一种茶树嫩芽内源激素含量的测定方法
一种茶树嫩芽内源激素含量的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于林学中树木内源激素技术领域，具体涉及一种基于高效液相色谱法 (HPLC)测定茶树顶芽内源激素含量的方法。
【背景技术】
[0002] 茶树（Camelliasinensis)在我国栽种历史悠久，是我国南方传统的经济植物 (张玉翠，2010)。目前关于茶树的科学研宄，多集中在形态指标、光合特性及内在品质等方 面。通过分子机理的研宄，深入认识植物激素调控茶树生长、发育及其对环境适应的机制， 具有重要的科学意义。
[0003] 植物激素（planthormone,PH)是指在植物体的某一部位合成，可转移到其他部 位，并对植物的生长发育具有显著调节作用的微量有机物，亦称植物天然激素或内源激素。 植物内源激素种类多，含量甚微，且易被破坏。它们在细胞分裂与伸长、组织与器官分化、开 花与结实、成熟与衰老、休眠与萌发、植物形态建成以及离体组织培养等方面具有重要作用 (SantnerA，2009)。茶树作为我国重要的农业经济作物，以采摘幼嫩新梢为主。茶芽的萌 发及生长极易受外界环境的影响，这些影响在很大程度上都是通过植物激素直接进行作用 的（岳川，2012)。
[0004] 由于吲哚乙酸和赤霉素都可以与化学试剂反应，生成物在紫外光激发下可以呈现 出不同颜色的荧光，因此可用荧光法测定其含量，植物激素的测定还有纸层析、气相色谱 (GC)、等方法，但由于分离效率和灵敏度的局限，目前关于植物顶芽和叶片的内源激素测定 方法主要为间接酶联免疫吸附法（ELISA)，已有茶树顶芽内源激素测定方法是间接酶联免 疫吸附法（ELISA)，其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反 应板）表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗 除。但需要购买酶联免疫试剂盒，对试验条件高。
[0005] 高效液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatography，简称HPLC)是一 种区别于经典液相色谱，基于仪器方法的高效能分离手段，因其高速、高效、高灵敏度、高自 动化的特点，广泛用于各个领域，也是目前用于茶树内源激素测定的重要方法。高效液相 色谱法测定快速、高效、高灵敏度、高自动化的特点，但对配制流动相、设置色谱条件要求较 高；由于茶树嫩芽中存在茶多酚等多酚类物质生化成分，会对激素的测定造成干扰，因此其 样品的前处理与其他品种样品前处理存在差异。目前关于利用高效液相色谱法测定茶树顶 芽的内源激素的方法前人研宄较少，尚未有相适宜的测定方法研宄成果。
【发明内容】
[0006] 发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种用于HPLC法测定茶 树顶芽的内源激素的方法，具有高速、高效、高灵敏度、高自动化的特点。本发明主要解决了 在利用高效液相色谱法测定茶树顶芽激素时，探索茶树顶芽样品前处理方法、流动相的选 择和色谱条件，对成功利用HPLC测定植物激素提供一种可靠快速方法。
[0007] 技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0008] -种茶树嫩芽内源激素含量的测定方法，包括以下步骤：
[0009] 1)样品收集冷冻与预处理；
[0010] 2)配置流动相及设置色谱条件；
[0011] 3)配置标准溶液并建立回归方程；
[0012] 4)样品待测溶液检测；
[0013] 所述流动相由甲醇与0. 075%冰乙酸溶液组成；所述标准溶液包括IAA标准液、ZT 标准液、ABA标准液和GA3#准液。
[0014] 进一步的，在本发明中，步骤2)所述色谱条件为流速0. 7mL/min，检测波长210nm 和254nm，柱温25°C，进样量20yL。
[0015] 进一步的，在本发明中，步骤2)所述流动相的配置方法为：再将甲醇与0.075%冰 乙酸溶液分别进行抽滤及超声波震动30min，按体积比为45:55配制流动相。
[0016] 进一步的，在本发明中，步骤3)所述标准溶液包括0.lg/L的IAA标准液、0. 001g/ L的ZT标准液、0. 001g/L的ABA标准液和0. 01g/L的GA3#准液。
[0017] 进一步的，在本发明中，步骤1)所述样品收集冷冻的具体方法为：采集茶树嫩芽 样品，置于液氮中5min后放入冰箱冷冻保存。
[0018] 进一步的，在本发明中，步骤1)所述样品预处理的具体方法为：
[0019] 1-1)浸提：称取冷冻的茶树嫩芽样品，加入80%冷甲醇研磨，置于4°C下静置16h 后，抽滤得粗提液；
[0020] 1-2) -次萃取：将步骤1-1)所得粗提液用等量石油醚萃取，弃去醚相，保留水 相；
[0021] 1-3)旋转蒸发：将步骤1-2)所得水相在37°C下旋转蒸发至溶液体积的1/4至 1/5 ；
[0022] 1-4)调节pH:将步骤1-3)所得旋蒸浓缩液调节pH至8. 0,加入PVP，过滤，用 0? 3mol/L酒石酸溶液调节pH至3. 5 ;
[0023] 1-5)二次萃取：将调好pH值的溶液用等量乙酸乙酯萃取，收集水相，合并酯相；
[0024] 1-6)酯相收集：将步骤1-5)所得酯相在37°C下旋转蒸干，溶解于甲醇，通过 0. 45ym滤膜抽滤，滤液保存于4°C下棕色瓶中，待测；
[0025] 1-7)水相收集：将步骤1-5)所得的水相调节pH至8. 0,用等量饱和正丁醇萃取得 有机相，在60°C下旋转蒸发，溶解于甲醇，离心，滤液保存于4°C下棕色瓶中，待测。
[0026] 进一步的，在本发明中，所述建立回归方程的具体方法为：在相应的色谱条件下分 别测定所述标准溶液，用保留时间对标准溶液进行定性判定；将所述标准液配制成系列浓 度梯度的标准混合液并进行检测，以混合标准液峰面积与其质量浓度进行线性回归分析； 以峰面积为纵坐标，以各进样浓度为横坐标，得到相应的标准溶液的线性回归方程。
[0027] 进一步的，在本发明中，所述系列浓度梯度的标准混合溶液的具体配制方法为：根 据混合后的标准混合溶液的总体积和其中各组分的最终浓度，得出各标准溶液所需量，将 配置好的标准溶液进行混合，制成标准混合溶液后进行检测，根据结果制成标准曲线。
[0028] 进一步的，在本发明中，样品待测溶液检测后，进行重现性和精密度的检验：取同 一批次茶树嫩芽样品待测溶液，加入已知浓度的混合标准溶液后，测定其中的内源激素含 量，计算加标回收率。
[0029] 进一步的，在本发明中，所述标准溶液和样品待测溶液在进行测定前均需用 0. 45ym滤膜过滤。
[0030] 有益效果：本发明提供的高效液相色谱法测定茶树顶芽的内源激素的方法，与现 有技术相比，本发明解决了在利用高效液相色谱法测定茶树顶芽激素时，探索茶树顶芽样 品前处理方法、流动相的选择和色谱条件，对成功利用HPLC测定植物激素提供一种可靠快 速方法，并且可快速、准确、同时测定茶树嫩芽的IAA、ZT、ABA和6八3的含量；进行加标回收 率实验，平均回收率为98. 91 %，符合激素测定要求。
【附图说明】
[0031] 图1为本发明方法的流程示意图；
[0032] 图2为本发明标准样品出峰时间色谱图，其中标明时间的峰从左至右依次为：反 玉米素、赤霉素、生长素、脱落酸。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
[0034] 如图1所示为一种的方法的流程示意图，具体技术方案如下：
[0035] 实施例
[0036] 第一步：茶树嫩芽样品收集
[0037] 经过不同氮肥处理（0. 4g/盆、0. 8g/盆、1. 6g/盆、2. 4g/盆）的茶树嫩芽，取一芽 两叶，若干，置于液氮中5min后放入冰箱冷冻，于-24°C下冷冻保存。液氮的作用主要固定 嫩芽中的内源激素。
[0038] 第二步：仪器设备与药品准备
[0039] (1)仪器设备
[0040] 10-1000yLDRAGONLAB可调式移液枪，上海万岛仪器科技有限公司；
[0041] 1000mL砂芯过滤装置，天津津腾实验设备有限公司；
[0042] QP-01小型真空泵，深圳良谊仪器公司；
[0043] DS-5510DTH超声波清洗器，上海奥析科学仪器有限公司；
[0044] LC600液相色谱仪，北京莱博泰科仪器股份有限公司。
[0045] (2)药品试剂
[0046] IAA标准品，SIGMA-ALDRICH，productofUSA;
[0047] ZT标准品，SIGMA-ALDRICH，productofUSA;
[0048] ABA标准品，SIGMA-ALDRICH，productofUSA;
[0049] GA3标准品，SIGMA-ALDRICH，productofUSA;
[0050] 甲醇，色谱纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；
[0051] 冰乙酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海。
[0052] 第三步：茶树嫩芽样品的预处理
[0053] 1-1)浸提：称取1. 000g冷冻的茶树嫩芽样品，用10ml80%冷甲醇研磨并完全转 移 至玻璃试管，置于4°C下静置16h后，将提取液抽滤，再用10ml80%冷甲醇重新浸提残渣 二次，合并清液得粗提液；
[0054] 1-2) -次萃取：将步骤1-1)所得粗提液用等量石油醚萃取，弃去醚相，保留水相， 重复两次；
[0055] 1-3)旋转蒸发：将步骤1-2)所得剩余水相在37°C下旋转蒸发至溶液体积的1/4 至 1/5 ;
[0056] 1-4)调节pH:将步骤1-3)所得减压旋蒸浓缩液用0? 5mol/L盐酸和0? 5mol/L氢 氧化钠调节pH至8. 0,在其中加入lgPVP，过滤，用0. 3mol/L酒石酸溶液将过滤后的溶液调 节pH至3. 5 ;
[0057] 1-5)二次萃取：将调好pH值的溶液用等量乙酸乙酯萃取，收集水相，合并酯相，重 复二次；
[0058] 1-6)酯相收集：将步骤1-5)所得剩余酯相在37°C下旋转蒸干，用甲醇定容至 2ml，通过0.45ym滤膜抽滤，滤液保存于4°C下棕色瓶中，待测；得到的是生长素、赤霉素、 脱落酸的检测液。
[0059] 1-7)水相收集：将步骤1-5)所得的水相用0. 5mol/LNaOH溶液将PH调至8. 0,用 等量饱和正丁醇萃取3次，保留有机相，于60°C下旋转蒸干，用甲醇定容至2ml，12000r离心 lOmin，取上清液保存于4°C下棕色瓶中，待测。得到的是玉米素检测液。
[0060] 第四步：流动相的配置和色谱条件的选择
[0061] (1)流动相的配置
[0062] 使用移液枪准确量取375yL冰乙酸，在500mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度线， 制成0. 075%冰乙酸。将甲醇与0. 075%冰乙酸分别抽滤并超声波震动30min，按体积比为 45 :55配制流动相，
[0063] (2)色谱条件的设置
[0064] 最适色谱条件设置为：以甲醇和0. 075 %冰乙酸为流动相，检测波长210nm和 254nm，流速为0. 7mL/min，柱温25°C，进样量为20yL。
[0065] 第五步：标准溶液配置与线性回归方程的建立
[0066] 分别准确称取标准品IAAlOOmg、ZTlmg、ABAlmg和GA310mg，在1000mL棕色容量 瓶中用甲醇定容至刻度线，制成〇.lg/L的IAA标准液、0. 001g/L的ZT标准液、0. 001g/L的 ABA标准液和0. 01g/L的GA3标准液，即成标准品贮备液；并将标准液配制成系列浓度梯度 的标准混合溶液，保存于4°C冰箱中，备用。
[0067] 将各浓度标准溶液根据混合体积不超过容量瓶刻度为依据进行混合，制成标准混 合溶液后进行测定，根据结果制成标准曲线。
[0068] 分别精密量取lmLIAA、ZT、ABA和6^的标准品贮备液，在10mL棕色容量瓶中用 甲醇定容至刻度线，过滤、进样并检测，在上述最适色谱条件下分别重复进样6次，以4种混 标峰面积与其质量浓度进行线性回归分析；以峰面积为纵坐标，以各进样浓度（mg/L)为横 坐标，在EXCEL中进行运算，得到四种激素的线性回归方程及其相关系数，如表1所示。
[0069]表1、内源激素在选定色谱条件下的标准曲线
[0070]
[0071] 从表1可以看出，各标准样品浓度与其峰面积线性关系良好，相关系数满足分析 要求，且决定系数R2均达到了 0.99以上。测定结果如附图2所示。
[0072] 第六步：茶树嫩芽样品含量的测定
[0073] 将茶树嫩芽样品经过预处理后在确定的色谱条件下进样，在最适色谱条件下，进 行测定，将测得的峰面积代入表1回归方程中计算出各激素浓度。每个样品重复进样6次， 所得结果为6次平均将测得的峰面积代入回归方程计算出测定值。
[0074] 实例：每个样品重复进样6次。茶树品种乌牛早的春季嫩芽中，GA3含量为 0? 654yg/gFW(鲜重），ZT含量为 0? 412yg/gFW，IAA含量为 0? 585yg/gFW，ABA含量为 1.35yg/gFW。
[0075] 第七步：重现性和精密度的检验
[0076] 取同一批次茶树顶芽样品贮备液，加混合标准贮备液后，按外标法以峰面积测定4 种茶树嫩芽激素含量，计算加标回收率。
[0077] 取lmL茶树嫩芽样品待测液，分别加入一定体积的标准溶液，测定各激素浓度，根 据结果换算成加标样前后各内源激素的质量值。重复6次，计算加标回收率。试验结果见 表2,进行加标回收率实验，平均回收率为98. 91 %，符合激素测定要求。
[0078] 表2茶树嫩芽内源激素加标回收试验结果
[0080] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种茶树嫩芽内源激素含量的测定方法，其特征在于：包括以下步骤： 1) 样品收集冷冻与预处理； 2) 配置流动相及设置色谱条件； 3) 配置标准溶液并建立回归方程； 4) 样品待测溶液检测； 所述流动相由甲醇与〇. 075%冰乙酸溶液组成；所述标准溶液包括IAA标准液、ZT标准 液、ABA标准液和GAjg准液。2. 根据权利要求1所述的茶树嫩芽内源激素含量的测定方法，其特征在于：步骤2)所 述色谱条件为流速〇? 7mL/min，检测波长210nm和254nm，柱温25°C，进样量20yL03. 根据权利要求1所述的茶树嫩芽内源激素含量的测定方法，其特征在于：步骤2) 所述流动相的配置方法为：再将甲醇与〇. 075%冰乙酸溶液分别进行抽滤及超声波震动 30min，按体积比为45:55配制流动相。4. 根据权利要求1所述的茶树嫩芽内源激素含量的测定方法，其特征在于：步骤3)所 述标准溶液包括〇.lg/L的IAA标准液、0. 001g/L的ZT标准液、0. 001g/L的ABA标准液和 0. 01g/L的GA3#准液。5. 根据权利要求1所述的茶树嫩芽内源激素含量的测定方法，其特征在于：步骤1) 所述样品收集冷冻的具体方法为：采集茶树嫩芽样品，置于液氮中5min后放入冰箱冷冻保 存。6. 根据权利要求1所述的茶树嫩芽内源激素含量的测定方法，其特征在于：步骤1)所 述样品预处理的具体方法为： 1-1)浸提：称取冷冻的茶树嫩芽样品，加入80%冷甲醇研磨，置于4°C下静置16h后， 抽滤得粗提液； 1-2) -次萃取：将步骤1-1)所得粗提液用等量石油醚萃取，弃去醚相，保留水相； 1-3)旋转蒸发：将步骤1-2)所得水相在37°C下旋转蒸发至溶液体积的1/4至1/5 ; 1-4)调节pH:将步骤1-3)所得旋蒸浓缩液调节pH至8. 0,加入PVP，过滤，用0. 3mol/L酒石酸溶液调节pH至3. 5 ; 1-5)二次萃取：将调好pH值的溶液用等量乙酸乙酯萃取，收集水相，合并酯相； 1-6)酯相收集：将步骤1-5)所得酯相在37°C下旋转蒸干，溶解于甲醇，通过0. 45ym滤膜抽滤，滤液保存于4°C下棕色瓶中，待测； 1-7)水相收集：将步骤1-5)所得的水相调节pH至8.0,用等量饱和正丁醇萃取得有机 相，在60°C下旋转蒸发，溶解于甲醇，离心，滤液保存于4°C下棕色瓶中，待测。7. 根据权利要求1所述的茶树嫩芽内源激素含量的测定方法，其特征在于：所述建立 回归方程的具体方法为：在相应的色谱条件下分别测定所述标准溶液，用保留时间对标准 溶液进行定性判定；将所述标准液配制成系列浓度梯度的标准混合液并进行检测，以混合 标准液峰面积与其质量浓度进行线性回归分析；以峰面积为纵坐标，以各进样浓度为横坐 标，得到相应的标准溶液的线性回归方程。8. 根据权利要求7所述的茶树嫩芽内源激素含量的测定方法，其特征在于：所述系列 浓度梯度的标准混合溶液的具体配制方法为：根据混合后的标准混合溶液的总体积和其中 各组分的最终浓度，得出各标准溶液所需量，将配置好的标准溶液进行混合，制成标准混合 溶液后进行检测，根据结果制成标准曲线。9. 根据权利要求7所述的茶树嫩芽内源激素含量的测定方法，其特征在于：样品待测 溶液检测后，进行重现性和精密度的检验：取同一批次茶树嫩芽样品待测溶液，加入已知浓 度的混合标准溶液后，测定其中的内源激素含量，计算加标回收率。10. 根据权利要求1至9任一所述的茶树嫩芽内源激素含量的测定方法，其特征在于： 所述标准溶液和样品待测溶液在进行测定前均需用〇. 45ym滤膜过滤。
【专利摘要】一种茶树嫩芽内源激素含量的测定方法。本发明公开了一种基于高效液相色谱法(HPLC)测定茶树嫩芽内源激素含量的方法，通过优化流动相组成及浓度、流速，及有机改良剂的添加比例、检测波长等条件，确定HPLC测定茶树嫩芽内源激素含量的最佳色谱条件，考察了该方法的重现性和精密度。本发明方法具有高速、高效、高灵敏度、高自动化的特点，主要解决了在利用高效液相色谱法测定茶树顶芽激素时，探索茶树顶芽样品前处理方法、流动相的选择和色谱条件，对成功利用HPLC测定植物激素提供一种可靠快速方法。
【IPC分类】G01N30/88
【公开号】CN104897843
【申请号】CN201510355039
【发明人】杨再强, 孙擎, 韩冬
【申请人】南京信息工程大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月24日
【技术领域】
[0001] 本发明属于林学中树木内源激素技术领域，具体涉及一种基于高效液相色谱法 (HPLC)测定茶树顶芽内源激素含量的方法。
【背景技术】
[0002] 茶树（Camelliasinensis)在我国栽种历史悠久，是我国南方传统的经济植物 (张玉翠，2010)。目前关于茶树的科学研宄，多集中在形态指标、光合特性及内在品质等方 面。通过分子机理的研宄，深入认识植物激素调控茶树生长、发育及其对环境适应的机制， 具有重要的科学意义。
[0003] 植物激素（planthormone,PH)是指在植物体的某一部位合成，可转移到其他部 位，并对植物的生长发育具有显著调节作用的微量有机物，亦称植物天然激素或内源激素。 植物内源激素种类多，含量甚微，且易被破坏。它们在细胞分裂与伸长、组织与器官分化、开 花与结实、成熟与衰老、休眠与萌发、植物形态建成以及离体组织培养等方面具有重要作用 (SantnerA，2009)。茶树作为我国重要的农业经济作物，以采摘幼嫩新梢为主。茶芽的萌 发及生长极易受外界环境的影响，这些影响在很大程度上都是通过植物激素直接进行作用 的（岳川，2012)。
[0004] 由于吲哚乙酸和赤霉素都可以与化学试剂反应，生成物在紫外光激发下可以呈现 出不同颜色的荧光，因此可用荧光法测定其含量，植物激素的测定还有纸层析、气相色谱 (GC)、等方法，但由于分离效率和灵敏度的局限，目前关于植物顶芽和叶片的内源激素测定 方法主要为间接酶联免疫吸附法（ELISA)，已有茶树顶芽内源激素测定方法是间接酶联免 疫吸附法（ELISA)，其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反 应板）表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗 除。但需要购买酶联免疫试剂盒，对试验条件高。
[0005] 高效液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatography，简称HPLC)是一 种区别于经典液相色谱，基于仪器方法的高效能分离手段，因其高速、高效、高灵敏度、高自 动化的特点，广泛用于各个领域，也是目前用于茶树内源激素测定的重要方法。高效液相 色谱法测定快速、高效、高灵敏度、高自动化的特点，但对配制流动相、设置色谱条件要求较 高；由于茶树嫩芽中存在茶多酚等多酚类物质生化成分，会对激素的测定造成干扰，因此其 样品的前处理与其他品种样品前处理存在差异。目前关于利用高效液相色谱法测定茶树顶 芽的内源激素的方法前人研宄较少，尚未有相适宜的测定方法研宄成果。
【发明内容】
[0006] 发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种用于HPLC法测定茶 树顶芽的内源激素的方法，具有高速、高效、高灵敏度、高自动化的特点。本发明主要解决了 在利用高效液相色谱法测定茶树顶芽激素时，探索茶树顶芽样品前处理方法、流动相的选 择和色谱条件，对成功利用HPLC测定植物激素提供一种可靠快速方法。
[0007] 技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0008] -种茶树嫩芽内源激素含量的测定方法，包括以下步骤：
[0009] 1)样品收集冷冻与预处理；
[0010] 2)配置流动相及设置色谱条件；
[0011] 3)配置标准溶液并建立回归方程；
[0012] 4)样品待测溶液检测；
[0013] 所述流动相由甲醇与0. 075%冰乙酸溶液组成；所述标准溶液包括IAA标准液、ZT 标准液、ABA标准液和GA3#准液。
[0014] 进一步的，在本发明中，步骤2)所述色谱条件为流速0. 7mL/min，检测波长210nm 和254nm，柱温25°C，进样量20yL。
[0015] 进一步的，在本发明中，步骤2)所述流动相的配置方法为：再将甲醇与0.075%冰 乙酸溶液分别进行抽滤及超声波震动30min，按体积比为45:55配制流动相。
[0016] 进一步的，在本发明中，步骤3)所述标准溶液包括0.lg/L的IAA标准液、0. 001g/ L的ZT标准液、0. 001g/L的ABA标准液和0. 01g/L的GA3#准液。
[0017] 进一步的，在本发明中，步骤1)所述样品收集冷冻的具体方法为：采集茶树嫩芽 样品，置于液氮中5min后放入冰箱冷冻保存。
[0018] 进一步的，在本发明中，步骤1)所述样品预处理的具体方法为：
[0019] 1-1)浸提：称取冷冻的茶树嫩芽样品，加入80%冷甲醇研磨，置于4°C下静置16h 后，抽滤得粗提液；
[0020] 1-2) -次萃取：将步骤1-1)所得粗提液用等量石油醚萃取，弃去醚相，保留水 相；
[0021] 1-3)旋转蒸发：将步骤1-2)所得水相在37°C下旋转蒸发至溶液体积的1/4至 1/5 ；
[0022] 1-4)调节pH:将步骤1-3)所得旋蒸浓缩液调节pH至8. 0,加入PVP，过滤，用 0? 3mol/L酒石酸溶液调节pH至3. 5 ;
[0023] 1-5)二次萃取：将调好pH值的溶液用等量乙酸乙酯萃取，收集水相，合并酯相；
[0024] 1-6)酯相收集：将步骤1-5)所得酯相在37°C下旋转蒸干，溶解于甲醇，通过 0. 45ym滤膜抽滤，滤液保存于4°C下棕色瓶中，待测；
[0025] 1-7)水相收集：将步骤1-5)所得的水相调节pH至8. 0,用等量饱和正丁醇萃取得 有机相，在60°C下旋转蒸发，溶解于甲醇，离心，滤液保存于4°C下棕色瓶中，待测。
[0026] 进一步的，在本发明中，所述建立回归方程的具体方法为：在相应的色谱条件下分 别测定所述标准溶液，用保留时间对标准溶液进行定性判定；将所述标准液配制成系列浓 度梯度的标准混合液并进行检测，以混合标准液峰面积与其质量浓度进行线性回归分析； 以峰面积为纵坐标，以各进样浓度为横坐标，得到相应的标准溶液的线性回归方程。
[0027] 进一步的，在本发明中，所述系列浓度梯度的标准混合溶液的具体配制方法为：根 据混合后的标准混合溶液的总体积和其中各组分的最终浓度，得出各标准溶液所需量，将 配置好的标准溶液进行混合，制成标准混合溶液后进行检测，根据结果制成标准曲线。
[0028] 进一步的，在本发明中，样品待测溶液检测后，进行重现性和精密度的检验：取同 一批次茶树嫩芽样品待测溶液，加入已知浓度的混合标准溶液后，测定其中的内源激素含 量，计算加标回收率。
[0029] 进一步的，在本发明中，所述标准溶液和样品待测溶液在进行测定前均需用 0. 45ym滤膜过滤。
[0030] 有益效果：本发明提供的高效液相色谱法测定茶树顶芽的内源激素的方法，与现 有技术相比，本发明解决了在利用高效液相色谱法测定茶树顶芽激素时，探索茶树顶芽样 品前处理方法、流动相的选择和色谱条件，对成功利用HPLC测定植物激素提供一种可靠快 速方法，并且可快速、准确、同时测定茶树嫩芽的IAA、ZT、ABA和6八3的含量；进行加标回收 率实验，平均回收率为98. 91 %，符合激素测定要求。
【附图说明】
[0031] 图1为本发明方法的流程示意图；
[0032] 图2为本发明标准样品出峰时间色谱图，其中标明时间的峰从左至右依次为：反 玉米素、赤霉素、生长素、脱落酸。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
[0034] 如图1所示为一种的方法的流程示意图，具体技术方案如下：
[0035] 实施例
[0036] 第一步：茶树嫩芽样品收集
[0037] 经过不同氮肥处理（0. 4g/盆、0. 8g/盆、1. 6g/盆、2. 4g/盆）的茶树嫩芽，取一芽 两叶，若干，置于液氮中5min后放入冰箱冷冻，于-24°C下冷冻保存。液氮的作用主要固定 嫩芽中的内源激素。
[0038] 第二步：仪器设备与药品准备
[0039] (1)仪器设备
[0040] 10-1000yLDRAGONLAB可调式移液枪，上海万岛仪器科技有限公司；
[0041] 1000mL砂芯过滤装置，天津津腾实验设备有限公司；
[0042] QP-01小型真空泵，深圳良谊仪器公司；
[0043] DS-5510DTH超声波清洗器，上海奥析科学仪器有限公司；
[0044] LC600液相色谱仪，北京莱博泰科仪器股份有限公司。
[0045] (2)药品试剂
[0046] IAA标准品，SIGMA-ALDRICH，productofUSA;
[0047] ZT标准品，SIGMA-ALDRICH，productofUSA;
[0048] ABA标准品，SIGMA-ALDRICH，productofUSA;
[0049] GA3标准品，SIGMA-ALDRICH，productofUSA;
[0050] 甲醇，色谱纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；
[0051] 冰乙酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海。
[0052] 第三步：茶树嫩芽样品的预处理
[0053] 1-1)浸提：称取1. 000g冷冻的茶树嫩芽样品，用10ml80%冷甲醇研磨并完全转 移 至玻璃试管，置于4°C下静置16h后，将提取液抽滤，再用10ml80%冷甲醇重新浸提残渣 二次，合并清液得粗提液；
[0054] 1-2) -次萃取：将步骤1-1)所得粗提液用等量石油醚萃取，弃去醚相，保留水相， 重复两次；
[0055] 1-3)旋转蒸发：将步骤1-2)所得剩余水相在37°C下旋转蒸发至溶液体积的1/4 至 1/5 ;
[0056] 1-4)调节pH:将步骤1-3)所得减压旋蒸浓缩液用0? 5mol/L盐酸和0? 5mol/L氢 氧化钠调节pH至8. 0,在其中加入lgPVP，过滤，用0. 3mol/L酒石酸溶液将过滤后的溶液调 节pH至3. 5 ;
[0057] 1-5)二次萃取：将调好pH值的溶液用等量乙酸乙酯萃取，收集水相，合并酯相，重 复二次；
[0058] 1-6)酯相收集：将步骤1-5)所得剩余酯相在37°C下旋转蒸干，用甲醇定容至 2ml，通过0.45ym滤膜抽滤，滤液保存于4°C下棕色瓶中，待测；得到的是生长素、赤霉素、 脱落酸的检测液。
[0059] 1-7)水相收集：将步骤1-5)所得的水相用0. 5mol/LNaOH溶液将PH调至8. 0,用 等量饱和正丁醇萃取3次，保留有机相，于60°C下旋转蒸干，用甲醇定容至2ml，12000r离心 lOmin，取上清液保存于4°C下棕色瓶中，待测。得到的是玉米素检测液。
[0060] 第四步：流动相的配置和色谱条件的选择
[0061] (1)流动相的配置
[0062] 使用移液枪准确量取375yL冰乙酸，在500mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度线， 制成0. 075%冰乙酸。将甲醇与0. 075%冰乙酸分别抽滤并超声波震动30min，按体积比为 45 :55配制流动相，
[0063] (2)色谱条件的设置
[0064] 最适色谱条件设置为：以甲醇和0. 075 %冰乙酸为流动相，检测波长210nm和 254nm，流速为0. 7mL/min，柱温25°C，进样量为20yL。
[0065] 第五步：标准溶液配置与线性回归方程的建立
[0066] 分别准确称取标准品IAAlOOmg、ZTlmg、ABAlmg和GA310mg，在1000mL棕色容量 瓶中用甲醇定容至刻度线，制成〇.lg/L的IAA标准液、0. 001g/L的ZT标准液、0. 001g/L的 ABA标准液和0. 01g/L的GA3标准液，即成标准品贮备液；并将标准液配制成系列浓度梯度 的标准混合溶液，保存于4°C冰箱中，备用。
[0067] 将各浓度标准溶液根据混合体积不超过容量瓶刻度为依据进行混合，制成标准混 合溶液后进行测定，根据结果制成标准曲线。
[0068] 分别精密量取lmLIAA、ZT、ABA和6^的标准品贮备液，在10mL棕色容量瓶中用 甲醇定容至刻度线，过滤、进样并检测，在上述最适色谱条件下分别重复进样6次，以4种混 标峰面积与其质量浓度进行线性回归分析；以峰面积为纵坐标，以各进样浓度（mg/L)为横 坐标，在EXCEL中进行运算，得到四种激素的线性回归方程及其相关系数，如表1所示。
[0069]表1、内源激素在选定色谱条件下的标准曲线
[0070]
[0071] 从表1可以看出，各标准样品浓度与其峰面积线性关系良好，相关系数满足分析 要求，且决定系数R2均达到了 0.99以上。测定结果如附图2所示。
[0072] 第六步：茶树嫩芽样品含量的测定
[0073] 将茶树嫩芽样品经过预处理后在确定的色谱条件下进样，在最适色谱条件下，进 行测定，将测得的峰面积代入表1回归方程中计算出各激素浓度。每个样品重复进样6次， 所得结果为6次平均将测得的峰面积代入回归方程计算出测定值。
[0074] 实例：每个样品重复进样6次。茶树品种乌牛早的春季嫩芽中，GA3含量为 0? 654yg/gFW(鲜重），ZT含量为 0? 412yg/gFW，IAA含量为 0? 585yg/gFW，ABA含量为 1.35yg/gFW。
[0075] 第七步：重现性和精密度的检验
[0076] 取同一批次茶树顶芽样品贮备液，加混合标准贮备液后，按外标法以峰面积测定4 种茶树嫩芽激素含量，计算加标回收率。
[0077] 取lmL茶树嫩芽样品待测液，分别加入一定体积的标准溶液，测定各激素浓度，根 据结果换算成加标样前后各内源激素的质量值。重复6次，计算加标回收率。试验结果见 表2,进行加标回收率实验，平均回收率为98. 91 %，符合激素测定要求。
[0078] 表2茶树嫩芽内源激素加标回收试验结果
[0080] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种茶树嫩芽内源激素含量的测定方法，其特征在于：包括以下步骤： 1) 样品收集冷冻与预处理； 2) 配置流动相及设置色谱条件； 3) 配置标准溶液并建立回归方程； 4) 样品待测溶液检测； 所述流动相由甲醇与〇. 075%冰乙酸溶液组成；所述标准溶液包括IAA标准液、ZT标准 液、ABA标准液和GAjg准液。2. 根据权利要求1所述的茶树嫩芽内源激素含量的测定方法，其特征在于：步骤2)所 述色谱条件为流速〇? 7mL/min，检测波长210nm和254nm，柱温25°C，进样量20yL03. 根据权利要求1所述的茶树嫩芽内源激素含量的测定方法，其特征在于：步骤2) 所述流动相的配置方法为：再将甲醇与〇. 075%冰乙酸溶液分别进行抽滤及超声波震动 30min，按体积比为45:55配制流动相。4. 根据权利要求1所述的茶树嫩芽内源激素含量的测定方法，其特征在于：步骤3)所 述标准溶液包括〇.lg/L的IAA标准液、0. 001g/L的ZT标准液、0. 001g/L的ABA标准液和 0. 01g/L的GA3#准液。5. 根据权利要求1所述的茶树嫩芽内源激素含量的测定方法，其特征在于：步骤1) 所述样品收集冷冻的具体方法为：采集茶树嫩芽样品，置于液氮中5min后放入冰箱冷冻保 存。6. 根据权利要求1所述的茶树嫩芽内源激素含量的测定方法，其特征在于：步骤1)所 述样品预处理的具体方法为： 1-1)浸提：称取冷冻的茶树嫩芽样品，加入80%冷甲醇研磨，置于4°C下静置16h后， 抽滤得粗提液； 1-2) -次萃取：将步骤1-1)所得粗提液用等量石油醚萃取，弃去醚相，保留水相； 1-3)旋转蒸发：将步骤1-2)所得水相在37°C下旋转蒸发至溶液体积的1/4至1/5 ; 1-4)调节pH:将步骤1-3)所得旋蒸浓缩液调节pH至8. 0,加入PVP，过滤，用0. 3mol/L酒石酸溶液调节pH至3. 5 ; 1-5)二次萃取：将调好pH值的溶液用等量乙酸乙酯萃取，收集水相，合并酯相； 1-6)酯相收集：将步骤1-5)所得酯相在37°C下旋转蒸干，溶解于甲醇，通过0. 45ym滤膜抽滤，滤液保存于4°C下棕色瓶中，待测； 1-7)水相收集：将步骤1-5)所得的水相调节pH至8.0,用等量饱和正丁醇萃取得有机 相，在60°C下旋转蒸发，溶解于甲醇，离心，滤液保存于4°C下棕色瓶中，待测。7. 根据权利要求1所述的茶树嫩芽内源激素含量的测定方法，其特征在于：所述建立 回归方程的具体方法为：在相应的色谱条件下分别测定所述标准溶液，用保留时间对标准 溶液进行定性判定；将所述标准液配制成系列浓度梯度的标准混合液并进行检测，以混合 标准液峰面积与其质量浓度进行线性回归分析；以峰面积为纵坐标，以各进样浓度为横坐 标，得到相应的标准溶液的线性回归方程。8. 根据权利要求7所述的茶树嫩芽内源激素含量的测定方法，其特征在于：所述系列 浓度梯度的标准混合溶液的具体配制方法为：根据混合后的标准混合溶液的总体积和其中 各组分的最终浓度，得出各标准溶液所需量，将配置好的标准溶液进行混合，制成标准混合 溶液后进行检测，根据结果制成标准曲线。9. 根据权利要求7所述的茶树嫩芽内源激素含量的测定方法，其特征在于：样品待测 溶液检测后，进行重现性和精密度的检验：取同一批次茶树嫩芽样品待测溶液，加入已知浓 度的混合标准溶液后，测定其中的内源激素含量，计算加标回收率。10. 根据权利要求1至9任一所述的茶树嫩芽内源激素含量的测定方法，其特征在于： 所述标准溶液和样品待测溶液在进行测定前均需用〇. 45ym滤膜过滤。
【专利摘要】一种茶树嫩芽内源激素含量的测定方法。本发明公开了一种基于高效液相色谱法(HPLC)测定茶树嫩芽内源激素含量的方法，通过优化流动相组成及浓度、流速，及有机改良剂的添加比例、检测波长等条件，确定HPLC测定茶树嫩芽内源激素含量的最佳色谱条件，考察了该方法的重现性和精密度。本发明方法具有高速、高效、高灵敏度、高自动化的特点，主要解决了在利用高效液相色谱法测定茶树顶芽激素时，探索茶树顶芽样品前处理方法、流动相的选择和色谱条件，对成功利用HPLC测定植物激素提供一种可靠快速方法。
【IPC分类】G01N30/88
【公开号】CN104897843
【申请号】CN201510355039
【发明人】杨再强, 孙擎, 韩冬
【申请人】南京信息工程大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月24日
最新回复(0)