一种强极性有机酸碱混合物的同时提取分离分析方法
一种强极性有机酸碱混合物的同时提取分离分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种水样中强极性有机酸碱混合物的同时提取分离分析方法，具体涉 及动态改性固相萃取结合离子对高效液相色谱法用于环境水样中多种强极性离子型药物 中间体的同时提取分离分析方法。
【背景技术】
[0002] 在化学药物合成反应监测、环境污染监测、兽药残留分析及体内药物分析中，多种 极性药物尤其是强极性离子型混合物的同时提取及分离分析是其中重要的步骤。环境样品 或生物样品中的非极性和弱极性化合物的提取和分离采用通常的液液萃取或固相萃取结 合反相液相色谱法，可以有效的分离和分析。然而，在实际工作中，有时需要对样品中一些 强极性的酸性、碱性和/或两性有机化合物的混合物进行同时提取和分析，由于其药物本 身的极性和酸碱性、溶剂的极性和溶解性、样品基体干扰等诸多因素的影响，难以对这些化 合物同时萃取和分析。在一些样品中，有机酸或有机碱也可以分别采取相应的阴离子或阳 离子交换树脂提取，而强极性的有机酸、有机碱和/或两性化合物的同时提取难以用普通 的液液萃取和固相萃取来解决。比如，阳离子交换树脂可以萃取碱性药物，但是不能同时萃 取酸性药物或其它弱极性、非极性药物。
[0003] |3 -内酰胺类抗生素（|3-lactamantibiotics)是指化学结构中含有|3 -内酰胺 环的一类抗生素，主要为青霉素类和头孢菌素类，由于该类抗生素作用强、毒性低、抗菌谱 广，因而应用十分广泛。在合成阿莫西林等内酰胺类抗生素时，反应体系中先后要用到 对羟基苯甘氨酸（p-HPG)、对羟基苯海因（p-HPH)和6-氨基青霉烷酸（6-APA)等中间体，随 着工艺的不同，有的反应系统中还存在少量苯乙酸（PAA)。因此在抗生素实际生产过程中， 工厂废水排放中可能会存在这些中间体的一种或数种，在对工厂周边环境水样进行监测分 析中，需要一种能同时提取和分析这些中间体的方法。由于p-HPH，p-HPG，6-APA和PAA均 属于强极性离子化合物，而且P-HPG和6-APA为强极性两性化合物，p-HPH和PAA为强极性 酸性化合物，在环境水样中的这些药物的同时提取很困难。目前对这类强极性有机酸碱一 般采用单独提取和分析的方法，费时费力。此外，在常规反相液相色谱分析中，P-HPH，p-HPG 和6-APA的保留时间很短，很难与其它杂质有效分离。这些情况表明，需要开发有效的样品 前处理方法和液相色谱分离方法来用于这些强极性有机酸碱混合物的同时提取和分析。
[0004] 这项研宄的目的是建立一种适合环境水样中0 _内酰胺类药物多种强极性中间 体的同时提取分析方法。
[0005] 技术内容
[0006] 为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种强极性有机酸碱混合物的同时 提取和分析方法。
[0007] 为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
[0008] -种强极性有机酸碱混合物的同时提取和分析方法，其特征在于：采用表面活性 剂动态改性0DS固相萃取柱与离子对色谱法联合使用；所述表面活性剂动态改性0DS固相 萃取柱由以下步骤制备：
[0009] 依次用甲醇、磷酸溶液活化0DS固相萃取柱后，上样适量表面活性剂SDS，对0DS固 相萃取柱进行动态改性，使萃取柱吸附上饱和的SDS。
[0010] 为了增加0DS固相萃取柱的活化效果，上述磷酸溶液优选体积百分浓度为0. 05% 磷酸溶液。
[0011] 为了进一步增加萃取柱上SDS的吸附效果，优选表面活性剂SDS的浓度为20mmol/ L〇
[0012] 表面活性剂SDS的用量由本领域技术人员根据实际情况确定。
[0013] 上述SDS改性固相萃取方法适用于p-HPG，6-APA和PAA的有机酸碱混合物的同时 提取分析。
[0014] 所述的离子对色谱法包括以下内容：以0DS硅胶柱为液相色谱固定相，庚烷磺酸 钠与磷酸的水溶液与甲醇组成的混合溶液为流动相，采用225nm波长检测。为了增强分离 效果，采用梯度洗脱分离。
[0015] 庚烷磺酸钠的浓度，磷酸溶液的pH值，甲醇的初始比例，以及梯度洗脱时间，由本 领域技术人员依具体情况确定。
[0016] 上述离子对色谱法，适用于含p-HPH，p-HPG，6-APA和PAA的有机酸碱混合物的同 时分尚分析。
[0017] 具体的说，
[0018] -种强极性有机酸碱混合物的同时提取和分析方法，用于同时分析p_HPH，p-HPG， 6-APA和PAA，或同时提取分析p-HPG，6-APA和PAA，其特征在于：采用表面活性剂动态改性 0DS固相萃取柱与离子对色谱法联合使用；所述表面活性剂动态改性0DS固相萃取柱由以 下步骤制备：
[0019] 依次用甲醇、0. 05%磷酸溶液活化0DS固相萃取柱后，上样适量20mmol/L的表面 活性剂SDS，对0DS固相萃取柱进行动态改性，使萃取柱吸附上饱和的SDS。
[0020] 进一步，
[0021] -种强极性有机酸碱混合物的同时提取分析方法，用于同时分析p-HPH，p-HPG， 6-APA和PAA，或同时提取分析p-HPG，6-APA和PAA，其特征在于，采用以下步骤：
[0022] (1)表面活性剂动态改性0DS固相萃取柱的制备，
[0023] 依次以甲醇、0. 05%磷酸溶液活化0DS固相萃取柱，然后上样20mmol/L的表面活 性剂SDS适量，对0DS固相萃取柱进行动态改性，使萃取柱充分吸附上SDS。
[0024] (2)供试品的制备，
[0025] 精密称取p-HPH标准品、6-APA标准品、PAA标准品和精密吸取p-HPG标准品适量， 用水稀释制得适当浓度的P-HPH、p-HPG、6-APA和PAA的混合溶液，调节pH后，将制得的混 合溶液经步骤（1)制得的动态改性固相萃取柱萃取，得到用于色谱分析的供试品溶液。
[0026] (3)采用离子对色谱法分离检测，
[0027] 用具有DAD或UV检测器的高效液相色谱仪，采用C18色谱柱，以含适当浓度的庚烷 磺酸钠溶液与甲醇的混合溶液为流动相，以磷酸调节PH，检测波长为225nm;精密吸取供试 品溶液，注入液相色谱仪中，进行分析测定。
[0028] 同时为拓展本方法应用范围，将标准品储备液用环境水样来稀释适当倍数，得到 混合样品溶液，经与上述相同方法萃取，得到用于色谱分析的供试品溶液。
[0029] 更具体的说，
[0030] -种强极性有机酸碱混合物的同时提取分析方法，用于同时分析p-HPH，p-HPG， 6-APA和PAA，或同时提取分析p-HPG，6-APA和PAA，其特征在于，采用以下步骤：
[0031] (1)表面活性剂动态改性0DS固相萃取柱的制备，
[0032] 依次以90%甲醇水溶液、0. 05%磷酸溶液活化0DS固相萃取柱，上样20mmol/L的 表面活性剂SDS溶液，对固相萃取柱进行动态改性，使萃取柱充分吸附SDS，再用0. 05%磷 酸溶液冲洗萃取柱；
[0033] (2)供试品的制备，
[0034] 精密称取p-HPH标准品、6-APA标准品、PAA标准品和精密吸取p-HPG标准品适量， 加 0? 05%磷酸溶液稀释制得浓度分别为p-HPH0-0? 40mg/mL、p-HPG0-0? 2mg/mL、6-APA 0-1. 00mg/mL和PAA0-1. 00mg/mL的混合溶液，将制得的混合溶液经步骤⑴制得的动态改 性固相萃取柱萃取，先用〇. 05%磷酸溶液清洗，再以5%的氨水/甲醇溶液淋洗，弃掉洗脱 液最初的〇.lml，收集氨水甲醇洗脱液的第0. 2-0. 3mL区间的洗脱液共0. 2ml，队吹干后用 0. 05 %磷酸溶液溶解，得到用于色谱分析的供试品溶液。
[0035] (3)采用离子对色谱法分离检测，
[0036] 用具有DAD检测器的高效液相色谱仪，以XDB-C18色谱柱为固定相，以含5_〇1/ L庚烷磺酸钠的0. 05%磷酸溶液与甲醇以适当比例形成的混合溶剂为流动相，其pH为2. 5 左右，精密吸取供试品溶液，注入液相色谱仪中，流速为lmL/min，柱温为20°C，进样量为 20uL，采用梯度洗脱进行分离，检测波长为225nm。
[0037] 上述梯度洗脱方式优先为从0-8min，流动相中甲醇比例由20%线性上升至60% (v/v)，并维持 4min。
[0038] 同时为拓展本方法应用范围，将标准品储备液用环境水样或某药厂排污口下游约 lkm处长江水来稀释适当倍数，用磷酸调节pH至2. 5左右，过滤后得到混合样品溶液，经与 上述相同方法萃取，得到用于色谱分析的供试品溶液。
[0039] 分析过程中，所述百分比为体积百分比，样品配制的浓度、样品稀释情况均由本领 域普通技术人员根据试验需要确定。
[0040] 本发明的有益效果有：
[0041] 1.本发明提供了一种适合多种强极性有机酸碱混合物的分离分析的离子对色谱 法，该方法可用于P-HPH，P-HPG，6-APA和PAA的同时分离分析，该方法专属性较高，线性关 系良好，分离度高，重现性好，适合强极性的两性药物与酸性药物混合物的同时分离分析。 目前尚未见到采用这种基于庚烷磺酸钠的离子色谱法用于这些混合物同时分离分析的报 道。
[0042] 2.本发明提供了一种在普通0DS填料上吸附SDS的动态改性固相萃取方法，兼具 静电作用和疏水作用，可用于水样及药厂排污水中强极性有机酸碱药物、两性药物和弱极 性药物的同时提取分析，在用于P-HPG，6-APA和PAA的同时提取分析上效果良好，结合离子 对色谱法，适用于抗生素药厂周边环境水样监测分析、药物合成反应监控以及体内药物分 析。目前尚未见到采用这种基于SDS改性的固相萃取法用于这些有机酸碱混合物同时提取 分析的报道。
[0043] 3.本发明对0 -内酰胺类抗生素中间体p-HPH，p-HPG，6-APA和PAA进行同时提取 分析，对四种中间体的分离度较好，互相之间没有明显干扰，对其中P-HPG，6-APA和PAA三 种中间体的同时萃取效果较好，有明显的富集作用。
[0044] 4.本发明用于某药厂下游的环境水样检测，p-HPG，6_APA，PAA的检出限分别为 0? 04、0. 14、0. 25yg/mL(S/N彡 3)，对p-HPG，6-APA，PAA的富集倍数在 33-48 倍之间。
【附图说明】
[0045] 图1SDS动态改性固相萃取柱吸附容量测试图
[0046] 图2SDS动态改性固相萃取柱考察了pH对萃取的影响
[0047] 图3SDS动态改性固相萃取柱考察了溶液中含盐量对萃取的影响
[0048] 图4SDS动态改性固相萃取柱考察了溶液中乙腈含量对萃取的影响
[0049] 图5改性0DS-SPE柱与0DS-SPE及MCX萃取柱萃取效果对比图
[0050] 图6改性0DS-SPE柱用于储备液的萃取图谱
[0051] 图7样品专属性考察高效液相色谱图，从上到下依次为空白江水、标准品及江水 加标样品经萃取后的HPLC谱图
[0052] 图8掺有药物的江水与空白江水的萃取后分离对比图
【具体实施方式】
[0053] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明的技术方案作进一步详细说明。
[0054] 主要仪器：
[0055] Agilent1200高效液相色谱仪（配DAD检测器，美国安捷伦科技有限公司），电子 天平（德国Sartorius工业），pH计（瑞士梅特勒-托利多国际股份有限公司），Milli-Q A10超纯水系统（美国Millipore公司）。
[0056] 试剂均为市售产品，主要试剂为：
[0057] 对羟基苯海因标准品（纯度> 99. 5%，珠海联邦制药股份有限公司）；对羟基苯 甘氨酸标准品（北京百灵威科技有限公司）；6_氨基青霉烷酸标准品（珠海联邦制药股份 有限公司）；苯乙酸标准品（南京森贝伽生物科技有限公司）；1_庚烷磺酸钠（国药集团化 学试剂有限公司）；甲醇（美国TEDIA天地试剂公司）；乙腈（美国TEDIA天地试剂公司）； 水为去离子水；0DS萃取柱（100mg/只，天津天毫公司）；MCX萃取柱（60mg/只，天津天毫公 司
[0058] 实施例1
[0059] 1储备液及流动相的配制
[0060] 1. 1标准品溶液的配制
[0061] 精密称取对羟基苯海因标准品0. 2000g，用0. 05%H3P04水溶液溶解并定容至 100mL，制得浓度为2. 00mg/mL的p-HPH标准品储备液。
[0062] 精密称取对羟基苯甘氨酸标准品0. 1000g，用0. 05%H3P04水溶液溶解并定容至 100mL，制得浓度为1. 00mg/mL的D-HPG标准品储备液。
[0063] 精密称取6-APA标准品0? 4000g，用0? 05 %H3P04水溶液溶解并定容至100mL，制 得浓度为4. 00mg/mL的6-APA标准品储备液。
[0064] 精密称取苯乙酸标准品0. 4000g，用0. 05%H3P04水溶液溶解并定容至lOOmL(本 领域普通技术人员可根据实际需要加少量甲醇助溶），制得浓度为4. 00mg/mL的PAA标准品 储备液。
[0065] 另外，取上述各溶液适量，用0. 05 %H3P04水溶液稀释制得浓度分别为p-HPH， p_HPG，6_APA和PAA分别为 0. 40mg/mL、0. 04mg/mL、l. 00mg/mL和 1. 00mg/mL的四种标准品 混合溶液；或，p-HPG，6-APA和PAA分别为0? 2mg/mL、1. 00mg/mL和1. 00mg/mL的三种标准 品混合溶液，常温放置，隔天新配，待用。
[0066] 上述各溶液根据需要用0. 05%H3P04水溶液溶稀释成适当浓度。
[0067] 1.2流动相的配制
[0068] 精密称量0. 5075gl-庚烷磺酸钠，溶于500mL0. 05%H3P(VK溶液中，制得5mmol/ L的庚烷磺酸钠溶液，测得pH= 2. 5。
[0069] 2离子对液相色谱条件
[0070]Agilent1200高效液相色谱仪（配有DAD检测器）
[0071] 色谱柱：AgilentEclipseXDB-C18 (250*4. 6mm，5ym)
[0072] 流动相：A(0. 05%磷酸溶液含5mmol/L庚烷磺酸钠，pH= 2. 5)和B(MeOH)的初始 比例为80/20 (v/v)，梯度洗脱
[0073] 流速：lmL/min
[0074] 波长：225nm
[0075] 柱温：2(TC
[0076] 进样量：20uL
[0077] 表2. 1流动相梯度洗脱程序
[0079] 3样品萃取
[0080] 3. 1萃取样品的配制
[0081] 精密吸取配制好的混合标准品溶液（P-HPH，P-HPG，6-APA和PAA分别为0. 40mg/ mL、0. 04g/mL、l. 00mg/mL和 1. 00mg/mL)，用 0. 05%H3P04水溶液稀释 50 倍，吸取 5ml上样 萃取；或用已经用磷酸调节至PH2. 5的某药厂排污口下游约lkm处江水稀释50倍，涡旋混 勾2min，继续祸旋混勾2min，7500r/min离心5min取上清液，然后吸取5ml上样萃取。
[0082] 3. 2 0DS萃取柱改性
[0083] 依次用5mL甲醇、2mL0. 05%磷酸溶液活化0DS固相萃取小柱，上样5mL20mmol/L 的表面活性剂SDS，对0DS固相萃取柱进行动态改性，使其保证萃取柱上已充分吸附上饱和 的SDS，再用0. 3mL0. 05%磷酸溶液冲洗未吸附上的SDS。
[0084] 3. 3样品前处理
[0085] 取5mL经稀释50倍的储备液或江水经动态改性固相萃取柱萃取，再依次用0. 5mL 0. 05%磷酸溶液、lmL5%氨水/甲醇溶液淋洗，收集氨水甲醇洗脱液第0. 2-0. 3mL区间的 洗脱液共0. 2ml，队吹干后用0.lmL0. 05 %磷酸溶液溶解，进行HPLC检测。
[0086] 实施例中一些重要影响因素的考察 [0087](一）吸附容量测试
[0088] 0DS-SPE柱萃取的原理主要是基于疏水作用。将具有强离子型基团和长链烷基疏 水基团的表面活性剂SDS固载于SPE柱中0DS固定相材料的表面，这样就可以得到SPE柱 兼具离子交换与疏水作用的混合型固定相的特性。本项目中表面活性剂SDS是动态吸附于 0DS填料表面，这种吸附量会随着被萃取水溶液样品体积的增加而有一定的流失。在本实验 中，采用的萃取柱是含l〇〇mg0DS填料的固相萃取柱，发明人采用的是20mmol/LSDS溶液， 上样量为20mL，这样能够确保萃取柱上吸附的SDS量达到饱和。
[0089] 发明人考察了四种药物在改性萃取柱上饱和吸附量。数据见图1。从图中可以 发现，对羟基苯甘氨酸和6-氨基青霉烷酸在改性萃取柱上的吸附容量非常大，这说明在 PH2. 5左右，由于这两种两性药物表现为带净的正电荷，在萃取中静电引力占主导，吸附量 很大。
[0090] 由于萃取容量实验中，样品浓度很高，上样量在2_8mL时，对羟基苯甘氨酸、6-氨 基青霉烷酸和苯乙酸才达到饱和，在后续萃取中，样品浓度很低，故样品上样量优选为5mL。 [0091](二）不同表面活性剂对萃取的影响
[0092] 发明人选择经SDS动态吸附改性的0DS-SPE柱用于对羟基苯海因、对羟基苯甘氨 酸、6-氨基青霉烷酸、苯乙酸这样一些极性药物的萃取。虽然，CTAB(溴化十六烷基三甲基 铵）可能更适合于酸性药物如对羟基苯海因、苯乙酸的萃取，但考虑到萃取与分离系统的 兼容性，以及被分析物中有的药物，如6-氨基青霉烷酸，在碱性条件下的稳定性，发明人最 终选取SDS而不是CTAB，用于这些药物的萃取。
[0093] (三）pH对萃取的影响
[0094] 发明人考察了pH对萃取的影响，数据见图2。从图中数据可见，pH从2.5_8.8,对 羟基苯海因的萃取回收率都较低，虽然在PH6. 86下未电离态占主导，与SDS之间的斥力并 不是很大，但是由于其亲水性极强，导致在SPE柱上吸附量小。对于对羟基苯甘氨酸和6-氨 基青霉烷酸，随着pH值的降低，回收率显著增加，对于这两种两性药物而言，pH值的降低， 一方面降低了羧基的离解，另一方面，增加了氨基的质子化程度，这有助于增加两性药物与 SDS之间的静电引力，提高了回收率。对于苯乙酸，其回收率随pH值升高而降低，由于其pKa 值约在4. 28左右，尽管它与SDS之间有一定的静电斥力，但是苯基的疏水性较强，仍能取得 较高的回收率。根据此实验的结果，在后面的动态改性萃取中，上样萃取溶液的pH值选择 2. 5左右为佳。
[0095](四）溶液中含盐量对萃取的影响
[0096] 溶液中含盐量对萃取的影响也进行了考察，数据见图3。从图中可见，盐量的增加， 影响较为复杂，苯乙酸的萃取量有所增加，但是对于对羟基苯甘氨酸和6-氨基青霉烷酸， 萃取量有明显的降低。这可能与疏水作用与离子交换作用对三者的不同影响有关。为降低 样品基体中盐分对萃取效率的影响，将含盐分较高的样品建议稀释一定倍数后用于萃取。
[0097] (五）溶液中乙腈含量对萃取的影响
[0098] 溶液中乙腈含量对萃取的影响也进行了考察，数据见图4。从图中可见，乙腈从 0%增加到20%，对对羟基苯甘氨酸、6-氨基青霉烷酸、对羟基苯海因的萃取影响较小， 但 是，苯乙酸的萃取量有较明显的减少。这也证实了，苯乙酸的萃取中，疏水作用占主导；而对 另外两性药物，静电引力占主导，疏水作用占次要作用，故萃取受到的影响较小。
[0099](六）上样和洗脱条件考察
[0100] 从以上各种影响萃取效果的因素进行考察后，选择样品上样溶液条件为：PH2. 5。 若将本方法用于生物体液的萃取，并采用乙腈除蛋白，建议上样萃取前，对样品根据实验需 要进行适当稀释，控制稀释后样品中乙腈浓度不超过10% (v/v)。
[0101] 本实验中采取的是100mg规格的小型萃取柱，上完样后，先选用0. 3mL0. 05%磷 酸水溶液清洗后，再用洗脱液洗脱，对比1.OmL5 %氨水甲醇溶液和1.OmL5 %氨水洗脱溶 液，发觉两者均能在〇.3ml内将目标物完全洗脱。在后面样品的萃取洗脱中，为了便于快速 浓缩，收集氨水甲醇作为洗脱液洗脱出的〇. 2-0. 3mL区间收集起来，浓缩至0.lml后进样。
[0102] (七）改性柱与0DS-SPE及MCX萃取柱进行比较
[0103] 发明人把本萃取方法与其他几种传统萃取柱进行了对比（萃取条件相同）。从图 5可以看出，传统0DS-SPE柱对对羟基苯海因、对羟基苯甘氨酸、6-氨基青霉烷酸的萃取效 果很差，但对苯乙酸的萃取效果很好。而MCX混合离子交换柱对对羟基苯甘氨酸、6-氨基青 霉烷酸和苯乙酸的萃取效果均不理想。本实验建立的SDS改性0DS-SPE柱对对羟基苯甘氨 酸、6-氨基青霉烷酸和苯乙酸的萃取效果均优于0DS-SPE柱和MCX柱。
[0104] (八）改性0DS-SPE柱用于储备液的萃取
[0105] 将储备液稀释50倍后萃取，从图6看出，采用前面优化后的条件对几种药物进行 萃取，除对羟基苯海因萃取不理想外，其余几种药物均有明显的富集作用。
[0106] 4方法学考察
[0107] 4. 1方法的专属性
[0108] 在本实验的离子对色谱条件下，p-HPH，p-HPG，6-APA，PAA四种中间体有较大色谱 峰，空白基质中无严重干扰（图7)，且分离度及峰型良好，该方法专属性较高。在此条件下 所测得的结果能代表待测成分浓度。
[0109] 4. 2标准曲线的制备
[0110] 配制含不同浓度P-HPH，p-HPG，6-APA和PAA的系列样品，采用离子对色谱法分离， 记录色谱图，以浓度C(yg/mL)为横坐标（X)，峰面积A为纵坐标（y)进行线性回归分析得 到各药物的标准曲线。
[0111] 由于p-HPH的萃取效果不理想，后面只测定了p-HPG，6-APA和PAA三种物质，对 p-HPG，6-APA和PAA的标准曲线和线性范围，见表2。
[0112] 表2 0-内酰胺类抗生素3种中间体的线性回归方程、相关系数、线性范围
[0113]
[0114] 4. 3分析样品的稳定性
[0115] 取标准混合储备液，按优化后的离子对色谱法分析，分别于0、1、2、4、12、24小时 取样进行HPLC分析。统计p-HPG，6-APA，PAA的峰面积，算得相对标准偏差RSD均< 8. 1 %， 而以保留时间计算的RSD均小于2. 3%。表明该方法对标准品混合液在24h内测得结果稳 定性良好。
[0116] 4.4分析方法的回收率及精密度
[0117] 分别配制三个浓度水平的混合标准品溶液（p-HPG:0. 2、0. 8、4. 0yg/mL，6-APA: 1. 0、4. 0、20. 0yg/mL，PAA:1. 0、4. 0、20. 0yg/mL)，每个浓度平行分析 5 次，改性柱萃取 后经HPLC分析，计算得到回收率和相对标准偏差（RSD)。3种中间体的平均回收率均在 69. 0% -97. 8%之间，相对标准偏差小于11. 5%，符合方法学验证要求，结果见表3。
[0118] 表3 3种中间体物质的平均回收率和相对标准偏差
[0120] 5改性0DS-SPE柱在某药厂排污管道下游1km处长江水萃取中的应用
[0121] 发明人将上述样品掺入某药厂排污管道下游1km处长江水，涡旋混匀2min，加磷 酸调节pH至2. 5,离心后取上清液萃取。
[0122] 经离子对色谱法进样分析得到的图谱，如图8。在该方法中，p-HPG，6-APA，PAA的 检出限分别为0. 04、0. 14、0. 25yg/mL(S/N彡3)。以掺入江水中药物浓度分别为0. 8yg/ mL(p-HPG)，4. 0yg/mL(6-APA)，4. 0yg/mL(PAA)的样品为考察对象，计算的回收率分别为 p-HPG，96. 7% ;6-APA，87. 3% ;PAA，67. 4%。连续萃取分析，经计算，各药物的RSD(peak area，n= 3)分别为p-HPG，7. 9%;6-APA，6. 1%;PAA，5. 8%。相比未萃取的水液中有关药物 的直接分析，本发明对P-HPG，6-APA，PAA的富集效果是很明显的，富集倍数分别达到33-48 倍之间，这表明本发明对强极性两性药物和酸性药物的同时提取是有效的。
【主权项】
1. 一种强极性有机酸碱混合物的同时提取和分析方法，其特征在于：采用表面活性剂 动态改性ODS固相萃取柱与离子对色谱法联合使用；所述表面活性剂动态改性ODS固相萃 取柱由以下步骤制备： 依次用甲醇、磷酸溶液活化ODS固相萃取柱后，上样适量表面活性剂SDS，对ODS固相萃 取柱进行动态改性，使萃取柱吸附上饱和的SDS。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述磷酸溶液为0. 05%磷酸溶液，以体积百 分比计。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述表面活性剂SDS的浓度为20mmol/L。4. 一种强极性有机酸碱混合物的同时提取和分析方法，用于同时分析p-HPH，p-HPG， 6-APA和PAA，或同时提取分析p-HPG，6-APA和PAA，其特征在于：采用表面活性剂动态改性 ODS固相萃取柱与离子对色谱法联合使用；所述表面活性剂动态改性ODS固相萃取柱由以 下步骤制备： 依次用甲醇、〇. 05%磷酸溶液活化ODS固相萃取柱后，上样适量20mmol/L的表面活性剂SDS，对ODS固相萃取柱进行动态改性，使萃取柱吸附上饱和的SDS。5. 如权利要求4所述的方法，用于同时分析p-HPH，p-HPG，6-APA和PAA，或同时提取分 析p-HPG，6-APA和PAA，其特征在于，采用以下步骤： (1) 表面活性剂动态改性ODS固相萃取柱的制备， 依次以甲醇、〇. 05%磷酸溶液活化ODS固相萃取柱，然后上样20mmol/L的表面活性剂SDS适量，对ODS固相萃取柱进行动态改性，使萃取柱充分吸附上SDS; (2) 供试品的制备， 精密称取P-HPH标准品、6-APA标准品、PAA标准品和精密吸取p-HPG标准品适量，用 水稀释制得适当浓度的P-HPH、p-HPG、6-APA和PAA的混合溶液，调节pH后，将制得的混合 溶液经步骤（1)制得的动态改性固相萃取柱萃取，得到用于色谱分析的供试品溶液； (3) 采用离子对色谱法分离检测， 用具有DAD或UV检测器的高效液相色谱仪，采用C18色谱柱，以含适当浓度的庚烷磺 酸钠溶液与甲醇的混合溶液为流动相，以磷酸调节PH，检测波长为225nm;精密吸取供试品 溶液，注入液相色谱仪中，进行分析测定。6. 如权利要求5所述的方法，用于同时分析p-HPH，p-HPG，6-APA和PAA，或同时提取分 析p-HPG，6-APA和PAA，其特征在于，采用以下步骤： (1) 表面活性剂动态改性ODS固相萃取柱的制备， 依次以90%甲醇水溶液、0. 05%磷酸溶液活化ODS固相萃取柱，上样20mmol/L的表面活 性剂SDS溶液，对ODS固相萃取柱进行动态改性，使萃取柱充分吸附SDS，再用0. 05%磷酸 溶液冲洗萃取柱； (2) 供试品的制备， 精密称取P-HPH标准品、6-APA标准品、PAA标准品和精密吸取p-HPG标准品适量，加 0.05% 磷酸溶液稀释制得浓度分别为p-HPH0.40mg/mL、p-HPG0.2mg/mL、6-APALOOmg/mL和PAAI.OOmg/mL的混合溶液，将制得的混合溶液经步骤（1)制得的动态改性固相萃 取柱萃取，先用0. 05%磷酸溶液清洗，再以5%的氨水/甲醇溶液淋洗，弃掉洗脱液最初的 0.lml，收集氨水甲醇洗脱液的第0. 2-0. 3mL区间的洗脱液共0. 2ml，N2吹干后用0. 05%磷 酸溶液溶解，得到用于色谱分析的供试品溶液； (3)采用离子对色谱法分离检测， 用具有DAD检测器的高效液相色谱仪，以XDB-C18为色谱柱，以含5mmol/L庚烷磺酸钠 的0. 05%磷酸溶液与甲醇以适当比例形成的混合溶剂为流动相，其pH为2. 5左右，精密吸 取供试品溶液，注入液相色谱仪中，流速为lmL/min，柱温为20°C，进样量为20uL，采用梯度 洗脱进行分离，检测波长为225nm。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述梯度洗脱方式为从0-8min，流动相中甲 醇比例由20%线性上升至60% (v/v)，并维持4min。
【专利摘要】本发明提供了一种强极性有机酸碱混合物的同时提取及分离分析方法，采用表面活性剂动态改性ODS固相萃取柱与离子对色谱法结合使用，该方法专属性较高，线性关系良好，尤其对强极性的两性药物和酸性药物富集分离效果较好，可以用于强极性离子型药物混合物的同时萃取及分离分析，适用于药厂周边环境水样中有关物质的监测分析。
【IPC分类】G01N30/88, G01N30/34, G01N30/06
【公开号】CN104897838
【申请号】CN201510315751
【发明人】胡继伟, 梁天娇, 张琳
【申请人】重庆医科大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月10日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种水样中强极性有机酸碱混合物的同时提取分离分析方法，具体涉 及动态改性固相萃取结合离子对高效液相色谱法用于环境水样中多种强极性离子型药物 中间体的同时提取分离分析方法。
【背景技术】
[0002] 在化学药物合成反应监测、环境污染监测、兽药残留分析及体内药物分析中，多种 极性药物尤其是强极性离子型混合物的同时提取及分离分析是其中重要的步骤。环境样品 或生物样品中的非极性和弱极性化合物的提取和分离采用通常的液液萃取或固相萃取结 合反相液相色谱法，可以有效的分离和分析。然而，在实际工作中，有时需要对样品中一些 强极性的酸性、碱性和/或两性有机化合物的混合物进行同时提取和分析，由于其药物本 身的极性和酸碱性、溶剂的极性和溶解性、样品基体干扰等诸多因素的影响，难以对这些化 合物同时萃取和分析。在一些样品中，有机酸或有机碱也可以分别采取相应的阴离子或阳 离子交换树脂提取，而强极性的有机酸、有机碱和/或两性化合物的同时提取难以用普通 的液液萃取和固相萃取来解决。比如，阳离子交换树脂可以萃取碱性药物，但是不能同时萃 取酸性药物或其它弱极性、非极性药物。
[0003] |3 -内酰胺类抗生素（|3-lactamantibiotics)是指化学结构中含有|3 -内酰胺 环的一类抗生素，主要为青霉素类和头孢菌素类，由于该类抗生素作用强、毒性低、抗菌谱 广，因而应用十分广泛。在合成阿莫西林等内酰胺类抗生素时，反应体系中先后要用到 对羟基苯甘氨酸（p-HPG)、对羟基苯海因（p-HPH)和6-氨基青霉烷酸（6-APA)等中间体，随 着工艺的不同，有的反应系统中还存在少量苯乙酸（PAA)。因此在抗生素实际生产过程中， 工厂废水排放中可能会存在这些中间体的一种或数种，在对工厂周边环境水样进行监测分 析中，需要一种能同时提取和分析这些中间体的方法。由于p-HPH，p-HPG，6-APA和PAA均 属于强极性离子化合物，而且P-HPG和6-APA为强极性两性化合物，p-HPH和PAA为强极性 酸性化合物，在环境水样中的这些药物的同时提取很困难。目前对这类强极性有机酸碱一 般采用单独提取和分析的方法，费时费力。此外，在常规反相液相色谱分析中，P-HPH，p-HPG 和6-APA的保留时间很短，很难与其它杂质有效分离。这些情况表明，需要开发有效的样品 前处理方法和液相色谱分离方法来用于这些强极性有机酸碱混合物的同时提取和分析。
[0004] 这项研宄的目的是建立一种适合环境水样中0 _内酰胺类药物多种强极性中间 体的同时提取分析方法。
[0005] 技术内容
[0006] 为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种强极性有机酸碱混合物的同时 提取和分析方法。
[0007] 为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
[0008] -种强极性有机酸碱混合物的同时提取和分析方法，其特征在于：采用表面活性 剂动态改性0DS固相萃取柱与离子对色谱法联合使用；所述表面活性剂动态改性0DS固相 萃取柱由以下步骤制备：
[0009] 依次用甲醇、磷酸溶液活化0DS固相萃取柱后，上样适量表面活性剂SDS，对0DS固 相萃取柱进行动态改性，使萃取柱吸附上饱和的SDS。
[0010] 为了增加0DS固相萃取柱的活化效果，上述磷酸溶液优选体积百分浓度为0. 05% 磷酸溶液。
[0011] 为了进一步增加萃取柱上SDS的吸附效果，优选表面活性剂SDS的浓度为20mmol/ L〇
[0012] 表面活性剂SDS的用量由本领域技术人员根据实际情况确定。
[0013] 上述SDS改性固相萃取方法适用于p-HPG，6-APA和PAA的有机酸碱混合物的同时 提取分析。
[0014] 所述的离子对色谱法包括以下内容：以0DS硅胶柱为液相色谱固定相，庚烷磺酸 钠与磷酸的水溶液与甲醇组成的混合溶液为流动相，采用225nm波长检测。为了增强分离 效果，采用梯度洗脱分离。
[0015] 庚烷磺酸钠的浓度，磷酸溶液的pH值，甲醇的初始比例，以及梯度洗脱时间，由本 领域技术人员依具体情况确定。
[0016] 上述离子对色谱法，适用于含p-HPH，p-HPG，6-APA和PAA的有机酸碱混合物的同 时分尚分析。
[0017] 具体的说，
[0018] -种强极性有机酸碱混合物的同时提取和分析方法，用于同时分析p_HPH，p-HPG， 6-APA和PAA，或同时提取分析p-HPG，6-APA和PAA，其特征在于：采用表面活性剂动态改性 0DS固相萃取柱与离子对色谱法联合使用；所述表面活性剂动态改性0DS固相萃取柱由以 下步骤制备：
[0019] 依次用甲醇、0. 05%磷酸溶液活化0DS固相萃取柱后，上样适量20mmol/L的表面 活性剂SDS，对0DS固相萃取柱进行动态改性，使萃取柱吸附上饱和的SDS。
[0020] 进一步，
[0021] -种强极性有机酸碱混合物的同时提取分析方法，用于同时分析p-HPH，p-HPG， 6-APA和PAA，或同时提取分析p-HPG，6-APA和PAA，其特征在于，采用以下步骤：
[0022] (1)表面活性剂动态改性0DS固相萃取柱的制备，
[0023] 依次以甲醇、0. 05%磷酸溶液活化0DS固相萃取柱，然后上样20mmol/L的表面活 性剂SDS适量，对0DS固相萃取柱进行动态改性，使萃取柱充分吸附上SDS。
[0024] (2)供试品的制备，
[0025] 精密称取p-HPH标准品、6-APA标准品、PAA标准品和精密吸取p-HPG标准品适量， 用水稀释制得适当浓度的P-HPH、p-HPG、6-APA和PAA的混合溶液，调节pH后，将制得的混 合溶液经步骤（1)制得的动态改性固相萃取柱萃取，得到用于色谱分析的供试品溶液。
[0026] (3)采用离子对色谱法分离检测，
[0027] 用具有DAD或UV检测器的高效液相色谱仪，采用C18色谱柱，以含适当浓度的庚烷 磺酸钠溶液与甲醇的混合溶液为流动相，以磷酸调节PH，检测波长为225nm;精密吸取供试 品溶液，注入液相色谱仪中，进行分析测定。
[0028] 同时为拓展本方法应用范围，将标准品储备液用环境水样来稀释适当倍数，得到 混合样品溶液，经与上述相同方法萃取，得到用于色谱分析的供试品溶液。
[0029] 更具体的说，
[0030] -种强极性有机酸碱混合物的同时提取分析方法，用于同时分析p-HPH，p-HPG， 6-APA和PAA，或同时提取分析p-HPG，6-APA和PAA，其特征在于，采用以下步骤：
[0031] (1)表面活性剂动态改性0DS固相萃取柱的制备，
[0032] 依次以90%甲醇水溶液、0. 05%磷酸溶液活化0DS固相萃取柱，上样20mmol/L的 表面活性剂SDS溶液，对固相萃取柱进行动态改性，使萃取柱充分吸附SDS，再用0. 05%磷 酸溶液冲洗萃取柱；
[0033] (2)供试品的制备，
[0034] 精密称取p-HPH标准品、6-APA标准品、PAA标准品和精密吸取p-HPG标准品适量， 加 0? 05%磷酸溶液稀释制得浓度分别为p-HPH0-0? 40mg/mL、p-HPG0-0? 2mg/mL、6-APA 0-1. 00mg/mL和PAA0-1. 00mg/mL的混合溶液，将制得的混合溶液经步骤⑴制得的动态改 性固相萃取柱萃取，先用〇. 05%磷酸溶液清洗，再以5%的氨水/甲醇溶液淋洗，弃掉洗脱 液最初的〇.lml，收集氨水甲醇洗脱液的第0. 2-0. 3mL区间的洗脱液共0. 2ml，队吹干后用 0. 05 %磷酸溶液溶解，得到用于色谱分析的供试品溶液。
[0035] (3)采用离子对色谱法分离检测，
[0036] 用具有DAD检测器的高效液相色谱仪，以XDB-C18色谱柱为固定相，以含5_〇1/ L庚烷磺酸钠的0. 05%磷酸溶液与甲醇以适当比例形成的混合溶剂为流动相，其pH为2. 5 左右，精密吸取供试品溶液，注入液相色谱仪中，流速为lmL/min，柱温为20°C，进样量为 20uL，采用梯度洗脱进行分离，检测波长为225nm。
[0037] 上述梯度洗脱方式优先为从0-8min，流动相中甲醇比例由20%线性上升至60% (v/v)，并维持 4min。
[0038] 同时为拓展本方法应用范围，将标准品储备液用环境水样或某药厂排污口下游约 lkm处长江水来稀释适当倍数，用磷酸调节pH至2. 5左右，过滤后得到混合样品溶液，经与 上述相同方法萃取，得到用于色谱分析的供试品溶液。
[0039] 分析过程中，所述百分比为体积百分比，样品配制的浓度、样品稀释情况均由本领 域普通技术人员根据试验需要确定。
[0040] 本发明的有益效果有：
[0041] 1.本发明提供了一种适合多种强极性有机酸碱混合物的分离分析的离子对色谱 法，该方法可用于P-HPH，P-HPG，6-APA和PAA的同时分离分析，该方法专属性较高，线性关 系良好，分离度高，重现性好，适合强极性的两性药物与酸性药物混合物的同时分离分析。 目前尚未见到采用这种基于庚烷磺酸钠的离子色谱法用于这些混合物同时分离分析的报 道。
[0042] 2.本发明提供了一种在普通0DS填料上吸附SDS的动态改性固相萃取方法，兼具 静电作用和疏水作用，可用于水样及药厂排污水中强极性有机酸碱药物、两性药物和弱极 性药物的同时提取分析，在用于P-HPG，6-APA和PAA的同时提取分析上效果良好，结合离子 对色谱法，适用于抗生素药厂周边环境水样监测分析、药物合成反应监控以及体内药物分 析。目前尚未见到采用这种基于SDS改性的固相萃取法用于这些有机酸碱混合物同时提取 分析的报道。
[0043] 3.本发明对0 -内酰胺类抗生素中间体p-HPH，p-HPG，6-APA和PAA进行同时提取 分析，对四种中间体的分离度较好，互相之间没有明显干扰，对其中P-HPG，6-APA和PAA三 种中间体的同时萃取效果较好，有明显的富集作用。
[0044] 4.本发明用于某药厂下游的环境水样检测，p-HPG，6_APA，PAA的检出限分别为 0? 04、0. 14、0. 25yg/mL(S/N彡 3)，对p-HPG，6-APA，PAA的富集倍数在 33-48 倍之间。
【附图说明】
[0045] 图1SDS动态改性固相萃取柱吸附容量测试图
[0046] 图2SDS动态改性固相萃取柱考察了pH对萃取的影响
[0047] 图3SDS动态改性固相萃取柱考察了溶液中含盐量对萃取的影响
[0048] 图4SDS动态改性固相萃取柱考察了溶液中乙腈含量对萃取的影响
[0049] 图5改性0DS-SPE柱与0DS-SPE及MCX萃取柱萃取效果对比图
[0050] 图6改性0DS-SPE柱用于储备液的萃取图谱
[0051] 图7样品专属性考察高效液相色谱图，从上到下依次为空白江水、标准品及江水 加标样品经萃取后的HPLC谱图
[0052] 图8掺有药物的江水与空白江水的萃取后分离对比图
【具体实施方式】
[0053] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明的技术方案作进一步详细说明。
[0054] 主要仪器：
[0055] Agilent1200高效液相色谱仪（配DAD检测器，美国安捷伦科技有限公司），电子 天平（德国Sartorius工业），pH计（瑞士梅特勒-托利多国际股份有限公司），Milli-Q A10超纯水系统（美国Millipore公司）。
[0056] 试剂均为市售产品，主要试剂为：
[0057] 对羟基苯海因标准品（纯度> 99. 5%，珠海联邦制药股份有限公司）；对羟基苯 甘氨酸标准品（北京百灵威科技有限公司）；6_氨基青霉烷酸标准品（珠海联邦制药股份 有限公司）；苯乙酸标准品（南京森贝伽生物科技有限公司）；1_庚烷磺酸钠（国药集团化 学试剂有限公司）；甲醇（美国TEDIA天地试剂公司）；乙腈（美国TEDIA天地试剂公司）； 水为去离子水；0DS萃取柱（100mg/只，天津天毫公司）；MCX萃取柱（60mg/只，天津天毫公 司
[0058] 实施例1
[0059] 1储备液及流动相的配制
[0060] 1. 1标准品溶液的配制
[0061] 精密称取对羟基苯海因标准品0. 2000g，用0. 05%H3P04水溶液溶解并定容至 100mL，制得浓度为2. 00mg/mL的p-HPH标准品储备液。
[0062] 精密称取对羟基苯甘氨酸标准品0. 1000g，用0. 05%H3P04水溶液溶解并定容至 100mL，制得浓度为1. 00mg/mL的D-HPG标准品储备液。
[0063] 精密称取6-APA标准品0? 4000g，用0? 05 %H3P04水溶液溶解并定容至100mL，制 得浓度为4. 00mg/mL的6-APA标准品储备液。
[0064] 精密称取苯乙酸标准品0. 4000g，用0. 05%H3P04水溶液溶解并定容至lOOmL(本 领域普通技术人员可根据实际需要加少量甲醇助溶），制得浓度为4. 00mg/mL的PAA标准品 储备液。
[0065] 另外，取上述各溶液适量，用0. 05 %H3P04水溶液稀释制得浓度分别为p-HPH， p_HPG，6_APA和PAA分别为 0. 40mg/mL、0. 04mg/mL、l. 00mg/mL和 1. 00mg/mL的四种标准品 混合溶液；或，p-HPG，6-APA和PAA分别为0? 2mg/mL、1. 00mg/mL和1. 00mg/mL的三种标准 品混合溶液，常温放置，隔天新配，待用。
[0066] 上述各溶液根据需要用0. 05%H3P04水溶液溶稀释成适当浓度。
[0067] 1.2流动相的配制
[0068] 精密称量0. 5075gl-庚烷磺酸钠，溶于500mL0. 05%H3P(VK溶液中，制得5mmol/ L的庚烷磺酸钠溶液，测得pH= 2. 5。
[0069] 2离子对液相色谱条件
[0070]Agilent1200高效液相色谱仪（配有DAD检测器）
[0071] 色谱柱：AgilentEclipseXDB-C18 (250*4. 6mm，5ym)
[0072] 流动相：A(0. 05%磷酸溶液含5mmol/L庚烷磺酸钠，pH= 2. 5)和B(MeOH)的初始 比例为80/20 (v/v)，梯度洗脱
[0073] 流速：lmL/min
[0074] 波长：225nm
[0075] 柱温：2(TC
[0076] 进样量：20uL
[0077] 表2. 1流动相梯度洗脱程序
[0079] 3样品萃取
[0080] 3. 1萃取样品的配制
[0081] 精密吸取配制好的混合标准品溶液（P-HPH，P-HPG，6-APA和PAA分别为0. 40mg/ mL、0. 04g/mL、l. 00mg/mL和 1. 00mg/mL)，用 0. 05%H3P04水溶液稀释 50 倍，吸取 5ml上样 萃取；或用已经用磷酸调节至PH2. 5的某药厂排污口下游约lkm处江水稀释50倍，涡旋混 勾2min，继续祸旋混勾2min，7500r/min离心5min取上清液，然后吸取5ml上样萃取。
[0082] 3. 2 0DS萃取柱改性
[0083] 依次用5mL甲醇、2mL0. 05%磷酸溶液活化0DS固相萃取小柱，上样5mL20mmol/L 的表面活性剂SDS，对0DS固相萃取柱进行动态改性，使其保证萃取柱上已充分吸附上饱和 的SDS，再用0. 3mL0. 05%磷酸溶液冲洗未吸附上的SDS。
[0084] 3. 3样品前处理
[0085] 取5mL经稀释50倍的储备液或江水经动态改性固相萃取柱萃取，再依次用0. 5mL 0. 05%磷酸溶液、lmL5%氨水/甲醇溶液淋洗，收集氨水甲醇洗脱液第0. 2-0. 3mL区间的 洗脱液共0. 2ml，队吹干后用0.lmL0. 05 %磷酸溶液溶解，进行HPLC检测。
[0086] 实施例中一些重要影响因素的考察 [0087](一）吸附容量测试
[0088] 0DS-SPE柱萃取的原理主要是基于疏水作用。将具有强离子型基团和长链烷基疏 水基团的表面活性剂SDS固载于SPE柱中0DS固定相材料的表面，这样就可以得到SPE柱 兼具离子交换与疏水作用的混合型固定相的特性。本项目中表面活性剂SDS是动态吸附于 0DS填料表面，这种吸附量会随着被萃取水溶液样品体积的增加而有一定的流失。在本实验 中，采用的萃取柱是含l〇〇mg0DS填料的固相萃取柱，发明人采用的是20mmol/LSDS溶液， 上样量为20mL，这样能够确保萃取柱上吸附的SDS量达到饱和。
[0089] 发明人考察了四种药物在改性萃取柱上饱和吸附量。数据见图1。从图中可以 发现，对羟基苯甘氨酸和6-氨基青霉烷酸在改性萃取柱上的吸附容量非常大，这说明在 PH2. 5左右，由于这两种两性药物表现为带净的正电荷，在萃取中静电引力占主导，吸附量 很大。
[0090] 由于萃取容量实验中，样品浓度很高，上样量在2_8mL时，对羟基苯甘氨酸、6-氨 基青霉烷酸和苯乙酸才达到饱和，在后续萃取中，样品浓度很低，故样品上样量优选为5mL。 [0091](二）不同表面活性剂对萃取的影响
[0092] 发明人选择经SDS动态吸附改性的0DS-SPE柱用于对羟基苯海因、对羟基苯甘氨 酸、6-氨基青霉烷酸、苯乙酸这样一些极性药物的萃取。虽然，CTAB(溴化十六烷基三甲基 铵）可能更适合于酸性药物如对羟基苯海因、苯乙酸的萃取，但考虑到萃取与分离系统的 兼容性，以及被分析物中有的药物，如6-氨基青霉烷酸，在碱性条件下的稳定性，发明人最 终选取SDS而不是CTAB，用于这些药物的萃取。
[0093] (三）pH对萃取的影响
[0094] 发明人考察了pH对萃取的影响，数据见图2。从图中数据可见，pH从2.5_8.8,对 羟基苯海因的萃取回收率都较低，虽然在PH6. 86下未电离态占主导，与SDS之间的斥力并 不是很大，但是由于其亲水性极强，导致在SPE柱上吸附量小。对于对羟基苯甘氨酸和6-氨 基青霉烷酸，随着pH值的降低，回收率显著增加，对于这两种两性药物而言，pH值的降低， 一方面降低了羧基的离解，另一方面，增加了氨基的质子化程度，这有助于增加两性药物与 SDS之间的静电引力，提高了回收率。对于苯乙酸，其回收率随pH值升高而降低，由于其pKa 值约在4. 28左右，尽管它与SDS之间有一定的静电斥力，但是苯基的疏水性较强，仍能取得 较高的回收率。根据此实验的结果，在后面的动态改性萃取中，上样萃取溶液的pH值选择 2. 5左右为佳。
[0095](四）溶液中含盐量对萃取的影响
[0096] 溶液中含盐量对萃取的影响也进行了考察，数据见图3。从图中可见，盐量的增加， 影响较为复杂，苯乙酸的萃取量有所增加，但是对于对羟基苯甘氨酸和6-氨基青霉烷酸， 萃取量有明显的降低。这可能与疏水作用与离子交换作用对三者的不同影响有关。为降低 样品基体中盐分对萃取效率的影响，将含盐分较高的样品建议稀释一定倍数后用于萃取。
[0097] (五）溶液中乙腈含量对萃取的影响
[0098] 溶液中乙腈含量对萃取的影响也进行了考察，数据见图4。从图中可见，乙腈从 0%增加到20%，对对羟基苯甘氨酸、6-氨基青霉烷酸、对羟基苯海因的萃取影响较小， 但 是，苯乙酸的萃取量有较明显的减少。这也证实了，苯乙酸的萃取中，疏水作用占主导；而对 另外两性药物，静电引力占主导，疏水作用占次要作用，故萃取受到的影响较小。
[0099](六）上样和洗脱条件考察
[0100] 从以上各种影响萃取效果的因素进行考察后，选择样品上样溶液条件为：PH2. 5。 若将本方法用于生物体液的萃取，并采用乙腈除蛋白，建议上样萃取前，对样品根据实验需 要进行适当稀释，控制稀释后样品中乙腈浓度不超过10% (v/v)。
[0101] 本实验中采取的是100mg规格的小型萃取柱，上完样后，先选用0. 3mL0. 05%磷 酸水溶液清洗后，再用洗脱液洗脱，对比1.OmL5 %氨水甲醇溶液和1.OmL5 %氨水洗脱溶 液，发觉两者均能在〇.3ml内将目标物完全洗脱。在后面样品的萃取洗脱中，为了便于快速 浓缩，收集氨水甲醇作为洗脱液洗脱出的〇. 2-0. 3mL区间收集起来，浓缩至0.lml后进样。
[0102] (七）改性柱与0DS-SPE及MCX萃取柱进行比较
[0103] 发明人把本萃取方法与其他几种传统萃取柱进行了对比（萃取条件相同）。从图 5可以看出，传统0DS-SPE柱对对羟基苯海因、对羟基苯甘氨酸、6-氨基青霉烷酸的萃取效 果很差，但对苯乙酸的萃取效果很好。而MCX混合离子交换柱对对羟基苯甘氨酸、6-氨基青 霉烷酸和苯乙酸的萃取效果均不理想。本实验建立的SDS改性0DS-SPE柱对对羟基苯甘氨 酸、6-氨基青霉烷酸和苯乙酸的萃取效果均优于0DS-SPE柱和MCX柱。
[0104] (八）改性0DS-SPE柱用于储备液的萃取
[0105] 将储备液稀释50倍后萃取，从图6看出，采用前面优化后的条件对几种药物进行 萃取，除对羟基苯海因萃取不理想外，其余几种药物均有明显的富集作用。
[0106] 4方法学考察
[0107] 4. 1方法的专属性
[0108] 在本实验的离子对色谱条件下，p-HPH，p-HPG，6-APA，PAA四种中间体有较大色谱 峰，空白基质中无严重干扰（图7)，且分离度及峰型良好，该方法专属性较高。在此条件下 所测得的结果能代表待测成分浓度。
[0109] 4. 2标准曲线的制备
[0110] 配制含不同浓度P-HPH，p-HPG，6-APA和PAA的系列样品，采用离子对色谱法分离， 记录色谱图，以浓度C(yg/mL)为横坐标（X)，峰面积A为纵坐标（y)进行线性回归分析得 到各药物的标准曲线。
[0111] 由于p-HPH的萃取效果不理想，后面只测定了p-HPG，6-APA和PAA三种物质，对 p-HPG，6-APA和PAA的标准曲线和线性范围，见表2。
[0112] 表2 0-内酰胺类抗生素3种中间体的线性回归方程、相关系数、线性范围
[0113]
[0114] 4. 3分析样品的稳定性
[0115] 取标准混合储备液，按优化后的离子对色谱法分析，分别于0、1、2、4、12、24小时 取样进行HPLC分析。统计p-HPG，6-APA，PAA的峰面积，算得相对标准偏差RSD均< 8. 1 %， 而以保留时间计算的RSD均小于2. 3%。表明该方法对标准品混合液在24h内测得结果稳 定性良好。
[0116] 4.4分析方法的回收率及精密度
[0117] 分别配制三个浓度水平的混合标准品溶液（p-HPG:0. 2、0. 8、4. 0yg/mL，6-APA: 1. 0、4. 0、20. 0yg/mL，PAA:1. 0、4. 0、20. 0yg/mL)，每个浓度平行分析 5 次，改性柱萃取 后经HPLC分析，计算得到回收率和相对标准偏差（RSD)。3种中间体的平均回收率均在 69. 0% -97. 8%之间，相对标准偏差小于11. 5%，符合方法学验证要求，结果见表3。
[0118] 表3 3种中间体物质的平均回收率和相对标准偏差
[0120] 5改性0DS-SPE柱在某药厂排污管道下游1km处长江水萃取中的应用
[0121] 发明人将上述样品掺入某药厂排污管道下游1km处长江水，涡旋混匀2min，加磷 酸调节pH至2. 5,离心后取上清液萃取。
[0122] 经离子对色谱法进样分析得到的图谱，如图8。在该方法中，p-HPG，6-APA，PAA的 检出限分别为0. 04、0. 14、0. 25yg/mL(S/N彡3)。以掺入江水中药物浓度分别为0. 8yg/ mL(p-HPG)，4. 0yg/mL(6-APA)，4. 0yg/mL(PAA)的样品为考察对象，计算的回收率分别为 p-HPG，96. 7% ;6-APA，87. 3% ;PAA，67. 4%。连续萃取分析，经计算，各药物的RSD(peak area，n= 3)分别为p-HPG，7. 9%;6-APA，6. 1%;PAA，5. 8%。相比未萃取的水液中有关药物 的直接分析，本发明对P-HPG，6-APA，PAA的富集效果是很明显的，富集倍数分别达到33-48 倍之间，这表明本发明对强极性两性药物和酸性药物的同时提取是有效的。
【主权项】
1. 一种强极性有机酸碱混合物的同时提取和分析方法，其特征在于：采用表面活性剂 动态改性ODS固相萃取柱与离子对色谱法联合使用；所述表面活性剂动态改性ODS固相萃 取柱由以下步骤制备： 依次用甲醇、磷酸溶液活化ODS固相萃取柱后，上样适量表面活性剂SDS，对ODS固相萃 取柱进行动态改性，使萃取柱吸附上饱和的SDS。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述磷酸溶液为0. 05%磷酸溶液，以体积百 分比计。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述表面活性剂SDS的浓度为20mmol/L。4. 一种强极性有机酸碱混合物的同时提取和分析方法，用于同时分析p-HPH，p-HPG， 6-APA和PAA，或同时提取分析p-HPG，6-APA和PAA，其特征在于：采用表面活性剂动态改性 ODS固相萃取柱与离子对色谱法联合使用；所述表面活性剂动态改性ODS固相萃取柱由以 下步骤制备： 依次用甲醇、〇. 05%磷酸溶液活化ODS固相萃取柱后，上样适量20mmol/L的表面活性剂SDS，对ODS固相萃取柱进行动态改性，使萃取柱吸附上饱和的SDS。5. 如权利要求4所述的方法，用于同时分析p-HPH，p-HPG，6-APA和PAA，或同时提取分 析p-HPG，6-APA和PAA，其特征在于，采用以下步骤： (1) 表面活性剂动态改性ODS固相萃取柱的制备， 依次以甲醇、〇. 05%磷酸溶液活化ODS固相萃取柱，然后上样20mmol/L的表面活性剂SDS适量，对ODS固相萃取柱进行动态改性，使萃取柱充分吸附上SDS; (2) 供试品的制备， 精密称取P-HPH标准品、6-APA标准品、PAA标准品和精密吸取p-HPG标准品适量，用 水稀释制得适当浓度的P-HPH、p-HPG、6-APA和PAA的混合溶液，调节pH后，将制得的混合 溶液经步骤（1)制得的动态改性固相萃取柱萃取，得到用于色谱分析的供试品溶液； (3) 采用离子对色谱法分离检测， 用具有DAD或UV检测器的高效液相色谱仪，采用C18色谱柱，以含适当浓度的庚烷磺 酸钠溶液与甲醇的混合溶液为流动相，以磷酸调节PH，检测波长为225nm;精密吸取供试品 溶液，注入液相色谱仪中，进行分析测定。6. 如权利要求5所述的方法，用于同时分析p-HPH，p-HPG，6-APA和PAA，或同时提取分 析p-HPG，6-APA和PAA，其特征在于，采用以下步骤： (1) 表面活性剂动态改性ODS固相萃取柱的制备， 依次以90%甲醇水溶液、0. 05%磷酸溶液活化ODS固相萃取柱，上样20mmol/L的表面活 性剂SDS溶液，对ODS固相萃取柱进行动态改性，使萃取柱充分吸附SDS，再用0. 05%磷酸 溶液冲洗萃取柱； (2) 供试品的制备， 精密称取P-HPH标准品、6-APA标准品、PAA标准品和精密吸取p-HPG标准品适量，加 0.05% 磷酸溶液稀释制得浓度分别为p-HPH0.40mg/mL、p-HPG0.2mg/mL、6-APALOOmg/mL和PAAI.OOmg/mL的混合溶液，将制得的混合溶液经步骤（1)制得的动态改性固相萃 取柱萃取，先用0. 05%磷酸溶液清洗，再以5%的氨水/甲醇溶液淋洗，弃掉洗脱液最初的 0.lml，收集氨水甲醇洗脱液的第0. 2-0. 3mL区间的洗脱液共0. 2ml，N2吹干后用0. 05%磷 酸溶液溶解，得到用于色谱分析的供试品溶液； (3)采用离子对色谱法分离检测， 用具有DAD检测器的高效液相色谱仪，以XDB-C18为色谱柱，以含5mmol/L庚烷磺酸钠 的0. 05%磷酸溶液与甲醇以适当比例形成的混合溶剂为流动相，其pH为2. 5左右，精密吸 取供试品溶液，注入液相色谱仪中，流速为lmL/min，柱温为20°C，进样量为20uL，采用梯度 洗脱进行分离，检测波长为225nm。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述梯度洗脱方式为从0-8min，流动相中甲 醇比例由20%线性上升至60% (v/v)，并维持4min。
【专利摘要】本发明提供了一种强极性有机酸碱混合物的同时提取及分离分析方法，采用表面活性剂动态改性ODS固相萃取柱与离子对色谱法结合使用，该方法专属性较高，线性关系良好，尤其对强极性的两性药物和酸性药物富集分离效果较好，可以用于强极性离子型药物混合物的同时萃取及分离分析，适用于药厂周边环境水样中有关物质的监测分析。
【IPC分类】G01N30/88, G01N30/34, G01N30/06
【公开号】CN104897838
【申请号】CN201510315751
【发明人】胡继伟, 梁天娇, 张琳
【申请人】重庆医科大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月10日
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