.22ym。5. 根据权利要求1所述的方法，其中，还包括用液相色谱-质谱分析提取液的步骤。6. 根据权利要求5所述的方法，其中，液相色谱条件为如下（1) - (6)中的任意一项或者 多项： (1) 色谱柱为菲罗门C18液相色谱柱； (2) 进样量为5yL; (3) 流动相为0. 1 %醋酸水溶液； ⑷流速为0?8mL/min; (5) 柱温为40°C; (6) 采用等度洗脱程序，洗脱时间5min。7. 根据权利要求5所述的方法，其中，质谱条件为如下（1)-(7)中的任意一项或者多 项： (1) 扫描方式为负离子扫描； (2) 定量离子对191/93,定性离子对191/85 ; (3) 碰撞能为-20V; (4) 离子源为电喷雾电离源； (5) 检测方式为多反应检测； (6) 电喷雾电压为-4500V; (7) 离子源温度为550 °C。8. -种检测样品中奎尼酸的试剂盒，包括乙酸铵水溶液和水相滤膜。9. 根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于如下（1)-(5)中的任意一项或者多项： ⑴所述乙酸铵水溶液的浓度为〇? 09-0. 15mol/L，具体为0? 1-0. 15mol/L或 0? 12-0. 15mol/L，优选为 0?lmol/L; (2) 乙酸铵水溶液的量至少为250mL，具体为250-500mL，优选为500mL; (3) 所述水相滤膜的孔径为0. 22ym; (4) 所述试剂盒为定量分析试剂盒；
【专利摘要】本发明属于分析技术领域，涉及检测样品中奎尼酸的方法，包括用乙酸铵水溶液浸润样品的步骤。还涉及检测样品中奎尼酸的试剂盒，包括乙酸铵水溶液和水相滤膜。所述试剂盒用于检测烟草或烟草制品中的奎尼酸含量，或者用于烟草或烟草制品的质量控制。
【IPC分类】G01N30/88
【公开号】CN104897836
【申请号】CN201510295614
【发明人】邓其馨, 刘泽春, 黄华发, 黄朝章, 周培琛, 方钲中, 苏明亮
【申请人】福建中烟工业有限责任公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月3日
【技术领域】
[0001] 本发明属于分析技术领域，涉及一种检测样品中奎尼酸的方法、试剂盒及其用途。
【背景技术】
[0002] 奎尼酸（quinicacid，QA)是植物进行有氧呼吸过程中，经莽草酸途径形成的一 种环状、多羟基及有光学活性的天然酚酸类化合物，又名1，3, 4, 5-四羟基环己烷-1-羧酸。 奎尼酸的分子式为C6H7(0H)4C00H，结构式如式I所示。
[0004] 奎尼酸广泛存在于各类植物中，例如烟草、金鸡纳树皮、胡萝卜叶、苹果、梨和咖啡 等，而且，少数真菌和细菌中也存在奎尼酸。奎尼酸及其衍生物常被作为食品抗氧化剂使 用；奎尼酸的咖啡酰类衍生物在抗病毒、治疗心血管疾病等方面得到较多关注和应用。因 此，奎尼酸是提取价值极高的精细化工产品和医药中间体。
[0005] 此外，奎尼酸在烟草中的含量较高，在0.05%-1%之间。奎尼酸对人体具有刺激 性，且是有害成分酚类化合物的前体物，因此奎尼酸会对烟草感官品质产生不良影响，且会 损害吸烟者的健康，亟需控制奎尼酸在烟草中的含量。
[0006] 通常采用液相色谱法分析奎尼酸的含量，该法采用二极管阵列检测器。但该方法 的检测时间较长，不利于快速检测。
[0007] 目前尚无快速检测样品尤其是烟草及烟草制品中奎尼酸的方法。
【发明内容】
[0008] 本发明人得到了一种快速检测样品中奎尼酸的方法，尤其适用于对烟草制品进行 检测。该方法快速准确、灵敏度高、选择性好、重现性好。而且，发明人惊奇地发现以乙酸铵 水溶液提取样品中的奎尼酸，前处理步骤简单、快速。此外，发明人还采用液相色谱-质谱 联用法对奎尼酸进行快速分析检测。
[0009] 本发明第一方面涉及一种检测样品中奎尼酸的方法，包括如下步骤：用乙酸铵水 溶液浸润样品，得到提取液。
[0010] 所述浸润指乙酸铵水溶液与样品发生接触时，液体附着在样品表面或渗透到样品 内部的现象。具体地，浸润时，乙酸铵水溶液液面至少为样品高度的1/3或至少为样品高度 的1/2,优选，乙酸铵水溶液完全浸没样品。
[0011] 本发明第一方面任一项的方法中，所述样品为烟草或烟草制品。
[0012] 发明人发现，提取溶剂的选择对奎尼酸分析有显著影响，乙酸铵水溶液能将 样品中的奎尼酸快速提取出来，提取率高且方法简单。而采用其他的磷酸钠缓冲溶液 (NaH2P04-Na2HP04)、磷酸钾缓冲溶液（K2HP04-KH2P04)等无法对样品中的奎尼酸进行有效的 提取分析。
[0013] 根据本发明第一方面的方法，所述检测为定量检测。
[0014] 本发明第一方面任一项的方法中，所述乙酸铵水溶液的浓度为0. 09-0. 15mol/L， 具体为 〇? 1-0. 15mol/L或 0? 12-0. 15mol/L，优选为 0?lmol/L。
[0015] 乙酸铵水溶液的浓度为0. 09-0. 15mol/L，可基本完全提取出样品中的奎尼酸。
[0016] 本发明第一方面任一项的方法中，向每克样品中添加乙酸铵水溶液的量为 250-1000mL，具体为 250-500mL，更具体为 250mL、300mL、500mL、750mL或 1000mL，优选为 500mL〇
[0017] 发明人发现，乙酸铵水溶液添加量过大时，信号微弱，容易受基线噪音的影响；添 加量过小时，对于奎尼酸含量高的样品，容易出现信号值过饱和、测定不准确的问题。将乙 酸铵水溶液添加量控制在250-1000mL/g，尤其是500mL/g，可以保有正常信号值，使测量准 确，同时合适的乙酸铵水溶液添加量能够使奎尼酸被均匀提取出来。
[0018] 本发明第一方面任一项的方法中，所述浸润在超声下进行；具体地，超声功率为最 大功率的40%;更具体地，浸润时间彡1〇111；[11，进一步具体地，浸润时间彡301]1；[11、彡401]1；[11或 多50min，优选为30min。
[0019] 本发明第一方面任一项的方法中，浸润温度为30-60°C，具体为30°C、40°C、50°C 或 60°C，优选 40°C。
[0020] 本发明第一方面任一项的方法中，还包括将提取液进行过滤的步骤；具体地，以水 相滤膜过滤提取液；更具体地，所述水相滤膜的孔径为0. 22ym。
[0021] 本发明第一方面任一项的方法中，还包括用液相色谱-质谱分析提取液的步骤。
[0022] 根据本发明任一的方法，液相色谱条件为如下（1)_(6)中的任意一项或者多项：
[0023] (1)色谱柱为菲罗门（V液相色谱柱；
[0024] (2)进样量为 5yL;
[0025] (3)流动相为0? 1 %醋酸水溶液；
[0026] (4)流速为 0? 8mL/min;
[0027] (5)柱温为 40°C;
[0028] (6)采用等度洗脱程序，洗脱时间5min。
[0029] 发明人发现采用菲罗门C18液相色谱柱分析提取液，得到的色谱峰型较好、响应值 较高；色谱峰响应值随着进样量增加而增加，但发明人发现进样量过高时，奎尼酸色谱峰出 现裂缝，影响了检测的准确性；以0. 1%醋酸水溶液作流动相，色谱峰值较好、响应值较高。
[0030] 根据本发明任一的方法，质谱条件为如下（1)_(7)中的任意一项或者多项：
[0031] (1)扫描方式为负离子扫描；
[0032] (2)定量离子对191/93,定性离子对191/85 ;
[0033] (3)碰撞能为-20V;
[0034](4)离子源为电喷雾电离源；
[0035] (5)检测方式为多反应检测；
[0036] (6)电喷雾电压为-4500V;
[0037] (7)离子源温度为550°C。
[0038] 以负离子方式扫描，碰撞能为-20V，选择定量离子对191/93,定性离子对191/85 进行检测，准确度高、灵敏度高、回收率高、重复性好。选择其他碰撞能和定量离子对检测时 准确度较低。
[0039] 本发明第二方面涉及一种检测样品中奎尼酸的试剂盒，包括乙酸铵水溶液和水相 滤膜。
[0040] 本发明第二方面任一项的试剂盒，包括如下（1)-(5)中的任意一项或者多项：
[0041] (1)所述乙酸铵水溶液的浓度为0.09-0. 15mol/L，具体为0? 1-0. 15mol/L或 0? 12-0. 15mol/L，优选为 0?lmol/L;
[0042] (2)乙酸铵水溶液的量至少为250mL，具体为250-500mL，优选为500mL;
[0043] (3)所述水相滤膜的孔径为0? 22ym;
[0044] (4)所述试剂盒为定量分析试剂盒；
[0045] (5)所述样品为烟草或烟草制品。
[0046] 本发明第三方面涉及所述试剂盒在检测样品中奎尼酸，或者在控制样品质量中的 用途；具体地，所述样品为烟草或烟草制品。
[0047] 发明的有益效果
[0048] (1)本发明以乙酸铵水溶液浸润样品，即能从样品特别是烟草或烟草制品中提取 奎尼酸，方法简单，无需使用有毒性的有机溶剂。
[0049] (2)本发明采用液相色谱-质谱联用法分析样品中的奎尼酸，快速准确、灵敏度 高、操作简单。
[0050] (3)使用本发明方法分析样品中奎尼酸的回收率高、重复性好。在烟草或烟草制品 的样品分析中几乎不存在杂峰，目标物线性相关性较好，将标准溶液稀释一定倍数，以信噪 比S/N= 3计算出奎尼酸的检出限为0.llmg/g，以信噪比S/N= 10计算出奎尼酸的定量限 为0. 35mg/g，平均回收率为93. 8 %~94. 8 %，相对标准偏差RSD〈5 %(n= 6)。
【附图说明】
[0051] 图1 :本发明实施例1中分析方法的流程图。
[0052] 图2 :本发明实施例1中标准溶液的色谱图。
[0053] 图3 :本发明实施例1中提取液的色谱图。
[0054] 图4 :本发明实施例1中奎尼酸的质谱图。
[0055] 图5 :本发明实施例1中奎尼酸的标准曲线图。
[0056] 图6 :本发明实施例2中不同提取溶剂与色谱峰面积的关系图。
[0057] 图7 :本发明实施例3中添加量为25mL乙酸铵水溶液时的色谱图；
[0058] 图8 :本发明实施例3中添加量为100mL乙酸铵水溶液时的色谱图；
[0059] 图9 :本发明实施例4中不同提取时间与测得的奎尼酸含量的关系图。
[0060] 图10 :本发明实施例7中纯水作流动相的色谱图。
【具体实施方式】
[0061] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市购获得的常规产品。
[0062] 实施例1 :对烟草制品中奎尼酸含量的分析
[0063] 分析方法如图1所示：
[0064] (1)配制标准溶液：称取0?lg奎尼酸，精确至0?OOOlg，用0?lmol/L乙酸铵水溶 液溶解后转移至l〇〇mL棕色容量瓶中定容，配制成lmg/mL标准储备液；分别移取0.lmL、 0.51^、11^、21^、31^和51^的标准储备液至10011^容量瓶中，用0.1111〇1/1乙酸铵水溶液定 容，得到奎尼酸浓度分别为 1yg/mL、5yg/mL、10yg/mL、20yg/mL、30yg/mL和 50yg/mL 的标准溶液，避光4°C保存，取用时提前放置于常温下，达到常温后方可使用。每周做一次标 线。
[0065] (2)制备样品的提取液：称取0.lg左右烟丝，置于150mL磨口三角瓶中，准确加入 50mL、0.lmol/L的乙酸铵水溶液，超声提取30min，超声功率为40 %，经0. 22ym水相滤膜过 滤后得到提取液。
[0066] (3)采用LC-MS/ MS方法分别对提取液、标准溶液进行分析。
[0067] 色谱分析条件：采用菲罗门C18液相色谱柱，柱温为40°C;进样量5yL;流动相为 0. 1%醋酸水溶液，流速为0. 8ml/min;采用等度洗脱程序，洗脱时间总共5min。
[0068] 标准溶液的色谱分析结果如图2所示，提取液的色谱分析结果如图3所示。
[0069] 质谱分析条件：离子源：电喷雾电离源（ESI);扫描方式：负离子扫描；检测方式： 多反应监测（MRM);电喷雾电压：-4500V;离子源温度：550°C;辅助气Gasl压力：60psi;辅 助气Gas2压力：50psi;去簇电压（DP) :-40V;碰撞能（CE) :-20V;离子对选择：定量离子对 191/93,定性离子对191/85。提取液的质谱图如图4所示。
[0070] (4)计算结果：
[0071] 以标准溶液中奎尼酸的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线如 图5所示，具体数据见表1。
[0072] 表 1
[0074] 将提取液色谱图中奎尼酸的色谱峰面积，代入以上标准曲线，得到提取液中的奎 尼酸含量，按照下式计算出烟丝中的奎尼酸含量。
[0075] m= 1000X(AXS)/n
[0076] 式中：
[0077] m一烟丝中的奎尼酸含量（mg/g);
[0078] A-提取液中的奎尼酸含量（yg/mL);
[0079]S-提取液体积（mL);
[0080]n-称取烟丝的质量（g)。
[0081] 本实施例烟丝的奎尼酸含量为5. 2mg/g。
[0082]由表1和图4可知，所采用的色谱条件在烟草制品实际样品分析中几乎不存在杂 峰，目标物具有较好的线性相关性，将混合标准溶液稀释一定倍数，以信噪比S/N= 3计算 出奎尼酸的检出限为0.llmg/g。
[0083]实施例2 :不同提取溶剂及不同浓度的比较
[0084]本实施例分别用纯水、磷酸钠缓冲溶液（NaH2P04-Na2HP04)、磷酸钾缓冲溶液 (1(2册04-腿2?0 4)以及0.03111〇1/1、0.09111〇1/1、0.12111〇1/1、0.15111〇1/1的乙酸铵水溶液对烟草 制品进行提取，其他条件参考实施例1。
[0085] 磷酸钠缓冲溶液、磷酸钾缓冲溶液作为提取溶剂提取烟草制品没有检测到色谱 峰。其他提取溶剂色谱分析的峰面积如图6所示。
[0086] 由图6可知，与乙酸铵水溶液相比，纯水提取烟草制品的奎尼酸提取率低。当乙酸 铵水溶液浓度多〇.lmol/L时，奎尼酸的提取率基本达到稳定，说明0.lmol/L乙酸铵水溶液 可基本将烟草制品的奎尼酸完全提取。
[0087]实施例3:乙酸铵水溶液不同添加量的比较
[0088] 本实施例分别向烟草制品中加入25ml、50ml、75ml和100ml的0.lmol/L乙酸铵水 溶液，其他参考实施例1，结果见表2。
[0089] 表2
[0091] 由表2可知，对于不同的乙酸铵水溶液添加量，结果无明显差异。如图7-8所示，当 添加量较大时，如图8的100mL添加量，信号值较小，易受基线噪音影响，而添加量较小时， 如图7的25mL添加量，易出现信号值过饱和，影响测定结果。为了兼顾提取的完全性和检 测的准确性，同时保证取样的均匀性和减少试剂用量，实验选择添加量为50mL。
[0092]实施例4 :不同提取时间的比较
[0093] 本实施例分别以10min、20min、30min、40min和50min作为提取时间，各自测得的 奎尼酸含量如图9所示。当超声时间多30min，测得的奎尼酸含量基本稳定，奎尼酸的提取 率最高。为避免过长时间超声导致样品的温度显著升高，同时为了使不同样品中的奎尼酸 都能被完全提取出来，提取时间采用30min。
[0094]实施例5:不同质谱备件的比较
[0095] 本实施例将质谱碰撞能（CE)设定为-15V，定量离子对为191/127,其他参考实施 例1。得到的提取液色谱峰面积仅为实施例1提取液色谱峰面积的81%。
[0096] 实施例6 :不同色谱梓的比较
[0097] 本实施例分别用Agilent公司生产的色谱柱ZORBAXEclipse C18 (1 00mmX2. 1mm，1. 8ym)、ZORBAXEclipseXDB-C8 (150mmX4. 6mm，5m)、ZORBAX SB-C3 (150mmX2. 1mm，5ym)、ZORBAXSB-C3(lOOmmX3. 0mm，1. 8ym)、ZORBAX XDB-Phenyl(150mmX4. 6mm，3. 5ym)、ZORBAX300-SCX(150mmX2. 1mm，5ym)、热电公司 生产的的色谱柱APS_2Hypersil(100_X2. 1mm, 5ym)和菲罗门Luna5uC18色谱柱 (150. 0_X3. 9mm, 5ym)进行分析测定，其他参考实施例1，结果表明，菲罗门Luna5uC18 色谱柱（150.OmmX3. 9mm, 5ym)的色谱峰型最好，响应值最高。
[0098] 实施例7 :不同流动相的比较
[0099] 本实施例以纯水作为流动相进行分析，其他参考实施例1，得到色谱图如图10所 不〇
[0100] 将图10与图2-3比较可知，以纯水作流动相时，奎尼酸的峰强度较低，而采用 0. 1 %醋酸作为流动相时，色谱峰型较好，响应值较高。
[0101]实施例8:不同讲样量的比较
[0102] 本实施例分别以1^1、2^1、5^1和10^1进样，其他参考实施例1。
[0103] 结果表明，色谱峰响应值会随着进样量的增加而增加，当达到10UL的进样量时， 奎尼酸色谱峰出现裂峰。因此选择5yL进样。
[0104] 实施例9 :重复件和加标回收率的考察
[0105] 分别向样品中加入lmg/g、5mg/g和10mg/g三种不同浓度的标准溶液，进行加标回 收率试验，每个样品分别测定6次，分析方法参考实施例1。根据分析结果计算烟草制品中 奎尼酸的加标回收率，结果如表3所示。
[0106]表3烟草制品中奎尼酸的回收率和重复性（n= 6)
[0107]
[0109] 由表3可以看出，在3个加标水平上，利用此方法分析检测烟草制品中奎尼酸的回 收率在93. 8% -94. 8%之间，样品测试结果的相对标准偏差小于5%，说明本法的回收率较 高，重复性较好。
[0110] 实施例10 :不同烟草制品奎尼酸含量的测宙
[0111] 采用实施例1的分析方法测定不同产地、不同类型烟叶中的奎尼酸含量，结果见 表4。
[0112] 表4不同产地、不同类型烟叶的奎尼酸含量
[0115] 尽管本发明的【具体实施方式】已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根 据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保 护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
【主权项】
1. 一种检测样品中奎尼酸的方法，包括如下步骤： 用乙酸铵水溶液浸润样品，得到提取液。2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品为烟草或烟草制品。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于如下（1)-(6)中的任意一项或者多项： (1)所述检测为定量检测； ⑵所述乙酸铵水溶液浓度为〇? 09-0. 15mol/L，具体为0? 1-0. 15mol/L或 0? 12-0. 15mol/L，优选为 0?lmol/L; (3) 向每克样品中添加乙酸铵水溶液的量为250-1000mL，具体为250-500mL，优选为 500mL； (4) 所述浸润在超声下进行； (5) 浸润时间彡lOmin，具体地，彡30min，优选为30min; (6) 浸润温度为30-60°C;优选40°C。4. 根据权利要求1所述的方法，其中，还包括将提取液进行过滤的步骤；具体地，以水 相滤膜过滤提取液；更具体地，所述水相滤膜的孔径为0.22ym。5. 根据权利要求1所述的方法，其中，还包括用液相色谱-质谱分析提取液的步骤。6. 根据权利要求5所述的方法，其中，液相色谱条件为如下（1) - (6)中的任意一项或者 多项： (1) 色谱柱为菲罗门C18液相色谱柱； (2) 进样量为5yL; (3) 流动相为0. 1 %醋酸水溶液； ⑷流速为0?8mL/min; (5) 柱温为40°C; (6) 采用等度洗脱程序，洗脱时间5min。7. 根据权利要求5所述的方法，其中，质谱条件为如下（1)-(7)中的任意一项或者多 项： (1) 扫描方式为负离子扫描； (2) 定量离子对191/93,定性离子对191/85 ; (3) 碰撞能为-20V; (4) 离子源为电喷雾电离源； (5) 检测方式为多反应检测； (6) 电喷雾电压为-4500V; (7) 离子源温度为550 °C。8. -种检测样品中奎尼酸的试剂盒，包括乙酸铵水溶液和水相滤膜。9. 根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于如下（1)-(5)中的任意一项或者多项： ⑴所述乙酸铵水溶液的浓度为〇? 09-0. 15mol/L，具体为0? 1-0. 15mol/L或 0? 12-0. 15mol/L，优选为 0?lmol/L; (2) 乙酸铵水溶液的量至少为250mL，具体为250-500mL，优选为500mL; (3) 所述水相滤膜的孔径为0. 22ym; (4) 所述试剂盒为定量分析试剂盒；
【专利摘要】本发明属于分析技术领域，涉及检测样品中奎尼酸的方法，包括用乙酸铵水溶液浸润样品的步骤。还涉及检测样品中奎尼酸的试剂盒，包括乙酸铵水溶液和水相滤膜。所述试剂盒用于检测烟草或烟草制品中的奎尼酸含量，或者用于烟草或烟草制品的质量控制。
【IPC分类】G01N30/88
【公开号】CN104897836
【申请号】CN201510295614
【发明人】邓其馨, 刘泽春, 黄华发, 黄朝章, 周培琛, 方钲中, 苏明亮
【申请人】福建中烟工业有限责任公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月3日
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