一种基于结核特异性il-31检测的诊断结核分枝杆菌感染的试剂盒的制作方法
一种基于结核特异性il-31检测的诊断结核分枝杆菌感染的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医疗领域，尤其涉及一种利用IL-31诊断结核分枝杆菌感染的诊断试剂盒以及使用该诊断试剂盒诊断结核分枝杆菌感染的方法。
【背景技术】
[0002]结核病是严重危害人类健康的感染性疾病，是目前世界上死亡率最高的慢性传染病。上个世纪80年代人们曾经一度认为已控制了这种疾病，但近年来结核病的发病及死亡率呈上升趋势，据世界卫生组织结核病最新报告中显示:目前全球平均患病人数为1400万人，有880万新发活动性结核病患者，2010年平均有110万HIV阴性人口死于结核病，平均有35万人口死于HIV合并结核病；一个具有传染性的结核病患者每年可份致10-15人感染结核分支杆菌。因此，结核病对全人类的生命健康威胁仍然十分严峻。我国是个结核病高发国家，结核病长期危害着我国人民健康，2010年我国耐多药结核分枝杆菌发病率居世界第二，每年新增活动性结核病患者约150万人，受感染人数约5亿，而每年因结核病死亡者达25万人，同时HIV感染的快速增长使我国结核病的控制面临着巨大的挑战，进一步阐明结核的免疫发病机制，为开发新型诊断手段、疫苗及免疫治疗药物提供有用的信息已经成为众多研宄者的共同目标。
[0003]结核分枝杆菌是一种胞内需氧致病菌，通常先由呼吸道进入人体，然后通过淋巴管或血液播散到其他部位，感染后2-6周人体细胞免疫逐步形成，淋巴细胞、大量的巨噬细胞大量流向感染病灶部位形成肉芽肿，细菌在巨噬细胞内不断生长直至巨噬细胞死亡，细菌重新释放至感染病灶。在这一过程中结核分枝杆菌与机体免疫细胞相互作用主要发生在天然免疫和获得性免疫应答两个方面，而通常会出现三种结局:天然免疫系统清除结核菌、结核分枝杆菌在宿主体内大量增殖导致活动性结核(Active tuberculosis,ATB)或者结核分枝杆菌以静止状态长期存活于肉芽肿和巨噬细胞内其长期被宿主免疫反应所控制，但又不被清除，从而导致潜伏性结核分枝杆菌感染(Latent tuberculosis infect1n, LTBI)状态。保守估计全球约有三分之一约20亿人口是潜伏性结核感染，这部分患者终身发发展为活动性结核几率为5-10%，患者将感染控制于潜伏状态还是发展为活动性结核状态中，获得性免疫应答起着关键作用。
[0004]当天然免疫应答无法从根本上控制结分枝杆菌繁殖时，在持续暴露于结核分枝杆菌抗原的情况下机体启动获得性免疫应答反应。由于结核分枝杆菌寄生在巨噬细胞内部，因此获得性免疫应答中细胞介导的较抗体介导的保护性免疫应答更重要种T细胞亚群参与了细胞免疫应答，CD4+T细胞在结核免疫中起重要保护作用，CD4+效应T细胞主要通过分泌干扰素-γ (IFN-γ)激活巨噬细胞减灭细菌，同时分泌白介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子a (TNF- α )等细胞因子参与免疫保护。⑶8+T细胞/γ δ T细胞通过分泌IFN-γ、穿孔素(Perforin)、颗粒酶(Granzyme)等在结核免疫保护中亦发挥重要作用。除了上述细胞外Thl7、Th22、NKT等参与了结核的保护性免疫应答反应。
[0005]结核性胸膜炎伴胸腔积液是临床上最常见的肺外结核，结核分枝杆菌对胸膜的侵犯与迟发型变态反应是结核性胸膜炎发病机制中的两个重要环节。炎症过程使胸膜血管通透性增加，富含蛋白质和特异的淋巴细胞的液体聚集在胸膜腔中，在这一过程中多种T细胞亚群参与了结核性胸膜炎的免疫应答反应，包括Thl、Th2、Th9、Thl7、Th22等，其分泌的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IL-22 等参与结核的免疫应答反应。
[0006]白介素31(interleukin-31，IL-31)是2004年Dillon等新近发现的细胞因子。初步研宄证实，IL-31及其受体通过调节免疫、调节细胞增殖等作用发挥其功能。目前研宄认为，IL-31是具有4个螺旋结构的单链分子，主要由⑶4+Th2细胞产生，在生理状态下表达水平较低。IL-31是通过IL-31RA受体——GPL(gpl30_like rec印tor)与OSMR形成的异二聚体进行信号转导的。GPL属于I型细胞因子家族，有研宄报道在髓系单核细胞、皮肤、肺与前列的上皮细胞及激活的⑶4+T细胞，均有IL-31RA表达。IL-31激活同时表达IL-31RA和OSMR的细胞；IL-31与IL-31RA结合后主要通过JAK-STAT通路、MPAK通路和PI3_kinase/AKT来进行信号转导发挥效应。IL-31受体主要分布在上皮细胞和淋巴细胞，在皮肤及支气管等组织中表达水平较高。在小鼠模型中发现，IL-31可负向调控⑶4+Th2细胞因子的分泌。近年来研宄发现，IL-31参与搔痒、秃发症、皮肤损伤、气道超敏反应、特应性皮炎、炎症性肠病及自身免疫相关性疾病的发病过程。但IL-31在结核病的免疫发病机制中作用及表达情况目前国内外无相关研宄。
【发明内容】
[0007]本发明为解决现有技术中的上述问题提出的，其目的是提供一种利用结核特异性IL-31诊断结核分枝杆菌感染的诊断试剂盒。
[0008]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0009]—种利用结核特异性IL-31诊断结核分枝杆菌感染的诊断试剂盒，其特征在于，该诊断试剂盒包括IL-31捕获抗体和检测抗体，作为诊断结核分枝杆菌感染的诊断标记物。
[0010]优选地，所述诊断试剂盒还包括结核特异性抗原多肽、稀释液、标准品、显色液、终止液、底物、包被缓冲液、洗涤缓冲液中的一种或几种。
[0011 ] 优选地，所述稀释液包括牛血清白蛋白、硫柳汞、磷酸缓冲液中的一种或几种。
[0012]优选地，所述显色液为辣根过氧化物酶。
[0013]优选地，所述终止液为稀硫酸溶液。
[0014]优选地，所述底物包括四甲基联苯胺、磷酸枣柠檬酸、双氧水、蒸馏水中的一种或几种；所述包被缓冲液为磷酸盐、碳酸盐溶液中的一种或几种；所述洗涤缓冲液包括磷酸盐、氯化钠、氯化钾、吐温-20、蒸馏水中的一种或几种。
[0015]优选地，所述诊断试剂盒还包括固体载体、封板膜。
[0016]优选地，所述固体载体为96孔平底板。
[0017]使用本发明的诊断试剂盒诊断结核性胸膜炎的方法具体包括以下步骤:
[0018]步骤1:无菌条件下采静脉外周全血，然后离心分离5-15分钟，弃上清，冻存于_80°C备用；
[0019]步骤2:外周血分别置于3不同包含物的离心管，包括A:结核特异性抗原刺激管(ESAT-6，CFP-1O, TB7.7) ；N:未加抗原刺激管；M:PHA抗原刺激管作为阳性对照，放置37°C培养箱中孵育24小时。
[0020]步骤3:孵育24小时后，将离心管离心，3000RPM，15min。
[0021]步骤4:去上清血浆，放入1.5mL离心管中；
[0022]步骤5:血浆中IL-31检测:用如上述的IL-31捕获抗体和检测抗体、双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA法)检测血浆中IL-31表达量。
[0023]优选地，所述步骤5中还可以包括以下步骤:
[0024]步骤5.1:
[0025]IL-31捕获抗体的制备:用包被缓冲液溶解IL-31抗体至工作浓度0.8 μ g/mL ；
[0026]IL-31检测抗体制备:用稀释液溶解IL-31抗体至工作浓度0.4 μ g/mL ；
[0027]标准品制备:用稀释液溶解标准品至数个梯度浓度；
[0028]步骤5.2:
[0029]包被固体载体:将所述IL-31捕获抗体吸附在固体载体表面，室温孵育12-36个小时；然后用洗涤缓冲液清洗所述固体载体表面3次；再在所述固体载体表面加入稀释液，室温孵育1-3个小时；
[0030]步骤5.3:
[0031]检测血浆样本:
[0032]先后将数个梯度浓度的标准品、步骤(5.1)制备的IL-31检测抗体、显色液、底物、终止液吸附在步骤(5.2)得到的固体载体表面，并获取不同标准品浓度的光密度值(OD值)，以标准品浓度做横坐标、对应OD值做纵坐标，绘制标准品回归曲线；
[0033]将血浆样本用稀释液1:1比例稀释样本，然后先后将稀释的样本、步骤(5.1)制备的IL-31检测抗体、显色液、底物、终止液吸附在步骤(5.2)得到的固体载体表面，获取的OD值通过所述标准品回归曲线计算出样本浓度，即血浆中IL-31表达量的检测值；其中，每吸附一次，都需用洗涤缓冲液清洗所述固体载体表面3次，并晾干。
[0034]优化的以结核特异性IL-31检测值为23.9pg/mL为诊断界值，以IL-31彡23.9pg/mL结果判断为结核分枝杆菌感染，以IL-31 < 23.9pg/mL结果判断为无结核分枝杆菌感染。
[0035]明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果:
[0036](I)采用本发明检测血浆中IL-31表达量，可用于结核分枝杆菌感染的诊断；
[0037](2)采用本发明检测血浆中结核特异性IL-31表达量，对结核性胸膜炎的诊断有较高的敏感性和准确度；
[0038](3)采用本发明检测血浆中结核特异性IL-31表达量，操作快速、合理可行，可以提高结核分枝杆菌感染诊断的敏感性和特异性；
[0039](4)采用本发明检测血浆中结核特异性IL-31表达量，可用于结核性胸膜炎与非结核性胸膜炎的鉴别诊断。
【附图说明】
[0040]图1:用于制备标准曲线的标准品稀释至8个梯度浓度的示意图；
[0041 ] 图2:8个梯度浓度标准品对应OD值的标准品线性回归曲线；
[0042]图3:结核性和非结核患者血浆中抗原刺激和未刺激处理后IL-31的表达量的统计学结果图；
[0043]图4:以结核特异性抗原在结核和非结核患者中结核特异性IL-31的表达水平，以及诊断的ROC曲线。
【具体实施方式】
[0044]本发明提供了一种利用IL-31诊断结核分枝杆菌感染的诊断试剂盒以及使用该诊断试剂盒诊断结核分枝杆菌感染的方法。
[0045]下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
[0046]本发明的一种利用IL-31诊断结核分枝杆菌感染的诊断试剂盒，诊断试剂盒包括IL -31捕获抗体和IL-31检测抗体作为结核分枝杆菌感染的诊断标记物。
[0047]该诊断试剂盒包括IL-31捕获抗体和检测抗体、结核特异性抗原多肽、稀释液、标准品、显色液、终止液、底物、包被缓冲液、洗涤缓冲液、固体载体、封板膜，其中显色液优选辣根过氧化物酶，终止液优选稀硫酸溶液，底物优选四基联苯胺(TMB)溶液，包被缓冲剂优选磷酸盐PBS缓冲剂，固体载体优选96孔底板和4ml试管。
[0048]实施例一:
[0049]本实施例中，使用上述诊断试剂盒诊断结核分枝杆菌感染的方法，该方法包括如下步骤:
[0050]1、采集外周全血:
[0051]1.1采集包括结核性胸膜炎和肿瘤性胸腔积液患者外周血样本:
[0052]结核性胸胸腔积液患者入选标准:(I)胸水为渗出液，普通细菌培养阴性，结核分枝杆菌培养阳性；(2)胸膜组织病理学检查符合结核。符合上述2项之一者为确诊结核性胸腔积液患者；(3)符合结核性胸腔积液的临床表现:低热，盗汗，乏力，胸闷，渗出性胸腔积液等且抗结核治疗有效者，为临床诊断结核性胸腔积液患者，共入选50例。
[0053]非结核性胸腔积液患者入选标准:(1)胸水为渗出液，结核分枝杆菌培养阳性，胸水脱落细胞查见肿瘤细胞；(2)胸膜组织病理学检查排除结核，明确为肿瘤胸膜转移。符合上述2项之一者肿瘤性胸腔积液患者，共入选41例。
[0054]1.2、标本采集与处理:
[0055]每个入选研宄对象用肝素抗凝的真空采血管采集外周血4ml，4小时之内进行标本处理；
[0056]1.2.1:采血
[0057]本实验需应用三支4ml试管，分别为:结核特异性抗原多肽抗原管(TB Antigentube)阴性对照管(Nil Antigen tube，未加抗原)，阳性对照管(Mitogen tube，加入PHA)。将采集的肝素抗凝血在6小时内加入阳性对照管、阴性对照管和结核抗原管中，每管lmL，将离心管管上下颠倒10次，混匀是血液需覆盖到整个管壁。混匀完后需尽快置入37°C孵育箱内。
[0058]从采血到放入孵育箱内的时间不超过8小时，尽量保持在2小时内。
[0059]1.2.2:孵育
[0060]离心管管在37°C培养箱内孵育24小时孵育后，将试管离心3000rpm，15分钟。
[0061]血浆需尽量全部吸取并转移至2ml冻存管_80°C保存，待ELISA检测。
[0062]2、血浆中结核特异性IL-31水平检测:
[0063]本实施例提供的诊断试剂盒是应用双抗体夹心酶联免疫吸附方法，检测人血浆中IL-31的表达量，其它类型标本包括血清、细胞培养上清和脑脊液等并不推荐应用该试剂合
ΙΤΓΤ.0
[0064]2.1、检测前准备:
[0065](a).诊断试剂盒保存在2_8°C，使用前室温平衡20分钟，将所有试剂平衡至室温;
[0066](b).1L-31捕获抗体制备:取浓度为0.2mg/mL的IL-31抗体，用优选地PH值为7.2的PBS包被缓冲液溶解至工作浓度0.8 μ g/mL ；
[0067](c).1L-31检测抗体制备:取浓度为0.2mg/mL的IL-31抗体，用优选地PH值为7.2的PBS包被缓冲液溶解至工作浓度0.4 μ g/mL ；
[0068](d).标准品制备:取浓度为10 μ g/mL的标准品，用稀释液溶解至500pg/mL，可参照图1进行操作，稀释8个梯度浓度制备标准曲线；检测前15min配置，最高标准曲线最高浓度优选600pg/mL。
[0069]待检测样本避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
[0070]2.2、包被 96 孔板:
[0071](a).将所述IL-31捕获抗体吸附在96孔板表面，每孔加入100 μ L，封板膜封板，室温孵育12-36个小时、优选24个小时；
[0072](b).吸净每孔液体，用洗涤缓冲液400 μ L清洗每孔3次，每次清洗需彻底吸干或反扣96孔板于清洁的吸水纸上扣干残余液体，可替换地使用洗板机进行清洗；
[0073](c).每孔加入300 μ L稀释液，室温孵育1-3个小时、优选2个小时；
[0074](d).重复步骤(b)，抗体包被结束。
[0075]2.3、检测血浆样本:
[0076](a).每孔加入100 μ L、8个浓度梯度的标准品，封板膜封板，室温孵育1_3个小时、优选2个小时，洗板两次，吸净每孔液体，用洗涤缓冲液400 μ L清洗每孔3次，每次清洗需彻底吸干或反扣96孔板于清洁的吸水纸上扣干残余液体，可替换地使用洗板机进行清洗；
[0077](b).每孔加入100 μ L的IL-31检测抗体，封板膜封板，室温孵育1_3个小时、优选2个小时，洗板，吸净每孔液体，用洗涤缓冲液400 μ L清洗每孔3次，每次清洗需彻底吸干或反扣96孔板于清洁的吸水纸上扣干残余液体，可替换地使用洗板机进行清洗；
[0078](c).每孔加入显色液辣根过氧化物100 μ L，封板膜封板，室温避光孵育20分钟，洗板，吸净每孔液体，用洗涤缓冲液400 μ L清洗每孔3次，每次清洗需彻底吸干或反扣96孔板于清洁的吸水纸上扣干残余液体，可替换地使用洗板机进行清洗；
[0079](d).每孔加入100 μ L底物，封板膜封板，室温避光孵育20分钟；
[0080](e).每孔加入50 μ L终止液，轻轻震动96孔板，确保混合均匀；
[0081](f).15分钟内在酶标仪上读取每孔的光密度值(即OD值)；不同浓度的标准品对应OD值绘制如图2所示的标准品线性回归曲线。
[0082]将步骤2.3 (a)中的“标准品”换成“血浆”，对91例血浆样本重复操作步骤2.3中的各个步骤，最终获取的OD值通过图2所述的标准品回归曲线计算出样本浓度，即为血浆中IL-31表达量的检测值。
[0083]3、诊断结果的判定:
[0084]本实施例提供了一种独立的诊断判定方法，根据血浆中结核特异性IL-31的表达水平对结核分枝杆菌感染进行诊断。
[0085]结核特异性IL-31表达水平以抗原刺激管值减去未刺激管值，即Antigen-specific-1L-31 = A-N (pg/mL).
[0086]分别以IL-31 彡 23.9-84.3pg/mL 区间结果判断为阳性，以 IL-31 < 23.9-84.3pg/mL区间结果判断为阴性，在本实施例的91例样本中，使用该判定方法判断结核分枝杆菌感染的敏感性为82.0-92.0%，特异性为90.6-100.0%。
[0087]优化的以Antigen-specific-1L-31检测值为23.9pg/mL为诊断界值，以Antigen-specif ic-1L-31 ^ 23.9pg/mL 结果判断为阳性以 Antigen-specific-1L-31< 23.9pg/mL结果判断为阴性，在本实施例的91例样本中，使用该判定方法判断结核分枝杆菌感染的敏感性为92.9%，特异性为85.7%。
[0088]本实施例的91例血浆本通过回归曲线计算出的IL-31表达量的检查值绘制在图3中，所示横坐标为分组，纵坐标为血楽IL-31表达量(pg/mL)。其中TB (tuberculous)表示结核组，共50例；Malignant表示肿瘤组，共41例；短线代表中位数，两组比较P < 0.0001，差别具有统计学意义。
[0089]图4:A:结核特异性 IL-31 (Antigen-specific-1L-31)在 2 组中的表达量，B:以结核特异性IL-31作为结核分枝杆菌感染诊断的ROC曲线，横坐标为特异性，纵坐标为敏感性，AUC = 93.9 ;其中，ROC表示受试者工作曲线，AUC表示曲线下面积。
[0090]采用本发明检测结核性胸膜炎患者血浆中结核特异性IL-31表达量，可用于结核分枝杆菌感染诊断，而且有较高的敏感性和准确度，同时操作快速，可提高结核分枝杆菌感染的诊断效率。
[0091]以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1.一种利用结核特异性IL-31诊断结核分枝杆菌感染的诊断试剂盒，其特征在于，该诊断试剂盒包括IL-31捕获抗体和IL-31检测抗体作为结核分枝杆菌感染的诊断标记物。2.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包括结核特异性抗原多肽、稀释液、标准品、显色液、终止液、底物、包被缓冲液、洗涤缓冲液中的一种或几种。3.根据权利要求2所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述稀释液包括牛血清白蛋白、硫柳汞、磷酸缓冲液中的一种或几种。4.根据权利要求2所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述显色液为辣根过氧化物酶。5.根据权利要求2所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述终止液为稀硫酸溶液。6.根据权利要求2所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述底物包括四甲基联苯胺、磷酸枣柠檬酸、双氧水、蒸馏水中的一种或几种；所述包被缓冲液为磷酸盐、碳酸盐溶液中的一种或几种；所述洗涤缓冲液包括磷酸盐、氯化钠、氯化钾、吐温-20、蒸馏水中的一种或几种。7.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包括固体载体、封板膜。8.根据权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述固体载体为96孔平底板，4ml试管。
【专利摘要】本发明提供一种利用结核特异性IL-31诊断结核分枝杆菌感染的诊断试剂盒。所述诊断试剂盒包括IL-31捕获抗体和检测抗体、结核特异性抗原多肽、稀释液、标准品、显色液、终止液、缓冲液、固体载体、封板膜。采用本发明检测血浆中IL-31表达量，可用于结核病诊断，而且有较高的敏感性和准确度，同时操作快速，可提高结核病的诊断效率。
【IPC分类】G01N33/569
【公开号】CN104897893
【申请号】CN201510317166
【发明人】高岩, 邵凌云, 张文宏, 吴晶, 张冰琰
【申请人】复旦大学附属华山医院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月10日
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医疗领域，尤其涉及一种利用IL-31诊断结核分枝杆菌感染的诊断试剂盒以及使用该诊断试剂盒诊断结核分枝杆菌感染的方法。
【背景技术】
[0002]结核病是严重危害人类健康的感染性疾病，是目前世界上死亡率最高的慢性传染病。上个世纪80年代人们曾经一度认为已控制了这种疾病，但近年来结核病的发病及死亡率呈上升趋势，据世界卫生组织结核病最新报告中显示:目前全球平均患病人数为1400万人，有880万新发活动性结核病患者，2010年平均有110万HIV阴性人口死于结核病，平均有35万人口死于HIV合并结核病；一个具有传染性的结核病患者每年可份致10-15人感染结核分支杆菌。因此，结核病对全人类的生命健康威胁仍然十分严峻。我国是个结核病高发国家，结核病长期危害着我国人民健康，2010年我国耐多药结核分枝杆菌发病率居世界第二，每年新增活动性结核病患者约150万人，受感染人数约5亿，而每年因结核病死亡者达25万人，同时HIV感染的快速增长使我国结核病的控制面临着巨大的挑战，进一步阐明结核的免疫发病机制，为开发新型诊断手段、疫苗及免疫治疗药物提供有用的信息已经成为众多研宄者的共同目标。
[0003]结核分枝杆菌是一种胞内需氧致病菌，通常先由呼吸道进入人体，然后通过淋巴管或血液播散到其他部位，感染后2-6周人体细胞免疫逐步形成，淋巴细胞、大量的巨噬细胞大量流向感染病灶部位形成肉芽肿，细菌在巨噬细胞内不断生长直至巨噬细胞死亡，细菌重新释放至感染病灶。在这一过程中结核分枝杆菌与机体免疫细胞相互作用主要发生在天然免疫和获得性免疫应答两个方面，而通常会出现三种结局:天然免疫系统清除结核菌、结核分枝杆菌在宿主体内大量增殖导致活动性结核(Active tuberculosis,ATB)或者结核分枝杆菌以静止状态长期存活于肉芽肿和巨噬细胞内其长期被宿主免疫反应所控制，但又不被清除，从而导致潜伏性结核分枝杆菌感染(Latent tuberculosis infect1n, LTBI)状态。保守估计全球约有三分之一约20亿人口是潜伏性结核感染，这部分患者终身发发展为活动性结核几率为5-10%，患者将感染控制于潜伏状态还是发展为活动性结核状态中，获得性免疫应答起着关键作用。
[0004]当天然免疫应答无法从根本上控制结分枝杆菌繁殖时，在持续暴露于结核分枝杆菌抗原的情况下机体启动获得性免疫应答反应。由于结核分枝杆菌寄生在巨噬细胞内部，因此获得性免疫应答中细胞介导的较抗体介导的保护性免疫应答更重要种T细胞亚群参与了细胞免疫应答，CD4+T细胞在结核免疫中起重要保护作用，CD4+效应T细胞主要通过分泌干扰素-γ (IFN-γ)激活巨噬细胞减灭细菌，同时分泌白介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子a (TNF- α )等细胞因子参与免疫保护。⑶8+T细胞/γ δ T细胞通过分泌IFN-γ、穿孔素(Perforin)、颗粒酶(Granzyme)等在结核免疫保护中亦发挥重要作用。除了上述细胞外Thl7、Th22、NKT等参与了结核的保护性免疫应答反应。
[0005]结核性胸膜炎伴胸腔积液是临床上最常见的肺外结核，结核分枝杆菌对胸膜的侵犯与迟发型变态反应是结核性胸膜炎发病机制中的两个重要环节。炎症过程使胸膜血管通透性增加，富含蛋白质和特异的淋巴细胞的液体聚集在胸膜腔中，在这一过程中多种T细胞亚群参与了结核性胸膜炎的免疫应答反应，包括Thl、Th2、Th9、Thl7、Th22等，其分泌的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IL-22 等参与结核的免疫应答反应。
[0006]白介素31(interleukin-31，IL-31)是2004年Dillon等新近发现的细胞因子。初步研宄证实，IL-31及其受体通过调节免疫、调节细胞增殖等作用发挥其功能。目前研宄认为，IL-31是具有4个螺旋结构的单链分子，主要由⑶4+Th2细胞产生，在生理状态下表达水平较低。IL-31是通过IL-31RA受体——GPL(gpl30_like rec印tor)与OSMR形成的异二聚体进行信号转导的。GPL属于I型细胞因子家族，有研宄报道在髓系单核细胞、皮肤、肺与前列的上皮细胞及激活的⑶4+T细胞，均有IL-31RA表达。IL-31激活同时表达IL-31RA和OSMR的细胞；IL-31与IL-31RA结合后主要通过JAK-STAT通路、MPAK通路和PI3_kinase/AKT来进行信号转导发挥效应。IL-31受体主要分布在上皮细胞和淋巴细胞，在皮肤及支气管等组织中表达水平较高。在小鼠模型中发现，IL-31可负向调控⑶4+Th2细胞因子的分泌。近年来研宄发现，IL-31参与搔痒、秃发症、皮肤损伤、气道超敏反应、特应性皮炎、炎症性肠病及自身免疫相关性疾病的发病过程。但IL-31在结核病的免疫发病机制中作用及表达情况目前国内外无相关研宄。
【发明内容】
[0007]本发明为解决现有技术中的上述问题提出的，其目的是提供一种利用结核特异性IL-31诊断结核分枝杆菌感染的诊断试剂盒。
[0008]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0009]—种利用结核特异性IL-31诊断结核分枝杆菌感染的诊断试剂盒，其特征在于，该诊断试剂盒包括IL-31捕获抗体和检测抗体，作为诊断结核分枝杆菌感染的诊断标记物。
[0010]优选地，所述诊断试剂盒还包括结核特异性抗原多肽、稀释液、标准品、显色液、终止液、底物、包被缓冲液、洗涤缓冲液中的一种或几种。
[0011 ] 优选地，所述稀释液包括牛血清白蛋白、硫柳汞、磷酸缓冲液中的一种或几种。
[0012]优选地，所述显色液为辣根过氧化物酶。
[0013]优选地，所述终止液为稀硫酸溶液。
[0014]优选地，所述底物包括四甲基联苯胺、磷酸枣柠檬酸、双氧水、蒸馏水中的一种或几种；所述包被缓冲液为磷酸盐、碳酸盐溶液中的一种或几种；所述洗涤缓冲液包括磷酸盐、氯化钠、氯化钾、吐温-20、蒸馏水中的一种或几种。
[0015]优选地，所述诊断试剂盒还包括固体载体、封板膜。
[0016]优选地，所述固体载体为96孔平底板。
[0017]使用本发明的诊断试剂盒诊断结核性胸膜炎的方法具体包括以下步骤:
[0018]步骤1:无菌条件下采静脉外周全血，然后离心分离5-15分钟，弃上清，冻存于_80°C备用；
[0019]步骤2:外周血分别置于3不同包含物的离心管，包括A:结核特异性抗原刺激管(ESAT-6，CFP-1O, TB7.7) ；N:未加抗原刺激管；M:PHA抗原刺激管作为阳性对照，放置37°C培养箱中孵育24小时。
[0020]步骤3:孵育24小时后，将离心管离心，3000RPM，15min。
[0021]步骤4:去上清血浆，放入1.5mL离心管中；
[0022]步骤5:血浆中IL-31检测:用如上述的IL-31捕获抗体和检测抗体、双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA法)检测血浆中IL-31表达量。
[0023]优选地，所述步骤5中还可以包括以下步骤:
[0024]步骤5.1:
[0025]IL-31捕获抗体的制备:用包被缓冲液溶解IL-31抗体至工作浓度0.8 μ g/mL ；
[0026]IL-31检测抗体制备:用稀释液溶解IL-31抗体至工作浓度0.4 μ g/mL ；
[0027]标准品制备:用稀释液溶解标准品至数个梯度浓度；
[0028]步骤5.2:
[0029]包被固体载体:将所述IL-31捕获抗体吸附在固体载体表面，室温孵育12-36个小时；然后用洗涤缓冲液清洗所述固体载体表面3次；再在所述固体载体表面加入稀释液，室温孵育1-3个小时；
[0030]步骤5.3:
[0031]检测血浆样本:
[0032]先后将数个梯度浓度的标准品、步骤(5.1)制备的IL-31检测抗体、显色液、底物、终止液吸附在步骤(5.2)得到的固体载体表面，并获取不同标准品浓度的光密度值(OD值)，以标准品浓度做横坐标、对应OD值做纵坐标，绘制标准品回归曲线；
[0033]将血浆样本用稀释液1:1比例稀释样本，然后先后将稀释的样本、步骤(5.1)制备的IL-31检测抗体、显色液、底物、终止液吸附在步骤(5.2)得到的固体载体表面，获取的OD值通过所述标准品回归曲线计算出样本浓度，即血浆中IL-31表达量的检测值；其中，每吸附一次，都需用洗涤缓冲液清洗所述固体载体表面3次，并晾干。
[0034]优化的以结核特异性IL-31检测值为23.9pg/mL为诊断界值，以IL-31彡23.9pg/mL结果判断为结核分枝杆菌感染，以IL-31 < 23.9pg/mL结果判断为无结核分枝杆菌感染。
[0035]明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果:
[0036](I)采用本发明检测血浆中IL-31表达量，可用于结核分枝杆菌感染的诊断；
[0037](2)采用本发明检测血浆中结核特异性IL-31表达量，对结核性胸膜炎的诊断有较高的敏感性和准确度；
[0038](3)采用本发明检测血浆中结核特异性IL-31表达量，操作快速、合理可行，可以提高结核分枝杆菌感染诊断的敏感性和特异性；
[0039](4)采用本发明检测血浆中结核特异性IL-31表达量，可用于结核性胸膜炎与非结核性胸膜炎的鉴别诊断。
【附图说明】
[0040]图1:用于制备标准曲线的标准品稀释至8个梯度浓度的示意图；
[0041 ] 图2:8个梯度浓度标准品对应OD值的标准品线性回归曲线；
[0042]图3:结核性和非结核患者血浆中抗原刺激和未刺激处理后IL-31的表达量的统计学结果图；
[0043]图4:以结核特异性抗原在结核和非结核患者中结核特异性IL-31的表达水平，以及诊断的ROC曲线。
【具体实施方式】
[0044]本发明提供了一种利用IL-31诊断结核分枝杆菌感染的诊断试剂盒以及使用该诊断试剂盒诊断结核分枝杆菌感染的方法。
[0045]下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
[0046]本发明的一种利用IL-31诊断结核分枝杆菌感染的诊断试剂盒，诊断试剂盒包括IL -31捕获抗体和IL-31检测抗体作为结核分枝杆菌感染的诊断标记物。
[0047]该诊断试剂盒包括IL-31捕获抗体和检测抗体、结核特异性抗原多肽、稀释液、标准品、显色液、终止液、底物、包被缓冲液、洗涤缓冲液、固体载体、封板膜，其中显色液优选辣根过氧化物酶，终止液优选稀硫酸溶液，底物优选四基联苯胺(TMB)溶液，包被缓冲剂优选磷酸盐PBS缓冲剂，固体载体优选96孔底板和4ml试管。
[0048]实施例一:
[0049]本实施例中，使用上述诊断试剂盒诊断结核分枝杆菌感染的方法，该方法包括如下步骤:
[0050]1、采集外周全血:
[0051]1.1采集包括结核性胸膜炎和肿瘤性胸腔积液患者外周血样本:
[0052]结核性胸胸腔积液患者入选标准:(I)胸水为渗出液，普通细菌培养阴性，结核分枝杆菌培养阳性；(2)胸膜组织病理学检查符合结核。符合上述2项之一者为确诊结核性胸腔积液患者；(3)符合结核性胸腔积液的临床表现:低热，盗汗，乏力，胸闷，渗出性胸腔积液等且抗结核治疗有效者，为临床诊断结核性胸腔积液患者，共入选50例。
[0053]非结核性胸腔积液患者入选标准:(1)胸水为渗出液，结核分枝杆菌培养阳性，胸水脱落细胞查见肿瘤细胞；(2)胸膜组织病理学检查排除结核，明确为肿瘤胸膜转移。符合上述2项之一者肿瘤性胸腔积液患者，共入选41例。
[0054]1.2、标本采集与处理:
[0055]每个入选研宄对象用肝素抗凝的真空采血管采集外周血4ml，4小时之内进行标本处理；
[0056]1.2.1:采血
[0057]本实验需应用三支4ml试管，分别为:结核特异性抗原多肽抗原管(TB Antigentube)阴性对照管(Nil Antigen tube，未加抗原)，阳性对照管(Mitogen tube，加入PHA)。将采集的肝素抗凝血在6小时内加入阳性对照管、阴性对照管和结核抗原管中，每管lmL，将离心管管上下颠倒10次，混匀是血液需覆盖到整个管壁。混匀完后需尽快置入37°C孵育箱内。
[0058]从采血到放入孵育箱内的时间不超过8小时，尽量保持在2小时内。
[0059]1.2.2:孵育
[0060]离心管管在37°C培养箱内孵育24小时孵育后，将试管离心3000rpm，15分钟。
[0061]血浆需尽量全部吸取并转移至2ml冻存管_80°C保存，待ELISA检测。
[0062]2、血浆中结核特异性IL-31水平检测:
[0063]本实施例提供的诊断试剂盒是应用双抗体夹心酶联免疫吸附方法，检测人血浆中IL-31的表达量，其它类型标本包括血清、细胞培养上清和脑脊液等并不推荐应用该试剂合
ΙΤΓΤ.0
[0064]2.1、检测前准备:
[0065](a).诊断试剂盒保存在2_8°C，使用前室温平衡20分钟，将所有试剂平衡至室温;
[0066](b).1L-31捕获抗体制备:取浓度为0.2mg/mL的IL-31抗体，用优选地PH值为7.2的PBS包被缓冲液溶解至工作浓度0.8 μ g/mL ；
[0067](c).1L-31检测抗体制备:取浓度为0.2mg/mL的IL-31抗体，用优选地PH值为7.2的PBS包被缓冲液溶解至工作浓度0.4 μ g/mL ；
[0068](d).标准品制备:取浓度为10 μ g/mL的标准品，用稀释液溶解至500pg/mL，可参照图1进行操作，稀释8个梯度浓度制备标准曲线；检测前15min配置，最高标准曲线最高浓度优选600pg/mL。
[0069]待检测样本避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
[0070]2.2、包被 96 孔板:
[0071](a).将所述IL-31捕获抗体吸附在96孔板表面，每孔加入100 μ L，封板膜封板，室温孵育12-36个小时、优选24个小时；
[0072](b).吸净每孔液体，用洗涤缓冲液400 μ L清洗每孔3次，每次清洗需彻底吸干或反扣96孔板于清洁的吸水纸上扣干残余液体，可替换地使用洗板机进行清洗；
[0073](c).每孔加入300 μ L稀释液，室温孵育1-3个小时、优选2个小时；
[0074](d).重复步骤(b)，抗体包被结束。
[0075]2.3、检测血浆样本:
[0076](a).每孔加入100 μ L、8个浓度梯度的标准品，封板膜封板，室温孵育1_3个小时、优选2个小时，洗板两次，吸净每孔液体，用洗涤缓冲液400 μ L清洗每孔3次，每次清洗需彻底吸干或反扣96孔板于清洁的吸水纸上扣干残余液体，可替换地使用洗板机进行清洗；
[0077](b).每孔加入100 μ L的IL-31检测抗体，封板膜封板，室温孵育1_3个小时、优选2个小时，洗板，吸净每孔液体，用洗涤缓冲液400 μ L清洗每孔3次，每次清洗需彻底吸干或反扣96孔板于清洁的吸水纸上扣干残余液体，可替换地使用洗板机进行清洗；
[0078](c).每孔加入显色液辣根过氧化物100 μ L，封板膜封板，室温避光孵育20分钟，洗板，吸净每孔液体，用洗涤缓冲液400 μ L清洗每孔3次，每次清洗需彻底吸干或反扣96孔板于清洁的吸水纸上扣干残余液体，可替换地使用洗板机进行清洗；
[0079](d).每孔加入100 μ L底物，封板膜封板，室温避光孵育20分钟；
[0080](e).每孔加入50 μ L终止液，轻轻震动96孔板，确保混合均匀；
[0081](f).15分钟内在酶标仪上读取每孔的光密度值(即OD值)；不同浓度的标准品对应OD值绘制如图2所示的标准品线性回归曲线。
[0082]将步骤2.3 (a)中的“标准品”换成“血浆”，对91例血浆样本重复操作步骤2.3中的各个步骤，最终获取的OD值通过图2所述的标准品回归曲线计算出样本浓度，即为血浆中IL-31表达量的检测值。
[0083]3、诊断结果的判定:
[0084]本实施例提供了一种独立的诊断判定方法，根据血浆中结核特异性IL-31的表达水平对结核分枝杆菌感染进行诊断。
[0085]结核特异性IL-31表达水平以抗原刺激管值减去未刺激管值，即Antigen-specific-1L-31 = A-N (pg/mL).
[0086]分别以IL-31 彡 23.9-84.3pg/mL 区间结果判断为阳性，以 IL-31 < 23.9-84.3pg/mL区间结果判断为阴性，在本实施例的91例样本中，使用该判定方法判断结核分枝杆菌感染的敏感性为82.0-92.0%，特异性为90.6-100.0%。
[0087]优化的以Antigen-specific-1L-31检测值为23.9pg/mL为诊断界值，以Antigen-specif ic-1L-31 ^ 23.9pg/mL 结果判断为阳性以 Antigen-specific-1L-31< 23.9pg/mL结果判断为阴性，在本实施例的91例样本中，使用该判定方法判断结核分枝杆菌感染的敏感性为92.9%，特异性为85.7%。
[0088]本实施例的91例血浆本通过回归曲线计算出的IL-31表达量的检查值绘制在图3中，所示横坐标为分组，纵坐标为血楽IL-31表达量(pg/mL)。其中TB (tuberculous)表示结核组，共50例；Malignant表示肿瘤组，共41例；短线代表中位数，两组比较P < 0.0001，差别具有统计学意义。
[0089]图4:A:结核特异性 IL-31 (Antigen-specific-1L-31)在 2 组中的表达量，B:以结核特异性IL-31作为结核分枝杆菌感染诊断的ROC曲线，横坐标为特异性，纵坐标为敏感性，AUC = 93.9 ;其中，ROC表示受试者工作曲线，AUC表示曲线下面积。
[0090]采用本发明检测结核性胸膜炎患者血浆中结核特异性IL-31表达量，可用于结核分枝杆菌感染诊断，而且有较高的敏感性和准确度，同时操作快速，可提高结核分枝杆菌感染的诊断效率。
[0091]以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1.一种利用结核特异性IL-31诊断结核分枝杆菌感染的诊断试剂盒，其特征在于，该诊断试剂盒包括IL-31捕获抗体和IL-31检测抗体作为结核分枝杆菌感染的诊断标记物。2.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包括结核特异性抗原多肽、稀释液、标准品、显色液、终止液、底物、包被缓冲液、洗涤缓冲液中的一种或几种。3.根据权利要求2所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述稀释液包括牛血清白蛋白、硫柳汞、磷酸缓冲液中的一种或几种。4.根据权利要求2所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述显色液为辣根过氧化物酶。5.根据权利要求2所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述终止液为稀硫酸溶液。6.根据权利要求2所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述底物包括四甲基联苯胺、磷酸枣柠檬酸、双氧水、蒸馏水中的一种或几种；所述包被缓冲液为磷酸盐、碳酸盐溶液中的一种或几种；所述洗涤缓冲液包括磷酸盐、氯化钠、氯化钾、吐温-20、蒸馏水中的一种或几种。7.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包括固体载体、封板膜。8.根据权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述固体载体为96孔平底板，4ml试管。
【专利摘要】本发明提供一种利用结核特异性IL-31诊断结核分枝杆菌感染的诊断试剂盒。所述诊断试剂盒包括IL-31捕获抗体和检测抗体、结核特异性抗原多肽、稀释液、标准品、显色液、终止液、缓冲液、固体载体、封板膜。采用本发明检测血浆中IL-31表达量，可用于结核病诊断，而且有较高的敏感性和准确度，同时操作快速，可提高结核病的诊断效率。
【IPC分类】G01N33/569
【公开号】CN104897893
【申请号】CN201510317166
【发明人】高岩, 邵凌云, 张文宏, 吴晶, 张冰琰
【申请人】复旦大学附属华山医院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月10日
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