一种治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法
一种治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药制剂检测领域，具体涉及一种治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方 法。
【背景技术】
[0002] 气滞胃痛颗粒由原料药柴胡、甘草、香附、延胡索、白芍、枳壳组成，具有舒肝理气、 和胃止痛的作用，临床用于肝郁气滞、胸痞胀满、胃脘疼痛等疾病的治疗。《中国药典2010 版》通过对芍药苷的TLC定性鉴别和芍药苷的HPLC定量测定以控制气滞胃痛颗粒的质量。
[0003] 枳壳，始载于《雷公炮炙论》，为芸香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培变 种的干燥未成熟果实，具有破气，行痰，消积的功效，临床用于胸膈痰滞、胸痞、胁胀、食积、 噫气、呕逆、下痢后重、脱肛、子宫脱垂等疾病的治疗。枳壳含有由单萜、倍半萜组成的挥发 油成分，主要成分为柠檬烯。根据现有资料的报道，柠檬烯为气滞胃痛颗粒中发挥胃肠动力 作用的主要有效物质。
[0004] 《HPLC法测定留兰香油中柠檬烯》（安徽农业科学，2012,40 (2)，743-744) 公开了 一种用HPLC法测定留兰香油中柠檬烯含量的方法，色谱条件具体为：以ODS C18(4.6mmX250mm，5ym)为色谱柱，以无水甲醇：水=75:25(V:V)为流动相等。以《HPLC 法测定留兰香油中柠檬烯》的方法对气滞胃痛颗粒中柠檬烯的含量进行测定时，由于气滞 胃痛颗粒由原料药柴胡、甘草、香附、延胡索、白芍、枳壳组成，柠檬烯与气滞胃痛颗粒中的 其他化学成分的分离效果较差，从而导致不能进行含量测定。因此，《HPLC法测定留兰香油 中柠檬烯》的方法并不适用于气滞胃痛颗粒中的柠檬烯的含量测定。
[0005] 因此，建立一种气滞胃痛颗粒中的柠檬烯含量测定方法，对于气滞胃痛颗粒的质 量进行全面控制具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 为此，本发明所要解决的是现有技术中没有气滞胃痛颗粒中的柠檬烯含量测定方 法、不利于从整体上对气滞胃痛颗粒的质量进行全面控制的技术问题，从而提出一种治疗 气滞胃痛的药物制剂的检测方法。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案来实现的：
[0008] 本发明提供一种治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法，所述药物制剂的原料药组 成为：
[0009] 柴胡、甘草、香附、
[0010] 延胡索、白芍、枳壳；
[0011] 该检测方法包括如下对柠檬烯的含量测定步骤：
[0012] (1)取待测药物制剂2.0~3. 0g，加30%~100%甲醇10~100mL，称重，超声或 加热回流10~60min，放冷，再次称重，用30 %~100 %甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取 滤液，作为供试品溶液；
[0013] (2)取柠檬烯对照品适量，加入30%~100%甲醇，制成每lmL甲醇含柠檬烯 0. 05~0. 15yL的溶液，作为对照品溶液；
[0014] (3)色谱条件：以C18为色谱柱，以化学键合相为固定相，以乙腈：水体积比为 60~80 :40~20的混合溶液为流动相，时间：20~40min，柱温：10~30°C，检测波长： 210nm，流速为 0? 5~L5mL/min；
[0015] (4)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液6~10yL，注入高效液相色谱仪，测 定。
[0016] 本发明上述治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法中，所述对柠檬烯的含量测定步 骤为：
[0017] (1)取待测药物制剂2. 5g，加100%甲醇50mL，称重，超声30min，放冷，再次称重， 用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液，作为供试品溶液；
[0018] (2)取柠檬烯对照品适量，加入100%甲醇，制成每lmL甲醇含柠檬烯0. 1yL的溶 液，作为对照品溶液；
[0019] (3)色谱条件：以C18为色谱柱，以非极性键合相为固定相，以乙腈：水=70:30为 流动相，时间：30min，柱温：10-30°C，检测波长：210nm，流速为1.OmL/min;
[0020] (4)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液8yL，注入高效液相色谱仪，测定。
[0021] 本发明上述治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法中，以硅碳型键合相为固定相。
[0022] 优选地，以三个硅羟基键与一个键合相C18键合的十八烷基硅烷键合硅胶为固定 相。
[0023] 本发明上述治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法中，该方法还包括如下鉴别和/ 或含量测定步骤中的至少一种：
[0024] A、TLC法鉴别芍药苷
[0025] (1)取待测药物制剂0? 4~0? 6g，加乙醇8~12mL，振摇4~6分钟，过滤，滤液蒸 干，残渣加乙醇0. 5~1. 5mL使溶解，作为供试品溶液；
[0026] (2)取芍药苷对照品，加乙醇制成每lmL含0. 8~1. 2mg溶液，作为对照品溶液；
[0027] (3)照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各8~12yL，分别点于同 一硅胶G薄层板上，以三氯甲烧-乙酸乙醋-甲醇-甲酸35~45 :4~6 :8~12 :0. 1~0. 3 为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰，进行鉴别；
[0028] B、HPLC法测定芍药苷的含量
[0029] (1)取待测药物制剂0.05~0? 15g，精密称定，置50mL量瓶中，加稀乙醇30~ 40mL，超声处理20~40分钟，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶 液；
[0030] (2)取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lmL含50~70yg的溶液，作 为对照品溶液；
[0031] (3)照高效液相色谱法试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0. 1% 磷酸溶液12~16 :88~84为流动相，检测波长为230nm，理论板数按芍药苷峰计算应不低 于 2000 ;
[0032] (4)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各8~12yL，注入液相色谱仪，测定。
[0033] 本发明上述治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法中，该方法还包括如下鉴别和/ 或含量测定步骤中的至少一种：
[0034] A、TLC法鉴别芍药苷
[0035] (1)取待测药物制剂0. 5g，加乙醇10mL，振摇5分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇 lmL使溶解，作为供试品溶液；
[0036] (2)取芍药苷对照品，加乙醇制成每lmL含lmg溶液，作为对照品溶液；
[0037] (3)照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各10yL，分别点于同一硅 胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸40 :5 :10 :0. 2为展开剂，展开，取出， 晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰，进行鉴别；
[0038] B、HPLC法测定芍药苷的含量
[0039] (1)取待测药物制剂0.lg，精密称定，置50mL量瓶中，加稀乙醇35mL，超声处理30 分钟，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
[0040] ⑵取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lmL含60yg的溶液，作为对照 品溶液；
[0041] (3)照高效液相色谱法试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0. 1% 磷酸溶液14 :86为流动相，检测波长为230nm，理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000 ;
[0042] (4)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10yL，注入液相色谱仪，测定。
[0043] 本发明所述治疗气滞胃痛的药物制剂的相关处方及制备方法详见中国专利 CN1712048A所公开的内容。
[0044] 本发明上述治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法中，所述药物制剂的原料药组成 为：
[0045] 柴胡30~100重量份、甘草15~60重量份、香附35~120重量份、
[0046] 延胡索35~120重量份、白芍40~150重量份、枳壳35~120重量份。
[0047] 优选地，本发明上述治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法中，所述药物制剂的原 料药组成为：
[0048] 柴胡36重量份、甘草20重量份、香附40重量份、
[0049] 延胡索40重量份、白苟48重量份、枳壳40重量份；或者
[0050] 柴胡80重量份、甘草40重量份、香附90重量份、
[0051] 延胡索90重量份、白苟120重量份、枳壳90重量份；或者
[0052] 柴胡70重量份、甘草60重量份、香附120重量份、
[0053] 延胡索80重量份、白苟150重量份、枳壳100重量份；或者
[0054] 柴胡90重量份、甘草50重量份、香附45重量份、
[0055] 延胡索100重量份、白苟120重量份、枳壳40重量份；或者
[0056] 柴胡50重量份、甘草40重量份、香附100重量份、
[0057] 延胡索40重量份、白苟70重量份、枳壳50重量份。
[0058] 本发明上述治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法中，所述药物制剂为片剂、胶囊 剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
[0059] 本发明上述治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法中，所述药物制剂由以下方法制 备：
[0060] (1)取选定重量份的枳壳和香附，提取，得提取液A和挥发油A;
[0061] (2)取选定重量份的柴胡、甘草、延胡索和白苟，加水提取2次，第一次提取0.5~ 4小时，第二次提取0. 5~3小时，合并2次提取所得的提取液，得提取液B;
[0062] (3)合并上述提取液A和提取液B，浓缩至相对密度为1. 10~1. 30的稠膏，加入 挥发油A，混匀，加入常规辅料、按照常规工艺制成临床可接受的剂型。
[0063] 本发明上述治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法中，所述药物制剂为无糖型颗粒 剂。
[0064] 本发明上述治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法中，所述无糖型颗粒剂由以下方 法制备：
[0065] (1)取选定重量份的枳壳和香附，提取，得提取液A和挥发油A;所述挥发油A中加 入0 -环糊精和水，包合0. 5~4小时，得包合物A;
[0066] (2)取选定重量份的柴胡、甘草、延胡索和白芍，加水提取2次，第一次提取0. 5~ 4小时，第二次提取0. 5~3小时，合并2次提取所得的提取液，得提取液B;
[0067] (3)合并上述提取液A和提取液B，浓缩至相对密度为1. 10~1. 30的稠膏，加入 包合物A，混匀，加入常规辅料、按照常规工艺制成无糖型颗粒剂。
[0068] 本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
[0069] 本发明的治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法，通过化学键合相色谱法测定柠檬 烯的含量，通过选择提取方法、提取溶剂、提取溶剂用量、提取时间等，使气滞胃痛颗粒中的 柠檬烯最大程度的被提取；通过选择色谱柱、流动相等，使气滞胃痛颗粒中的柠檬烯与其它 化学成分的分离效果最好，从而准确地对气滞胃痛颗粒中的柠檬烯的含量进行测定。该检 测方法快速、全面、针对性强，联合现有的TLC鉴别和HPLC法测定芍药苷的含量，有利于对 该药物的质量进行有效控制，有助于提高该药物使用的安全性和稳定性。
【附图说明】
[0070] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合 附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
[0071] 图1⑷是本发明实验例中AngilentTC-C18(250X4. 6mm，5ym)色谱柱对供试品 的分离效果图；
[0072] 图1 (B)是本发明实验例中AngilentTC-C18 (250X4. 6mm，5ym)色谱柱对对照品 的分离效果图；
[0073] 图2⑷是本发明实验例中PhenomenexlTC-C18(250X4. 6mm，5ym)色谱柱对供 试品的分离效果图；
[0074] 图2⑶是本发明实验例中PhenomenexlTC-C18(250X4. 6mm，5ym)色谱柱对对 照品的分离效果图；
[0075] 图3⑷是本发明实验例中AngilentTC-C18(150X4.6mm，5ym)色谱柱对供试品 的分离效果图；
[0076] 图3(B)是本发明实验例中AngilentTC-C18(150X4. 6mm，5ym)色谱柱对对照品 的分离效果图；
[0077] 图4⑷是本发明实验例中WelchUltimateLP-C18 (250X4. 6_，5ym)色谱柱对 供试品的分离效果图；
[0078] 图 4(B)是本发明实验例中WelchUltimateLP-C18 (250X4. 6mm，5ym)色谱柱对 对照品的分离效果图；
[0079] 图5是本发明实验例中空白溶剂的色谱图；
[0080] 图6是本发明实验例中柠檬烯对照品的色谱图；
[0081] 图7是本发明实验例中供试品溶液的色谱图；
[0082] 图8是本发明实验例中柠檬烯的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0083] 实验例
[0084] 1.仪器与试药
[0085] 1. 1 仪器
[0086] 岛津10A高效液相色谱仪（日本岛津公司）；
[0087] ACXULABALC-11C. 4型电子天平（德国赛多利斯集团）；
[0088] SHZ-DIII型循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；
[0089] WelchUltimateLP-C18 色谱柱（4. 6_X250mm，5ym)(美国月旭公司），为采用 三位键合工艺（三个硅羟基键与一个键合相C18结合）所制成；
[0090] 超纯水处理装置（Milli-Q，美国Millipore公司）；
[0091] HS6150型超声波清洗器（天津恒奥科技发展有限公司）；
[0092] HHS型电子恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。
[0093] 1. 2 试药
[0094] 无糖型气滞胃痛颗粒（辽宁华润本溪三药有限公司，批号分别为20141112， 20141111、20140304、20140914、20140910、20140601、20140911、20140404、20140718、 20140912)；
[0095] 柠檬烯对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：YM0510SA14);
[0096] 乙腈（色谱纯，中国天津科密欧化学试剂有限公司）；
[0097] 超纯水（18.2MQ)。
[0098] 2.方法与结果
[0099] 2. 1供试品溶液制备
[0100] 取无糖型气滞胃痛颗粒2. 5g，精密称定，置于锥形瓶中，加甲醇50mL，称重，超声 30min，放冷，再次称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0101] 2. 2对照品溶液制备
[0102] 取柠檬烯对照品适量，精密量取，加甲醇制成每lmL含柠檬烯0. 1yL的溶液，即 得。
[0103] 2. 3色谱条件
[0104] 色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，WelchUltimateLP-C18色谱柱；流动 相为乙腈：水=70:30，时间：3〇111；[11，柱温：10-30°0，检测波长：21011111，流速为1.011117 /111；[11。
[0105] 2. 4单因素变量分析
[0106] 2. 4. 1色谱柱耐用性
[0107] 选用不同的色谱柱，按上述色谱条件分析，记录试验情况，结果见表1、图1(A)、图 1 (B)、图 2 (A)、图 2 (B)、图 3 (A)、图 3 (B)、图 4 (A)和图 4 (B)。
[0108] 表1不同色谱柱对分离效果的影响
[0110] 结果表明，以上色谱柱分离度均大于1. 5,而只有WelchUltimateLP-C18色谱柱 表现为色谱峰对称性良好（对称度在0. 95~1. 05之间），且WelchUltimateLP-C18色谱 柱的理论塔板数明显高于其他三种色谱柱，且在实验过程中发现，其他三种色谱柱的重复 性较差，进样次数越多，色谱峰的对称度越差。因此可以认为，WelchUltimateLP-C18色 谱柱对无糖型气滞胃痛颗粒中柠檬烯的分离效果最好。
[0111] 2. 4. 2提取方法
[0112] 取同一批次无糖型气滞胃痛颗粒2. 5g四份（批号：20140601)，精密称定，置于锥 形瓶中，加50%甲醇25mL，称重，分别采用超声处理30min和加热回流60min的处理方式， 放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，结果见表2。
[0113] 表2提取方法的影响
[0115] 结果表明，超声提取法较加热回流提取法柠檬烯含量较大，故将提取方法确定为 超声提取。
[0116] 2. 4. 3提取溶剂
[0117] 取同一批次无糖型气滞胃痛颗粒2.5g六份（批号：20140910)，精密称定，置于锥 形瓶中，分别加30%甲醇、50%甲醇、100%甲醇25mL，称重，超声处理30min，放冷，再称定 重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，结果见表3。
[0118] 表3提取溶剂的影响
[0120] 结果表明，采用100%甲醇为提取溶剂的样品所测得的柠檬烯含量高于其他两种 溶剂，故采用100%甲醇为提取溶剂。
[0121] 2. 4. 4提取时间
[0122] 取同一批次无糖型气滞胃痛颗粒2.5g六份（批号：20140910)，精密称定，置于锥 形瓶中，加甲醇25mL，称重，分别超声处理10min、30min、60min，放冷，再称定重量，用甲醇 补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，结果见表4。
[0123] 表4提取时间的影响
[0125] 结果表明，提取时间为lOmin时，检测到的柠檬烯含量较 低；提取时间为30min和 60min时，测得的柠檬烯的含量差异不大，而故将提取时间定为30min。
[0126] 2. 4. 5提取溶剂用量
[0127] 取同一批次无糖型气滞胃痛颗粒2. 5g六份（批号：20140404)，精密称定，置于 锥形瓶中，分别加甲醇10mL、25mL、50mL、100mL，称重，分别超声处理30min，放冷，再称定重 量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，结果见表5。
[0128] 表5溶剂用量的影响
[0129]
[0131] 结果表明，溶剂用量为50mL时测得的柠檬烯的含量最大，故将提取溶剂用量定为 50mL〇
[0132] 综上所述，无糖型气滞胃痛颗粒中柠檬烯的最佳提取工艺为取无糖型气滞胃痛颗 粒2. 5g，精密称定，置于锥形瓶中，加甲醇50mL，称重，超声30min，放冷，再次称重，用甲醇 补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。
[0133] 2. 5方法学验证
[0134] 2. 5.1 专属性
[0135] 采用高效液相色谱仪分别检测甲醇、对照品溶液及供试品溶液，进样量8yL，结果 分别见图5、6和7。
[0136] 2. 5. 2标准曲线
[0137] 精密吸取浓度为0. 1yL/mL的柠檬烯对照品溶液2、4、8、10、12、20yL，分别注入 液相色谱仪，测定各自峰面积，以对照品进样量X为横坐标，峰面积值Y为纵坐标，求得回归 方程：Y= 634439577. 9221X+2396. 2273,R= 0? 9998。
[0138] 表6柠檬烯标准曲线
[0140] 结果见表6和图8。这表明，柠檬烯在0.0002-0. 0020yL范围内与峰面积呈良好 的线性关系。
[0141] 2. 5. 3 精密度
[0142] 取同一对照品溶液8yL，重复进样6次，计算各色谱峰峰面积的RSD(相对标准偏 差）（相对标准偏差=标准偏差/计算结果的算术平均值X100% )，结果见表7。
[0143] 表7精密度试验结果
[0145] 由上表可知，色谱峰峰面积RSD值为0.83%，小于3%。这表明，本发明所构建的 采用化学键合相色谱法检测柠檬烯的含量的方法精密度良好。
[0146] 2. 5. 4 稳定性
[0147] 取同一供试品溶液8yL(批号：20141111)，于0、2、4、6、8、10h测定柠檬烯含量，计 算含量RSD值，结果见表8。
[0148] 表8稳定性试验结果
[0150] 由上表可知，柠檬烯含量RSD值为1. 59%，小于3%。这表明，本发明通过化学键 合相色谱法检测柠檬烯含量的方法稳定性良好。
[0151] 2. 5. 5 重复性
[0152] 取同一批次无糖型气滞胃痛颗粒六份（批号：20141111)，制成供试品溶液，检测 其中柠檬烯的含量，计算含量RSD值，结果见表9。
[0153] 表9重复性试验结果
[0155] 由上表可知，梓檬稀含量RSD值为0. 56%，小于3%。这表明，本发明通过化学键 合相色谱法检测柠檬烯含量的方法重复性良好。
[0156] 2. 5. 6 回收率
[0157] 取同一批次无糖型气滞胃痛颗粒六份（批号：20141111)，加2.5yL/mL柠檬烯对 照品溶液lmL，制成供试品溶液，测定样品中柠檬烯的含量，计算回收率，结果平均回收率为 97. 13%，RSD为 0? 64%，见表 10。
[0158] 表10回收率试验结果
[0159]
[0160] 2. 6样品含量测定
[0161] 取10批次无糖型气滞胃痛颗粒2. 5g，精密称定，制成供试品溶液，检测柠檬烯含 量，检测结果见表11。
[0162] 表11 10批次无糖型气滞胃痛颗粒柠檬烯的含量测定结果
[0164] 2. 7样品含量限度
[0165] 根据以上10批样品中柠檬烯的含量测定结果，确定含量限度为：每lg无糖型气滞 胃痛颗粒含柠檬烯量应不低于0. 45yL。
[0166] 3对比实验
[0167] 分别按照对比例1和实施例2进行对比实验，实验结果如表12所示。
[0168] 表12对比例1和实施例2的分离效果的比较
[0170] 由表12可知，采用对比例1的方法，分离度小于1. 5,色谱峰对称性较差，且理论塔 板数较小，对气滞胃痛颗粒中柠檬烯的分离效果较差，从而导致不能进行含量测定。因此， 对比例1的方法并不适用于气滞胃痛颗粒中柠檬烯的含量测定。
[0171] 综上所述，本发明一种无糖型气滞胃痛颗粒中挥发性指标成分柠檬烯的质量控制 方法，通过单因素考察，得到了无糖型气滞胃痛颗粒中柠檬烯的最佳提取工艺，经方法学验 证了此方法的科学性及合理性，并对10批次的无糖型气滞胃痛颗粒中的柠檬烯含量进行 了检测，得到了其含量限度，完善了无糖型气滞胃痛颗粒的质量控制标准。该检测方法快 速、全面、针对性强，联合现有的TLC鉴别和HPLC法测定芍药苷的含量，有利于对该药物的 质量进行有效控制，有助于提高该药物使用的安全性和稳定性。
[0172] 实施例1无糖颗粒剂的制备
[0173] 【处方】柴胡36重量份、甘草20重量份、香附40重量份、延胡索40重量份、白芍48 重量份、枳壳40重量份。
[0174] 【制备方法】(1)取选定重量份的枳壳和香附，提取，得提取液A和挥发油A;所述挥 发油A中加入0 -环糊精和水，包合0. 5~4小时，得包合物A;
[0175] (2)取选定重量份的柴胡、甘草、延胡索和白芍，加水提取2次，第一次提取0.5~ 4小时，第二次提取0. 5~3小时，合并2次提取所得的提取液，得提取液B;
[0176] (3)合并上述提取液A和提取液B，浓缩至相对密度为1. 10~1. 30 (50°C测）的稠 膏，加入包合物A，混匀，加入常规辅料、按照常规工艺制成无糖型颗粒剂。
[0177] 实施例2化学键合相色谱法测定柠檬烯的含量
[0178] 本实施例化学键合相色谱法测定柠檬烯的含量包括以下步骤：
[0179] (1)取待测药物制剂2. 5g，加100%甲醇50mL，称重，超声30min，放冷，再次称重， 用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液，作为供试品溶液；
[0180] (2)取柠檬烯对照品适量，加入100%甲醇，制成每lmL甲醇含柠檬烯0. 1yL的溶 液，作为对照品溶液；
[0181] (3)色谱条件：以 250X4. 6mm，5ym的WelchUltimateLP-C18 为色谱柱，以三个 硅羟基键与一个键合相C18键合的十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以乙腈：水=70:30为 流动相，时间：30min，柱温：10-30°C，检测波长：210nm，流速为1.OmL/min;
[0182] (4)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液8yL，注入高效液相色谱仪，测定。
[0183] 实施例3化学键合相色谱法测定柠檬烯的含量
[0184] 本实施例化学键合相色谱法测定柠檬烯的含量包括以下步骤：
[0185] (1)取待测药物制剂2.Og，加30%甲醇100mL，称重，超声或加热回流60min，放冷， 再次称重，用30%甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液，作为供试品溶液；
[0186] (2)取柠檬烯对照品适量，加入30%甲醇，制成每lmL甲醇含柠檬烯0. 05yL的溶 液，作为对照品溶液；
[0187] (3)色谱条件：以150X4. 6mm，5ym的AngilentTC-C18为色谱柱，以乙腈：水 体积比为60 :40的混合溶液为流动相，时间：20min，柱温：10°C，检测波长：210nm，流速为 0. 5mL/min；
[0188] (4)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液6yL，注入高效液相色谱仪，测定。
[0189] 实施例4化学键合相色谱法测定柠檬烯的含量
[0190] 本实施例化学键合相色谱法测定柠檬烯的含量包括以下步骤：
[0191] (1)取待测药物制剂3. 0g，加100%甲醇10mL，称重，超声或加热回流lOmin，放冷， 再次称重，用100%甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液，作为供试品溶液；
[0192] (2)取柠檬烯对照品适量，加入100%甲醇，制成每lmL甲醇含柠檬烯0. 15yL的 溶液，作为对照品溶液；
[0193] (3)色谱条件：以250X4. 6mm，5ym的AngilentTC-C18为色谱柱，以乙腈：水 体积比为80 :20的混合溶液为流动相，时间：40min，柱温：30°C，检测波长：210nm，流速为 1. 5mL/min；
[0194] (4)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液10yL，注入高效液相色谱仪，测定。
[0195] 实施例5化学键合相色谱法测定柠檬烯的含量
[0196] 本实施例化学键合相色谱法测定柠檬烯的含量包括以下步骤：
[0197] (1)取待测药物制剂2. 5g，加100%甲醇50mL，称重，超声30min，放冷，再次称重， 用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液，作为供试品溶液；
[0198] (2)取柠檬烯对照品适量，加入100%甲醇，制成每lmL甲醇含柠檬烯0. 1yL的溶 液，作为对照品溶液；
[0199] (3)色谱条件：以250X4.6mm，5ym的PhenomenexlTC-C18为色谱柱，以乙腈：水 =70:30为流动相，时间：30min，柱温：10_30°C，检测波长：210nm，流速为1.OmL/min;
[0200] (4)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液8yL，注入高效液相色谱仪，测定。
[0201] 实施例6TLC法鉴别芍药苷
[0202] 本实施例TLC法鉴别芍药苷包括以下步骤：
[0203] (1)取待测药物制剂0. 5g，加乙醇10mL，振摇5分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇 lmL使溶解，作为供试品溶液；
[0204] (2)取芍药苷对照品，加乙醇制成每lmL含lmg溶液，作为对照品溶液；
[0205] (3)照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各10yL，分别点于同一硅 胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸40 :5 :10 :0. 2为展开剂，展开，取出， 晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰，进行鉴别。
[0206] 实施例7HPLC法测宙芍药苷的含量
[0207] 本实施例HPLC法测定芍药苷的含量包括以下步骤：
[0208] (1)取待测药物制剂0.lg，精密称定，置50mL量瓶中，加稀乙醇35mL，超声处理30 分钟，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
[0209] (2)取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lmL含60yg的溶液，作为对照 品溶液；
[0210] (3)照高效液相色谱法试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0. 1% 磷酸溶液14 :86为流动相，检测波长为230nm，理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000 ;
[0211] (4)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10yL，注入液相色谱仪，测定。
[0212] 对比例1化学键合相色谱法测定柠檬烯的含量
[0213] 本实施例化学键合相色谱法测定柠檬烯的含量与实施例2化学键合相色 谱法测定柠檬烯的含量的各步骤的操作参数均相同，区别仅在于：色谱条件：以0DS C18(4.6_X250mm，5ym)为色谱柱，以无水甲醇：水=75:25(V:V)为流动相，时间：30min， 柱温：25°C，检测波长：200nm，流速为1.OmL/min，进样量为10yL。
[0214]显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对 于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或 变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或 变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
【主权项】
1. 一种治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法，其特征在于，所述药物制剂的原料药组 成为：柴胡、甘草、香附、延胡索、白芍、枳壳； 该检测方法包括如下对柠檬烯的含量测定步骤： (1) 取待测药物制剂2.O~3.Og，加30%~100%甲醇10~lOOmL，称重，超声或加热 回流10~60min，放冷，再次称重，用30%~100%甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤 液，作为供试品溶液； (2) 取柠檬烯对照品适量，加入30%~100%甲醇，制成每ImL甲醇含柠檬烯0.05~ 0. 15yL的溶液，作为对照品溶液； (3) 色谱条件：以C18为色谱柱，以化学键合相为固定相，以乙腈：水体积比为60~80 : 40~20的混合溶液为流动相，时间：20~40min，柱温：10~30°C，检测波长：210nm，流速 为 0? 5~L5mT,/min； (4) 分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液6~IOyL，注入高效液相色谱仪，测定。2. 根据权利要求1所述的治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法，其特征在于，所述对 柠檬烯的含量测定步骤为： (1)取待测药物制剂2. 5g，加100%甲醇50mL，称重，超声30min，放冷，再次称重，用甲 醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液，作为供试品溶液； ⑵取柠檬烯对照品适量，加入100%甲醇，制成每ImL甲醇含柠檬烯0.IyL的溶液， 作为对照品溶液； (3) 色谱条件：以C18为色谱柱，以非极性键合相为固定相，以乙腈：水=70:30为流动 相，时间：30min，柱温：10-30°C，检测波长：210nm，流速为I.OmL/min; (4) 分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液8yL，注入高效液相色谱仪，测定。3. 根据权利要求1或2所述的治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法，其特征在于，以硅 碳型键合相为固定相。4. 根据权利要求3所述的治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法，其特征在于，以三个 硅羟基键与一个键合相C18键合的十八烷基硅烷键合硅胶为固定相。5. 根据权利要求1-4任一项所述的治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法，其特征在 于，所述药物制剂的原料药组成为： 柴胡30~100重量份、甘草15~60重量份、香附35~120重量份、 延胡索35~120重量份、白芍40~150重量份、枳壳35~120重量份。6. 根据权利要求5所述的治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法，其特征在于，所述药 物制剂的原料药组成为： 柴胡36重量份、甘草20重量份、香附40重量份、 延胡索40重量份、白苟48重量份、枳壳40重量份；或者 柴胡80重量份、甘草40重量份、香附90重量份、 延胡索90重量份、白苟120重量份、枳壳90重量份；或者 柴胡70重量份、甘草60重量份、香附120重量份、 延胡索80重量份、白苟150重量份、枳壳100重量份；或者 柴胡90重量份、甘草50重量份、香附45重量份、 延胡索100重量份、白苟120重量份、枳壳40重量份；或者 柴胡50重量份、甘草40重量份、香附100重量份、 延胡索40重量份、白苟70重量份、枳壳50重量份。7. 根据权利要求1-6任一项所述的治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法，其特征在 于，所述药物制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、 口服液体制剂或注射制剂。8. 根据权利要求7所述的治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法，其特征在于，所述药 物制剂由以下方法制备： (1) 取选定重量份的枳壳和香附，提取，得提取液A和挥发油A; (2) 取选定重量份的柴胡、甘草、延胡索和白芍，加水提取2次，第一次提取0. 5~4小 时，第二次提取0. 5~3小时，合并2次提取所得的提取液，得提取液B; (3) 合并上述提取液A和提取液B，浓缩至相对密度为1. 10~1. 30的稠膏，加入挥发 油A，混匀，加入常规辅料、按照常规工艺制成临床可接受的剂型。9. 根据权利要求1-8任一项所述的治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法，其特征在 于，所述药物制剂为无糖型颗粒剂。10. 根据权利要求9所述的治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法，其特征在于，所述无 糖型颗粒剂由以下方法制备： (1) 取选定重量份的枳壳和香附，提取，得提取液A和挥发油A;所述挥发油A中加入 0-环糊精和水，包合0. 5~4小时，得包合物A; (2) 取选定重量份的柴胡、甘草、延胡索和白芍，加水提取2次，第一次提取0. 5~4小 时，第二次提取0. 5~3小时，合并2次提取所得的提取液，得提取液B; (3) 合并上述提取液A和提取液B，浓缩至相对密度为1. 10~1. 30的稠膏，加入包合 物A，混匀，加入常规辅料、按照常规工艺制成无糖型颗粒剂。
【专利摘要】本发明涉及一种治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法，包括如下对柠檬烯的含量测定步骤：(1)取待测药物制剂2.0～3.0g，加30％～100％甲醇10～100mL，称重，超声或加热回流10～60min，放冷，再次称重，用30％～100％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液，作为供试品溶液；(2)取柠檬烯对照品，加入甲醇，制成每1mL甲醇含柠檬烯0.05～0.15μL的溶液，作为对照品溶液；(3)色谱条件：以C18为色谱柱，以化学键合相为固定相，乙腈：水体积比为60～80：40～20的混合溶液为流动相，时间：20～40min，柱温：10～30℃，检测波长：210nm，流速0.5～1.5mL/min；(4)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液6～10μL，注入高效液相色谱仪，测定。该检测方法快速、全面、针对性强，有利于对该药物的质量进行有效控制，有助于提高使用的安全性和稳定性。
【IPC分类】G01N30/90, G01N30/88
【公开号】CN104897837
【申请号】CN201510312537
【发明人】孟宪生, 何晓霞, 潘英, 韩凌, 张跃飞, 常馨, 包永睿, 王帅, 马鹏岗
【申请人】辽宁华润本溪三药有限公司, 本溪国家中成药工程技术研究中心有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月8日
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药制剂检测领域，具体涉及一种治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方 法。
【背景技术】
[0002] 气滞胃痛颗粒由原料药柴胡、甘草、香附、延胡索、白芍、枳壳组成，具有舒肝理气、 和胃止痛的作用，临床用于肝郁气滞、胸痞胀满、胃脘疼痛等疾病的治疗。《中国药典2010 版》通过对芍药苷的TLC定性鉴别和芍药苷的HPLC定量测定以控制气滞胃痛颗粒的质量。
[0003] 枳壳，始载于《雷公炮炙论》，为芸香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培变 种的干燥未成熟果实，具有破气，行痰，消积的功效，临床用于胸膈痰滞、胸痞、胁胀、食积、 噫气、呕逆、下痢后重、脱肛、子宫脱垂等疾病的治疗。枳壳含有由单萜、倍半萜组成的挥发 油成分，主要成分为柠檬烯。根据现有资料的报道，柠檬烯为气滞胃痛颗粒中发挥胃肠动力 作用的主要有效物质。
[0004] 《HPLC法测定留兰香油中柠檬烯》（安徽农业科学，2012,40 (2)，743-744) 公开了 一种用HPLC法测定留兰香油中柠檬烯含量的方法，色谱条件具体为：以ODS C18(4.6mmX250mm，5ym)为色谱柱，以无水甲醇：水=75:25(V:V)为流动相等。以《HPLC 法测定留兰香油中柠檬烯》的方法对气滞胃痛颗粒中柠檬烯的含量进行测定时，由于气滞 胃痛颗粒由原料药柴胡、甘草、香附、延胡索、白芍、枳壳组成，柠檬烯与气滞胃痛颗粒中的 其他化学成分的分离效果较差，从而导致不能进行含量测定。因此，《HPLC法测定留兰香油 中柠檬烯》的方法并不适用于气滞胃痛颗粒中的柠檬烯的含量测定。
[0005] 因此，建立一种气滞胃痛颗粒中的柠檬烯含量测定方法，对于气滞胃痛颗粒的质 量进行全面控制具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 为此，本发明所要解决的是现有技术中没有气滞胃痛颗粒中的柠檬烯含量测定方 法、不利于从整体上对气滞胃痛颗粒的质量进行全面控制的技术问题，从而提出一种治疗 气滞胃痛的药物制剂的检测方法。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案来实现的：
[0008] 本发明提供一种治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法，所述药物制剂的原料药组 成为：
[0009] 柴胡、甘草、香附、
[0010] 延胡索、白芍、枳壳；
[0011] 该检测方法包括如下对柠檬烯的含量测定步骤：
[0012] (1)取待测药物制剂2.0~3. 0g，加30%~100%甲醇10~100mL，称重，超声或 加热回流10~60min，放冷，再次称重，用30 %~100 %甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取 滤液，作为供试品溶液；
[0013] (2)取柠檬烯对照品适量，加入30%~100%甲醇，制成每lmL甲醇含柠檬烯 0. 05~0. 15yL的溶液，作为对照品溶液；
[0014] (3)色谱条件：以C18为色谱柱，以化学键合相为固定相，以乙腈：水体积比为 60~80 :40~20的混合溶液为流动相，时间：20~40min，柱温：10~30°C，检测波长： 210nm，流速为 0? 5~L5mL/min；
[0015] (4)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液6~10yL，注入高效液相色谱仪，测 定。
[0016] 本发明上述治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法中，所述对柠檬烯的含量测定步 骤为：
[0017] (1)取待测药物制剂2. 5g，加100%甲醇50mL，称重，超声30min，放冷，再次称重， 用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液，作为供试品溶液；
[0018] (2)取柠檬烯对照品适量，加入100%甲醇，制成每lmL甲醇含柠檬烯0. 1yL的溶 液，作为对照品溶液；
[0019] (3)色谱条件：以C18为色谱柱，以非极性键合相为固定相，以乙腈：水=70:30为 流动相，时间：30min，柱温：10-30°C，检测波长：210nm，流速为1.OmL/min;
[0020] (4)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液8yL，注入高效液相色谱仪，测定。
[0021] 本发明上述治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法中，以硅碳型键合相为固定相。
[0022] 优选地，以三个硅羟基键与一个键合相C18键合的十八烷基硅烷键合硅胶为固定 相。
[0023] 本发明上述治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法中，该方法还包括如下鉴别和/ 或含量测定步骤中的至少一种：
[0024] A、TLC法鉴别芍药苷
[0025] (1)取待测药物制剂0? 4~0? 6g，加乙醇8~12mL，振摇4~6分钟，过滤，滤液蒸 干，残渣加乙醇0. 5~1. 5mL使溶解，作为供试品溶液；
[0026] (2)取芍药苷对照品，加乙醇制成每lmL含0. 8~1. 2mg溶液，作为对照品溶液；
[0027] (3)照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各8~12yL，分别点于同 一硅胶G薄层板上，以三氯甲烧-乙酸乙醋-甲醇-甲酸35~45 :4~6 :8~12 :0. 1~0. 3 为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰，进行鉴别；
[0028] B、HPLC法测定芍药苷的含量
[0029] (1)取待测药物制剂0.05~0? 15g，精密称定，置50mL量瓶中，加稀乙醇30~ 40mL，超声处理20~40分钟，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶 液；
[0030] (2)取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lmL含50~70yg的溶液，作 为对照品溶液；
[0031] (3)照高效液相色谱法试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0. 1% 磷酸溶液12~16 :88~84为流动相，检测波长为230nm，理论板数按芍药苷峰计算应不低 于 2000 ;
[0032] (4)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各8~12yL，注入液相色谱仪，测定。
[0033] 本发明上述治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法中，该方法还包括如下鉴别和/ 或含量测定步骤中的至少一种：
[0034] A、TLC法鉴别芍药苷
[0035] (1)取待测药物制剂0. 5g，加乙醇10mL，振摇5分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇 lmL使溶解，作为供试品溶液；
[0036] (2)取芍药苷对照品，加乙醇制成每lmL含lmg溶液，作为对照品溶液；
[0037] (3)照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各10yL，分别点于同一硅 胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸40 :5 :10 :0. 2为展开剂，展开，取出， 晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰，进行鉴别；
[0038] B、HPLC法测定芍药苷的含量
[0039] (1)取待测药物制剂0.lg，精密称定，置50mL量瓶中，加稀乙醇35mL，超声处理30 分钟，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
[0040] ⑵取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lmL含60yg的溶液，作为对照 品溶液；
[0041] (3)照高效液相色谱法试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0. 1% 磷酸溶液14 :86为流动相，检测波长为230nm，理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000 ;
[0042] (4)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10yL，注入液相色谱仪，测定。
[0043] 本发明所述治疗气滞胃痛的药物制剂的相关处方及制备方法详见中国专利 CN1712048A所公开的内容。
[0044] 本发明上述治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法中，所述药物制剂的原料药组成 为：
[0045] 柴胡30~100重量份、甘草15~60重量份、香附35~120重量份、
[0046] 延胡索35~120重量份、白芍40~150重量份、枳壳35~120重量份。
[0047] 优选地，本发明上述治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法中，所述药物制剂的原 料药组成为：
[0048] 柴胡36重量份、甘草20重量份、香附40重量份、
[0049] 延胡索40重量份、白苟48重量份、枳壳40重量份；或者
[0050] 柴胡80重量份、甘草40重量份、香附90重量份、
[0051] 延胡索90重量份、白苟120重量份、枳壳90重量份；或者
[0052] 柴胡70重量份、甘草60重量份、香附120重量份、
[0053] 延胡索80重量份、白苟150重量份、枳壳100重量份；或者
[0054] 柴胡90重量份、甘草50重量份、香附45重量份、
[0055] 延胡索100重量份、白苟120重量份、枳壳40重量份；或者
[0056] 柴胡50重量份、甘草40重量份、香附100重量份、
[0057] 延胡索40重量份、白苟70重量份、枳壳50重量份。
[0058] 本发明上述治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法中，所述药物制剂为片剂、胶囊 剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
[0059] 本发明上述治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法中，所述药物制剂由以下方法制 备：
[0060] (1)取选定重量份的枳壳和香附，提取，得提取液A和挥发油A;
[0061] (2)取选定重量份的柴胡、甘草、延胡索和白苟，加水提取2次，第一次提取0.5~ 4小时，第二次提取0. 5~3小时，合并2次提取所得的提取液，得提取液B;
[0062] (3)合并上述提取液A和提取液B，浓缩至相对密度为1. 10~1. 30的稠膏，加入 挥发油A，混匀，加入常规辅料、按照常规工艺制成临床可接受的剂型。
[0063] 本发明上述治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法中，所述药物制剂为无糖型颗粒 剂。
[0064] 本发明上述治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法中，所述无糖型颗粒剂由以下方 法制备：
[0065] (1)取选定重量份的枳壳和香附，提取，得提取液A和挥发油A;所述挥发油A中加 入0 -环糊精和水，包合0. 5~4小时，得包合物A;
[0066] (2)取选定重量份的柴胡、甘草、延胡索和白芍，加水提取2次，第一次提取0. 5~ 4小时，第二次提取0. 5~3小时，合并2次提取所得的提取液，得提取液B;
[0067] (3)合并上述提取液A和提取液B，浓缩至相对密度为1. 10~1. 30的稠膏，加入 包合物A，混匀，加入常规辅料、按照常规工艺制成无糖型颗粒剂。
[0068] 本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
[0069] 本发明的治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法，通过化学键合相色谱法测定柠檬 烯的含量，通过选择提取方法、提取溶剂、提取溶剂用量、提取时间等，使气滞胃痛颗粒中的 柠檬烯最大程度的被提取；通过选择色谱柱、流动相等，使气滞胃痛颗粒中的柠檬烯与其它 化学成分的分离效果最好，从而准确地对气滞胃痛颗粒中的柠檬烯的含量进行测定。该检 测方法快速、全面、针对性强，联合现有的TLC鉴别和HPLC法测定芍药苷的含量，有利于对 该药物的质量进行有效控制，有助于提高该药物使用的安全性和稳定性。
【附图说明】
[0070] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合 附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
[0071] 图1⑷是本发明实验例中AngilentTC-C18(250X4. 6mm，5ym)色谱柱对供试品 的分离效果图；
[0072] 图1 (B)是本发明实验例中AngilentTC-C18 (250X4. 6mm，5ym)色谱柱对对照品 的分离效果图；
[0073] 图2⑷是本发明实验例中PhenomenexlTC-C18(250X4. 6mm，5ym)色谱柱对供 试品的分离效果图；
[0074] 图2⑶是本发明实验例中PhenomenexlTC-C18(250X4. 6mm，5ym)色谱柱对对 照品的分离效果图；
[0075] 图3⑷是本发明实验例中AngilentTC-C18(150X4.6mm，5ym)色谱柱对供试品 的分离效果图；
[0076] 图3(B)是本发明实验例中AngilentTC-C18(150X4. 6mm，5ym)色谱柱对对照品 的分离效果图；
[0077] 图4⑷是本发明实验例中WelchUltimateLP-C18 (250X4. 6_，5ym)色谱柱对 供试品的分离效果图；
[0078] 图 4(B)是本发明实验例中WelchUltimateLP-C18 (250X4. 6mm，5ym)色谱柱对 对照品的分离效果图；
[0079] 图5是本发明实验例中空白溶剂的色谱图；
[0080] 图6是本发明实验例中柠檬烯对照品的色谱图；
[0081] 图7是本发明实验例中供试品溶液的色谱图；
[0082] 图8是本发明实验例中柠檬烯的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0083] 实验例
[0084] 1.仪器与试药
[0085] 1. 1 仪器
[0086] 岛津10A高效液相色谱仪（日本岛津公司）；
[0087] ACXULABALC-11C. 4型电子天平（德国赛多利斯集团）；
[0088] SHZ-DIII型循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；
[0089] WelchUltimateLP-C18 色谱柱（4. 6_X250mm，5ym)(美国月旭公司），为采用 三位键合工艺（三个硅羟基键与一个键合相C18结合）所制成；
[0090] 超纯水处理装置（Milli-Q，美国Millipore公司）；
[0091] HS6150型超声波清洗器（天津恒奥科技发展有限公司）；
[0092] HHS型电子恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。
[0093] 1. 2 试药
[0094] 无糖型气滞胃痛颗粒（辽宁华润本溪三药有限公司，批号分别为20141112， 20141111、20140304、20140914、20140910、20140601、20140911、20140404、20140718、 20140912)；
[0095] 柠檬烯对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：YM0510SA14);
[0096] 乙腈（色谱纯，中国天津科密欧化学试剂有限公司）；
[0097] 超纯水（18.2MQ)。
[0098] 2.方法与结果
[0099] 2. 1供试品溶液制备
[0100] 取无糖型气滞胃痛颗粒2. 5g，精密称定，置于锥形瓶中，加甲醇50mL，称重，超声 30min，放冷，再次称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0101] 2. 2对照品溶液制备
[0102] 取柠檬烯对照品适量，精密量取，加甲醇制成每lmL含柠檬烯0. 1yL的溶液，即 得。
[0103] 2. 3色谱条件
[0104] 色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，WelchUltimateLP-C18色谱柱；流动 相为乙腈：水=70:30，时间：3〇111；[11，柱温：10-30°0，检测波长：21011111，流速为1.011117 /111；[11。
[0105] 2. 4单因素变量分析
[0106] 2. 4. 1色谱柱耐用性
[0107] 选用不同的色谱柱，按上述色谱条件分析，记录试验情况，结果见表1、图1(A)、图 1 (B)、图 2 (A)、图 2 (B)、图 3 (A)、图 3 (B)、图 4 (A)和图 4 (B)。
[0108] 表1不同色谱柱对分离效果的影响
[0110] 结果表明，以上色谱柱分离度均大于1. 5,而只有WelchUltimateLP-C18色谱柱 表现为色谱峰对称性良好（对称度在0. 95~1. 05之间），且WelchUltimateLP-C18色谱 柱的理论塔板数明显高于其他三种色谱柱，且在实验过程中发现，其他三种色谱柱的重复 性较差，进样次数越多，色谱峰的对称度越差。因此可以认为，WelchUltimateLP-C18色 谱柱对无糖型气滞胃痛颗粒中柠檬烯的分离效果最好。
[0111] 2. 4. 2提取方法
[0112] 取同一批次无糖型气滞胃痛颗粒2. 5g四份（批号：20140601)，精密称定，置于锥 形瓶中，加50%甲醇25mL，称重，分别采用超声处理30min和加热回流60min的处理方式， 放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，结果见表2。
[0113] 表2提取方法的影响
[0115] 结果表明，超声提取法较加热回流提取法柠檬烯含量较大，故将提取方法确定为 超声提取。
[0116] 2. 4. 3提取溶剂
[0117] 取同一批次无糖型气滞胃痛颗粒2.5g六份（批号：20140910)，精密称定，置于锥 形瓶中，分别加30%甲醇、50%甲醇、100%甲醇25mL，称重，超声处理30min，放冷，再称定 重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，结果见表3。
[0118] 表3提取溶剂的影响
[0120] 结果表明，采用100%甲醇为提取溶剂的样品所测得的柠檬烯含量高于其他两种 溶剂，故采用100%甲醇为提取溶剂。
[0121] 2. 4. 4提取时间
[0122] 取同一批次无糖型气滞胃痛颗粒2.5g六份（批号：20140910)，精密称定，置于锥 形瓶中，加甲醇25mL，称重，分别超声处理10min、30min、60min，放冷，再称定重量，用甲醇 补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，结果见表4。
[0123] 表4提取时间的影响
[0125] 结果表明，提取时间为lOmin时，检测到的柠檬烯含量较 低；提取时间为30min和 60min时，测得的柠檬烯的含量差异不大，而故将提取时间定为30min。
[0126] 2. 4. 5提取溶剂用量
[0127] 取同一批次无糖型气滞胃痛颗粒2. 5g六份（批号：20140404)，精密称定，置于 锥形瓶中，分别加甲醇10mL、25mL、50mL、100mL，称重，分别超声处理30min，放冷，再称定重 量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，结果见表5。
[0128] 表5溶剂用量的影响
[0129]
[0131] 结果表明，溶剂用量为50mL时测得的柠檬烯的含量最大，故将提取溶剂用量定为 50mL〇
[0132] 综上所述，无糖型气滞胃痛颗粒中柠檬烯的最佳提取工艺为取无糖型气滞胃痛颗 粒2. 5g，精密称定，置于锥形瓶中，加甲醇50mL，称重，超声30min，放冷，再次称重，用甲醇 补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。
[0133] 2. 5方法学验证
[0134] 2. 5.1 专属性
[0135] 采用高效液相色谱仪分别检测甲醇、对照品溶液及供试品溶液，进样量8yL，结果 分别见图5、6和7。
[0136] 2. 5. 2标准曲线
[0137] 精密吸取浓度为0. 1yL/mL的柠檬烯对照品溶液2、4、8、10、12、20yL，分别注入 液相色谱仪，测定各自峰面积，以对照品进样量X为横坐标，峰面积值Y为纵坐标，求得回归 方程：Y= 634439577. 9221X+2396. 2273,R= 0? 9998。
[0138] 表6柠檬烯标准曲线
[0140] 结果见表6和图8。这表明，柠檬烯在0.0002-0. 0020yL范围内与峰面积呈良好 的线性关系。
[0141] 2. 5. 3 精密度
[0142] 取同一对照品溶液8yL，重复进样6次，计算各色谱峰峰面积的RSD(相对标准偏 差）（相对标准偏差=标准偏差/计算结果的算术平均值X100% )，结果见表7。
[0143] 表7精密度试验结果
[0145] 由上表可知，色谱峰峰面积RSD值为0.83%，小于3%。这表明，本发明所构建的 采用化学键合相色谱法检测柠檬烯的含量的方法精密度良好。
[0146] 2. 5. 4 稳定性
[0147] 取同一供试品溶液8yL(批号：20141111)，于0、2、4、6、8、10h测定柠檬烯含量，计 算含量RSD值，结果见表8。
[0148] 表8稳定性试验结果
[0150] 由上表可知，柠檬烯含量RSD值为1. 59%，小于3%。这表明，本发明通过化学键 合相色谱法检测柠檬烯含量的方法稳定性良好。
[0151] 2. 5. 5 重复性
[0152] 取同一批次无糖型气滞胃痛颗粒六份（批号：20141111)，制成供试品溶液，检测 其中柠檬烯的含量，计算含量RSD值，结果见表9。
[0153] 表9重复性试验结果
[0155] 由上表可知，梓檬稀含量RSD值为0. 56%，小于3%。这表明，本发明通过化学键 合相色谱法检测柠檬烯含量的方法重复性良好。
[0156] 2. 5. 6 回收率
[0157] 取同一批次无糖型气滞胃痛颗粒六份（批号：20141111)，加2.5yL/mL柠檬烯对 照品溶液lmL，制成供试品溶液，测定样品中柠檬烯的含量，计算回收率，结果平均回收率为 97. 13%，RSD为 0? 64%，见表 10。
[0158] 表10回收率试验结果
[0159]
[0160] 2. 6样品含量测定
[0161] 取10批次无糖型气滞胃痛颗粒2. 5g，精密称定，制成供试品溶液，检测柠檬烯含 量，检测结果见表11。
[0162] 表11 10批次无糖型气滞胃痛颗粒柠檬烯的含量测定结果
[0164] 2. 7样品含量限度
[0165] 根据以上10批样品中柠檬烯的含量测定结果，确定含量限度为：每lg无糖型气滞 胃痛颗粒含柠檬烯量应不低于0. 45yL。
[0166] 3对比实验
[0167] 分别按照对比例1和实施例2进行对比实验，实验结果如表12所示。
[0168] 表12对比例1和实施例2的分离效果的比较
[0170] 由表12可知，采用对比例1的方法，分离度小于1. 5,色谱峰对称性较差，且理论塔 板数较小，对气滞胃痛颗粒中柠檬烯的分离效果较差，从而导致不能进行含量测定。因此， 对比例1的方法并不适用于气滞胃痛颗粒中柠檬烯的含量测定。
[0171] 综上所述，本发明一种无糖型气滞胃痛颗粒中挥发性指标成分柠檬烯的质量控制 方法，通过单因素考察，得到了无糖型气滞胃痛颗粒中柠檬烯的最佳提取工艺，经方法学验 证了此方法的科学性及合理性，并对10批次的无糖型气滞胃痛颗粒中的柠檬烯含量进行 了检测，得到了其含量限度，完善了无糖型气滞胃痛颗粒的质量控制标准。该检测方法快 速、全面、针对性强，联合现有的TLC鉴别和HPLC法测定芍药苷的含量，有利于对该药物的 质量进行有效控制，有助于提高该药物使用的安全性和稳定性。
[0172] 实施例1无糖颗粒剂的制备
[0173] 【处方】柴胡36重量份、甘草20重量份、香附40重量份、延胡索40重量份、白芍48 重量份、枳壳40重量份。
[0174] 【制备方法】(1)取选定重量份的枳壳和香附，提取，得提取液A和挥发油A;所述挥 发油A中加入0 -环糊精和水，包合0. 5~4小时，得包合物A;
[0175] (2)取选定重量份的柴胡、甘草、延胡索和白芍，加水提取2次，第一次提取0.5~ 4小时，第二次提取0. 5~3小时，合并2次提取所得的提取液，得提取液B;
[0176] (3)合并上述提取液A和提取液B，浓缩至相对密度为1. 10~1. 30 (50°C测）的稠 膏，加入包合物A，混匀，加入常规辅料、按照常规工艺制成无糖型颗粒剂。
[0177] 实施例2化学键合相色谱法测定柠檬烯的含量
[0178] 本实施例化学键合相色谱法测定柠檬烯的含量包括以下步骤：
[0179] (1)取待测药物制剂2. 5g，加100%甲醇50mL，称重，超声30min，放冷，再次称重， 用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液，作为供试品溶液；
[0180] (2)取柠檬烯对照品适量，加入100%甲醇，制成每lmL甲醇含柠檬烯0. 1yL的溶 液，作为对照品溶液；
[0181] (3)色谱条件：以 250X4. 6mm，5ym的WelchUltimateLP-C18 为色谱柱，以三个 硅羟基键与一个键合相C18键合的十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以乙腈：水=70:30为 流动相，时间：30min，柱温：10-30°C，检测波长：210nm，流速为1.OmL/min;
[0182] (4)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液8yL，注入高效液相色谱仪，测定。
[0183] 实施例3化学键合相色谱法测定柠檬烯的含量
[0184] 本实施例化学键合相色谱法测定柠檬烯的含量包括以下步骤：
[0185] (1)取待测药物制剂2.Og，加30%甲醇100mL，称重，超声或加热回流60min，放冷， 再次称重，用30%甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液，作为供试品溶液；
[0186] (2)取柠檬烯对照品适量，加入30%甲醇，制成每lmL甲醇含柠檬烯0. 05yL的溶 液，作为对照品溶液；
[0187] (3)色谱条件：以150X4. 6mm，5ym的AngilentTC-C18为色谱柱，以乙腈：水 体积比为60 :40的混合溶液为流动相，时间：20min，柱温：10°C，检测波长：210nm，流速为 0. 5mL/min；
[0188] (4)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液6yL，注入高效液相色谱仪，测定。
[0189] 实施例4化学键合相色谱法测定柠檬烯的含量
[0190] 本实施例化学键合相色谱法测定柠檬烯的含量包括以下步骤：
[0191] (1)取待测药物制剂3. 0g，加100%甲醇10mL，称重，超声或加热回流lOmin，放冷， 再次称重，用100%甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液，作为供试品溶液；
[0192] (2)取柠檬烯对照品适量，加入100%甲醇，制成每lmL甲醇含柠檬烯0. 15yL的 溶液，作为对照品溶液；
[0193] (3)色谱条件：以250X4. 6mm，5ym的AngilentTC-C18为色谱柱，以乙腈：水 体积比为80 :20的混合溶液为流动相，时间：40min，柱温：30°C，检测波长：210nm，流速为 1. 5mL/min；
[0194] (4)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液10yL，注入高效液相色谱仪，测定。
[0195] 实施例5化学键合相色谱法测定柠檬烯的含量
[0196] 本实施例化学键合相色谱法测定柠檬烯的含量包括以下步骤：
[0197] (1)取待测药物制剂2. 5g，加100%甲醇50mL，称重，超声30min，放冷，再次称重， 用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液，作为供试品溶液；
[0198] (2)取柠檬烯对照品适量，加入100%甲醇，制成每lmL甲醇含柠檬烯0. 1yL的溶 液，作为对照品溶液；
[0199] (3)色谱条件：以250X4.6mm，5ym的PhenomenexlTC-C18为色谱柱，以乙腈：水 =70:30为流动相，时间：30min，柱温：10_30°C，检测波长：210nm，流速为1.OmL/min;
[0200] (4)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液8yL，注入高效液相色谱仪，测定。
[0201] 实施例6TLC法鉴别芍药苷
[0202] 本实施例TLC法鉴别芍药苷包括以下步骤：
[0203] (1)取待测药物制剂0. 5g，加乙醇10mL，振摇5分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇 lmL使溶解，作为供试品溶液；
[0204] (2)取芍药苷对照品，加乙醇制成每lmL含lmg溶液，作为对照品溶液；
[0205] (3)照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各10yL，分别点于同一硅 胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸40 :5 :10 :0. 2为展开剂，展开，取出， 晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰，进行鉴别。
[0206] 实施例7HPLC法测宙芍药苷的含量
[0207] 本实施例HPLC法测定芍药苷的含量包括以下步骤：
[0208] (1)取待测药物制剂0.lg，精密称定，置50mL量瓶中，加稀乙醇35mL，超声处理30 分钟，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
[0209] (2)取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lmL含60yg的溶液，作为对照 品溶液；
[0210] (3)照高效液相色谱法试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0. 1% 磷酸溶液14 :86为流动相，检测波长为230nm，理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000 ;
[0211] (4)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10yL，注入液相色谱仪，测定。
[0212] 对比例1化学键合相色谱法测定柠檬烯的含量
[0213] 本实施例化学键合相色谱法测定柠檬烯的含量与实施例2化学键合相色 谱法测定柠檬烯的含量的各步骤的操作参数均相同，区别仅在于：色谱条件：以0DS C18(4.6_X250mm，5ym)为色谱柱，以无水甲醇：水=75:25(V:V)为流动相，时间：30min， 柱温：25°C，检测波长：200nm，流速为1.OmL/min，进样量为10yL。
[0214]显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对 于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或 变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或 变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
【主权项】
1. 一种治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法，其特征在于，所述药物制剂的原料药组 成为：柴胡、甘草、香附、延胡索、白芍、枳壳； 该检测方法包括如下对柠檬烯的含量测定步骤： (1) 取待测药物制剂2.O~3.Og，加30%~100%甲醇10~lOOmL，称重，超声或加热 回流10~60min，放冷，再次称重，用30%~100%甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤 液，作为供试品溶液； (2) 取柠檬烯对照品适量，加入30%~100%甲醇，制成每ImL甲醇含柠檬烯0.05~ 0. 15yL的溶液，作为对照品溶液； (3) 色谱条件：以C18为色谱柱，以化学键合相为固定相，以乙腈：水体积比为60~80 : 40~20的混合溶液为流动相，时间：20~40min，柱温：10~30°C，检测波长：210nm，流速 为 0? 5~L5mT,/min； (4) 分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液6~IOyL，注入高效液相色谱仪，测定。2. 根据权利要求1所述的治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法，其特征在于，所述对 柠檬烯的含量测定步骤为： (1)取待测药物制剂2. 5g，加100%甲醇50mL，称重，超声30min，放冷，再次称重，用甲 醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液，作为供试品溶液； ⑵取柠檬烯对照品适量，加入100%甲醇，制成每ImL甲醇含柠檬烯0.IyL的溶液， 作为对照品溶液； (3) 色谱条件：以C18为色谱柱，以非极性键合相为固定相，以乙腈：水=70:30为流动 相，时间：30min，柱温：10-30°C，检测波长：210nm，流速为I.OmL/min; (4) 分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液8yL，注入高效液相色谱仪，测定。3. 根据权利要求1或2所述的治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法，其特征在于，以硅 碳型键合相为固定相。4. 根据权利要求3所述的治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法，其特征在于，以三个 硅羟基键与一个键合相C18键合的十八烷基硅烷键合硅胶为固定相。5. 根据权利要求1-4任一项所述的治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法，其特征在 于，所述药物制剂的原料药组成为： 柴胡30~100重量份、甘草15~60重量份、香附35~120重量份、 延胡索35~120重量份、白芍40~150重量份、枳壳35~120重量份。6. 根据权利要求5所述的治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法，其特征在于，所述药 物制剂的原料药组成为： 柴胡36重量份、甘草20重量份、香附40重量份、 延胡索40重量份、白苟48重量份、枳壳40重量份；或者 柴胡80重量份、甘草40重量份、香附90重量份、 延胡索90重量份、白苟120重量份、枳壳90重量份；或者 柴胡70重量份、甘草60重量份、香附120重量份、 延胡索80重量份、白苟150重量份、枳壳100重量份；或者 柴胡90重量份、甘草50重量份、香附45重量份、 延胡索100重量份、白苟120重量份、枳壳40重量份；或者 柴胡50重量份、甘草40重量份、香附100重量份、 延胡索40重量份、白苟70重量份、枳壳50重量份。7. 根据权利要求1-6任一项所述的治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法，其特征在 于，所述药物制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、 口服液体制剂或注射制剂。8. 根据权利要求7所述的治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法，其特征在于，所述药 物制剂由以下方法制备： (1) 取选定重量份的枳壳和香附，提取，得提取液A和挥发油A; (2) 取选定重量份的柴胡、甘草、延胡索和白芍，加水提取2次，第一次提取0. 5~4小 时，第二次提取0. 5~3小时，合并2次提取所得的提取液，得提取液B; (3) 合并上述提取液A和提取液B，浓缩至相对密度为1. 10~1. 30的稠膏，加入挥发 油A，混匀，加入常规辅料、按照常规工艺制成临床可接受的剂型。9. 根据权利要求1-8任一项所述的治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法，其特征在 于，所述药物制剂为无糖型颗粒剂。10. 根据权利要求9所述的治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法，其特征在于，所述无 糖型颗粒剂由以下方法制备： (1) 取选定重量份的枳壳和香附，提取，得提取液A和挥发油A;所述挥发油A中加入 0-环糊精和水，包合0. 5~4小时，得包合物A; (2) 取选定重量份的柴胡、甘草、延胡索和白芍，加水提取2次，第一次提取0. 5~4小 时，第二次提取0. 5~3小时，合并2次提取所得的提取液，得提取液B; (3) 合并上述提取液A和提取液B，浓缩至相对密度为1. 10~1. 30的稠膏，加入包合 物A，混匀，加入常规辅料、按照常规工艺制成无糖型颗粒剂。
【专利摘要】本发明涉及一种治疗气滞胃痛的药物制剂的检测方法，包括如下对柠檬烯的含量测定步骤：(1)取待测药物制剂2.0～3.0g，加30％～100％甲醇10～100mL，称重，超声或加热回流10～60min，放冷，再次称重，用30％～100％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液，作为供试品溶液；(2)取柠檬烯对照品，加入甲醇，制成每1mL甲醇含柠檬烯0.05～0.15μL的溶液，作为对照品溶液；(3)色谱条件：以C18为色谱柱，以化学键合相为固定相，乙腈：水体积比为60～80：40～20的混合溶液为流动相，时间：20～40min，柱温：10～30℃，检测波长：210nm，流速0.5～1.5mL/min；(4)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液6～10μL，注入高效液相色谱仪，测定。该检测方法快速、全面、针对性强，有利于对该药物的质量进行有效控制，有助于提高使用的安全性和稳定性。
【IPC分类】G01N30/90, G01N30/88
【公开号】CN104897837
【申请号】CN201510312537
【发明人】孟宪生, 何晓霞, 潘英, 韩凌, 张跃飞, 常馨, 包永睿, 王帅, 马鹏岗
【申请人】辽宁华润本溪三药有限公司, 本溪国家中成药工程技术研究中心有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月8日
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