一种弓形虫检测试剂盒的制作方法
一种弓形虫检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检疫技术领域，具体地说，涉及一种弓形虫检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫，并能感染几乎所有温血动物的有核细胞。引 起世界范围广泛流行的人兽共患寄生虫病。据估计世界上大约三分之一的人感染了该寄生 虫。弓形虫是一种机会性致病寄生虫，主要危害孕妇及免疫系统低下的人群，免疫功能正常 的人感染并不引起明显的临床症状。
[0003] 弓形虫感染动物后能够诱导机体产生强烈的Thl型细胞免疫反应，导致特异性 ⑶4+T、⑶8+T细胞分泌大量IFN-Y以抵抗弓形虫感染。
[0004] 目前，临床最常采用酶联免疫吸附试验（ELISA)对弓形虫特异性抗体、循环抗原 进行检测以确定弓形虫感染。弓形感染动物体后会产生多种同型抗体，现在临床上多检测 IgG及IgM。弓形虫感染1-2周后才能在血液中检测到该抗体，1-2月后达到高峰，随之有不 同程度的下降。IgM的出现与消失都较IgG快，并且由于风湿等疾病因子的干扰，现在商品 化的IgM检测试剂盒存在低特异性的缺点。感染弓形虫后，抗体的产生因个体差异而明显 不同，甚至出现很大比例的假阴性，因而抗体的检测效率不高，所以迫切需要开发一种敏感 性高、特异性强的弓形虫检测的新方法。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种检测弓形虫的试剂 盒。
[0006] 技术方案如下：
[0007] -种弓形虫检测试剂盒，所述试剂盒包括：弓形虫抗原、IFN-Y捕获抗体、IFN-Y 标准品、生物素标记的IFN-Y检测抗体。
[0008] 进一步地，所述试剂盒还包括：细胞培养基、阳性对照物、阴性对照物、包被液、封 闭液、HRP标记的链霉亲和素、显色液和终止液。
[0009] 其中，所述阳性对照物为刀豆蛋白A。
[0010] 其中，所述细胞培养基含有10%胎牛血清，1〇〇单位/ml的青链霉素，0. 0002%的 巯基乙醇。
[0011] 进一步地，所述弓形虫抗原包括弓形虫表面糖蛋白SAG1 (GenBank:S76248. 1)、 SAG2 (GenBank:JX045478. 1);缓殖子期特异性蛋白BAG1 (ToxoDB:TGME49_259020);致密颗 粒蛋白GRA1 (GenBank:M26007. 1)、GRA3 (GenBank:U13771. 1)、GRA4 (GenBank:M76432. 1)、 GRA5 (GenBank:EU918733. 1)、GRA6 (GenBank:HM776942. 1)、GRA7 (GenBank:DQ459443.2)、 GRA10 (GenBank:AY769952.1)、GRA15 (ToxoDB:TGME49_275470);棒状体蛋白R0P1 (GenBank:M71274. 1),R0P2 (GenBank:Z36906. 1),R0P7 (GenBank:AM056071. 1), R0P16(GenBank:GQ249080.1)、R0P18(GenBank:AM075204.1);微线蛋白MIC1 (GenBank:Z71786. 1),MIC2 (ToxoDB:TGME49_201780),MIC3 (GenBank:JF330835. 1),MIC4 (GenBank:FJ785459. 1)、MIC6 (GenBank:AF110270. 1)、MIC8 (GenBank:GQ260152. 1);棒状 体颈部蛋白R0N4 (GenBank:DQ096566. 1);顶端膜抗原AMA1 (GenBank:FJ593880. 1)和热 应激蛋白HSP70 (GenBank:AB019539. 1)。
[0012] 更进一步地，所述弓形虫抗原是通过超声裂解弓形虫速殖子或缓殖子虫体、或者 利用大肠杆菌原核表达并纯化后制备得到的。
[0013] 前述试剂盒的使用方法为：
[0014] (1)无菌采集动物或人的抗凝血；
[0015] (2)全血稀释后铺细胞培养板；
[0016] (3)用弓形虫抗原对动物或人外周血或外周血中分离的细胞进行刺激，使其中的 弓形虫特异性T细胞释放出IFN-Y;
[0017] (4)收集培养细胞的上清；
[0018] (5)ELISA定量检测样品中IFN-Y的含量；
[0019] (6)根据试剂盒设置的阴阳性对照品刺激IFN-Y的水平，比较IFN-Y比值差异， 判断动物或人是否感染过弓形虫。
[0020] 本发明的有益效果在于：
[0021] 本发明提供了一种弓形虫检测试剂盒，利用感染弓形虫的人或动物全血中弓形虫 特异性T细胞分泌的IFN-Y远高于未感染受试者的特点来诊断弓形虫病。本试剂盒高度 敏感和特异，克服了现有的弓形虫抗体检测试剂盒所常见的检出率差、误诊率高的缺点。以 外，利用该试剂盒可以检测针对弓形虫病的细胞免疫应答水平，为弓形虫病疫苗的效果评 价提供新的方法。
【附图说明】
[0022] 图1为从感染或不感染弓形虫的人采集外周血，全血受弓形虫抗原刺激后IFN-Y 的分泌水平与血清中弓形虫特异性IgG水平的比较；
[0023] 其中：A表示人血清中IgG水平的ELISA检测结果，B表示人全血受抗原刺激后 IFN-Y的ELISA检测结果。
[0024] 图2为本发明猫感染弓形虫后外周血淋巴细胞（PBMC)受抗原刺激后IFN-Y的 ELISA及Real-timePCR检测结果；其中：A表示猫血清中弓形虫特异性IgG水平ELISA检 测结果，B表示猫外周血淋巴细胞（PBMC)受抗原刺激后IFN-Y的ELISA检测结果，C表示 猫外周血淋巴细胞（PBMC)受抗原刺激后IFN-Y的Real-timePCR检测结果；Negative表 示IgG水平检测阴性组的猫；Infectedwithcysts表示口服100个弓形虫Pru株包囊后 10天的猫；IgGpositive表示IgG水平检测阳性的猫。
[0025] 图3为本发明猫感染弓形虫后全血受抗原刺激后IFN-Y的分泌水平与血清IgG 水平的比较；图中不同填充代表多只弓形虫不同感染状态下的猫。其中：A表示猫血清中 IgG水平ELISA检测结果，B表示猫全血受抗原刺激后IFN-Y的ELISA检测结果。
【具体实施方式】
[0026] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0027] 实施例1基于IFN-Y释放的弓形虫病检测试剂盒
[0028] 试剂盒中包括下列成分：
[0030]
[0031] 此外，需自备的常规试剂及耗材包括PBS、蒸馏水、双蒸水、六孔细胞培养板、各种 规格的吸头。
[0032] 实施例2基于IFN-Y释放的弓形虫病检测试剂盒的使用程序
[0033] 1、样品的前处理
[0034] (1)外周血采集：用真空采血管无菌采取人或动物抗凝血，每个受试者3ml。
[0035] (2)外周血稀释：在采集后12小时内将血液中加入等体积的细胞培养基(含 90%RPM1640培养基，含10%胎牛血清，100单位/ml的青链霉素，0. 0002%的0 -巯基乙醇） 进行稀释，混匀。
[0036] (3)细胞铺板：将稀释后的血液加入六孔细胞培养板，每孔2ml，每个受试者的血 细胞铺3个孔。
[0037] (4)加弓形虫抗原刺激：第一孔加入细胞培养基作为阴性对照，第二孔加入终浓度 为12iig/ml的弓形虫抗原，第三孔加入终浓度为20iig/ml的刀豆蛋白A作为阳性对照。
[0038](5)培养：37°C，置于二氧化碳细胞培养箱中培养48h。每隔12h，轻轻晃动六孔板。
[0039] 2.样品的收集
[0040] 取培养48h后的全血培养上清，3000转/分离心10分钟，取上清，置于4°C(适于 短期）或-20°C(适于长期）保存。
[0041] 2、样品中含有的T细胞分泌的IFN-Y的ELISA定量检测：
[0042] (1)包被IFN-Y的捕获抗体：用包被缓冲液（PBS)稀释IFN-Y的捕获抗体至最适 浓度，每孔加入100y1稀释好的捕获抗体加入96孔ELISA检测板，于4°C下过夜。
[0043] (2)洗涤：移去包被液，凹孔用300yl/孔的洗涤缓冲液（PBS+0. 05%TWeen-20)洗 3次，每次5分钟。洗漆时将板子放在96孔板振荡器上，600转/分钟。
[0044] (3)封闭：每孔加入300ii1封闭液（1%BSA)，放于湿盒中，37°C，2h。
[0045] (4)洗涤：同第二步的洗涤步骤。
[0046] (5)加入IFN-Y标准品及待检样品：将标准品作一系列倍比稀释，如4ng/ml、2ng/ ml、lng/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62. 5pg/ml、0pg/ml，从而制作IFN-Y的标准曲 线。待检样品根据需要进行稀释(浓度超出待测范围)或不稀释。将稀释后标准品及待检样 品100ii1加入96孔板，每个样品加两孔，放于湿盒中，37C，lh。
[0047] (6)洗涤：同第二步的洗涤步骤。
[0048] (7)加入生物素标记的IFN-Y检测抗体：将生物素标记的检测抗体稀释到最适浓 度，每孔加l〇〇y1，放于湿盒中，37°C，lh。
[0049] (8)洗涤：同第二步的洗涤步骤。
[0050] (9)加入HRP标记的链霉未和素：将HRP标记的链霉未和素稀释到最适浓度，每孔 加lOOiil，放于湿盒中，37°C，20分钟。
[0051] (10)加显色液：每孔加100ylTMB显色液，室温避光反应15分钟。
[0052] (11)终止：每孔加入50ill终止液。（12)读数：将ELISA反应板放入具有450nm 波长滤光片的酶标仪中读取0D值。
[0053] (13)根据反应中应用不同浓度的IFN-Y所获得的标准曲线来判定本次待检样品 中IFN-y的浓度。样品的阴阳性判定按公式（T-N)/(P-N)=R进行，其中N代表阴性对照 的IFN-Y含量，T代表弓形虫抗原刺激孔的IFN-Y含量，P代表阳性对照的IFN-Y含量。
[0054] 当P彡1000pg/ml时，R> 0? 25时，判为阳性，否则为阴性；当P> 1000pg/ml时， R> 0. 15时，判为阳性，否则为阴性。
[0055] 实施例3通过ELISA检测人全血中特异性T细胞分泌的IFN-Y检测人是否感染 弓形虫
[0056] 首先利用人弓形虫病IgG检测试剂盒对不同感染状态下的人进行血清IgG检测； 其次，采集人的抗凝血，用弓形虫抗原刺激，48h后取上清进行IFN-Y定量检测。
[0057]结果发现，利用ELISA检测人全血分泌的IFN-Y，是检测人是否感染弓形虫的一 种新方法，提示我们，该种方法可以用于检测人的弓形虫病，而且通过该方法可以检测出弓 形虫感染后，人体内的细胞免疫应答状态。
[0058] (1)人血清中IgG水平的检测：
[0059]采集人的血清，用人弓形虫病IgG检测试剂盒（Abeam公司产品)对12个受试者血 清中的IgG水平进行检测。检测结果见图1(A)，对于12位受试者，其中6人为弓形虫感染 阳性，另外6人为阴性。
[00 60] (2)用弓形虫抗原对人全血进行刺激：
[0061] 无菌采取人肝素钠抗凝血，每人3ml，加等量含10%胎牛血清的RPM1640培养基进 行稀释，将稀释后的血液加入六孔板，每只人设置三个培养孔，第一孔加细胞培养基作为阴 性对照，第二孔加入终浓度为12iig/ml的弓形虫抗原，第三孔加入终浓度为20iig/ml的刀 豆蛋白A作为阳性对照。37°C，置于细胞培养箱中培养48h。
[0062] (3)用ELISA方法检测人全血分泌的IFN-Y:
[0063] 收集六孔细胞培养板中的上清，300g离心lOmin，弃红细胞，取上清留作ELISA样 品，用Biolegend公司的人IFN-Y定量检测ELISA试剂盒对样品中的IFN-Y含量进行测 定，按试剂盒的说明，制作样品的标准曲线，对样品中的IFN-y进行定量。检测结果见图1 (B)，每位受试者全血受弓形虫抗原刺激后，所分泌的IFN-y不同。其中，6位受试者的抗 原刺激孔所分泌的IFN-y与阴性对照孔基本相同，而剩余的6位受试者则有较大变化。根 据判定标准，判定其中6人为弓形虫感染阳性，其余6人为阴性，这个结果与前述IgG检测 试剂盒得到的结果一致。
[0064] 实施例4通过基于IFN-Y释放实验的检测试剂盒检测猫是否感染弓形虫
[0065] 为确定干扰素释放试验是否能用于猫弓形虫病的诊断，首先利用猫弓形虫病IgG 检测试剂盒对不同感染状态下的猫进行血清IgG检测。其次，用本发明的弓形虫病检测试 剂盒对猫弓形虫病进行检测。用淋巴细胞分离液分离猫的外周血单核细胞，对单核细胞进 行弓形虫抗原的刺激，取上清进行进行IFN-Y定量检测，细胞沉淀用于提取RNA，从mRNA水 平对IFN-y的表达情况进行检测。
[0066] 结果发现，利用ELISA检测猫外周血单核细胞分泌IFN-Y，检测猫是否感染弓形 虫的方法上述另外两种方法具有很高的相似度。提示我们，该种方法可以用于检测猫的弓 形虫病，而且通过该方法可以检测出弓形虫感染后，猫体内的细胞免疫应答状态。
[0067] 具体的步骤如下：
[0068] ( 1)猫血清中IgG水平的检测：
[0069] 本试验共分三组：第一组，取三只弓形虫IgG水平阴性的猫，每只猫口服感染100 个Pru株包囊，10天后，采集猫的血清，作为口服包囊组；第二组，取三只弓形虫IgG水平阴 性猫，口服PBS，采集血清，作为阴性对照组；第三组，选取三只自然感染弓形虫的猫，口服 PBS，采集血清，作为自然感染组。用动物弓形虫病IgG检测试剂盒(珠海海泰生物公司产品） 对猫血清中的IgG水平进行检测。检测结果见图2(A)，阴性对照组及口服包囊组的猫是阴 性，自然感染组的猫是阳性。结果表明，口服包囊10天后，猫血清中IgG水平较阴性对照组 略有上升，前者平均0D值为后者的1. 41倍。但与自然感染组差别很大，自然感染组的平均 0D值为阴性对照组的10. 65倍。
[0070] (3)外周血单核细胞的分离：
[0071] 无菌采集猫肝素钠抗凝血，加等量PBS稀释，取6ml淋巴细胞分离液(天津灏翔公 司产品）于15ml离心管中，然后在其上加入6ml稀释抗凝血，室温，800g离心20min。离心 后，吸取淋巴细胞，用其至少5倍体积PBS进行洗涤2次，室温，400g离心lOmin，并弃上清。
[0072] (4)用弓形虫抗原对外周血单核细胞进行刺激：
[0073] 对细胞进行计数，然后将细胞加入12孔细胞培养板，每孔5X106个外周血单核细 胞。每只猫设置三个培养孔，第一孔加细胞培养基作为阴性对照，第二孔加入12yg/ml的 弓形虫抗原，第三孔加入20yg/ml的刀豆蛋白A作为阳性对照。37°C，置于细胞培养箱中 培养48h。
[0074] (5)用Real-timePCR方法对检测外周血单核细胞中IFN-YmRNA含量：
[0075] 收集12孔细胞培养板中的细胞，300g离心lOmin，取上清留作ELISA样品，将细胞 沉淀用公司的Trizol试剂（Invitrogen公司产品)提取总RNA，利用Nanodrop2000测定RNA 的浓度及纯度，再用ABI公司的反转录试剂盒（FirstStrandSynthesisKitforRT-PCR) 合成猫外周血单核细胞的cDNA。
[0076] 表1荧光定量PCR检测IFN-Y所用的引物
[0078] 突光定量PCR反应体系：2XSYBRmix，10u1;Primerforward，0? 5u1;Primer reverse, 0. 5u1；RNAfreeH20,7u1 ；cDNA,2u1〇
[0079] 反应程序：50 °C，2min;
[0080] 95°C,lOmin；
[0081] 循环（40 个）：95°C，15s;6(TC，lmin。
[0082] 外周血单核细胞中IFN-ymRNA含量的检测结果见图2(C)。通过每一组中加抗原 刺激孔与未加抗原刺激孔的比值平均值可以看出，口服包囊组者为阴性对照组的3. 89倍； 阳性对照组为阴性对照组的5. 14倍。另外，作为阳性刺激物，刀豆蛋白A的效果要好于PMA+ 离子霉素，前者刺激PBMC产和的IFN-ymRNA水平为后者平均值的3. 74倍。以上结果表明， 同检测血清中的IgG方法相比，通过检测外周血单核细胞分泌IFN-ymRNA含量，可以更好 地提高人工感染弓形虫包囊初期的检出率。
[0083] (6)用ELISA方法检测外周血单核细胞分泌的IFN-Y:
[0084] 收集12孔细胞培养板中的细胞培养上清，用R&D公司的猫IFN-Y定量检测ELISA 试剂盒对样品中的IFN-Y含量进行测定，按试剂盒的说明，制作样品的标准曲线，对样品 中的IFN-Y进行定量。检测结果见图2(B)，阴性对照组及口服包囊组全为阴性，自然感染 组为阳性。通过每一组中加抗原刺激组与未加抗原刺激组的比值平均值可以看出，口服包 囊组为阴性对照组的2. 42倍；阳性对照组为阴性对照组的16. 91倍。另外，作为阳性刺激 物，刀豆蛋白A的效果要好于PMA+离子霉素，前者刺激PBMC产和的IFN-Y水平为后者平 均值的4. 82倍。以上结果表明，该方法与利用Real-time方法检测弓形虫感染猫的结论基 本一致，即该方法与利用检测血清中的IgG方法相比，可以全部检出弓形虫感染阳性猫，检 出率为100%。
[0085] 实施例5通过ELISA检测猫全血中特异性T细胞分泌的IFN-Y检测猫是否感染 弓形虫
[0086] 在确定利用ELISA检测猫外周血单核细胞分泌IFN-Y，可以检测猫是否感染弓形 虫的基础上，我们验证猫全血中特异性T细胞分泌的IFN-Y，是否可以用于检测猫是否感 染弓形虫。
[0087] 首先利用猫弓形虫病IgG检测试剂盒对不同感染状态下的猫进行血清IgG检测； 其次，采集猫的抗凝血，用弓形虫抗原刺激，利用上述实施例2中的方法进行IFN-Y定量检 测。
[0088] 结果发现，利用ELISA检测猫全血分泌的IFN-Y，是检测猫是否感染弓形虫的一 种新方法，提示我们，该种方法可以用于检测猫的弓形虫病，而且通过该方法可以检测出弓 形虫感染后，猫体内的细胞免疫应答状态。
[0089] (1)猫血清中IgG水平的检测：
[0090] 采集猫的血清，用动物弓形虫病IgG检测试剂盒(珠海海泰生物）对猫血清中的IgG水平进行检测。检测结果见图3 (A)，对12只猫进行检测后发现，7只猫为阳性，5只猫 为阴性。
[0091] (2)用弓形虫抗原对猫全血进行刺激：
[0092] 无菌采取猫肝素钠抗凝血，每只猫3ml，加等量细胞培养基进行稀释，将稀释后的 血液加入六孔板，每只猫设置三个培养孔，第一孔加阴性对照，第二孔加入终浓度为12yg/ ml的弓形虫抗原，第三孔加入终浓度为20yg/ml的刀豆蛋白A作为阳性对照。37°C，置于 细胞培养箱中培养48h。
[0093] (3)用ELISA方法检测猫全血分泌的IFN-Y:
[0094] 收集六孔细胞培养板中的上清，300g离心lOmin，弃红细胞，取上清留作ELISA样 品，用R&D公司的猫IFN-Y定量检测ELISA试剂盒对样品中的IFN-Y含量进行测定，按试 齐U盒的说明，制作样品的标准曲线，对样品中的IFN-y进行定量。检测结果见图3(B)。每 只猫全血受弓形虫抗原刺激后，所分泌的IFN-y不同。其中，5只猫的抗原刺激孔所分泌的 IFN-y与阴性对照孔基本相同，经判定为阴性；而剩余的7只猫则有较大变化，经判定为阳 性。该方法与利用检测血清中的IgG方法相比，可以全部检出弓形虫感染阳性猫，检出率为 100%。
[0095] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种弓形虫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：弓形虫抗原、IFN-Y捕获抗 体、IFN-Y标准品、生物素标记的IFN-Y检测抗体。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：细胞培养基、阳性 对照物、阴性对照物、包被液、封闭液、HRP标记的链霉亲和素、显色液和终止液。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照物为刀豆蛋白A。4. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述细胞培养基含有胎牛血清、青链霉 素、(6-巯基乙醇。5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述弓形虫抗原包括弓形虫表面糖蛋 白SAGl、SAG2 ;缓殖子期特异性蛋白BAGl;致密颗粒蛋白GRAl、GRA3-GRA7、GRA10、GRA15 ; 棒状体蛋白R0P1、R0P2、R0P7、R0P16、R0P18 ;微线蛋白MIC1-4、MIC6、MIC8;棒状体颈部蛋 白ROM;顶端膜抗原AMl和热应激蛋白HSP70。6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述弓形虫抗原是通过超声裂解弓形 虫速殖子或缓殖子虫体、或者利用大肠杆菌原核表达并纯化后制备得到的。7. 根据权利要求1-6任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法为： (1) 无菌采集动物或人的抗凝血； (2) 全血稀释后铺细胞培养板； (3) 用弓形虫抗原对动物或人外周血或外周血中分离的细胞进行刺激，使其中的弓形 虫特异性T细胞释放出IFN-Y; (4) 收集培养细胞的上清； (5) ELISA定量检测样品中IFN-Y的含量； (6) 根据试剂盒设置的阴阳性对照品刺激IFN-Y的水平，比较IFN-Y比值差异，判断 动物或人是否感染过弓形虫。
【专利摘要】本发明提供了一种弓形虫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：弓形虫抗原、IFN-γ捕获抗体、IFN-γ标准品、生物素标记的IFN-γ检测抗体、细胞培养基、阳性对照物、阴性对照物、包被液、封闭液、HRP标记的链霉亲和素、显色液和终止液。本发明试剂盒具有高度的敏感性和特异性，克服了现有的弓形虫抗体检测试剂盒所常见的检出率差、误诊率高的缺点。
【IPC分类】G01N33/569
【公开号】CN104897891
【申请号】CN201410081706
【发明人】索勋, 刘贤勇, 尹青
【申请人】中国农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月6日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检疫技术领域，具体地说，涉及一种弓形虫检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫，并能感染几乎所有温血动物的有核细胞。引 起世界范围广泛流行的人兽共患寄生虫病。据估计世界上大约三分之一的人感染了该寄生 虫。弓形虫是一种机会性致病寄生虫，主要危害孕妇及免疫系统低下的人群，免疫功能正常 的人感染并不引起明显的临床症状。
[0003] 弓形虫感染动物后能够诱导机体产生强烈的Thl型细胞免疫反应，导致特异性 ⑶4+T、⑶8+T细胞分泌大量IFN-Y以抵抗弓形虫感染。
[0004] 目前，临床最常采用酶联免疫吸附试验（ELISA)对弓形虫特异性抗体、循环抗原 进行检测以确定弓形虫感染。弓形感染动物体后会产生多种同型抗体，现在临床上多检测 IgG及IgM。弓形虫感染1-2周后才能在血液中检测到该抗体，1-2月后达到高峰，随之有不 同程度的下降。IgM的出现与消失都较IgG快，并且由于风湿等疾病因子的干扰，现在商品 化的IgM检测试剂盒存在低特异性的缺点。感染弓形虫后，抗体的产生因个体差异而明显 不同，甚至出现很大比例的假阴性，因而抗体的检测效率不高，所以迫切需要开发一种敏感 性高、特异性强的弓形虫检测的新方法。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种检测弓形虫的试剂 盒。
[0006] 技术方案如下：
[0007] -种弓形虫检测试剂盒，所述试剂盒包括：弓形虫抗原、IFN-Y捕获抗体、IFN-Y 标准品、生物素标记的IFN-Y检测抗体。
[0008] 进一步地，所述试剂盒还包括：细胞培养基、阳性对照物、阴性对照物、包被液、封 闭液、HRP标记的链霉亲和素、显色液和终止液。
[0009] 其中，所述阳性对照物为刀豆蛋白A。
[0010] 其中，所述细胞培养基含有10%胎牛血清，1〇〇单位/ml的青链霉素，0. 0002%的 巯基乙醇。
[0011] 进一步地，所述弓形虫抗原包括弓形虫表面糖蛋白SAG1 (GenBank:S76248. 1)、 SAG2 (GenBank:JX045478. 1);缓殖子期特异性蛋白BAG1 (ToxoDB:TGME49_259020);致密颗 粒蛋白GRA1 (GenBank:M26007. 1)、GRA3 (GenBank:U13771. 1)、GRA4 (GenBank:M76432. 1)、 GRA5 (GenBank:EU918733. 1)、GRA6 (GenBank:HM776942. 1)、GRA7 (GenBank:DQ459443.2)、 GRA10 (GenBank:AY769952.1)、GRA15 (ToxoDB:TGME49_275470);棒状体蛋白R0P1 (GenBank:M71274. 1),R0P2 (GenBank:Z36906. 1),R0P7 (GenBank:AM056071. 1), R0P16(GenBank:GQ249080.1)、R0P18(GenBank:AM075204.1);微线蛋白MIC1 (GenBank:Z71786. 1),MIC2 (ToxoDB:TGME49_201780),MIC3 (GenBank:JF330835. 1),MIC4 (GenBank:FJ785459. 1)、MIC6 (GenBank:AF110270. 1)、MIC8 (GenBank:GQ260152. 1);棒状 体颈部蛋白R0N4 (GenBank:DQ096566. 1);顶端膜抗原AMA1 (GenBank:FJ593880. 1)和热 应激蛋白HSP70 (GenBank:AB019539. 1)。
[0012] 更进一步地，所述弓形虫抗原是通过超声裂解弓形虫速殖子或缓殖子虫体、或者 利用大肠杆菌原核表达并纯化后制备得到的。
[0013] 前述试剂盒的使用方法为：
[0014] (1)无菌采集动物或人的抗凝血；
[0015] (2)全血稀释后铺细胞培养板；
[0016] (3)用弓形虫抗原对动物或人外周血或外周血中分离的细胞进行刺激，使其中的 弓形虫特异性T细胞释放出IFN-Y;
[0017] (4)收集培养细胞的上清；
[0018] (5)ELISA定量检测样品中IFN-Y的含量；
[0019] (6)根据试剂盒设置的阴阳性对照品刺激IFN-Y的水平，比较IFN-Y比值差异， 判断动物或人是否感染过弓形虫。
[0020] 本发明的有益效果在于：
[0021] 本发明提供了一种弓形虫检测试剂盒，利用感染弓形虫的人或动物全血中弓形虫 特异性T细胞分泌的IFN-Y远高于未感染受试者的特点来诊断弓形虫病。本试剂盒高度 敏感和特异，克服了现有的弓形虫抗体检测试剂盒所常见的检出率差、误诊率高的缺点。以 外，利用该试剂盒可以检测针对弓形虫病的细胞免疫应答水平，为弓形虫病疫苗的效果评 价提供新的方法。
【附图说明】
[0022] 图1为从感染或不感染弓形虫的人采集外周血，全血受弓形虫抗原刺激后IFN-Y 的分泌水平与血清中弓形虫特异性IgG水平的比较；
[0023] 其中：A表示人血清中IgG水平的ELISA检测结果，B表示人全血受抗原刺激后 IFN-Y的ELISA检测结果。
[0024] 图2为本发明猫感染弓形虫后外周血淋巴细胞（PBMC)受抗原刺激后IFN-Y的 ELISA及Real-timePCR检测结果；其中：A表示猫血清中弓形虫特异性IgG水平ELISA检 测结果，B表示猫外周血淋巴细胞（PBMC)受抗原刺激后IFN-Y的ELISA检测结果，C表示 猫外周血淋巴细胞（PBMC)受抗原刺激后IFN-Y的Real-timePCR检测结果；Negative表 示IgG水平检测阴性组的猫；Infectedwithcysts表示口服100个弓形虫Pru株包囊后 10天的猫；IgGpositive表示IgG水平检测阳性的猫。
[0025] 图3为本发明猫感染弓形虫后全血受抗原刺激后IFN-Y的分泌水平与血清IgG 水平的比较；图中不同填充代表多只弓形虫不同感染状态下的猫。其中：A表示猫血清中 IgG水平ELISA检测结果，B表示猫全血受抗原刺激后IFN-Y的ELISA检测结果。
【具体实施方式】
[0026] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0027] 实施例1基于IFN-Y释放的弓形虫病检测试剂盒
[0028] 试剂盒中包括下列成分：
[0030]
[0031] 此外，需自备的常规试剂及耗材包括PBS、蒸馏水、双蒸水、六孔细胞培养板、各种 规格的吸头。
[0032] 实施例2基于IFN-Y释放的弓形虫病检测试剂盒的使用程序
[0033] 1、样品的前处理
[0034] (1)外周血采集：用真空采血管无菌采取人或动物抗凝血，每个受试者3ml。
[0035] (2)外周血稀释：在采集后12小时内将血液中加入等体积的细胞培养基(含 90%RPM1640培养基，含10%胎牛血清，100单位/ml的青链霉素，0. 0002%的0 -巯基乙醇） 进行稀释，混匀。
[0036] (3)细胞铺板：将稀释后的血液加入六孔细胞培养板，每孔2ml，每个受试者的血 细胞铺3个孔。
[0037] (4)加弓形虫抗原刺激：第一孔加入细胞培养基作为阴性对照，第二孔加入终浓度 为12iig/ml的弓形虫抗原，第三孔加入终浓度为20iig/ml的刀豆蛋白A作为阳性对照。
[0038](5)培养：37°C，置于二氧化碳细胞培养箱中培养48h。每隔12h，轻轻晃动六孔板。
[0039] 2.样品的收集
[0040] 取培养48h后的全血培养上清，3000转/分离心10分钟，取上清，置于4°C(适于 短期）或-20°C(适于长期）保存。
[0041] 2、样品中含有的T细胞分泌的IFN-Y的ELISA定量检测：
[0042] (1)包被IFN-Y的捕获抗体：用包被缓冲液（PBS)稀释IFN-Y的捕获抗体至最适 浓度，每孔加入100y1稀释好的捕获抗体加入96孔ELISA检测板，于4°C下过夜。
[0043] (2)洗涤：移去包被液，凹孔用300yl/孔的洗涤缓冲液（PBS+0. 05%TWeen-20)洗 3次，每次5分钟。洗漆时将板子放在96孔板振荡器上，600转/分钟。
[0044] (3)封闭：每孔加入300ii1封闭液（1%BSA)，放于湿盒中，37°C，2h。
[0045] (4)洗涤：同第二步的洗涤步骤。
[0046] (5)加入IFN-Y标准品及待检样品：将标准品作一系列倍比稀释，如4ng/ml、2ng/ ml、lng/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62. 5pg/ml、0pg/ml，从而制作IFN-Y的标准曲 线。待检样品根据需要进行稀释(浓度超出待测范围)或不稀释。将稀释后标准品及待检样 品100ii1加入96孔板，每个样品加两孔，放于湿盒中，37C，lh。
[0047] (6)洗涤：同第二步的洗涤步骤。
[0048] (7)加入生物素标记的IFN-Y检测抗体：将生物素标记的检测抗体稀释到最适浓 度，每孔加l〇〇y1，放于湿盒中，37°C，lh。
[0049] (8)洗涤：同第二步的洗涤步骤。
[0050] (9)加入HRP标记的链霉未和素：将HRP标记的链霉未和素稀释到最适浓度，每孔 加lOOiil，放于湿盒中，37°C，20分钟。
[0051] (10)加显色液：每孔加100ylTMB显色液，室温避光反应15分钟。
[0052] (11)终止：每孔加入50ill终止液。（12)读数：将ELISA反应板放入具有450nm 波长滤光片的酶标仪中读取0D值。
[0053] (13)根据反应中应用不同浓度的IFN-Y所获得的标准曲线来判定本次待检样品 中IFN-y的浓度。样品的阴阳性判定按公式（T-N)/(P-N)=R进行，其中N代表阴性对照 的IFN-Y含量，T代表弓形虫抗原刺激孔的IFN-Y含量，P代表阳性对照的IFN-Y含量。
[0054] 当P彡1000pg/ml时，R> 0? 25时，判为阳性，否则为阴性；当P> 1000pg/ml时， R> 0. 15时，判为阳性，否则为阴性。
[0055] 实施例3通过ELISA检测人全血中特异性T细胞分泌的IFN-Y检测人是否感染 弓形虫
[0056] 首先利用人弓形虫病IgG检测试剂盒对不同感染状态下的人进行血清IgG检测； 其次，采集人的抗凝血，用弓形虫抗原刺激，48h后取上清进行IFN-Y定量检测。
[0057]结果发现，利用ELISA检测人全血分泌的IFN-Y，是检测人是否感染弓形虫的一 种新方法，提示我们，该种方法可以用于检测人的弓形虫病，而且通过该方法可以检测出弓 形虫感染后，人体内的细胞免疫应答状态。
[0058] (1)人血清中IgG水平的检测：
[0059]采集人的血清，用人弓形虫病IgG检测试剂盒（Abeam公司产品)对12个受试者血 清中的IgG水平进行检测。检测结果见图1(A)，对于12位受试者，其中6人为弓形虫感染 阳性，另外6人为阴性。
[00 60] (2)用弓形虫抗原对人全血进行刺激：
[0061] 无菌采取人肝素钠抗凝血，每人3ml，加等量含10%胎牛血清的RPM1640培养基进 行稀释，将稀释后的血液加入六孔板，每只人设置三个培养孔，第一孔加细胞培养基作为阴 性对照，第二孔加入终浓度为12iig/ml的弓形虫抗原，第三孔加入终浓度为20iig/ml的刀 豆蛋白A作为阳性对照。37°C，置于细胞培养箱中培养48h。
[0062] (3)用ELISA方法检测人全血分泌的IFN-Y:
[0063] 收集六孔细胞培养板中的上清，300g离心lOmin，弃红细胞，取上清留作ELISA样 品，用Biolegend公司的人IFN-Y定量检测ELISA试剂盒对样品中的IFN-Y含量进行测 定，按试剂盒的说明，制作样品的标准曲线，对样品中的IFN-y进行定量。检测结果见图1 (B)，每位受试者全血受弓形虫抗原刺激后，所分泌的IFN-y不同。其中，6位受试者的抗 原刺激孔所分泌的IFN-y与阴性对照孔基本相同，而剩余的6位受试者则有较大变化。根 据判定标准，判定其中6人为弓形虫感染阳性，其余6人为阴性，这个结果与前述IgG检测 试剂盒得到的结果一致。
[0064] 实施例4通过基于IFN-Y释放实验的检测试剂盒检测猫是否感染弓形虫
[0065] 为确定干扰素释放试验是否能用于猫弓形虫病的诊断，首先利用猫弓形虫病IgG 检测试剂盒对不同感染状态下的猫进行血清IgG检测。其次，用本发明的弓形虫病检测试 剂盒对猫弓形虫病进行检测。用淋巴细胞分离液分离猫的外周血单核细胞，对单核细胞进 行弓形虫抗原的刺激，取上清进行进行IFN-Y定量检测，细胞沉淀用于提取RNA，从mRNA水 平对IFN-y的表达情况进行检测。
[0066] 结果发现，利用ELISA检测猫外周血单核细胞分泌IFN-Y，检测猫是否感染弓形 虫的方法上述另外两种方法具有很高的相似度。提示我们，该种方法可以用于检测猫的弓 形虫病，而且通过该方法可以检测出弓形虫感染后，猫体内的细胞免疫应答状态。
[0067] 具体的步骤如下：
[0068] ( 1)猫血清中IgG水平的检测：
[0069] 本试验共分三组：第一组，取三只弓形虫IgG水平阴性的猫，每只猫口服感染100 个Pru株包囊，10天后，采集猫的血清，作为口服包囊组；第二组，取三只弓形虫IgG水平阴 性猫，口服PBS，采集血清，作为阴性对照组；第三组，选取三只自然感染弓形虫的猫，口服 PBS，采集血清，作为自然感染组。用动物弓形虫病IgG检测试剂盒(珠海海泰生物公司产品） 对猫血清中的IgG水平进行检测。检测结果见图2(A)，阴性对照组及口服包囊组的猫是阴 性，自然感染组的猫是阳性。结果表明，口服包囊10天后，猫血清中IgG水平较阴性对照组 略有上升，前者平均0D值为后者的1. 41倍。但与自然感染组差别很大，自然感染组的平均 0D值为阴性对照组的10. 65倍。
[0070] (3)外周血单核细胞的分离：
[0071] 无菌采集猫肝素钠抗凝血，加等量PBS稀释，取6ml淋巴细胞分离液(天津灏翔公 司产品）于15ml离心管中，然后在其上加入6ml稀释抗凝血，室温，800g离心20min。离心 后，吸取淋巴细胞，用其至少5倍体积PBS进行洗涤2次，室温，400g离心lOmin，并弃上清。
[0072] (4)用弓形虫抗原对外周血单核细胞进行刺激：
[0073] 对细胞进行计数，然后将细胞加入12孔细胞培养板，每孔5X106个外周血单核细 胞。每只猫设置三个培养孔，第一孔加细胞培养基作为阴性对照，第二孔加入12yg/ml的 弓形虫抗原，第三孔加入20yg/ml的刀豆蛋白A作为阳性对照。37°C，置于细胞培养箱中 培养48h。
[0074] (5)用Real-timePCR方法对检测外周血单核细胞中IFN-YmRNA含量：
[0075] 收集12孔细胞培养板中的细胞，300g离心lOmin，取上清留作ELISA样品，将细胞 沉淀用公司的Trizol试剂（Invitrogen公司产品)提取总RNA，利用Nanodrop2000测定RNA 的浓度及纯度，再用ABI公司的反转录试剂盒（FirstStrandSynthesisKitforRT-PCR) 合成猫外周血单核细胞的cDNA。
[0076] 表1荧光定量PCR检测IFN-Y所用的引物
[0078] 突光定量PCR反应体系：2XSYBRmix，10u1;Primerforward，0? 5u1;Primer reverse, 0. 5u1；RNAfreeH20,7u1 ；cDNA,2u1〇
[0079] 反应程序：50 °C，2min;
[0080] 95°C,lOmin；
[0081] 循环（40 个）：95°C，15s;6(TC，lmin。
[0082] 外周血单核细胞中IFN-ymRNA含量的检测结果见图2(C)。通过每一组中加抗原 刺激孔与未加抗原刺激孔的比值平均值可以看出，口服包囊组者为阴性对照组的3. 89倍； 阳性对照组为阴性对照组的5. 14倍。另外，作为阳性刺激物，刀豆蛋白A的效果要好于PMA+ 离子霉素，前者刺激PBMC产和的IFN-ymRNA水平为后者平均值的3. 74倍。以上结果表明， 同检测血清中的IgG方法相比，通过检测外周血单核细胞分泌IFN-ymRNA含量，可以更好 地提高人工感染弓形虫包囊初期的检出率。
[0083] (6)用ELISA方法检测外周血单核细胞分泌的IFN-Y:
[0084] 收集12孔细胞培养板中的细胞培养上清，用R&D公司的猫IFN-Y定量检测ELISA 试剂盒对样品中的IFN-Y含量进行测定，按试剂盒的说明，制作样品的标准曲线，对样品 中的IFN-Y进行定量。检测结果见图2(B)，阴性对照组及口服包囊组全为阴性，自然感染 组为阳性。通过每一组中加抗原刺激组与未加抗原刺激组的比值平均值可以看出，口服包 囊组为阴性对照组的2. 42倍；阳性对照组为阴性对照组的16. 91倍。另外，作为阳性刺激 物，刀豆蛋白A的效果要好于PMA+离子霉素，前者刺激PBMC产和的IFN-Y水平为后者平 均值的4. 82倍。以上结果表明，该方法与利用Real-time方法检测弓形虫感染猫的结论基 本一致，即该方法与利用检测血清中的IgG方法相比，可以全部检出弓形虫感染阳性猫，检 出率为100%。
[0085] 实施例5通过ELISA检测猫全血中特异性T细胞分泌的IFN-Y检测猫是否感染 弓形虫
[0086] 在确定利用ELISA检测猫外周血单核细胞分泌IFN-Y，可以检测猫是否感染弓形 虫的基础上，我们验证猫全血中特异性T细胞分泌的IFN-Y，是否可以用于检测猫是否感 染弓形虫。
[0087] 首先利用猫弓形虫病IgG检测试剂盒对不同感染状态下的猫进行血清IgG检测； 其次，采集猫的抗凝血，用弓形虫抗原刺激，利用上述实施例2中的方法进行IFN-Y定量检 测。
[0088] 结果发现，利用ELISA检测猫全血分泌的IFN-Y，是检测猫是否感染弓形虫的一 种新方法，提示我们，该种方法可以用于检测猫的弓形虫病，而且通过该方法可以检测出弓 形虫感染后，猫体内的细胞免疫应答状态。
[0089] (1)猫血清中IgG水平的检测：
[0090] 采集猫的血清，用动物弓形虫病IgG检测试剂盒(珠海海泰生物）对猫血清中的IgG水平进行检测。检测结果见图3 (A)，对12只猫进行检测后发现，7只猫为阳性，5只猫 为阴性。
[0091] (2)用弓形虫抗原对猫全血进行刺激：
[0092] 无菌采取猫肝素钠抗凝血，每只猫3ml，加等量细胞培养基进行稀释，将稀释后的 血液加入六孔板，每只猫设置三个培养孔，第一孔加阴性对照，第二孔加入终浓度为12yg/ ml的弓形虫抗原，第三孔加入终浓度为20yg/ml的刀豆蛋白A作为阳性对照。37°C，置于 细胞培养箱中培养48h。
[0093] (3)用ELISA方法检测猫全血分泌的IFN-Y:
[0094] 收集六孔细胞培养板中的上清，300g离心lOmin，弃红细胞，取上清留作ELISA样 品，用R&D公司的猫IFN-Y定量检测ELISA试剂盒对样品中的IFN-Y含量进行测定，按试 齐U盒的说明，制作样品的标准曲线，对样品中的IFN-y进行定量。检测结果见图3(B)。每 只猫全血受弓形虫抗原刺激后，所分泌的IFN-y不同。其中，5只猫的抗原刺激孔所分泌的 IFN-y与阴性对照孔基本相同，经判定为阴性；而剩余的7只猫则有较大变化，经判定为阳 性。该方法与利用检测血清中的IgG方法相比，可以全部检出弓形虫感染阳性猫，检出率为 100%。
[0095] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种弓形虫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：弓形虫抗原、IFN-Y捕获抗 体、IFN-Y标准品、生物素标记的IFN-Y检测抗体。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：细胞培养基、阳性 对照物、阴性对照物、包被液、封闭液、HRP标记的链霉亲和素、显色液和终止液。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照物为刀豆蛋白A。4. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述细胞培养基含有胎牛血清、青链霉 素、(6-巯基乙醇。5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述弓形虫抗原包括弓形虫表面糖蛋 白SAGl、SAG2 ;缓殖子期特异性蛋白BAGl;致密颗粒蛋白GRAl、GRA3-GRA7、GRA10、GRA15 ; 棒状体蛋白R0P1、R0P2、R0P7、R0P16、R0P18 ;微线蛋白MIC1-4、MIC6、MIC8;棒状体颈部蛋 白ROM;顶端膜抗原AMl和热应激蛋白HSP70。6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述弓形虫抗原是通过超声裂解弓形 虫速殖子或缓殖子虫体、或者利用大肠杆菌原核表达并纯化后制备得到的。7. 根据权利要求1-6任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法为： (1) 无菌采集动物或人的抗凝血； (2) 全血稀释后铺细胞培养板； (3) 用弓形虫抗原对动物或人外周血或外周血中分离的细胞进行刺激，使其中的弓形 虫特异性T细胞释放出IFN-Y; (4) 收集培养细胞的上清； (5) ELISA定量检测样品中IFN-Y的含量； (6) 根据试剂盒设置的阴阳性对照品刺激IFN-Y的水平，比较IFN-Y比值差异，判断 动物或人是否感染过弓形虫。
【专利摘要】本发明提供了一种弓形虫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：弓形虫抗原、IFN-γ捕获抗体、IFN-γ标准品、生物素标记的IFN-γ检测抗体、细胞培养基、阳性对照物、阴性对照物、包被液、封闭液、HRP标记的链霉亲和素、显色液和终止液。本发明试剂盒具有高度的敏感性和特异性，克服了现有的弓形虫抗体检测试剂盒所常见的检出率差、误诊率高的缺点。
【IPC分类】G01N33/569
【公开号】CN104897891
【申请号】CN201410081706
【发明人】索勋, 刘贤勇, 尹青
【申请人】中国农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月6日
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