一种青蒿素及其衍生物抗肿瘤活性的体外筛选方法
一种青蒿素及其衍生物抗肿瘤活性的体外筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抗肿瘤药物活性的体外筛选方法，具体涉及一种基于青蒿素及其 衍生物与转铁蛋白结合能力强弱为判断依据的抗肿瘤活性的体外筛选方法。
【背景技术】
[0002] 青蒿素是我国首先从传统中药-青蒿中分离得到的一种具有独特过氧桥结构的 倍半萜内酯化合物，青蒿素及其衍生物如双氢青蒿素、青蒿琥酯等具有高效抗疟活性和良 好的安全性，已广泛应用于临床。近年来大量研宄表明，青蒿素类化合物还具有抗肿瘤、抗 病毒和免疫调节等多种重要药理作用，特别是青蒿素及其衍生物的抗肿瘤作用日益受到研 宄者的关注。
[0003] Beekman(PlantaMed.，1998,64(7) :615_619)等研宄了双氢青蒿素对 9 种不同 组织60株肿瘤细胞的抑制作用，结果表明双氢青蒿素对白血病、黑色素瘤、结肠癌、前列腺 癌和乳腺癌细胞高度敏感；Jiao(ActaPharmacolSin，2007, 28(7) : 1045-1056)等的研宄 显示卵巢癌细胞对双氢青蒿素的敏感性比正常卵巢细胞高5-10倍；Lai(LifeScience， 2001，70 (1) :49-56)等的研宄证明在有转铁蛋白存在或同时给予硫酸亚铁时，青蒿素类化 合物对肿瘤细胞具有选择性杀伤作用而对正常细胞损伤极小，并证实青蒿素类化合物与转 铁蛋白结合可有效选择杀伤人白血病Molt-4肿瘤细胞，而对正常细胞几乎没有毒性！美 国国立癌肿研宄所对青蒿琥酯抗肿瘤活性的研宄表明，青蒿琥酯对55种人体肿瘤细胞系 具有抑制作用，对白血病和结肠癌细胞最敏感。
[0004] 与此同时，青蒿素及其衍生物抗肿瘤机制的研宄也取得一定的成果，研宄结果表 明青蒿素及其衍生物主要抗肿瘤机制与其抗疟作用机制相似，过氧桥是其抗肿瘤活性基 团，青蒿素及其衍生物在细胞内亚铁离子催化下过氧桥断裂产生自由基，从而对细胞产生 毒性作用。对肿瘤细胞而言，由于其快速增殖需要大量的Fe(II)作为合成去氧核糖的原 料，使其细胞表面的转铁蛋白受体高度表达，出现肿瘤细胞中Fe(II)的含量远远高于正常 细胞的现象，这可以使青蒿素及其衍生物表现出对肿瘤细胞的选择性杀伤作用。鉴于青蒿 素及其衍生物拥有的强抗癌作用和高度选择性，使得青蒿素类化合物在抗肿瘤药物研宄领 域越来越受到重视，如美国国立癌肿研宄所已将其列为抗癌药物筛选及抗癌活性的重点研 宄课题。
[0005] 自1979年李英等首次报道青蒿素衍生物的合成以来，已有几百个青蒿素类衍生 物被合成，其中90%以上的衍生物是以双氢青蒿素为母核对其C-12位羟基进行修饰的产 物，主要有醚类衍生物、酯类衍生物和杂原子取代双氢青蒿素羟基中氧的衍生物，以及青蒿 素多聚体等。相对于青蒿素类衍生物的合成而言，具有抗肿瘤活性青蒿素类衍生物的筛选 工作却严重滞后。目前，青蒿素及其衍生物抗肿瘤活性筛选主要采用直接的体内体外抗肿 瘤活性比较方法，该方法具有直接准确的优点，但成本高耗时长。因此，尽快建立青蒿素类 衍生物的体外活性筛选方法，对所合成的大量青蒿素类衍生物进行初步的活性筛选，对于 为新型高性能的青蒿素衍生物合成提供理论依据，同时加快青蒿素类衍生物临床应用的研 发进程，具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于解决具有抗肿瘤活性的青蒿素类衍生物的筛选工作严重滞后 的技术问题，建立一种利用光谱学方法，依据青蒿素及其衍生物与转铁蛋白结合能力强弱 来判断的青蒿素类衍生物抗肿瘤活性的体外筛选方法。该方法可以快速有效判断青蒿素衍 生物抗肿瘤活性，对推动其在抗肿瘤领域中的应用。
[0007] 为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是：
[0008] 一种青蒿素及其衍生物抗肿瘤活性的体外筛选方法，采用紫外-可见吸收光谱或 荧光光谱分析青蒿素或其衍生物与转铁蛋白的相互作用，计算青蒿素或其衍生物与转铁蛋 白的结合常数Kb，比较青蒿素或其衍生物与转铁蛋白的结合常数Kb或根据结合常数Kb进行 排序，推断青蒿素或其衍生物抗肿瘤活性的强弱顺序，再采用抗肿瘤活性实验验证上述筛 选结果。
[0009] 鉴于青蒿素及其衍生物的抗肿瘤活性与血液中和肿瘤组织部位存在的转铁蛋白 有着至关重要的关系，本发明建立依据青蒿素及其衍生物与转铁蛋白结合能力强弱来判断 的青蒿素类衍生物抗肿瘤活性的体外筛选方法。运用紫外-可见光谱或荧光光谱技术，测 定青蒿素及其衍生物与转铁蛋白的相互作用结合常数Kb，结合抗肿瘤活性实验结果，建立 依据青蒿素及其衍生物与转铁蛋白结合能力强弱（Kb大小）来判断的青蒿素类衍生物抗肿 瘤活性的体外筛选方法，为新型青蒿素类药物的设计合成及其临床应用提供理论和实践基 础。
[0010] 具体地，所述的方法包括以下步骤：
[0011] 1)浓度恒定的转铁蛋白溶液中，逐渐增大溶液中青蒿素或其衍生物的浓度，扫描 其紫外-可见光谱，由下列方程求出结合常数kb;
[0012] A〇/A_A〇 - ￡Tf/ (eART-Tf_eTf) (1 + 1/kb[ARTS])
[0013] 式中：&和A分别表示青蒿素或其衍生物不存在和存在时转铁蛋白溶液的吸光 度；[ARTS]为青蒿素或其衍生物的浓度；e"和eAKT_Tf分别表示转铁蛋白和青蒿素或其衍 生物-转铁蛋白复合物的吸收系数；
[0014] 或者
[0015] 浓度恒定的转铁蛋白溶液中，逐渐增大溶液中青蒿素或其衍生物的浓度，以280nm 的激发波长扫描其荧光发射光谱；由下列方程计算结合常数Kb和结合位点数n;
[0016] l〇g[(F0-F)/F] =logKb+nlog[Q]
[0017] 式中：匕和F分别表示猝灭剂不存在和存在时转铁蛋白溶液的荧光强度；[Q]为青 蒿素或其衍生物的浓度；
[0018] 2)比较青蒿素或其衍生物与转铁蛋白的结合常数Kb或根据结合常数Kb进行排序， 推断青蒿素或其衍生物抗肿瘤活性的强弱顺序；
[0019] 3)采用抗肿瘤活性实验验证上述筛选结果。
[0020] 本发明中所涉及的青蒿素或其衍生物包括青蒿素、双氢青蒿素、9-0H青蒿素、青蒿 素醚类衍生物、酯类衍生物和杂原子取代双氢青蒿素羟基中氧的衍生物等。所述的青蒿素 醚类衍生物包括蒿甲醚、篙乙醚等，酯类衍生物包括青蒿琥酯、青蒿素碳酸脂、青蒿素羧酸 酯等，杂原子取代双氢青蒿素羟基中氧的衍生物包括含卤素、氮、硫等杂原子的双氢青蒿素 衍生物。
[0021] 所述的方法中，转铁蛋白浓度范围为1.0X10_6~lX10_4mol/L;青蒿素或其衍生 物浓度范围为1.0X10-6~1X10 _3mol/L。
[0022] 有益效果：本发明建立了一种依据青蒿素及其衍生物与转铁蛋白结合能力强弱来 判断的青蒿素类衍生物抗肿瘤活性的体外筛选方法，利用光谱学方法，测定青蒿素或其衍 生物与转铁蛋白的结合常数Kb，根据结合常数Kb进行排序并推断青蒿素或其衍生物抗肿瘤 活性的强弱顺序，结合抗肿瘤活性实验结果，从而对青蒿素或其衍生物的抗肿瘤活性进行 体外筛选。该方法可以快速有效判断青蒿素衍生物抗肿瘤活性，为新型青蒿素类药物的设 计合成及其临床应用提供理论和实践基础，推动其在抗肿瘤领域中的应用。本发明所述的 方法具有成本低，耗时短，操作简单，重现性佳的优点。
【附图说明】
[0023] 图1青蒿素（A)、双氢青蒿素⑶和9-OH青蒿素（C)与转铁蛋白在298k(l)及 310k(2)下相互作用的荧光发射光谱；[转铁蛋白]=1.0Xl(T6m〇l/L，[药物V(a-f)= 0、2/3、4/3、2、8/3、10/3Xl(T6mol/L;Xex = 280nm，pH= 7. 00
[0024] 图2青蒿素（A)、双氢青蒿素⑶和9-OH青蒿素（C)猝灭转铁蛋白荧光的 l〇g(FQ-F)/F对log[Q]的线性拟合曲线（298及310K)。
【具体实施方式】
[0025] 下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要 指出以下实施例只用于对
【发明内容】
的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。
[0026] 在本发明的实施例中，所用的青蒿素衍生物为双氢青蒿素和9-OH青蒿素。双氢青 蒿素和9-OH青蒿素作为商品化的青蒿素衍生物，已被用于临床治疗疟疾，研宄表明双氢青 蒿素和9-OH青蒿素还具有一定的抗肿瘤活性。本发明通过以下的实施例进行描述是为了 阐明本发明，而不是以任何方式限制本发明。本发明的依据青蒿素衍生物与转铁蛋白结合 能力强弱来判断的青蒿素类衍生物抗肿瘤活性的体外筛选方法同样适用青蒿素及其它青 蒿素衍生物。
[0027] 实施例1
[0028] 在浓度范围为1.OX1(T6~IXl(T4m〇l/L内配置转铁蛋白溶液，固定转铁蛋白的浓 度，分别加入青蒿素、双氢青蒿素和9-OH青蒿素，在浓度范围1.0XKT6~lXl(T3m〇l/L内 逐渐增大溶液中青蒿素、双氢青蒿素（DHA)和9-OH青蒿素（9-OHQHS)的浓度，以280nm的 激发波长分别在298K和310K下扫描不同体系的焚光发射光谱，焚光发射光谱如图1所不。
[0029] 由下列方程可以计算结合常数Kb和结合位点数n
[0030] l〇g[(F0-F)/F] =logKb+nlog[Q]
[0031] 式中：匕和F分别表示猝灭剂不存在和存在时转铁蛋白的荧光强度；[Q]为青蒿素 衍生物的浓度。
[0032] 可采用线性回归的方法，青蒿素衍生物猝灭转铁蛋白荧光的lgt^-FVF]对 lg[Q]的线性拟合曲线，斜率即为结合位点数n，截距即为logKb，从而可以求出青蒿素衍生 物与转铁蛋白相互作用的结合常数Kb。
[0033] 实验结果如表1和表2所示。结果显示在两种不同温度条件下，双氢青蒿素的Kb 均强于9-OH青蒿素，预判双氢青蒿素的抗肿瘤活性强于9-OH青蒿素。抗肿瘤实验采用MTT 比色法测定。抗肿瘤实验证明双氢青蒿素和9-OH青蒿素抗肿瘤活性的IC5(I分别为21. 94 和56. 95yM。实验结果证明两种青蒿素衍生物与转铁蛋白结合能力强弱规律与其抗肿瘤活 性强弱规律一致。
[0034] 表1青蒿素、双氢青蒿素和9-OH青蒿素与转铁蛋白结合常数对比表
[0036] 表2青蒿素、双氢青蒿素和9-OH青蒿素抗肿瘤活性IC5(I对比表
[0038] 本发明的体外筛选方法，依据青蒿素衍生物与转铁蛋白结合能力强弱来判断的青 蒿素类衍生物抗肿瘤活性。实施例中青蒿素衍生物与转铁蛋白结合能力强弱使用青蒿素衍 生物与转铁蛋白蛋白结合常数Kb为指标判断，本领域技术人员不难理解，上述指标还可通 过紫外-可见吸收光谱技术获得。
[0039] 实施例2,与实施例1基本相同，但所述的青蒿素衍生物为蒿甲醚或篙乙醚。
[0040] 实施例3,与实施例1基本相同，但所述的青蒿素衍生物为青蒿琥酯、青蒿素碳酸 脂和青蒿素羧酸酯。
[0041] 实施例4,与实施例1基本相同，但所述的青蒿素衍生物为卤素、氮或硫杂原子取 代的双氢青蒿素衍生物。
【主权项】
1. 一种青蒿素及其衍生物抗肿瘤活性的体外筛选方法，其特征在于，采用紫外-可见 吸收光谱或荧光光谱分析青蒿素或其衍生物与转铁蛋白的相互作用，计算青蒿素或其衍生 物与转铁蛋白的结合常数Kb，比较青蒿素或其衍生物与转铁蛋白的结合常数Kb或根据结合 常数Kb进行排序，推断青蒿素或其衍生物抗肿瘤活性的强弱顺序，再采用抗肿瘤活性实验 验证上述筛选结果。2. 根据权利要求1所述的青蒿素及其衍生物抗肿瘤活性的体外筛选方法，其特征在 于，所述的方法包括以下步骤： 1) 浓度恒定的转铁蛋白溶液中，逐渐增大溶液中青蒿素或其衍生物的浓度，扫描其紫 外-可见光谱，由下列方程求出结合常数kb A0A-A0=eTf/(e ART-Tf- ￡Tf) (1 + 1/kb[ARTS]) 式中：Atl和A分别表示青蒿素或其衍生物不存在和存在时转铁蛋白溶液的吸光度； [ARTS]为青蒿素或其衍生物的浓度；￡"和e__"分别表示转铁蛋白和青蒿素或其衍生 物-转铁蛋白复合物的吸收系数； 或者 浓度恒定的转铁蛋白溶液中，逐渐增大溶液中青蒿素或其衍生物的浓度，以280nm的 激发波长扫描其荧光发射光谱；由下列方程计算结合常数Kb和结合位点数n log[ (F0-F)/F] =logKb+nlog[Q] 式中：Ftl和F分别表示猝灭剂不存在和存在时转铁蛋白溶液的荧光强度；[Q]为青蒿素 或其衍生物的浓度； 2) 比较青蒿素或其衍生物与转铁蛋白的结合常数Kb或根据结合常数Kb进行排序，推 断青蒿素或其衍生物抗肿瘤活性的强弱顺序； 3) 采用抗肿瘤活性实验验证上述筛选结果。3. 根据权利要求1或2所述的青蒿素及其衍生物抗肿瘤活性的体外筛选方法，其特征 在于，所述的青蒿素或其衍生物为青蒿素、双氢青蒿素、9-0H青蒿素、青蒿素醚类衍生物、酯 类衍生物和杂原子取代双氢青蒿素羟基中氧的衍生物。4. 根据权利要求3所述的青蒿素及其衍生物抗肿瘤活性的体外筛选方法，其特征在 于，所述的青蒿素醚类衍生物为蒿甲醚或篙乙醚，酯类衍生物为青蒿琥酯、青蒿素碳酸脂或 青蒿素羧酸酯，杂原子取代双氢青蒿素羟基中氧的衍生物为卤素、氮或硫杂原子取代的双 氢青蒿素衍生物。5. 根据权利要求2所述的青蒿素及其衍生物抗肿瘤活性的体外筛选方法，其特征在 于，所述的方法中，转铁蛋白浓度范围为I.OX10_6~IX10 _4mol/L;青蒿素或其衍生物浓度 范围为1.0\1〇-6~1父1〇-3111〇1/1 〇
【专利摘要】一种青蒿素及其衍生物抗肿瘤活性的体外筛选方法，采用紫外-可见吸收光谱或荧光光谱分析青蒿素或其衍生物与转铁蛋白的相互作用，计算青蒿素或其衍生物与转铁蛋白的结合常数Kb，比较青蒿素或其衍生物与转铁蛋白的结合常数Kb或根据结合常数Kb进行排序，推断青蒿素或其衍生物抗肿瘤活性的强弱顺序，再采用抗肿瘤活性实验验证上述筛选结果。本发明利用光谱学方法测定青蒿素或其衍生物与转铁蛋白的结合常数Kb，结合抗肿瘤活性实验结果，依据结合常数Kb的排序对青蒿素或其衍生物的抗肿瘤活性进行体外筛选。该方法可以快速有效判断青蒿素衍生物抗肿瘤活性，为新型青蒿素类药物的设计合成及其临床应用提供基础，推动其在抗肿瘤领域中的应用。
【IPC分类】G01N21/31, G01N33/50, G01N21/64
【公开号】CN104897887
【申请号】CN201510295429
【发明人】周家宏, 周林, 魏少华, 肖梦思, 袁秀雪
【申请人】南京师范大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月2日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抗肿瘤药物活性的体外筛选方法，具体涉及一种基于青蒿素及其 衍生物与转铁蛋白结合能力强弱为判断依据的抗肿瘤活性的体外筛选方法。
【背景技术】
[0002] 青蒿素是我国首先从传统中药-青蒿中分离得到的一种具有独特过氧桥结构的 倍半萜内酯化合物，青蒿素及其衍生物如双氢青蒿素、青蒿琥酯等具有高效抗疟活性和良 好的安全性，已广泛应用于临床。近年来大量研宄表明，青蒿素类化合物还具有抗肿瘤、抗 病毒和免疫调节等多种重要药理作用，特别是青蒿素及其衍生物的抗肿瘤作用日益受到研 宄者的关注。
[0003] Beekman(PlantaMed.，1998,64(7) :615_619)等研宄了双氢青蒿素对 9 种不同 组织60株肿瘤细胞的抑制作用，结果表明双氢青蒿素对白血病、黑色素瘤、结肠癌、前列腺 癌和乳腺癌细胞高度敏感；Jiao(ActaPharmacolSin，2007, 28(7) : 1045-1056)等的研宄 显示卵巢癌细胞对双氢青蒿素的敏感性比正常卵巢细胞高5-10倍；Lai(LifeScience， 2001，70 (1) :49-56)等的研宄证明在有转铁蛋白存在或同时给予硫酸亚铁时，青蒿素类化 合物对肿瘤细胞具有选择性杀伤作用而对正常细胞损伤极小，并证实青蒿素类化合物与转 铁蛋白结合可有效选择杀伤人白血病Molt-4肿瘤细胞，而对正常细胞几乎没有毒性！美 国国立癌肿研宄所对青蒿琥酯抗肿瘤活性的研宄表明，青蒿琥酯对55种人体肿瘤细胞系 具有抑制作用，对白血病和结肠癌细胞最敏感。
[0004] 与此同时，青蒿素及其衍生物抗肿瘤机制的研宄也取得一定的成果，研宄结果表 明青蒿素及其衍生物主要抗肿瘤机制与其抗疟作用机制相似，过氧桥是其抗肿瘤活性基 团，青蒿素及其衍生物在细胞内亚铁离子催化下过氧桥断裂产生自由基，从而对细胞产生 毒性作用。对肿瘤细胞而言，由于其快速增殖需要大量的Fe(II)作为合成去氧核糖的原 料，使其细胞表面的转铁蛋白受体高度表达，出现肿瘤细胞中Fe(II)的含量远远高于正常 细胞的现象，这可以使青蒿素及其衍生物表现出对肿瘤细胞的选择性杀伤作用。鉴于青蒿 素及其衍生物拥有的强抗癌作用和高度选择性，使得青蒿素类化合物在抗肿瘤药物研宄领 域越来越受到重视，如美国国立癌肿研宄所已将其列为抗癌药物筛选及抗癌活性的重点研 宄课题。
[0005] 自1979年李英等首次报道青蒿素衍生物的合成以来，已有几百个青蒿素类衍生 物被合成，其中90%以上的衍生物是以双氢青蒿素为母核对其C-12位羟基进行修饰的产 物，主要有醚类衍生物、酯类衍生物和杂原子取代双氢青蒿素羟基中氧的衍生物，以及青蒿 素多聚体等。相对于青蒿素类衍生物的合成而言，具有抗肿瘤活性青蒿素类衍生物的筛选 工作却严重滞后。目前，青蒿素及其衍生物抗肿瘤活性筛选主要采用直接的体内体外抗肿 瘤活性比较方法，该方法具有直接准确的优点，但成本高耗时长。因此，尽快建立青蒿素类 衍生物的体外活性筛选方法，对所合成的大量青蒿素类衍生物进行初步的活性筛选，对于 为新型高性能的青蒿素衍生物合成提供理论依据，同时加快青蒿素类衍生物临床应用的研 发进程，具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于解决具有抗肿瘤活性的青蒿素类衍生物的筛选工作严重滞后 的技术问题，建立一种利用光谱学方法，依据青蒿素及其衍生物与转铁蛋白结合能力强弱 来判断的青蒿素类衍生物抗肿瘤活性的体外筛选方法。该方法可以快速有效判断青蒿素衍 生物抗肿瘤活性，对推动其在抗肿瘤领域中的应用。
[0007] 为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是：
[0008] 一种青蒿素及其衍生物抗肿瘤活性的体外筛选方法，采用紫外-可见吸收光谱或 荧光光谱分析青蒿素或其衍生物与转铁蛋白的相互作用，计算青蒿素或其衍生物与转铁蛋 白的结合常数Kb，比较青蒿素或其衍生物与转铁蛋白的结合常数Kb或根据结合常数Kb进行 排序，推断青蒿素或其衍生物抗肿瘤活性的强弱顺序，再采用抗肿瘤活性实验验证上述筛 选结果。
[0009] 鉴于青蒿素及其衍生物的抗肿瘤活性与血液中和肿瘤组织部位存在的转铁蛋白 有着至关重要的关系，本发明建立依据青蒿素及其衍生物与转铁蛋白结合能力强弱来判断 的青蒿素类衍生物抗肿瘤活性的体外筛选方法。运用紫外-可见光谱或荧光光谱技术，测 定青蒿素及其衍生物与转铁蛋白的相互作用结合常数Kb，结合抗肿瘤活性实验结果，建立 依据青蒿素及其衍生物与转铁蛋白结合能力强弱（Kb大小）来判断的青蒿素类衍生物抗肿 瘤活性的体外筛选方法，为新型青蒿素类药物的设计合成及其临床应用提供理论和实践基 础。
[0010] 具体地，所述的方法包括以下步骤：
[0011] 1)浓度恒定的转铁蛋白溶液中，逐渐增大溶液中青蒿素或其衍生物的浓度，扫描 其紫外-可见光谱，由下列方程求出结合常数kb;
[0012] A〇/A_A〇 - ￡Tf/ (eART-Tf_eTf) (1 + 1/kb[ARTS])
[0013] 式中：&和A分别表示青蒿素或其衍生物不存在和存在时转铁蛋白溶液的吸光 度；[ARTS]为青蒿素或其衍生物的浓度；e"和eAKT_Tf分别表示转铁蛋白和青蒿素或其衍 生物-转铁蛋白复合物的吸收系数；
[0014] 或者
[0015] 浓度恒定的转铁蛋白溶液中，逐渐增大溶液中青蒿素或其衍生物的浓度，以280nm 的激发波长扫描其荧光发射光谱；由下列方程计算结合常数Kb和结合位点数n;
[0016] l〇g[(F0-F)/F] =logKb+nlog[Q]
[0017] 式中：匕和F分别表示猝灭剂不存在和存在时转铁蛋白溶液的荧光强度；[Q]为青 蒿素或其衍生物的浓度；
[0018] 2)比较青蒿素或其衍生物与转铁蛋白的结合常数Kb或根据结合常数Kb进行排序， 推断青蒿素或其衍生物抗肿瘤活性的强弱顺序；
[0019] 3)采用抗肿瘤活性实验验证上述筛选结果。
[0020] 本发明中所涉及的青蒿素或其衍生物包括青蒿素、双氢青蒿素、9-0H青蒿素、青蒿 素醚类衍生物、酯类衍生物和杂原子取代双氢青蒿素羟基中氧的衍生物等。所述的青蒿素 醚类衍生物包括蒿甲醚、篙乙醚等，酯类衍生物包括青蒿琥酯、青蒿素碳酸脂、青蒿素羧酸 酯等，杂原子取代双氢青蒿素羟基中氧的衍生物包括含卤素、氮、硫等杂原子的双氢青蒿素 衍生物。
[0021] 所述的方法中，转铁蛋白浓度范围为1.0X10_6~lX10_4mol/L;青蒿素或其衍生 物浓度范围为1.0X10-6~1X10 _3mol/L。
[0022] 有益效果：本发明建立了一种依据青蒿素及其衍生物与转铁蛋白结合能力强弱来 判断的青蒿素类衍生物抗肿瘤活性的体外筛选方法，利用光谱学方法，测定青蒿素或其衍 生物与转铁蛋白的结合常数Kb，根据结合常数Kb进行排序并推断青蒿素或其衍生物抗肿瘤 活性的强弱顺序，结合抗肿瘤活性实验结果，从而对青蒿素或其衍生物的抗肿瘤活性进行 体外筛选。该方法可以快速有效判断青蒿素衍生物抗肿瘤活性，为新型青蒿素类药物的设 计合成及其临床应用提供理论和实践基础，推动其在抗肿瘤领域中的应用。本发明所述的 方法具有成本低，耗时短，操作简单，重现性佳的优点。
【附图说明】
[0023] 图1青蒿素（A)、双氢青蒿素⑶和9-OH青蒿素（C)与转铁蛋白在298k(l)及 310k(2)下相互作用的荧光发射光谱；[转铁蛋白]=1.0Xl(T6m〇l/L，[药物V(a-f)= 0、2/3、4/3、2、8/3、10/3Xl(T6mol/L;Xex = 280nm，pH= 7. 00
[0024] 图2青蒿素（A)、双氢青蒿素⑶和9-OH青蒿素（C)猝灭转铁蛋白荧光的 l〇g(FQ-F)/F对log[Q]的线性拟合曲线（298及310K)。
【具体实施方式】
[0025] 下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要 指出以下实施例只用于对
【发明内容】
的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。
[0026] 在本发明的实施例中，所用的青蒿素衍生物为双氢青蒿素和9-OH青蒿素。双氢青 蒿素和9-OH青蒿素作为商品化的青蒿素衍生物，已被用于临床治疗疟疾，研宄表明双氢青 蒿素和9-OH青蒿素还具有一定的抗肿瘤活性。本发明通过以下的实施例进行描述是为了 阐明本发明，而不是以任何方式限制本发明。本发明的依据青蒿素衍生物与转铁蛋白结合 能力强弱来判断的青蒿素类衍生物抗肿瘤活性的体外筛选方法同样适用青蒿素及其它青 蒿素衍生物。
[0027] 实施例1
[0028] 在浓度范围为1.OX1(T6~IXl(T4m〇l/L内配置转铁蛋白溶液，固定转铁蛋白的浓 度，分别加入青蒿素、双氢青蒿素和9-OH青蒿素，在浓度范围1.0XKT6~lXl(T3m〇l/L内 逐渐增大溶液中青蒿素、双氢青蒿素（DHA)和9-OH青蒿素（9-OHQHS)的浓度，以280nm的 激发波长分别在298K和310K下扫描不同体系的焚光发射光谱，焚光发射光谱如图1所不。
[0029] 由下列方程可以计算结合常数Kb和结合位点数n
[0030] l〇g[(F0-F)/F] =logKb+nlog[Q]
[0031] 式中：匕和F分别表示猝灭剂不存在和存在时转铁蛋白的荧光强度；[Q]为青蒿素 衍生物的浓度。
[0032] 可采用线性回归的方法，青蒿素衍生物猝灭转铁蛋白荧光的lgt^-FVF]对 lg[Q]的线性拟合曲线，斜率即为结合位点数n，截距即为logKb，从而可以求出青蒿素衍生 物与转铁蛋白相互作用的结合常数Kb。
[0033] 实验结果如表1和表2所示。结果显示在两种不同温度条件下，双氢青蒿素的Kb 均强于9-OH青蒿素，预判双氢青蒿素的抗肿瘤活性强于9-OH青蒿素。抗肿瘤实验采用MTT 比色法测定。抗肿瘤实验证明双氢青蒿素和9-OH青蒿素抗肿瘤活性的IC5(I分别为21. 94 和56. 95yM。实验结果证明两种青蒿素衍生物与转铁蛋白结合能力强弱规律与其抗肿瘤活 性强弱规律一致。
[0034] 表1青蒿素、双氢青蒿素和9-OH青蒿素与转铁蛋白结合常数对比表
[0036] 表2青蒿素、双氢青蒿素和9-OH青蒿素抗肿瘤活性IC5(I对比表
[0038] 本发明的体外筛选方法，依据青蒿素衍生物与转铁蛋白结合能力强弱来判断的青 蒿素类衍生物抗肿瘤活性。实施例中青蒿素衍生物与转铁蛋白结合能力强弱使用青蒿素衍 生物与转铁蛋白蛋白结合常数Kb为指标判断，本领域技术人员不难理解，上述指标还可通 过紫外-可见吸收光谱技术获得。
[0039] 实施例2,与实施例1基本相同，但所述的青蒿素衍生物为蒿甲醚或篙乙醚。
[0040] 实施例3,与实施例1基本相同，但所述的青蒿素衍生物为青蒿琥酯、青蒿素碳酸 脂和青蒿素羧酸酯。
[0041] 实施例4,与实施例1基本相同，但所述的青蒿素衍生物为卤素、氮或硫杂原子取 代的双氢青蒿素衍生物。
【主权项】
1. 一种青蒿素及其衍生物抗肿瘤活性的体外筛选方法，其特征在于，采用紫外-可见 吸收光谱或荧光光谱分析青蒿素或其衍生物与转铁蛋白的相互作用，计算青蒿素或其衍生 物与转铁蛋白的结合常数Kb，比较青蒿素或其衍生物与转铁蛋白的结合常数Kb或根据结合 常数Kb进行排序，推断青蒿素或其衍生物抗肿瘤活性的强弱顺序，再采用抗肿瘤活性实验 验证上述筛选结果。2. 根据权利要求1所述的青蒿素及其衍生物抗肿瘤活性的体外筛选方法，其特征在 于，所述的方法包括以下步骤： 1) 浓度恒定的转铁蛋白溶液中，逐渐增大溶液中青蒿素或其衍生物的浓度，扫描其紫 外-可见光谱，由下列方程求出结合常数kb A0A-A0=eTf/(e ART-Tf- ￡Tf) (1 + 1/kb[ARTS]) 式中：Atl和A分别表示青蒿素或其衍生物不存在和存在时转铁蛋白溶液的吸光度； [ARTS]为青蒿素或其衍生物的浓度；￡"和e__"分别表示转铁蛋白和青蒿素或其衍生 物-转铁蛋白复合物的吸收系数； 或者 浓度恒定的转铁蛋白溶液中，逐渐增大溶液中青蒿素或其衍生物的浓度，以280nm的 激发波长扫描其荧光发射光谱；由下列方程计算结合常数Kb和结合位点数n log[ (F0-F)/F] =logKb+nlog[Q] 式中：Ftl和F分别表示猝灭剂不存在和存在时转铁蛋白溶液的荧光强度；[Q]为青蒿素 或其衍生物的浓度； 2) 比较青蒿素或其衍生物与转铁蛋白的结合常数Kb或根据结合常数Kb进行排序，推 断青蒿素或其衍生物抗肿瘤活性的强弱顺序； 3) 采用抗肿瘤活性实验验证上述筛选结果。3. 根据权利要求1或2所述的青蒿素及其衍生物抗肿瘤活性的体外筛选方法，其特征 在于，所述的青蒿素或其衍生物为青蒿素、双氢青蒿素、9-0H青蒿素、青蒿素醚类衍生物、酯 类衍生物和杂原子取代双氢青蒿素羟基中氧的衍生物。4. 根据权利要求3所述的青蒿素及其衍生物抗肿瘤活性的体外筛选方法，其特征在 于，所述的青蒿素醚类衍生物为蒿甲醚或篙乙醚，酯类衍生物为青蒿琥酯、青蒿素碳酸脂或 青蒿素羧酸酯，杂原子取代双氢青蒿素羟基中氧的衍生物为卤素、氮或硫杂原子取代的双 氢青蒿素衍生物。5. 根据权利要求2所述的青蒿素及其衍生物抗肿瘤活性的体外筛选方法，其特征在 于，所述的方法中，转铁蛋白浓度范围为I.OX10_6~IX10 _4mol/L;青蒿素或其衍生物浓度 范围为1.0\1〇-6~1父1〇-3111〇1/1 〇
【专利摘要】一种青蒿素及其衍生物抗肿瘤活性的体外筛选方法，采用紫外-可见吸收光谱或荧光光谱分析青蒿素或其衍生物与转铁蛋白的相互作用，计算青蒿素或其衍生物与转铁蛋白的结合常数Kb，比较青蒿素或其衍生物与转铁蛋白的结合常数Kb或根据结合常数Kb进行排序，推断青蒿素或其衍生物抗肿瘤活性的强弱顺序，再采用抗肿瘤活性实验验证上述筛选结果。本发明利用光谱学方法测定青蒿素或其衍生物与转铁蛋白的结合常数Kb，结合抗肿瘤活性实验结果，依据结合常数Kb的排序对青蒿素或其衍生物的抗肿瘤活性进行体外筛选。该方法可以快速有效判断青蒿素衍生物抗肿瘤活性，为新型青蒿素类药物的设计合成及其临床应用提供基础，推动其在抗肿瘤领域中的应用。
【IPC分类】G01N21/31, G01N33/50, G01N21/64
【公开号】CN104897887
【申请号】CN201510295429
【发明人】周家宏, 周林, 魏少华, 肖梦思, 袁秀雪
【申请人】南京师范大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月2日
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