一种检测黄曲霉毒素m1的荧光微球免疫层析试纸条及方法
一种检测黄曲霉毒素m1的荧光微球免疫层析试纸条及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测黄曲霉毒素Ml的试纸条及方法，具体涉及一种用于检测牛 奶中黄曲霉毒素Ml的荧光微球免疫层析试纸条。
【背景技术】
[0002] 黄曲霉毒素（aflatoxin，AF)是迄今发现污染农产品毒素最强的一类生物毒素，也 是强致癌物。最为常见的有AF81、82、61、62，其中八？81的存在量与毒性都是最大的。黄 曲霉毒素Ml是黄曲霉毒素B1的4-羟基衍生物，是B1在体内经过羟化而衍生成的代谢产 物，一部分从尿和乳汁排出，另一部分存在于动物的可食部分中。主要存在于土壤、动植物、 霉变谷物、各种坚果、食品、调味品、食用油、牛奶和奶制品等霉变制品中，直接或间接进入 人类食物链，是致癌致畸致突变的毒物，严重威胁人类健康和生命安全。牛乳及其制品是易 受到黄曲霉毒素污染的食品之一。为保证其安全卫生，各国都制定了严格的限量标准。美 国FDA规定牛乳中黄曲霉毒素Ml的限量水平为0. 5iig/kg，我国也规定牛乳中黄曲霉毒素 Ml含量不得超过0. 5iig/kg。
[0003] 目前，对黄曲霉毒素检测的方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、免疫分析 法、质谱法、免疫亲和荧光光度法等。薄层色谱法操作繁琐、污染大、定量差、耗时长；高效 液相色谱法具有灵敏度高、分离能力强、特异性好和测定结果可靠等特点，但如果食品成分 复杂，在进行液相色谱分离前，需对样品作彻底有效的净化处理，不适合于大批量样品的检 测，应用受到限制；酶联免疫吸附法是目前常使用的一种检测方法，它具有快速、灵敏、对样 品纯度要求不高等优点，特别适用于大批量样品的检测，荧光免疫层析法与酶联免疫法相 比检测时间更短，稳定性好、操作简便、无需其他仪器设备，结果判断直观可靠，适用于现场 进行快速筛选。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种检测黄曲霉毒素Ml的荧光微球免疫层析试纸条。
[0005] 本发明所提供的检测黄曲霉毒素Ml的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于包 括由样品结合垫、层析膜、吸水垫和底衬组成的试纸条；所述样品结合垫上含有荧光微球标 记黄曲霉毒素Ml单克隆抗体；所述层析膜上有检测区和质控区，检测区包被有黄曲霉毒素 Ml半抗原-载体蛋白偶联物，质控区包被有羊抗鼠抗抗体。所述样品结合垫是将荧光微球 抗体偶联物以特定缓冲体系稀释后，将样品结合垫浸泡于稀释缓冲液中，经真空冷冻干燥 后制备而得；所述荧光微球是内部包埋荧光染料、表面修饰有羧基官能团的微球悬液，荧光 微球由聚苯乙烯包被，粒径1〇〇~300nm，固体含量1%~10%，官能团密度100~600uEq/g。
[0006] 所述的荧光微球标记黄曲霉毒素Ml单克隆抗体是通过EDC和NHS介导的与蛋白 表面氨基的酰胺化反应制备获得的。
[0007] 所述的黄曲霉毒素Ml半抗原是由黄曲霉毒素Ml与对苯二胺反应获得，包括如下 步骤：
[0008] 65mg黄曲霉毒素Ml溶于lmL二甲基亚砜（DMS0)，60°C下缓慢滴加入25mg对苯二 胺和0.lmL吡啶在lmLDMS0的混合液中，滴加完毕后，继续反应15h，旋蒸除去溶剂，柱层析 纯化后得到黄曲霉毒素Ml的对苯二胺单缩合物。
[0009] 所述荧光微球标记黄曲霉毒素Ml单克隆抗体的黄曲霉毒素Ml单克隆抗体是以黄 曲霉毒素Ml半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得的。
[0010] 所述黄曲霉毒素Ml半抗原-载体蛋白偶联物是由黄曲霉毒素Ml半抗原与载体蛋 白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清白蛋白、甲状腺蛋白、血蓝蛋白、人血清 白蛋白。
[0011] 所述样品结合垫是将样品结合垫置于含牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在缓冲体系 中的终浓度为0. 5%体积百分含量)、pH7. 2、0.lmol/L磷酸盐缓冲液中均匀浸泡2h，将处理 完的样品结合垫平铺于干燥网上置于37°C干燥室干燥2h(湿度要求30%)，将荧光微球抗体 偶联物以贮存缓冲液稀释后，将样品结合垫浸泡于其中经真空冷冻干燥后制备而得，备用。
[0012] 所述底衬为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品结合垫为玻璃纤维膜； 所述吸水垫为吸水纸；所述层析膜为硝酸纤维素膜。
[0013] 本发明的另一个目的是提供一种制备上述黄曲霉毒素Ml荧光微球免疫层析试纸 条的方法，其包括步骤：
[0014] 1)制备黄曲霉毒素Ml单克隆抗体；
[0015] 2)制备突光微球标记黄曲霉毒素Ml单克隆抗体，并在样品结合垫中包埋突光微 球抗体偶联物；
[0016] 3)将样品结合垫、层析膜、吸水垫由一端依次粘贴在底衬上组装成试纸条；
[0017] 4)切割、组装成试纸条用于检测黄曲霉毒素Ml。
[0018] 具体地说，步骤包括：
[0019] 1)将黄曲霉毒素Ml与对苯二胺反应，制备黄曲霉毒素Ml半抗原；
[0020] 2)将黄曲霉毒素Ml半抗原与载体蛋白偶联，制备黄曲霉毒素Ml半抗原-载体蛋 白偶联物；
[0021] 3)用黄曲霉毒素Ml半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓 瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌黄曲霉毒素Ml单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
[0022] 4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；
[0023] 5)通过EDC和NHS介导的与蛋白表面氨基的酰胺化反应完成荧光微球标记黄曲霉 毒素Ml单克隆抗体，得到荧光微球抗体偶联物；
[0024] 6)将荧光微球抗体偶联物以特定缓冲体系稀释后，将样品结合垫浸泡于稀释缓冲 液中，经真空冷冻干燥后制备得到样品结合垫；
[0025] 7)将样品结合垫、层析膜、吸水垫由一端依次粘贴在底衬上组装成试纸条；
[0026] 8)将制备好的试纸条进行切害I]、组装用于检测黄曲霉毒素Ml。
[0027] 本发明的另一个目的是提供一种黄曲霉毒素Ml荧光微球免疫层析试纸条用于检 测牛奶中的黄曲霉毒素Ml残留的方法，包括如下步骤：
[0028] 1)用荧光微球免疫层析试纸条进行检测；
[0029] 2)用荧光检测仪分析检测结果。
[0030] 本发明中用试纸条检测样品时，样本中的黄曲霉毒素Ml在流动的过程中与荧光 微球标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和层析膜检测区（T线）上的黄曲霉毒素Ml 半抗原-载体蛋白偶联物的结合，从而导致检测线荧光抗体信号强度的变化。
[0031] 本发明采用将黄曲霉毒素Ml单克隆抗体与荧光微球偶联物包埋在样品结合垫 上，具有亲水性佳、可大容量吸附抗体偶联物、迅速重湿润、抗体结合物释放充分、性能特 好、释放快、形态好等优势，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。本发明的试纸条具 有成本低、操作简单、检测时间短、储存简单等优点。用本发明的试纸条检测黄曲霉毒素M1， 方法简单、快速、适用范围广、成本低、易推广使用。
【附图说明】
[0032] 图1为试纸条剖面结构示意图。
[0033] 图2为试纸条俯视图。
[0034] 图3为黄曲霉毒素Ml半抗原合成路线图。
[0035] 图4为黄曲霉毒素Ml半抗原核磁共振氢谱图。
【具体实施方式】
[0036] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0037] 实施例1检测黄曲霉毒素Ml的荧光微球免疫层析试纸条的构成
[0038] 所述试纸条是由样品结合垫、层析膜、吸水垫和底衬组成，如图1所示；
[0039] 所述样品结合垫1、层析膜2、吸水垫3依次按顺序粘贴在底衬6上，样品结合垫的 末端与层析膜的始端相连，层析膜的末端与吸水垫相连，样品结合垫的始端与底衬的始端 对齐，吸水垫的末端与底衬的末端对齐；
[0040] 所述层析膜上有检测区4和质控区5,均呈与所述试纸条的长相垂直的条带状，检 测区位于近于样品结合垫的一端，质控区位于远离样品结合垫的一端。样品结合垫上含有 荧光微球标记黄曲霉毒素Ml单克隆抗体；检测区包被有黄曲霉毒素Ml半抗原-载体蛋白 偶联物(黄曲霉毒素Ml半抗原-卵清白蛋白的偶联物)，质控区包被有羊抗鼠抗抗体；
[0041] 所述底衬为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品结合垫为玻璃纤维膜； 所述吸水垫为吸水纸；所述层析膜为硝酸纤维素膜。
[0042] 将制备好的试纸条进行切割、装在特制的塑料制卡中，组装成试纸条在2~8°C阴 凉避光干燥保存，有效期12个月。
[0043] 实施例2实施例1中所述的荧光微球免疫层析试纸条的制备方法
[0044] 一、试纸条的制备
[0045] 试纸条的制备方法主要包括以下步骤：
[0046] 1)制备黄曲霉毒素Ml单克隆抗体；
[0047] 2)制备突光微球标记黄曲霉毒素Ml单克隆抗体，并在样品结合垫中包埋突光微 球抗体偶联物；
[0048] 3)将样品结合垫、层析膜、吸水垫由一端依次粘贴在底衬上组装成试纸条；
[0049] 4)切割、组装成试纸条用于检测黄曲霉毒素Ml。
[0050] 下面分步详细叙述：
[0051] (一）各部件的制备
[0052] 1.黄曲霉毒素Ml抗原和单克隆抗体的制备
[0053] ( 1)黄曲霉毒素Ml半抗原的合成和鉴定
[0054] 半抗原的合成(合成路线如图3 )
[0055] 65mg黄曲霉毒素Ml溶于lmLDMSO, 60°C下缓慢滴加入25mg对苯二胺和0?lmL吡 啶在lmLDMS0的混合液中，滴加完毕后，继续反应15h，旋蒸除去溶剂，柱层析纯化后得到 黄曲霉毒素Ml的对苯二胺单缩合物。
[0056] 半抗原的鉴定
[0057] 取上述产物经核磁共振氢谱测定，如图4所示，图谱中7.Oppm左右增加的2组芳 环信号峰，说明半抗原合成成功。
[0058] (2)免疫原的制备
[0059] 取8. 4mg黄曲霉毒素Ml半抗原溶于2mL水中得到溶液I;取戊二醛50iiL逐滴加 入到溶液I中，室温搅拌反应24h得到溶液II;取50mg牛血清白蛋白（BSA)用4mL水溶解得 到溶液III;将溶液II缓慢加入到溶液III中，室温搅拌反应过夜，加入30mg硼氢化钠（NaBH4) 还原，用〇. 〇2mol/L的PBS透析三天，每天更换透析液三次，得到免疫原。
[0060] (3)包被原的制备
[0061] 将BSA替换成卵清白蛋白（OVA)按上述（2)的步骤制备 得到黄曲霉毒素Ml包被 原。
[0062] (4)黄曲霉毒素Ml单克隆抗体的制备
[0063] 用上述（2)的步骤制备得到的黄曲霉毒素Ml免疫原免疫Balb/c小鼠制备黄曲霉 毒素Ml单克隆抗体。
[0064] 2.羊抗鼠抗抗体的制备
[0065] 以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗 抗体。
[0066] 3.突光微球标记黄曲霉毒素Ml单克隆抗体
[0067] ( 1)突光微球
[0068] 标记用的荧光微球是内部包埋荧光染料、表面修饰有羧基官能团的微球悬液，荧 光微球由聚苯乙烯包被，粒径1〇〇~300nm，固体含量1%~10%，官能团密度100~600uEq/ g°
[0069] (2)相关溶液的制备
[0070] 活化缓冲液：pH5. 5~6. 5的0? 05mol/L的2- (N-吗啡啉）乙磺酸（MES)溶液。
[0071] 偶联缓冲液：pH7. 5~8. 5的0. 05mol/L硼酸盐缓冲液(避免使用存在游离胺的溶 剂)。
[0072] 封闭缓冲液：pH7. 4的磷酸盐缓冲液（PB)，含0. 1~0. 4mol/L的伯胺(盐酸羟胺、 乙醇胺、氨基乙醇)，1%~10%BSA。
[0073] 贮存缓冲液：pH7. 4的磷酸盐缓冲液（PB)含0? 03%Proclin300及0? 1%BSA。
[0074] 活化剂：水溶性碳二亚胺（摩尔质量比EDC:C00H= (1. 5~3) : 1NHS:⑶0H= (8~ 20) : 1)，临用前以活化缓冲液稀释至所需浓度。
[0075](3)荧光微球标记黄曲霉毒素Ml单克隆抗体
[0076] 通过EDC和NHS介导的与蛋白表面氨基的酰胺化反应完成突光微球标记黄曲霉毒 素Ml单克隆抗体。
[0077] 突光微球标记黄曲霉毒素Ml单克隆抗体的制备：取内部包埋突光染料、表面修 饰有羧基官能团的微球悬液100UL混悬于900iiLpH6. 0的0. 05mol/L的MES缓冲液中， 10000r/min于4°C离心lOmin弃上清，重悬微球于lmLMES缓冲液中，以此法洗漆微球2 次，加入适量活化剂(摩尔质量比EDC:NHS:C00H=1. 5:8:1)，混匀后室温振荡活化lOmin;混 悬液于4°C10000r/min离心lOmin弃上清，重悬于偶联缓冲液中，以此法洗涤微球2次，加 入lOiiL黄曲霉毒素Ml单克隆抗体溶液(蛋白浓度lmg/mL)，混匀后室温振荡偶联120min; 混悬液于4°C10000r/min离心lOmin弃上清，重悬于封闭缓冲液（pH7. 4的PB含0.lmol/ L盐酸羟胺及1%BSA)中，以此法洗涤微球1次，混匀后室温振荡封闭30min;混悬液于 4°C10000r/min离心lOmin弃上清，重悬于贮存缓冲液（pH7. 4的PB含0. 03%Proclin300及 0. 1%BSA)中，以此法洗涤微球1次，混匀后于4°C避光保存。
[0078] 4?样品结合垫的制备
[0079] 将样品结合垫置于含牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在缓冲体系中的终浓度为0. 5% 体积百分含量)、pH7. 2、0.lmol/L磷酸盐缓冲液中均匀浸泡2h，将处理完的样品结合垫平铺 于干燥网上置于37°C干燥室干燥2h(湿度要求30%)，将荧光微球抗体偶联物以贮存缓冲液 稀释后，将样品结合垫浸泡于其中经真空冷冻干燥后制备而得，备用。
[0080] 5.层析膜的制备
[0081] 包被过程：用0. 05mol/L的pH7. 2的磷酸缓冲液将黄曲霉毒素Ml半抗原-卵清 白蛋白偶联物稀释到l〇〇yg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测区 (T线)，包被量为l.OiiL/cm;用O.Olmol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀 释到200yg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控区（C线)，包被量为 1. OiU/cm。将包被好的反应膜置于37°C条件下干燥16h，备用。
[0082] (二）各部件的组装
[0083] 将所述样品结合垫、层析膜、吸水垫依次按顺序粘贴在所述底衬上；样品结合垫的 末端与层析膜的始端相连，层析膜的末端与吸水垫的始端相连，样品结合垫的始端与底衬 的始端对齐，吸水垫的末端与底衬的末端对齐，层析膜上有检测区和质控区，检测区（T线） 和质控区（C线）均为与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测区位于近于样品结合垫的一 侧；
[0084] 质控区位于远离样品结合垫的一侧；将试纸条用机器切成3. 96_宽度的小条，装 在特制的塑料制卡中，形成试纸条用于检测黄曲霉毒素Ml残留，试纸条在2~8°C阴凉避光 干燥保存，有效期为12个月。
[0085] 实施例3样品中黄曲霉毒素Ml的检测
[0086] 1.用试纸条检测样品
[0087] 从原包装中取出所需数目的试纸条，并做好标记；同时将待检牛奶样本置于60~ 70°C水浴5min，取出；用微量移液器吸取150yl待检牛奶样品溶液垂直滴加3~4滴(约 100yL)于加样孔中，液体流动时开始计时，反应3~5min;将试纸条插入KFT-100A型荧光 检测仪的承载器中，通过触摸显示屏选择待检项目，按下"开始检测"按键，荧光检测仪将自 动对检测卡进行扫描测试；通过仪器的显示屏幕上读取检测结果。
[0088] 2.检测结果分析
[0089] 测试完成后，仪器将根据检测得到的荧光信号的强弱，自动计算出牛奶样本中黄 曲霉毒素Ml的浓度值，并根据预设的阈值给出阴阳性判断。
[0090] 阴性（一）：若荧光检测仪的显示屏幕上结果显示为阴性，表示牛奶样本不含有黄 曲霉毒素Ml或其浓度低于检测限。
[0091] 阳性（ + ):若荧光检测仪的显示屏幕上结果显示为阳性，表示牛奶样本黄曲霉毒素 Ml浓度等于或高于检测限。
[0092] 无效：若质控区未检出荧光信号强度，表明不正确的操作过程或试纸条已失效。
[0093] 实施例4试纸条技术参数的确定
[0094] 1.检测限试验
[0095] 向空白牛奶样品中分别添加黄曲霉毒素Ml标准品至终浓度为0、0.05、0. 1、 0. 2yg/L，用试纸条进行牛奶样品检测，结果为：当黄曲霉毒素Ml标准品浓度为0、 0. 05yg/L时，荧光检测仪结果显示为阴性，当黄曲霉毒素Ml标准品浓度为0. 1、0. 2yg/ L时，荧光检测仪结果显示为阳性，表明本试纸条对牛奶样品黄曲霉毒素Ml检测限为 0. 1ug/L〇
[0096] 2.假阳性率、假阴性率试验
[0097] 取已知黄曲霉毒素Ml含量大于0. 1iig/L的牛奶阳性样品20份和黄曲霉毒素Ml 含量小于0. 1Ug/L的牛奶阴性样品20份，用3个批次生产的试纸条分别进行检测，结果见 表1、表2。
[0098] 表1检测阳性样品结果
[0100] 表2检测阴性样品结果
[0102] 结果表明：用3个批次生产的试纸条检测阳性牛奶样品时，荧光检测仪结果显示 全为阳性，可知阳性样本符合率为100%，假阴性率为0。检测20份阴性牛奶样品时，荧光检 测仪结果显示全为阴性，可知阴性符合率为100%，假阳性率为0。本发明的检测黄曲霉毒素 Ml试纸条可以对牛奶样品中黄曲霉毒素Ml残留进行快速检测。
【主权项】
1. 一种检测黄曲霉毒素Ml的突光微球免疫层析试纸条，其特征在于包括由样品结合 垫、层析膜、吸水垫和底衬组成的试纸条；所述样品结合垫上含有荧光微球标记黄曲霉毒素 Ml单克隆抗体；所述层析膜上有检测区和质控区，检测区包被有黄曲霉毒素Ml半抗原-载 体蛋白偶联物，质控区包被有羊抗鼠抗抗体。所述样品结合垫是将荧光微球抗体偶联物以 特定缓冲体系稀释后，将样品结合垫浸泡于稀释缓冲液中，经真空冷冻干燥后制备而得；所 述荧光微球是内部包埋荧光染料、表面修饰有羧基官能团的微球悬液，荧光微球由聚苯乙 烯包被，粒径1〇〇~300nm，固体含量1%~10%，官能团密度100~600uEq/g。2. 如权利要求1所述的检测黄曲霉毒素Ml的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于所 述的荧光微球标记黄曲霉毒素Ml单克隆抗体是通过EDC和NHS介导的与蛋白表面氨基的 酰胺化反应获得的。3. 如权利要求1所述的检测黄曲霉毒素Ml的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于所 述的黄曲霉毒素Ml半抗原是由黄曲霉毒素Ml与对苯二胺反应获得，包括如下步骤： 65mg黄曲霉毒素Ml溶于ImLDMSO, 60°C下缓慢滴加入25mg对苯二胺和0.ImL吡啶在ImLDMSO的混合液中，滴加完毕后，继续反应15h，旋蒸除去溶剂，柱层析纯化后得到黄曲霉 毒素Ml的对苯二胺单缩合物。4. 如权利要求1所述的检测黄曲霉毒素Ml的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于 所述荧光微球标记黄曲霉毒素Ml单克隆抗体的黄曲霉毒素Ml单克隆抗体是以黄曲霉毒素 Ml半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得的。5. 权利要求1所述的检测黄曲霉毒素Ml的荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，其特 征在于包括如下步骤： 1) 制备黄曲霉毒素Ml单克隆抗体； 2) 制备突光微球标记黄曲霉毒素Ml单克隆抗体，并在样品结合垫中包埋突光微球抗 体偶联物； 3) 将样品结合垫、层析膜、吸水垫由一端依次粘贴在底衬上组装成试纸条； 4) 切割、组装成试纸条用于检测黄曲霉毒素Ml。6. 权利要求1所述的检测黄曲霉毒素Ml的荧光微球免疫层析试纸条用于检测牛奶中 的黄曲霉毒素Ml，其特征在于包括如下步骤： 1) 用权利要求1-4任一项所述的荧光微球免疫层析试纸条进行检测； 2) 用荧光检测仪分析检测结果。
【专利摘要】本发明公开了一种检测黄曲霉毒素M1的荧光微球免疫层析试纸条，包括由样品结合垫、层析膜、吸水垫和粘性底衬组成的试纸条，所述样品结合垫上含有荧光微球标记黄曲霉毒素M1单克隆抗体；所述层析膜上有检测区和质控区，检测区包被有黄曲霉毒素M1半抗原-载体蛋白偶联物，质控区包被有羊抗鼠抗抗体。用本发明试纸条检测黄曲霉毒素M1的方法简单、快速、适用范围广、成本低、易推广使用。
【IPC分类】G01N33/577, G01N33/04
【公开号】CN104897863
【申请号】CN201410079913
【发明人】万宇平, 冯才伟, 赵正苗, 何方洋, 朱亮亮, 冯静, 崔海峰, 余厚美
【申请人】北京勤邦生物技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月6日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测黄曲霉毒素Ml的试纸条及方法，具体涉及一种用于检测牛 奶中黄曲霉毒素Ml的荧光微球免疫层析试纸条。
【背景技术】
[0002] 黄曲霉毒素（aflatoxin，AF)是迄今发现污染农产品毒素最强的一类生物毒素，也 是强致癌物。最为常见的有AF81、82、61、62，其中八？81的存在量与毒性都是最大的。黄 曲霉毒素Ml是黄曲霉毒素B1的4-羟基衍生物，是B1在体内经过羟化而衍生成的代谢产 物，一部分从尿和乳汁排出，另一部分存在于动物的可食部分中。主要存在于土壤、动植物、 霉变谷物、各种坚果、食品、调味品、食用油、牛奶和奶制品等霉变制品中，直接或间接进入 人类食物链，是致癌致畸致突变的毒物，严重威胁人类健康和生命安全。牛乳及其制品是易 受到黄曲霉毒素污染的食品之一。为保证其安全卫生，各国都制定了严格的限量标准。美 国FDA规定牛乳中黄曲霉毒素Ml的限量水平为0. 5iig/kg，我国也规定牛乳中黄曲霉毒素 Ml含量不得超过0. 5iig/kg。
[0003] 目前，对黄曲霉毒素检测的方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、免疫分析 法、质谱法、免疫亲和荧光光度法等。薄层色谱法操作繁琐、污染大、定量差、耗时长；高效 液相色谱法具有灵敏度高、分离能力强、特异性好和测定结果可靠等特点，但如果食品成分 复杂，在进行液相色谱分离前，需对样品作彻底有效的净化处理，不适合于大批量样品的检 测，应用受到限制；酶联免疫吸附法是目前常使用的一种检测方法，它具有快速、灵敏、对样 品纯度要求不高等优点，特别适用于大批量样品的检测，荧光免疫层析法与酶联免疫法相 比检测时间更短，稳定性好、操作简便、无需其他仪器设备，结果判断直观可靠，适用于现场 进行快速筛选。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种检测黄曲霉毒素Ml的荧光微球免疫层析试纸条。
[0005] 本发明所提供的检测黄曲霉毒素Ml的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于包 括由样品结合垫、层析膜、吸水垫和底衬组成的试纸条；所述样品结合垫上含有荧光微球标 记黄曲霉毒素Ml单克隆抗体；所述层析膜上有检测区和质控区，检测区包被有黄曲霉毒素 Ml半抗原-载体蛋白偶联物，质控区包被有羊抗鼠抗抗体。所述样品结合垫是将荧光微球 抗体偶联物以特定缓冲体系稀释后，将样品结合垫浸泡于稀释缓冲液中，经真空冷冻干燥 后制备而得；所述荧光微球是内部包埋荧光染料、表面修饰有羧基官能团的微球悬液，荧光 微球由聚苯乙烯包被，粒径1〇〇~300nm，固体含量1%~10%，官能团密度100~600uEq/g。
[0006] 所述的荧光微球标记黄曲霉毒素Ml单克隆抗体是通过EDC和NHS介导的与蛋白 表面氨基的酰胺化反应制备获得的。
[0007] 所述的黄曲霉毒素Ml半抗原是由黄曲霉毒素Ml与对苯二胺反应获得，包括如下 步骤：
[0008] 65mg黄曲霉毒素Ml溶于lmL二甲基亚砜（DMS0)，60°C下缓慢滴加入25mg对苯二 胺和0.lmL吡啶在lmLDMS0的混合液中，滴加完毕后，继续反应15h，旋蒸除去溶剂，柱层析 纯化后得到黄曲霉毒素Ml的对苯二胺单缩合物。
[0009] 所述荧光微球标记黄曲霉毒素Ml单克隆抗体的黄曲霉毒素Ml单克隆抗体是以黄 曲霉毒素Ml半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得的。
[0010] 所述黄曲霉毒素Ml半抗原-载体蛋白偶联物是由黄曲霉毒素Ml半抗原与载体蛋 白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清白蛋白、甲状腺蛋白、血蓝蛋白、人血清 白蛋白。
[0011] 所述样品结合垫是将样品结合垫置于含牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在缓冲体系 中的终浓度为0. 5%体积百分含量)、pH7. 2、0.lmol/L磷酸盐缓冲液中均匀浸泡2h，将处理 完的样品结合垫平铺于干燥网上置于37°C干燥室干燥2h(湿度要求30%)，将荧光微球抗体 偶联物以贮存缓冲液稀释后，将样品结合垫浸泡于其中经真空冷冻干燥后制备而得，备用。
[0012] 所述底衬为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品结合垫为玻璃纤维膜； 所述吸水垫为吸水纸；所述层析膜为硝酸纤维素膜。
[0013] 本发明的另一个目的是提供一种制备上述黄曲霉毒素Ml荧光微球免疫层析试纸 条的方法，其包括步骤：
[0014] 1)制备黄曲霉毒素Ml单克隆抗体；
[0015] 2)制备突光微球标记黄曲霉毒素Ml单克隆抗体，并在样品结合垫中包埋突光微 球抗体偶联物；
[0016] 3)将样品结合垫、层析膜、吸水垫由一端依次粘贴在底衬上组装成试纸条；
[0017] 4)切割、组装成试纸条用于检测黄曲霉毒素Ml。
[0018] 具体地说，步骤包括：
[0019] 1)将黄曲霉毒素Ml与对苯二胺反应，制备黄曲霉毒素Ml半抗原；
[0020] 2)将黄曲霉毒素Ml半抗原与载体蛋白偶联，制备黄曲霉毒素Ml半抗原-载体蛋 白偶联物；
[0021] 3)用黄曲霉毒素Ml半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓 瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌黄曲霉毒素Ml单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
[0022] 4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；
[0023] 5)通过EDC和NHS介导的与蛋白表面氨基的酰胺化反应完成荧光微球标记黄曲霉 毒素Ml单克隆抗体，得到荧光微球抗体偶联物；
[0024] 6)将荧光微球抗体偶联物以特定缓冲体系稀释后，将样品结合垫浸泡于稀释缓冲 液中，经真空冷冻干燥后制备得到样品结合垫；
[0025] 7)将样品结合垫、层析膜、吸水垫由一端依次粘贴在底衬上组装成试纸条；
[0026] 8)将制备好的试纸条进行切害I]、组装用于检测黄曲霉毒素Ml。
[0027] 本发明的另一个目的是提供一种黄曲霉毒素Ml荧光微球免疫层析试纸条用于检 测牛奶中的黄曲霉毒素Ml残留的方法，包括如下步骤：
[0028] 1)用荧光微球免疫层析试纸条进行检测；
[0029] 2)用荧光检测仪分析检测结果。
[0030] 本发明中用试纸条检测样品时，样本中的黄曲霉毒素Ml在流动的过程中与荧光 微球标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和层析膜检测区（T线）上的黄曲霉毒素Ml 半抗原-载体蛋白偶联物的结合，从而导致检测线荧光抗体信号强度的变化。
[0031] 本发明采用将黄曲霉毒素Ml单克隆抗体与荧光微球偶联物包埋在样品结合垫 上，具有亲水性佳、可大容量吸附抗体偶联物、迅速重湿润、抗体结合物释放充分、性能特 好、释放快、形态好等优势，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。本发明的试纸条具 有成本低、操作简单、检测时间短、储存简单等优点。用本发明的试纸条检测黄曲霉毒素M1， 方法简单、快速、适用范围广、成本低、易推广使用。
【附图说明】
[0032] 图1为试纸条剖面结构示意图。
[0033] 图2为试纸条俯视图。
[0034] 图3为黄曲霉毒素Ml半抗原合成路线图。
[0035] 图4为黄曲霉毒素Ml半抗原核磁共振氢谱图。
【具体实施方式】
[0036] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0037] 实施例1检测黄曲霉毒素Ml的荧光微球免疫层析试纸条的构成
[0038] 所述试纸条是由样品结合垫、层析膜、吸水垫和底衬组成，如图1所示；
[0039] 所述样品结合垫1、层析膜2、吸水垫3依次按顺序粘贴在底衬6上，样品结合垫的 末端与层析膜的始端相连，层析膜的末端与吸水垫相连，样品结合垫的始端与底衬的始端 对齐，吸水垫的末端与底衬的末端对齐；
[0040] 所述层析膜上有检测区4和质控区5,均呈与所述试纸条的长相垂直的条带状，检 测区位于近于样品结合垫的一端，质控区位于远离样品结合垫的一端。样品结合垫上含有 荧光微球标记黄曲霉毒素Ml单克隆抗体；检测区包被有黄曲霉毒素Ml半抗原-载体蛋白 偶联物(黄曲霉毒素Ml半抗原-卵清白蛋白的偶联物)，质控区包被有羊抗鼠抗抗体；
[0041] 所述底衬为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品结合垫为玻璃纤维膜； 所述吸水垫为吸水纸；所述层析膜为硝酸纤维素膜。
[0042] 将制备好的试纸条进行切割、装在特制的塑料制卡中，组装成试纸条在2~8°C阴 凉避光干燥保存，有效期12个月。
[0043] 实施例2实施例1中所述的荧光微球免疫层析试纸条的制备方法
[0044] 一、试纸条的制备
[0045] 试纸条的制备方法主要包括以下步骤：
[0046] 1)制备黄曲霉毒素Ml单克隆抗体；
[0047] 2)制备突光微球标记黄曲霉毒素Ml单克隆抗体，并在样品结合垫中包埋突光微 球抗体偶联物；
[0048] 3)将样品结合垫、层析膜、吸水垫由一端依次粘贴在底衬上组装成试纸条；
[0049] 4)切割、组装成试纸条用于检测黄曲霉毒素Ml。
[0050] 下面分步详细叙述：
[0051] (一）各部件的制备
[0052] 1.黄曲霉毒素Ml抗原和单克隆抗体的制备
[0053] ( 1)黄曲霉毒素Ml半抗原的合成和鉴定
[0054] 半抗原的合成(合成路线如图3 )
[0055] 65mg黄曲霉毒素Ml溶于lmLDMSO, 60°C下缓慢滴加入25mg对苯二胺和0?lmL吡 啶在lmLDMS0的混合液中，滴加完毕后，继续反应15h，旋蒸除去溶剂，柱层析纯化后得到 黄曲霉毒素Ml的对苯二胺单缩合物。
[0056] 半抗原的鉴定
[0057] 取上述产物经核磁共振氢谱测定，如图4所示，图谱中7.Oppm左右增加的2组芳 环信号峰，说明半抗原合成成功。
[0058] (2)免疫原的制备
[0059] 取8. 4mg黄曲霉毒素Ml半抗原溶于2mL水中得到溶液I;取戊二醛50iiL逐滴加 入到溶液I中，室温搅拌反应24h得到溶液II;取50mg牛血清白蛋白（BSA)用4mL水溶解得 到溶液III;将溶液II缓慢加入到溶液III中，室温搅拌反应过夜，加入30mg硼氢化钠（NaBH4) 还原，用〇. 〇2mol/L的PBS透析三天，每天更换透析液三次，得到免疫原。
[0060] (3)包被原的制备
[0061] 将BSA替换成卵清白蛋白（OVA)按上述（2)的步骤制备 得到黄曲霉毒素Ml包被 原。
[0062] (4)黄曲霉毒素Ml单克隆抗体的制备
[0063] 用上述（2)的步骤制备得到的黄曲霉毒素Ml免疫原免疫Balb/c小鼠制备黄曲霉 毒素Ml单克隆抗体。
[0064] 2.羊抗鼠抗抗体的制备
[0065] 以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗 抗体。
[0066] 3.突光微球标记黄曲霉毒素Ml单克隆抗体
[0067] ( 1)突光微球
[0068] 标记用的荧光微球是内部包埋荧光染料、表面修饰有羧基官能团的微球悬液，荧 光微球由聚苯乙烯包被，粒径1〇〇~300nm，固体含量1%~10%，官能团密度100~600uEq/ g°
[0069] (2)相关溶液的制备
[0070] 活化缓冲液：pH5. 5~6. 5的0? 05mol/L的2- (N-吗啡啉）乙磺酸（MES)溶液。
[0071] 偶联缓冲液：pH7. 5~8. 5的0. 05mol/L硼酸盐缓冲液(避免使用存在游离胺的溶 剂)。
[0072] 封闭缓冲液：pH7. 4的磷酸盐缓冲液（PB)，含0. 1~0. 4mol/L的伯胺(盐酸羟胺、 乙醇胺、氨基乙醇)，1%~10%BSA。
[0073] 贮存缓冲液：pH7. 4的磷酸盐缓冲液（PB)含0? 03%Proclin300及0? 1%BSA。
[0074] 活化剂：水溶性碳二亚胺（摩尔质量比EDC:C00H= (1. 5~3) : 1NHS:⑶0H= (8~ 20) : 1)，临用前以活化缓冲液稀释至所需浓度。
[0075](3)荧光微球标记黄曲霉毒素Ml单克隆抗体
[0076] 通过EDC和NHS介导的与蛋白表面氨基的酰胺化反应完成突光微球标记黄曲霉毒 素Ml单克隆抗体。
[0077] 突光微球标记黄曲霉毒素Ml单克隆抗体的制备：取内部包埋突光染料、表面修 饰有羧基官能团的微球悬液100UL混悬于900iiLpH6. 0的0. 05mol/L的MES缓冲液中， 10000r/min于4°C离心lOmin弃上清，重悬微球于lmLMES缓冲液中，以此法洗漆微球2 次，加入适量活化剂(摩尔质量比EDC:NHS:C00H=1. 5:8:1)，混匀后室温振荡活化lOmin;混 悬液于4°C10000r/min离心lOmin弃上清，重悬于偶联缓冲液中，以此法洗涤微球2次，加 入lOiiL黄曲霉毒素Ml单克隆抗体溶液(蛋白浓度lmg/mL)，混匀后室温振荡偶联120min; 混悬液于4°C10000r/min离心lOmin弃上清，重悬于封闭缓冲液（pH7. 4的PB含0.lmol/ L盐酸羟胺及1%BSA)中，以此法洗涤微球1次，混匀后室温振荡封闭30min;混悬液于 4°C10000r/min离心lOmin弃上清，重悬于贮存缓冲液（pH7. 4的PB含0. 03%Proclin300及 0. 1%BSA)中，以此法洗涤微球1次，混匀后于4°C避光保存。
[0078] 4?样品结合垫的制备
[0079] 将样品结合垫置于含牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在缓冲体系中的终浓度为0. 5% 体积百分含量)、pH7. 2、0.lmol/L磷酸盐缓冲液中均匀浸泡2h，将处理完的样品结合垫平铺 于干燥网上置于37°C干燥室干燥2h(湿度要求30%)，将荧光微球抗体偶联物以贮存缓冲液 稀释后，将样品结合垫浸泡于其中经真空冷冻干燥后制备而得，备用。
[0080] 5.层析膜的制备
[0081] 包被过程：用0. 05mol/L的pH7. 2的磷酸缓冲液将黄曲霉毒素Ml半抗原-卵清 白蛋白偶联物稀释到l〇〇yg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测区 (T线)，包被量为l.OiiL/cm;用O.Olmol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀 释到200yg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控区（C线)，包被量为 1. OiU/cm。将包被好的反应膜置于37°C条件下干燥16h，备用。
[0082] (二）各部件的组装
[0083] 将所述样品结合垫、层析膜、吸水垫依次按顺序粘贴在所述底衬上；样品结合垫的 末端与层析膜的始端相连，层析膜的末端与吸水垫的始端相连，样品结合垫的始端与底衬 的始端对齐，吸水垫的末端与底衬的末端对齐，层析膜上有检测区和质控区，检测区（T线） 和质控区（C线）均为与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测区位于近于样品结合垫的一 侧；
[0084] 质控区位于远离样品结合垫的一侧；将试纸条用机器切成3. 96_宽度的小条，装 在特制的塑料制卡中，形成试纸条用于检测黄曲霉毒素Ml残留，试纸条在2~8°C阴凉避光 干燥保存，有效期为12个月。
[0085] 实施例3样品中黄曲霉毒素Ml的检测
[0086] 1.用试纸条检测样品
[0087] 从原包装中取出所需数目的试纸条，并做好标记；同时将待检牛奶样本置于60~ 70°C水浴5min，取出；用微量移液器吸取150yl待检牛奶样品溶液垂直滴加3~4滴(约 100yL)于加样孔中，液体流动时开始计时，反应3~5min;将试纸条插入KFT-100A型荧光 检测仪的承载器中，通过触摸显示屏选择待检项目，按下"开始检测"按键，荧光检测仪将自 动对检测卡进行扫描测试；通过仪器的显示屏幕上读取检测结果。
[0088] 2.检测结果分析
[0089] 测试完成后，仪器将根据检测得到的荧光信号的强弱，自动计算出牛奶样本中黄 曲霉毒素Ml的浓度值，并根据预设的阈值给出阴阳性判断。
[0090] 阴性（一）：若荧光检测仪的显示屏幕上结果显示为阴性，表示牛奶样本不含有黄 曲霉毒素Ml或其浓度低于检测限。
[0091] 阳性（ + ):若荧光检测仪的显示屏幕上结果显示为阳性，表示牛奶样本黄曲霉毒素 Ml浓度等于或高于检测限。
[0092] 无效：若质控区未检出荧光信号强度，表明不正确的操作过程或试纸条已失效。
[0093] 实施例4试纸条技术参数的确定
[0094] 1.检测限试验
[0095] 向空白牛奶样品中分别添加黄曲霉毒素Ml标准品至终浓度为0、0.05、0. 1、 0. 2yg/L，用试纸条进行牛奶样品检测，结果为：当黄曲霉毒素Ml标准品浓度为0、 0. 05yg/L时，荧光检测仪结果显示为阴性，当黄曲霉毒素Ml标准品浓度为0. 1、0. 2yg/ L时，荧光检测仪结果显示为阳性，表明本试纸条对牛奶样品黄曲霉毒素Ml检测限为 0. 1ug/L〇
[0096] 2.假阳性率、假阴性率试验
[0097] 取已知黄曲霉毒素Ml含量大于0. 1iig/L的牛奶阳性样品20份和黄曲霉毒素Ml 含量小于0. 1Ug/L的牛奶阴性样品20份，用3个批次生产的试纸条分别进行检测，结果见 表1、表2。
[0098] 表1检测阳性样品结果
[0100] 表2检测阴性样品结果
[0102] 结果表明：用3个批次生产的试纸条检测阳性牛奶样品时，荧光检测仪结果显示 全为阳性，可知阳性样本符合率为100%，假阴性率为0。检测20份阴性牛奶样品时，荧光检 测仪结果显示全为阴性，可知阴性符合率为100%，假阳性率为0。本发明的检测黄曲霉毒素 Ml试纸条可以对牛奶样品中黄曲霉毒素Ml残留进行快速检测。
【主权项】
1. 一种检测黄曲霉毒素Ml的突光微球免疫层析试纸条，其特征在于包括由样品结合 垫、层析膜、吸水垫和底衬组成的试纸条；所述样品结合垫上含有荧光微球标记黄曲霉毒素 Ml单克隆抗体；所述层析膜上有检测区和质控区，检测区包被有黄曲霉毒素Ml半抗原-载 体蛋白偶联物，质控区包被有羊抗鼠抗抗体。所述样品结合垫是将荧光微球抗体偶联物以 特定缓冲体系稀释后，将样品结合垫浸泡于稀释缓冲液中，经真空冷冻干燥后制备而得；所 述荧光微球是内部包埋荧光染料、表面修饰有羧基官能团的微球悬液，荧光微球由聚苯乙 烯包被，粒径1〇〇~300nm，固体含量1%~10%，官能团密度100~600uEq/g。2. 如权利要求1所述的检测黄曲霉毒素Ml的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于所 述的荧光微球标记黄曲霉毒素Ml单克隆抗体是通过EDC和NHS介导的与蛋白表面氨基的 酰胺化反应获得的。3. 如权利要求1所述的检测黄曲霉毒素Ml的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于所 述的黄曲霉毒素Ml半抗原是由黄曲霉毒素Ml与对苯二胺反应获得，包括如下步骤： 65mg黄曲霉毒素Ml溶于ImLDMSO, 60°C下缓慢滴加入25mg对苯二胺和0.ImL吡啶在ImLDMSO的混合液中，滴加完毕后，继续反应15h，旋蒸除去溶剂，柱层析纯化后得到黄曲霉 毒素Ml的对苯二胺单缩合物。4. 如权利要求1所述的检测黄曲霉毒素Ml的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于 所述荧光微球标记黄曲霉毒素Ml单克隆抗体的黄曲霉毒素Ml单克隆抗体是以黄曲霉毒素 Ml半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得的。5. 权利要求1所述的检测黄曲霉毒素Ml的荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，其特 征在于包括如下步骤： 1) 制备黄曲霉毒素Ml单克隆抗体； 2) 制备突光微球标记黄曲霉毒素Ml单克隆抗体，并在样品结合垫中包埋突光微球抗 体偶联物； 3) 将样品结合垫、层析膜、吸水垫由一端依次粘贴在底衬上组装成试纸条； 4) 切割、组装成试纸条用于检测黄曲霉毒素Ml。6. 权利要求1所述的检测黄曲霉毒素Ml的荧光微球免疫层析试纸条用于检测牛奶中 的黄曲霉毒素Ml，其特征在于包括如下步骤： 1) 用权利要求1-4任一项所述的荧光微球免疫层析试纸条进行检测； 2) 用荧光检测仪分析检测结果。
【专利摘要】本发明公开了一种检测黄曲霉毒素M1的荧光微球免疫层析试纸条，包括由样品结合垫、层析膜、吸水垫和粘性底衬组成的试纸条，所述样品结合垫上含有荧光微球标记黄曲霉毒素M1单克隆抗体；所述层析膜上有检测区和质控区，检测区包被有黄曲霉毒素M1半抗原-载体蛋白偶联物，质控区包被有羊抗鼠抗抗体。用本发明试纸条检测黄曲霉毒素M1的方法简单、快速、适用范围广、成本低、易推广使用。
【IPC分类】G01N33/577, G01N33/04
【公开号】CN104897863
【申请号】CN201410079913
【发明人】万宇平, 冯才伟, 赵正苗, 何方洋, 朱亮亮, 冯静, 崔海峰, 余厚美
【申请人】北京勤邦生物技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月6日
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