一种检测胞内分枝杆菌的elisa检测方法
一种检测胞内分枝杆菌的elisa检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学、细胞生物学与微生物学领域。
【背景技术】
[0002]胞内分枝杆菌为典型的非结核分枝杆菌(NTM)成员，属于分枝杆菌属。生长缓慢(培养所需时间4-8周)，广泛分布于自然界，人畜均可感染，该菌侵入人及动物机体内引起的机体免疫学改变，促进迟发型变态反应增强，感染后因排菌而导致易感者感染，造成本病长期流行。另外胞内分枝杆菌感染与肺结核病的临床表现极为相似，容易造成误诊误治。基于目前胞内分枝杆菌感染对国内外公共卫生方面存在极大的潜在威胁，发展和建立特异、灵敏的检测胞内分枝杆菌方法是十分急需、必要的。
[0003]HBHA是分枝杆菌分泌的一种黏附素，它是由致病性分枝杆菌产生的一种糖蛋白，近年来国内外相关研宄表明HBHA基因具备较好的免疫原性和免疫反应性，是一种良好的疫苗研制的候选基因。2006年张旭霞等应用以天然和重组HBHA蛋白进行ELISA方法检测人结核病，结果显示两者都具备良好的检测敏感性和特异性。可以较好的用于结核病的诊断。
[0004]目前胞内分枝杆菌菌种鉴定主要以形态和生理生化特征的综合指标为依据，此方法操作复杂、费时，重复性差，且试验的影响因素较多，有时出现误判。而ELISA检测方法是目前技术较成熟的技术，其具有操作简便、特异性强、价格低廉且无须特殊仪器等优点比较容易大面积推广。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是:提供一种检测胞内分枝杆菌的ELISA检测方法，采用单克隆抗体技术制备胞内分枝杆菌HBHA单克隆抗体，以制备的胞内分枝杆菌HBHA单克隆抗体为包被抗体，建立胞内分枝杆菌双抗夹心ELISA检测方法，实现快速、便捷、实时、特异检测胞内分枝杆菌生物学新方法，为人类健康与农牧业发展服务。
[0006]本发明的胞内分枝杆菌ELISA检测方法是: a、胞内分枝杆菌抗血清的制备
(O免疫死菌剂与活菌制剂的制备
免疫死菌剂:胞内分枝杆菌于Middle brook 7H10抗原培养基中培养2~4周(菌处于对数生长期)，用含3%甲醛的无菌生理盐水洗涤一下并收集于小安培瓶中，37 ^于室温静置24h灭活胞内分枝杆菌，旋涡震荡器充分震荡混匀制成菌悬液，再静置lh，吸取沉淀后的上层菌悬液于离心管中，4°C离心机3000r/min~5000r/min离心lOmin，弃去上清液，并在525nm波长下用无菌生理盐水稀释菌体沉淀至OD值为0.3，4°C备用。
[0007]活菌免疫制剂:待Middle brook 7H10抗原培养基上的胞内分枝杆菌处于对数生长期(培养2~4周)，用无菌生理盐水冲洗胞内分枝杆菌并收集于小安培瓶中，于室温下静置24h，旋涡震荡器充分震荡混匀制成菌悬液，再静置lh，吸取沉淀后的上层菌悬液于离心管中，4°C离心机3000r/min~5000r/min离心lOmin，弃去上清液，并在525nm波长下用无菌生理盐水稀释菌体沉淀至OD值为0.3，4°C备用。
[0008](2)胞内分枝杆菌抗血清制备
首先试验用健康无抗兔，共免疫四次，每次免疫相隔一周，第一次、第二次为胞内分枝杆菌死菌剂免疫；第三次和第四次用胞内分枝杆菌活菌制剂。同时设空白对照组，注射生理盐水。四次免疫分别以0.5mL、l.0mLU.0mLU.5mL剂量耳缘静脉注射。末次免疫后一周，对实验动物进行耳缘静脉采血，并做抗体效价检测，当血清凝集效价达到1:160时，颈动脉采血，采集的血液移入灭菌50mL大离心管中，置于37°C培养箱中静置30min后再于4°C冰箱中静置过夜，自然沉降法析出血清，之后4°C离心机中3000r/min~5000r/min离心lOmin，收集上清抗血清，分装于无菌小安培瓶中。-20 °C保存备用。
[0009]b、改良过碘酸钠法制备胞内分枝杆菌抗血清酶标抗体
(I)取5mg辣根过氧化物酶(HRP)溶于0.5mL蒸馏水，加入1%2，4 二硝基氟苯(DNFB)无水乙醇溶液100 μ I,室温下轻微搅拌作用Ih。
[0010](2)加入ImL 0.06mol/L Na14,室温下避光轻搅30min，溶液呈黄绿色。
[0011](3)加入ImL0.16mol/L乙二醇，室温(20°C ± )下轻搅作用I h，终止氧化反应。
[0012](4)加入5mg抗体，装入透析袋，置0.05mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液I 000 mL中，4°C透析过夜，更换3次。
[0013](5)取出透析袋中液体(约3 mL)，加入5mg/mLNaHB4 200 μ L 4°C 2h或过夜。
[0014](6)加50%饱和硫酸铵(NH4)2304溶液6 mL沉淀结合物，置4°C 30min后，3 OOOr/min离心30min，取沉淀。
[0015](7)将沉淀物溶于PBS (0.02M ρΗ7.4)中，装入透析袋，并以此缓冲液透析平衡6~12h，换液3次。
[0016](8)在结合物内加入等量60%甘油，小量分装(或冻干，不需加甘油)，低温保存备用。
[0017]C、胞内分枝杆菌双抗夹心ELISA检测方法建立
Cl)抗体包被:100 μ L包被液(pH 9.6,0.05mol/L碳酸盐缓冲液)包被胞内分枝杆菌HBHA单抗隆抗体(终浓度为0.2-0.6 μ g/ml)，4°C包被12~24h或37°C孵育lh~2h，甩掉孔内液体。
[0018](2)封闭:每孔中加入10(^1^封闭液(1°/(^4)轻轻摇匀，4°〇过夜或37°〇lh。甩掉孔内封闭液，逐孔加满洗涤缓冲液(pH 7.4,0.15mol/L PBS)，静置2~3min，甩掉孔内洗涤缓冲液，反复洗涤2~4次后拍干。
[0019](3)加待检样品:每孔加入待检的疑似胞内分枝杆菌检样每孔100yL，37°C温育l~1.5h。弃去菌样，逐孔加满洗涤缓冲液(pH 7.4,0.15mol/L PBS)，静置2~3min，甩掉孔内洗涤缓冲液，反复洗涤2~4次后拍干。每次检测应同时设定空白对照、阳性对照和阴性对照各孔。
[0020](4)加酶标抗体:每孔加入1: 5000~1: 3000稀释的胞内分枝杆菌抗兔IgG-HRP(辣根过氧化物酶标记的胞内分枝杆菌抗兔血清)每孔100 μ L，轻轻摇匀，37°C温育I h，弃去酶标抗体，逐孔加满洗涤缓冲液(pH 7.4,0.15mol/L PBS)，静置2~3min，甩掉孔内洗涤缓冲液，反复洗涤2~4次后拍干。
[0021](5)加显色液:每孔各加入TMB (四甲基联苯胺)显色液100 μ L，，室温避光显色1min?30mino
[0022](6)终止反应:每孔加入50 μ L终止液(2mol/L H2SO4)终止，测OD45tl值，并记录。
[0023](7)判定结果:试验组OD45tl/阴性对照组OD45tl值大于或等于2.1为阳性。
[0024]样品处理:
如检样为液体，取100 μ L检样进行ELISA检测即可。
[0025]如检样为固体动物组织样品，将样品用高压灭菌的生理盐水冲洗三次，去除结缔组织，修切成0.5cmX0.5cm大小方块，加入约ImL生理盐水剪碎或研磨至匀浆。浸泡超过1min,离心取100 μ L上清进行ELISA检测。
[0026]本发明的有益效果是:本发明制备胞内分枝杆菌HBHA单克隆抗体，由于单克隆抗体具备纯度高、特异性强、可以提高各种血清学方法检测抗原的敏感性及特异性的特点，因此以胞内分枝杆菌HBHA单克隆抗体为包被抗体，建立胞内分枝杆菌双抗夹心ELISA检测方法，可以提高检测的特异性与敏感性。对胞内分枝杆菌病的诊断和防制具有重要的现实意义，涉及到畜牧业健康发展和国计民生，具有广阔的发展前景和巨大的市场需求。
【附图说明】
[0027]图1是本发明外扩片段的PCR扩增结果图；
图2是本发明内扩片段的PCR扩增结果图；
图3是本发明重组质粒pMD18-T-HBHA的Hind III /BamH I双酶切鉴定图；
图4是本发明测序结果(加入两端酶切位点共646 bp)图；
图5是本发明SDS-PAGE分析图；
图6是本发明表达载体pET32a-HBHA表达产物的Western blot分析图；
图7是本发明HBHA蛋白分离纯化。
【具体实施方式】
[0028]下面结合附图对本发明做进一步描述:
实施例1
图1 中，1.1 HBHA 基因外扩产物；1.2 DL 2000 DNA Marker; 1.3 D 15000 DNAMarker.图 2 中，2.1.DL 2000 DNA Marker; 2.2.HBHA 基因内扩产物；
图 3 中，3.1 DL 2000 DNA Marke; 3.2 DM 10000 Marker; 3.3重组质粒pMD18-T_HBHA的Hind III /BamH I双酶切结果；
图5中，5.1.pET 32a-HBHA诱导前对照；5.2.pET 32a (+)空载体诱导全菌；5.3.pET 32a-HBHA诱导全菌；5.4.蛋白分子量标准；
图6中，6.1预染蛋白分子质量标准；6.2 pET32a_HBHA诱导全菌进行Western blot
分析
图7中，7.1纯化的HBHA蛋白；7.2 pET 32a_HBHA诱导全菌；7.3预染蛋白分子量标准。
[0029]1、HBHA原核表达载体的构建及蛋白表达与纯化 (I)胞内分枝杆菌的复壮
胞内分枝杆菌(ATCC13 950株)购自于中国药品生物制品检定所。
[0030]采用改良罗氏培养基对胞内分枝杆菌进行复苏培养，置于37 °〇恒温培养箱中培养4-8周，培养过程中定期观察，待菌体长满培养基表面时取出放于4 °C冰箱中备用。
[0031 ] (2 )胞内分枝杆菌DNA提取
使用Takara基因组抽提试剂盒进行胞内分枝杆菌基因组DNA的提取，-20 °C保存备用。
[0032](3)引物设计与合成及胞内分枝杆菌HBHA的PCR扩增
应用Primer 5.0软件，参照GenBank中胞内分枝杆菌标准菌株M.1ntracellulareATCC 13950 (GenBank登录号:ΥΡ_005340080.I)基因序列，设计扩增HBHA基因大约630 bp特异性片段引物一对(由上海生物技术有限公司合成)，即
Pl:5' -CAGGATCCAAAGGAAAAACCATGGCGGA-3'(下划线部分为 BamH I 酶切位点)，
P2:5' -CGAAGCTTCTACTTCTGGGTGACCTTCTTG-3'(下划线部分为 Hind III酶切位点)。
[0033]1.2.3胞内分枝杆菌HBHA的PCR扩增 PCR反应体系:胞内分枝杆菌DNA
1.5 μ L, Ρ1/Ρ2 (10 μπιοΙ/L)各 1.5 μ L, dNTPs (2.5 mmol/L)3.5 μ L, 10XExTaqbuffer (Mg2+) 5.0 μ L，Extmi (5 U/μ L) 1.0 μ L, ddH20 36.0 μ L，总体积 50 yL。反应程序:94 °C 4 min ；94 °C 30 s，61 °C 30 s，72 °C 60 s，30 个循环；72 °C 10 min。取 PCR产物在10 g/L琼脂糖凝胶上进行电泳检测，用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化目的基因。(见附图1、附图2所示)
(4)pMD18-T-HBHA重组质粒的构建
将HBHA基因PCR回收产物与pMD18-T载体连接，构建重组质粒pMD18-T_HBHA。将连接产物转入E.coli DH5a并挑取阳性单克隆，进行BamH I和Hind III双酶切鉴定，(见附图3所示)将单克隆菌液送宝生物工程(大连)有限公司测序。(测序结果见附图4所示)
(5)原核表达载体pET32a-HBHA的构建、原核表达及纯化
采用限制性内切酶BamH I和Hind III对重组质粒pMD18-T_HBHA进行双酶切，回收目的片段HBHA，与经同样双酶切的表达载体pET32a (+)连接，将连接产物pET32a_HBHA转化入BL21CDE3)中，任选阳性克隆pET32a-HBHA重组菌接种于10 mL LB培养基(Amplr)中，37 V180 r/min 培养 1.5 ?2 h(0D _值为 0.4 ?0.6)，加入 IPTG 至终浓度为 0.8 mmol/L，37°C180 !■/!!!化诱导培养*』ho实验同时设诱导前菌液及转化入BL21 (DE3)中的pET32a(+)空载体诱导作为对照。将培养好的菌液3500 r/min离心10 min，收集菌体。取4 mL PBS将菌体重悬，反复冻融3次。吸取100 μ?菌液，加入2 X SDS上样缓冲液100 μ?,沸水中煮样5 min左右。以12 %的SDS-PAGE凝胶电泳进行鉴定。(见附图5所示)
同时进行Western blot分析。将SDS-PAGE电泳结束后的凝胶取下连同转印滤纸、PVDF膜一同置于转印缓冲液中浸泡1.5 ho取出后按顺序，滤纸(3层)、硝酸纤维素膜、凝胶、滤纸(3层)，依次将其放入转印槽中，不要存有气泡。凝胶一侧接负极，PVDF膜接正极，200 mA恒流转印I?2 ho用封闭液BSA将PVDF膜封闭I h，用PBST稀释的胞内分枝杆菌阳性血清抗体(I: 1000)加到膜上，4 °C过夜。PBS洗涤3次，其间要不断振荡，再加入用PBST稀释的HRP标记的羊抗兔二抗(1:5000)，不断振荡，之后PBS洗涤4?5次，最后DAB显色3?5 min。去离子水洗膜完后扫描鉴定结果并记录。(见附图6所示) 离心收集诱导后菌体，参照His-Binding-Resin说明书进行HBHA可溶性蛋白分离纯化(见附图7所示)，并应用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量。HBHA蛋白浓度为0.7 mg/
mLo
[0034]2、胞内分枝杆菌抗HBHA单克隆抗体的制备
2.1动物免疫
选取8-12周龄雌性BALB/c小鼠，使用纯化的胞内分枝杆菌HBHA蛋白作为抗原进行免疫，免疫剂量为蛋白抗原10yg/小鼠/次，免疫时间间隔为三周，共免疫三次。第三次免疫三周后采小鼠尾静脉血用ELISA方法检测血清效价，检测免疫效果。效价高的小鼠使用蛋白抗原10yg/只加强免疫，3天后取脾融合。
[0035]2.2骨髓瘤细胞与饲养细胞的制备
2.3骨髓瘤细胞的准备
在准备融合前两周开始复苏骨髓瘤细胞(SP2/0)。将存于液氮罐中的骨髓瘤细胞(SP2/0)取出并于完全1640培养基中进行复苏并传代培养，备用。
[0036]2.4饲养细胞的制备
细胞融合前一天无菌操作制备小鼠腹腔巨噬细胞悬液，稀释后加人96孔细胞培养板内，细胞浓度为2 X 14个/孔。
[0037]2.5杂交瘤细胞的制备
(I)取已免疫的BALB/c小鼠，眼球放血，收集分离血清并检测抗体效价，断颈处死小鼠，75%酒精中浸泡5min，于超净台中无菌操作取脾，研磨，制成细胞悬液，计数、备用。
[0038](2)将之前制备的骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10的比例混合，50ml离心管内用预热的培养液洗一次，100rpm离心8min，尽量弃尽上清液，轻弹离心管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状。
[0039](3)在室温下细胞融合:①一手均匀地转动离心管，另一手用Iml吸管吸取50%PEG溶液1ml，并沿转动的管壁(尽量接近细胞处)加入，从加入到加完的时间控制在60s左右，边加边搅拌。②静置90s ;③立即在5min内加人25ml预热37°C的不完全培养液。使PEG稀释而失去促融作用。具体加法是第一分钟加1ml，第二分钟加4ml，剩余液体3min内加完；800r/min离心6min，弃上清液；⑤加1ml HAT培养液，轻轻吹匀沉淀的细胞；⑥根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液至所需量；⑦将融合后细胞悬液加入含饲养层细胞的96孔板，每孔lOOul，在37°C 5%C02孵箱中培养。一般一块96孔板含有I X 10 7—4X 17脾细胞。
[0040]2.6杂交瘤细胞株的筛选
融合后一周左右镜下检出有小细胞团的克隆孔，待细胞团长到板底面积的三分之一以上或者细胞培养液变黄，用ELISA间接法检测细胞上清中是否存在抗HBHA的抗体，对检出阳性的细胞团及时转种并进行克隆化；对检测阴性的孔，大约一周后再检测一次，如仍为阴性，便可弃去。
[0041]2.7杂交瘤细胞株的保存与抗体制备
对筛选出的阳性孔细胞株进行亚克隆(三次)，以得到稳定分泌单抗的纯化细胞株，结合融合细胞板孔数及亚克隆代数，对细胞株标记编号并及时进行细胞株冻存。
[0042]将该细胞株应用小鼠体内诱生法进行单克隆抗体的大量制备。
[0043]3胞内分枝杆菌ELISA检测方法的建立
3.1胞内分枝杆菌抗血清的制备
(O免疫死菌剂与活菌制剂的制备
免疫死菌剂:胞内分枝杆菌于Middle brook 7H10抗原培养基中培养3周左右(菌处于对数生长期)，用含3%甲醛的无菌生理盐水洗涤一下并收集于小安培瓶中，37 °C于室温静置约24h灭活胞内分枝杆菌，旋涡震荡器充分震荡混匀制成菌悬液，再静置lh，吸取沉淀后的上层菌悬液于离心管中，4°C离心机3000r/min离心lOmin，弃去上清液，并在525nm波长下用无菌生理盐水稀释菌体沉淀至OD值为0.3，4°C备用。
[0044]活菌免疫制剂:待Middle brook 7H10抗原培养基上的胞内分枝杆菌处于对数生长期时，用无菌生理盐水冲洗胞内分枝杆菌菌并收集于小安培瓶中，于室温下静置24h，旋涡震荡器充分震荡混匀制成菌悬液，再静置lh，吸取沉淀后的上层菌悬液于离心管中，4°C离心机3000r/min离心lOmin，弃去上清液，并在525nm波长下用无菌生理盐水稀释菌体沉淀至OD值为0.3，4°C备用。
[0045](2)胞内分枝杆菌抗血清制备
首先试验用健康无抗兔，共免疫四次，每次免疫相隔一周，第一次、第二次为胞内分枝杆菌死菌剂免疫；第三次和第四次用胞内分枝杆菌活菌制剂。同时设空白对照组，注射生理盐水。四次免疫分别以0.5mL、l.0mLU.0mLU.5mL剂量耳缘静脉注射。末次免疫后一周，心脏采血，自然沉降法析出血清，于4°C 2500r/min离心lOmin，收集上清胞内分枝杆菌抗兔血清，分装于无菌小安培瓶中。测得血清凝集效价为1:2560，-20 °C保存备用。
[0046]3.2改良过碘酸钠法制备胞内分枝杆菌抗血清酶标抗体
(I)取5mg辣根过氧化物酶(HRP)溶于0.5mL蒸 馏水，加入1%2，4 二硝基氟苯(DNFB)无水乙醇溶液0.lmL，室温下轻微搅拌作用lh。
[0047](2)加入ImL 0.06mol/L Na104，室温下避光轻搅30min，溶液呈黄绿色。
[0048](3)加入ImL0.16mol/L乙二醇，室温(20°C ± )下轻搅作用I h，终止氧化反应。
[0049](4)加入5mg抗体，装入透析袋，置0.05mol/L,pH9.6碳酸盐缓冲液I 000 mL中，4°C透析过夜，更换3次。
[0050](5)取出透析袋中液体(约3 mL)，加入5mg/mLNaHB4 0.2 mL 4°C 2h或过夜。
[0051](6)加50%饱和硫酸铵(順4)2304溶液6 mL沉淀结合物，置4°C 30min后，3 OOOr/min离心30min，取深淀
(7)将沉淀物溶于PBS (0.02M ρΗ7.4)中，装入透析袋，并以此缓冲液透析平衡6-12h，换液3次。
[0052](8)在结合物内加入等量60%甘油，小量分装(或冻干，不需加甘油)，低温保存备用。
[0053]3.3胞内分枝杆菌双抗夹心ELISA检测方法建立
(1)100μ L包被液(pH 9.6)包被胞内分枝杆菌HBHA单抗隆抗体(浓度为0.4 μ g/ml)，4°C包被12h或37°C孵育2h ；
(2)弃包被液，用PBST洗涤3次，3~5min/次。
[0054](3)每孔中加入100 μ L1%BSA37°C封闭lh。倒掉封闭液，用PBST冲洗一次，于干毛巾上轻拍，拍干水分后再加入洗液，室温静置3-5min。如此洗涤重复2~4次。最后倒掉洗液，拍干。
[0055](4)加酶标抗体:每孔加入1: 5000~1: 3000稀释的胞内分枝杆菌抗兔IgG-HRP(辣根过氧化物酶标记的胞内分枝杆菌抗兔血清)每孔100 μ L，轻轻摇匀，37°C温育I h，弃去酶标抗体，逐孔加满洗涤缓冲液(pH 7.4,0.15mol/L PBS)，静置2~3min，甩掉孔内洗涤缓冲液，反复洗涤2~4次后拍干。
[0056](5)加入1: 5000稀释的胞内分枝杆菌抗兔IgG-HRP每孔100 μ L，37°C反应大约60min左右。弃去抗兔酶标二抗，洗涤，方法同上。
[0057](6)每孔各加入0.1mL底物溶液，室温避光显色，显色后，每孔加入0.05mL终止液终止，测(》45(|值，并记录。
[0058](7)以生理盐水对照组小鼠血清100倍稀释为阴性对照，试验组OD45tl/阴性对照组OD45tl值大于或等于2.1为阳性。
[0059]样品处理:
如检样为液体，取100 μ L检样进行ELISA检测即可。
[0060]如检样为固体动物组织样品，将样品用高压灭菌的生理盐水冲洗三次，去除结缔组织，修切成0.5cmX0.5cm大小方块，加入ImL生理盐水剪碎或研磨至匀浆。浸泡超过1min,离心取上清。
[0061]3.4特异性试验
应用建立的胞内分枝杆菌双抗夹心ELISA检测方法分别对吉林农业大学动物科学技术学院惠赠的偶发分枝杆菌、淡黄分枝杆菌、母牛分枝杆菌、新金分枝杆菌进行检测，检测结果均为阴性，即P/N〈2.1。表明该方法与其他抗原均无交叉反应。
[0062]3.5敏感性试验
将阳性样品(浓度为I XlO4M胞内分枝杆菌菌液)、阴性样品(PBS)倍比稀释，并进行ELISA试验(试验设空白对照)，结果显示，阳性样品IXlOVml胞内分枝杆菌菌液倍比稀释至浓度为500个/ml时，P/N>2.1在。说明该方法具有一定的敏感性。
[0063]3.6待测样品检测
利用所建立的胞内分枝杆菌双抗夹心ELISA检测方法对本实保存的8株胞内分枝杆菌进行检测，检测结果均为阳性。使用该方法对来自吉林周边的检测样品(牛、猪颁下淋巴结和肠系膜淋巴结)25份(吉林农业大学动物科学技术学院惠赠)进行检测，检测出胞内分枝杆菌2株，结果与分子生物学检测结果相一致。
[0064]〈110〉长春理工大学
〈120〉一种检测胞内分枝杆菌的ELISA检测方法
〈170〉PatentIn wers1n3.1
〈160〉 I
〈210〉 I
〈211〉 630
〈212〉DNA
〈213〉胞内分枝杆菌intracellulare)
〈400〉 I
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【主权项】
1.一种检测胞内分枝杆菌的ELISA检测方法，其方法是: (1)抗体包被，用100μ L包被液即pH 9.6,0.05mol/L碳酸盐缓冲液包被胞内分枝杆菌HBHA单抗隆抗体终浓度为0.2-0.6 μ g/ml，4°C包被12~24h或37°C孵育lh~2h，甩掉孔内液体； (2)封闭，每孔中加入1%BSA的100μ L封闭液轻轻摇匀，4°C过夜或37°C Ih ;甩掉孔内封闭液，逐孔加满pH 7.4,0.15mol/L PBS的洗涤缓冲液，静置2~3min，甩掉孔内洗涤缓冲液，反复洗涤2~4次后拍干； (3)加待检样品，每孔加入待检的疑似胞内分枝杆菌检样每孔100yL，37°C温育1-1.5h ;弃去菌样，逐孔加满pH 7.4,0.15mol/L PBS的洗涤缓冲液，静置2~3min，甩掉孔内洗涤缓冲液，反复洗涤2~4次后拍干；每次检测应同时设定空白对照、阳性对照和阴性对照各孔； (4)加酶标抗体，每孔加入1: 5000~1: 3000稀释的辣根过氧化物酶标记的胞内分枝杆菌抗兔血清每孔100 μ L，轻轻摇匀，37°C温育I h，弃去酶标抗体，逐孔加满pH 7.4，0.15mol/L PBS的洗涤缓冲液，静置2~3min，甩掉孔内洗涤缓冲液，反复洗涤2~4次后拍干； (5)加显色液，每孔各加入四甲基联苯胺TMB显色液100yL，，室温避光显色1min?30min ； (6)终止反应，每孔加入2mol/LH2S0450 μ L终止液终止，测OD45tl值，并记录； (7)判定结果，试验组OD45tl/阴性对照组OD45tl值大于或等于2.1为阳性； 样品处理 如检样为液体，取100 μ L检样进行ELISA检测即可； 如检样为固体动物组织样品，将样品用高压灭菌的生理盐水冲洗三次，去除结缔组织，修切成0.5cmX0.5cm大小方块，加入约ImL生理盐水剪碎或研磨至勾楽；浸泡超过lOmin，离心取100 μ L上清进行ELISA检测。
【专利摘要】一种检测胞内分枝杆菌的ELISA检测方法，涉及分子生物学、细胞生物学与微生物学领域，其方法是：（1）抗体包被，（2）封闭，（3）加待检样品，（4）加酶标抗体，（5）加显色液，（6）终止反应，（7）判定结果。有益效果是：本发明制备胞内分枝杆菌HBHA单克隆抗体，由于单克隆抗体具备纯度高、特异性强、可以提高各种血清学方法检测抗原的敏感性及特异性的特点，因此以胞内分枝杆菌HBHA单克隆抗体为包被抗体，建立胞内分枝杆菌双抗夹心ELISA检测方法，可以提高检测的特异性与敏感性。对胞内分枝杆菌病的诊断和防制具有重要的现实意义，涉及到畜牧业健康发展和国计民生，具有广阔的发展前景和巨大的市场需求。
【IPC分类】G01N33/577, G01N33/569
【公开号】CN104897894
【申请号】CN201510325952
【发明人】葛淑敏, 张淑华, 陈玉娟, 王准
【申请人】长春理工大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月15日
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学、细胞生物学与微生物学领域。
【背景技术】
[0002]胞内分枝杆菌为典型的非结核分枝杆菌(NTM)成员，属于分枝杆菌属。生长缓慢(培养所需时间4-8周)，广泛分布于自然界，人畜均可感染，该菌侵入人及动物机体内引起的机体免疫学改变，促进迟发型变态反应增强，感染后因排菌而导致易感者感染，造成本病长期流行。另外胞内分枝杆菌感染与肺结核病的临床表现极为相似，容易造成误诊误治。基于目前胞内分枝杆菌感染对国内外公共卫生方面存在极大的潜在威胁，发展和建立特异、灵敏的检测胞内分枝杆菌方法是十分急需、必要的。
[0003]HBHA是分枝杆菌分泌的一种黏附素，它是由致病性分枝杆菌产生的一种糖蛋白，近年来国内外相关研宄表明HBHA基因具备较好的免疫原性和免疫反应性，是一种良好的疫苗研制的候选基因。2006年张旭霞等应用以天然和重组HBHA蛋白进行ELISA方法检测人结核病，结果显示两者都具备良好的检测敏感性和特异性。可以较好的用于结核病的诊断。
[0004]目前胞内分枝杆菌菌种鉴定主要以形态和生理生化特征的综合指标为依据，此方法操作复杂、费时，重复性差，且试验的影响因素较多，有时出现误判。而ELISA检测方法是目前技术较成熟的技术，其具有操作简便、特异性强、价格低廉且无须特殊仪器等优点比较容易大面积推广。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是:提供一种检测胞内分枝杆菌的ELISA检测方法，采用单克隆抗体技术制备胞内分枝杆菌HBHA单克隆抗体，以制备的胞内分枝杆菌HBHA单克隆抗体为包被抗体，建立胞内分枝杆菌双抗夹心ELISA检测方法，实现快速、便捷、实时、特异检测胞内分枝杆菌生物学新方法，为人类健康与农牧业发展服务。
[0006]本发明的胞内分枝杆菌ELISA检测方法是: a、胞内分枝杆菌抗血清的制备
(O免疫死菌剂与活菌制剂的制备
免疫死菌剂:胞内分枝杆菌于Middle brook 7H10抗原培养基中培养2~4周(菌处于对数生长期)，用含3%甲醛的无菌生理盐水洗涤一下并收集于小安培瓶中，37 ^于室温静置24h灭活胞内分枝杆菌，旋涡震荡器充分震荡混匀制成菌悬液，再静置lh，吸取沉淀后的上层菌悬液于离心管中，4°C离心机3000r/min~5000r/min离心lOmin，弃去上清液，并在525nm波长下用无菌生理盐水稀释菌体沉淀至OD值为0.3，4°C备用。
[0007]活菌免疫制剂:待Middle brook 7H10抗原培养基上的胞内分枝杆菌处于对数生长期(培养2~4周)，用无菌生理盐水冲洗胞内分枝杆菌并收集于小安培瓶中，于室温下静置24h，旋涡震荡器充分震荡混匀制成菌悬液，再静置lh，吸取沉淀后的上层菌悬液于离心管中，4°C离心机3000r/min~5000r/min离心lOmin，弃去上清液，并在525nm波长下用无菌生理盐水稀释菌体沉淀至OD值为0.3，4°C备用。
[0008](2)胞内分枝杆菌抗血清制备
首先试验用健康无抗兔，共免疫四次，每次免疫相隔一周，第一次、第二次为胞内分枝杆菌死菌剂免疫；第三次和第四次用胞内分枝杆菌活菌制剂。同时设空白对照组，注射生理盐水。四次免疫分别以0.5mL、l.0mLU.0mLU.5mL剂量耳缘静脉注射。末次免疫后一周，对实验动物进行耳缘静脉采血，并做抗体效价检测，当血清凝集效价达到1:160时，颈动脉采血，采集的血液移入灭菌50mL大离心管中，置于37°C培养箱中静置30min后再于4°C冰箱中静置过夜，自然沉降法析出血清，之后4°C离心机中3000r/min~5000r/min离心lOmin，收集上清抗血清，分装于无菌小安培瓶中。-20 °C保存备用。
[0009]b、改良过碘酸钠法制备胞内分枝杆菌抗血清酶标抗体
(I)取5mg辣根过氧化物酶(HRP)溶于0.5mL蒸馏水，加入1%2，4 二硝基氟苯(DNFB)无水乙醇溶液100 μ I,室温下轻微搅拌作用Ih。
[0010](2)加入ImL 0.06mol/L Na14,室温下避光轻搅30min，溶液呈黄绿色。
[0011](3)加入ImL0.16mol/L乙二醇，室温(20°C ± )下轻搅作用I h，终止氧化反应。
[0012](4)加入5mg抗体，装入透析袋，置0.05mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液I 000 mL中，4°C透析过夜，更换3次。
[0013](5)取出透析袋中液体(约3 mL)，加入5mg/mLNaHB4 200 μ L 4°C 2h或过夜。
[0014](6)加50%饱和硫酸铵(NH4)2304溶液6 mL沉淀结合物，置4°C 30min后，3 OOOr/min离心30min，取沉淀。
[0015](7)将沉淀物溶于PBS (0.02M ρΗ7.4)中，装入透析袋，并以此缓冲液透析平衡6~12h，换液3次。
[0016](8)在结合物内加入等量60%甘油，小量分装(或冻干，不需加甘油)，低温保存备用。
[0017]C、胞内分枝杆菌双抗夹心ELISA检测方法建立
Cl)抗体包被:100 μ L包被液(pH 9.6,0.05mol/L碳酸盐缓冲液)包被胞内分枝杆菌HBHA单抗隆抗体(终浓度为0.2-0.6 μ g/ml)，4°C包被12~24h或37°C孵育lh~2h，甩掉孔内液体。
[0018](2)封闭:每孔中加入10(^1^封闭液(1°/(^4)轻轻摇匀，4°〇过夜或37°〇lh。甩掉孔内封闭液，逐孔加满洗涤缓冲液(pH 7.4,0.15mol/L PBS)，静置2~3min，甩掉孔内洗涤缓冲液，反复洗涤2~4次后拍干。
[0019](3)加待检样品:每孔加入待检的疑似胞内分枝杆菌检样每孔100yL，37°C温育l~1.5h。弃去菌样，逐孔加满洗涤缓冲液(pH 7.4,0.15mol/L PBS)，静置2~3min，甩掉孔内洗涤缓冲液，反复洗涤2~4次后拍干。每次检测应同时设定空白对照、阳性对照和阴性对照各孔。
[0020](4)加酶标抗体:每孔加入1: 5000~1: 3000稀释的胞内分枝杆菌抗兔IgG-HRP(辣根过氧化物酶标记的胞内分枝杆菌抗兔血清)每孔100 μ L，轻轻摇匀，37°C温育I h，弃去酶标抗体，逐孔加满洗涤缓冲液(pH 7.4,0.15mol/L PBS)，静置2~3min，甩掉孔内洗涤缓冲液，反复洗涤2~4次后拍干。
[0021](5)加显色液:每孔各加入TMB (四甲基联苯胺)显色液100 μ L，，室温避光显色1min?30mino
[0022](6)终止反应:每孔加入50 μ L终止液(2mol/L H2SO4)终止，测OD45tl值，并记录。
[0023](7)判定结果:试验组OD45tl/阴性对照组OD45tl值大于或等于2.1为阳性。
[0024]样品处理:
如检样为液体，取100 μ L检样进行ELISA检测即可。
[0025]如检样为固体动物组织样品，将样品用高压灭菌的生理盐水冲洗三次，去除结缔组织，修切成0.5cmX0.5cm大小方块，加入约ImL生理盐水剪碎或研磨至匀浆。浸泡超过1min,离心取100 μ L上清进行ELISA检测。
[0026]本发明的有益效果是:本发明制备胞内分枝杆菌HBHA单克隆抗体，由于单克隆抗体具备纯度高、特异性强、可以提高各种血清学方法检测抗原的敏感性及特异性的特点，因此以胞内分枝杆菌HBHA单克隆抗体为包被抗体，建立胞内分枝杆菌双抗夹心ELISA检测方法，可以提高检测的特异性与敏感性。对胞内分枝杆菌病的诊断和防制具有重要的现实意义，涉及到畜牧业健康发展和国计民生，具有广阔的发展前景和巨大的市场需求。
【附图说明】
[0027]图1是本发明外扩片段的PCR扩增结果图；
图2是本发明内扩片段的PCR扩增结果图；
图3是本发明重组质粒pMD18-T-HBHA的Hind III /BamH I双酶切鉴定图；
图4是本发明测序结果(加入两端酶切位点共646 bp)图；
图5是本发明SDS-PAGE分析图；
图6是本发明表达载体pET32a-HBHA表达产物的Western blot分析图；
图7是本发明HBHA蛋白分离纯化。
【具体实施方式】
[0028]下面结合附图对本发明做进一步描述:
实施例1
图1 中，1.1 HBHA 基因外扩产物；1.2 DL 2000 DNA Marker; 1.3 D 15000 DNAMarker.图 2 中，2.1.DL 2000 DNA Marker; 2.2.HBHA 基因内扩产物；
图 3 中，3.1 DL 2000 DNA Marke; 3.2 DM 10000 Marker; 3.3重组质粒pMD18-T_HBHA的Hind III /BamH I双酶切结果；
图5中，5.1.pET 32a-HBHA诱导前对照；5.2.pET 32a (+)空载体诱导全菌；5.3.pET 32a-HBHA诱导全菌；5.4.蛋白分子量标准；
图6中，6.1预染蛋白分子质量标准；6.2 pET32a_HBHA诱导全菌进行Western blot
分析
图7中，7.1纯化的HBHA蛋白；7.2 pET 32a_HBHA诱导全菌；7.3预染蛋白分子量标准。
[0029]1、HBHA原核表达载体的构建及蛋白表达与纯化 (I)胞内分枝杆菌的复壮
胞内分枝杆菌(ATCC13 950株)购自于中国药品生物制品检定所。
[0030]采用改良罗氏培养基对胞内分枝杆菌进行复苏培养，置于37 °〇恒温培养箱中培养4-8周，培养过程中定期观察，待菌体长满培养基表面时取出放于4 °C冰箱中备用。
[0031 ] (2 )胞内分枝杆菌DNA提取
使用Takara基因组抽提试剂盒进行胞内分枝杆菌基因组DNA的提取，-20 °C保存备用。
[0032](3)引物设计与合成及胞内分枝杆菌HBHA的PCR扩增
应用Primer 5.0软件，参照GenBank中胞内分枝杆菌标准菌株M.1ntracellulareATCC 13950 (GenBank登录号:ΥΡ_005340080.I)基因序列，设计扩增HBHA基因大约630 bp特异性片段引物一对(由上海生物技术有限公司合成)，即
Pl:5' -CAGGATCCAAAGGAAAAACCATGGCGGA-3'(下划线部分为 BamH I 酶切位点)，
P2:5' -CGAAGCTTCTACTTCTGGGTGACCTTCTTG-3'(下划线部分为 Hind III酶切位点)。
[0033]1.2.3胞内分枝杆菌HBHA的PCR扩增 PCR反应体系:胞内分枝杆菌DNA
1.5 μ L, Ρ1/Ρ2 (10 μπιοΙ/L)各 1.5 μ L, dNTPs (2.5 mmol/L)3.5 μ L, 10XExTaqbuffer (Mg2+) 5.0 μ L，Extmi (5 U/μ L) 1.0 μ L, ddH20 36.0 μ L，总体积 50 yL。反应程序:94 °C 4 min ；94 °C 30 s，61 °C 30 s，72 °C 60 s，30 个循环；72 °C 10 min。取 PCR产物在10 g/L琼脂糖凝胶上进行电泳检测，用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化目的基因。(见附图1、附图2所示)
(4)pMD18-T-HBHA重组质粒的构建
将HBHA基因PCR回收产物与pMD18-T载体连接，构建重组质粒pMD18-T_HBHA。将连接产物转入E.coli DH5a并挑取阳性单克隆，进行BamH I和Hind III双酶切鉴定，(见附图3所示)将单克隆菌液送宝生物工程(大连)有限公司测序。(测序结果见附图4所示)
(5)原核表达载体pET32a-HBHA的构建、原核表达及纯化
采用限制性内切酶BamH I和Hind III对重组质粒pMD18-T_HBHA进行双酶切，回收目的片段HBHA，与经同样双酶切的表达载体pET32a (+)连接，将连接产物pET32a_HBHA转化入BL21CDE3)中，任选阳性克隆pET32a-HBHA重组菌接种于10 mL LB培养基(Amplr)中，37 V180 r/min 培养 1.5 ?2 h(0D _值为 0.4 ?0.6)，加入 IPTG 至终浓度为 0.8 mmol/L，37°C180 !■/!!!化诱导培养*』ho实验同时设诱导前菌液及转化入BL21 (DE3)中的pET32a(+)空载体诱导作为对照。将培养好的菌液3500 r/min离心10 min，收集菌体。取4 mL PBS将菌体重悬，反复冻融3次。吸取100 μ?菌液，加入2 X SDS上样缓冲液100 μ?,沸水中煮样5 min左右。以12 %的SDS-PAGE凝胶电泳进行鉴定。(见附图5所示)
同时进行Western blot分析。将SDS-PAGE电泳结束后的凝胶取下连同转印滤纸、PVDF膜一同置于转印缓冲液中浸泡1.5 ho取出后按顺序，滤纸(3层)、硝酸纤维素膜、凝胶、滤纸(3层)，依次将其放入转印槽中，不要存有气泡。凝胶一侧接负极，PVDF膜接正极，200 mA恒流转印I?2 ho用封闭液BSA将PVDF膜封闭I h，用PBST稀释的胞内分枝杆菌阳性血清抗体(I: 1000)加到膜上，4 °C过夜。PBS洗涤3次，其间要不断振荡，再加入用PBST稀释的HRP标记的羊抗兔二抗(1:5000)，不断振荡，之后PBS洗涤4?5次，最后DAB显色3?5 min。去离子水洗膜完后扫描鉴定结果并记录。(见附图6所示) 离心收集诱导后菌体，参照His-Binding-Resin说明书进行HBHA可溶性蛋白分离纯化(见附图7所示)，并应用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量。HBHA蛋白浓度为0.7 mg/
mLo
[0034]2、胞内分枝杆菌抗HBHA单克隆抗体的制备
2.1动物免疫
选取8-12周龄雌性BALB/c小鼠，使用纯化的胞内分枝杆菌HBHA蛋白作为抗原进行免疫，免疫剂量为蛋白抗原10yg/小鼠/次，免疫时间间隔为三周，共免疫三次。第三次免疫三周后采小鼠尾静脉血用ELISA方法检测血清效价，检测免疫效果。效价高的小鼠使用蛋白抗原10yg/只加强免疫，3天后取脾融合。
[0035]2.2骨髓瘤细胞与饲养细胞的制备
2.3骨髓瘤细胞的准备
在准备融合前两周开始复苏骨髓瘤细胞(SP2/0)。将存于液氮罐中的骨髓瘤细胞(SP2/0)取出并于完全1640培养基中进行复苏并传代培养，备用。
[0036]2.4饲养细胞的制备
细胞融合前一天无菌操作制备小鼠腹腔巨噬细胞悬液，稀释后加人96孔细胞培养板内，细胞浓度为2 X 14个/孔。
[0037]2.5杂交瘤细胞的制备
(I)取已免疫的BALB/c小鼠，眼球放血，收集分离血清并检测抗体效价，断颈处死小鼠，75%酒精中浸泡5min，于超净台中无菌操作取脾，研磨，制成细胞悬液，计数、备用。
[0038](2)将之前制备的骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10的比例混合，50ml离心管内用预热的培养液洗一次，100rpm离心8min，尽量弃尽上清液，轻弹离心管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状。
[0039](3)在室温下细胞融合:①一手均匀地转动离心管，另一手用Iml吸管吸取50%PEG溶液1ml，并沿转动的管壁(尽量接近细胞处)加入，从加入到加完的时间控制在60s左右，边加边搅拌。②静置90s ;③立即在5min内加人25ml预热37°C的不完全培养液。使PEG稀释而失去促融作用。具体加法是第一分钟加1ml，第二分钟加4ml，剩余液体3min内加完；800r/min离心6min，弃上清液；⑤加1ml HAT培养液，轻轻吹匀沉淀的细胞；⑥根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液至所需量；⑦将融合后细胞悬液加入含饲养层细胞的96孔板，每孔lOOul，在37°C 5%C02孵箱中培养。一般一块96孔板含有I X 10 7—4X 17脾细胞。
[0040]2.6杂交瘤细胞株的筛选
融合后一周左右镜下检出有小细胞团的克隆孔，待细胞团长到板底面积的三分之一以上或者细胞培养液变黄，用ELISA间接法检测细胞上清中是否存在抗HBHA的抗体，对检出阳性的细胞团及时转种并进行克隆化；对检测阴性的孔，大约一周后再检测一次，如仍为阴性，便可弃去。
[0041]2.7杂交瘤细胞株的保存与抗体制备
对筛选出的阳性孔细胞株进行亚克隆(三次)，以得到稳定分泌单抗的纯化细胞株，结合融合细胞板孔数及亚克隆代数，对细胞株标记编号并及时进行细胞株冻存。
[0042]将该细胞株应用小鼠体内诱生法进行单克隆抗体的大量制备。
[0043]3胞内分枝杆菌ELISA检测方法的建立
3.1胞内分枝杆菌抗血清的制备
(O免疫死菌剂与活菌制剂的制备
免疫死菌剂:胞内分枝杆菌于Middle brook 7H10抗原培养基中培养3周左右(菌处于对数生长期)，用含3%甲醛的无菌生理盐水洗涤一下并收集于小安培瓶中，37 °C于室温静置约24h灭活胞内分枝杆菌，旋涡震荡器充分震荡混匀制成菌悬液，再静置lh，吸取沉淀后的上层菌悬液于离心管中，4°C离心机3000r/min离心lOmin，弃去上清液，并在525nm波长下用无菌生理盐水稀释菌体沉淀至OD值为0.3，4°C备用。
[0044]活菌免疫制剂:待Middle brook 7H10抗原培养基上的胞内分枝杆菌处于对数生长期时，用无菌生理盐水冲洗胞内分枝杆菌菌并收集于小安培瓶中，于室温下静置24h，旋涡震荡器充分震荡混匀制成菌悬液，再静置lh，吸取沉淀后的上层菌悬液于离心管中，4°C离心机3000r/min离心lOmin，弃去上清液，并在525nm波长下用无菌生理盐水稀释菌体沉淀至OD值为0.3，4°C备用。
[0045](2)胞内分枝杆菌抗血清制备
首先试验用健康无抗兔，共免疫四次，每次免疫相隔一周，第一次、第二次为胞内分枝杆菌死菌剂免疫；第三次和第四次用胞内分枝杆菌活菌制剂。同时设空白对照组，注射生理盐水。四次免疫分别以0.5mL、l.0mLU.0mLU.5mL剂量耳缘静脉注射。末次免疫后一周，心脏采血，自然沉降法析出血清，于4°C 2500r/min离心lOmin，收集上清胞内分枝杆菌抗兔血清，分装于无菌小安培瓶中。测得血清凝集效价为1:2560，-20 °C保存备用。
[0046]3.2改良过碘酸钠法制备胞内分枝杆菌抗血清酶标抗体
(I)取5mg辣根过氧化物酶(HRP)溶于0.5mL蒸 馏水，加入1%2，4 二硝基氟苯(DNFB)无水乙醇溶液0.lmL，室温下轻微搅拌作用lh。
[0047](2)加入ImL 0.06mol/L Na104，室温下避光轻搅30min，溶液呈黄绿色。
[0048](3)加入ImL0.16mol/L乙二醇，室温(20°C ± )下轻搅作用I h，终止氧化反应。
[0049](4)加入5mg抗体，装入透析袋，置0.05mol/L,pH9.6碳酸盐缓冲液I 000 mL中，4°C透析过夜，更换3次。
[0050](5)取出透析袋中液体(约3 mL)，加入5mg/mLNaHB4 0.2 mL 4°C 2h或过夜。
[0051](6)加50%饱和硫酸铵(順4)2304溶液6 mL沉淀结合物，置4°C 30min后，3 OOOr/min离心30min，取深淀
(7)将沉淀物溶于PBS (0.02M ρΗ7.4)中，装入透析袋，并以此缓冲液透析平衡6-12h，换液3次。
[0052](8)在结合物内加入等量60%甘油，小量分装(或冻干，不需加甘油)，低温保存备用。
[0053]3.3胞内分枝杆菌双抗夹心ELISA检测方法建立
(1)100μ L包被液(pH 9.6)包被胞内分枝杆菌HBHA单抗隆抗体(浓度为0.4 μ g/ml)，4°C包被12h或37°C孵育2h ；
(2)弃包被液，用PBST洗涤3次，3~5min/次。
[0054](3)每孔中加入100 μ L1%BSA37°C封闭lh。倒掉封闭液，用PBST冲洗一次，于干毛巾上轻拍，拍干水分后再加入洗液，室温静置3-5min。如此洗涤重复2~4次。最后倒掉洗液，拍干。
[0055](4)加酶标抗体:每孔加入1: 5000~1: 3000稀释的胞内分枝杆菌抗兔IgG-HRP(辣根过氧化物酶标记的胞内分枝杆菌抗兔血清)每孔100 μ L，轻轻摇匀，37°C温育I h，弃去酶标抗体，逐孔加满洗涤缓冲液(pH 7.4,0.15mol/L PBS)，静置2~3min，甩掉孔内洗涤缓冲液，反复洗涤2~4次后拍干。
[0056](5)加入1: 5000稀释的胞内分枝杆菌抗兔IgG-HRP每孔100 μ L，37°C反应大约60min左右。弃去抗兔酶标二抗，洗涤，方法同上。
[0057](6)每孔各加入0.1mL底物溶液，室温避光显色，显色后，每孔加入0.05mL终止液终止，测(》45(|值，并记录。
[0058](7)以生理盐水对照组小鼠血清100倍稀释为阴性对照，试验组OD45tl/阴性对照组OD45tl值大于或等于2.1为阳性。
[0059]样品处理:
如检样为液体，取100 μ L检样进行ELISA检测即可。
[0060]如检样为固体动物组织样品，将样品用高压灭菌的生理盐水冲洗三次，去除结缔组织，修切成0.5cmX0.5cm大小方块，加入ImL生理盐水剪碎或研磨至匀浆。浸泡超过1min,离心取上清。
[0061]3.4特异性试验
应用建立的胞内分枝杆菌双抗夹心ELISA检测方法分别对吉林农业大学动物科学技术学院惠赠的偶发分枝杆菌、淡黄分枝杆菌、母牛分枝杆菌、新金分枝杆菌进行检测，检测结果均为阴性，即P/N〈2.1。表明该方法与其他抗原均无交叉反应。
[0062]3.5敏感性试验
将阳性样品(浓度为I XlO4M胞内分枝杆菌菌液)、阴性样品(PBS)倍比稀释，并进行ELISA试验(试验设空白对照)，结果显示，阳性样品IXlOVml胞内分枝杆菌菌液倍比稀释至浓度为500个/ml时，P/N>2.1在。说明该方法具有一定的敏感性。
[0063]3.6待测样品检测
利用所建立的胞内分枝杆菌双抗夹心ELISA检测方法对本实保存的8株胞内分枝杆菌进行检测，检测结果均为阳性。使用该方法对来自吉林周边的检测样品(牛、猪颁下淋巴结和肠系膜淋巴结)25份(吉林农业大学动物科学技术学院惠赠)进行检测，检测出胞内分枝杆菌2株，结果与分子生物学检测结果相一致。
[0064]〈110〉长春理工大学
〈120〉一种检测胞内分枝杆菌的ELISA检测方法
〈170〉PatentIn wers1n3.1
〈160〉 I
〈210〉 I
〈211〉 630
〈212〉DNA
〈213〉胞内分枝杆菌intracellulare)
〈400〉 I
aaaggaaaaa ccatggcgga aaactcgaac atcgaagact tgcgggctcc tttgctcgcg 60CN 104897894 A i^sdt8/8 H
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H.1
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【主权项】
1.一种检测胞内分枝杆菌的ELISA检测方法，其方法是: (1)抗体包被，用100μ L包被液即pH 9.6,0.05mol/L碳酸盐缓冲液包被胞内分枝杆菌HBHA单抗隆抗体终浓度为0.2-0.6 μ g/ml，4°C包被12~24h或37°C孵育lh~2h，甩掉孔内液体； (2)封闭，每孔中加入1%BSA的100μ L封闭液轻轻摇匀，4°C过夜或37°C Ih ;甩掉孔内封闭液，逐孔加满pH 7.4,0.15mol/L PBS的洗涤缓冲液，静置2~3min，甩掉孔内洗涤缓冲液，反复洗涤2~4次后拍干； (3)加待检样品，每孔加入待检的疑似胞内分枝杆菌检样每孔100yL，37°C温育1-1.5h ;弃去菌样，逐孔加满pH 7.4,0.15mol/L PBS的洗涤缓冲液，静置2~3min，甩掉孔内洗涤缓冲液，反复洗涤2~4次后拍干；每次检测应同时设定空白对照、阳性对照和阴性对照各孔； (4)加酶标抗体，每孔加入1: 5000~1: 3000稀释的辣根过氧化物酶标记的胞内分枝杆菌抗兔血清每孔100 μ L，轻轻摇匀，37°C温育I h，弃去酶标抗体，逐孔加满pH 7.4，0.15mol/L PBS的洗涤缓冲液，静置2~3min，甩掉孔内洗涤缓冲液，反复洗涤2~4次后拍干； (5)加显色液，每孔各加入四甲基联苯胺TMB显色液100yL，，室温避光显色1min?30min ； (6)终止反应，每孔加入2mol/LH2S0450 μ L终止液终止，测OD45tl值，并记录； (7)判定结果，试验组OD45tl/阴性对照组OD45tl值大于或等于2.1为阳性； 样品处理 如检样为液体，取100 μ L检样进行ELISA检测即可； 如检样为固体动物组织样品，将样品用高压灭菌的生理盐水冲洗三次，去除结缔组织，修切成0.5cmX0.5cm大小方块，加入约ImL生理盐水剪碎或研磨至勾楽；浸泡超过lOmin，离心取100 μ L上清进行ELISA检测。
【专利摘要】一种检测胞内分枝杆菌的ELISA检测方法，涉及分子生物学、细胞生物学与微生物学领域，其方法是：（1）抗体包被，（2）封闭，（3）加待检样品，（4）加酶标抗体，（5）加显色液，（6）终止反应，（7）判定结果。有益效果是：本发明制备胞内分枝杆菌HBHA单克隆抗体，由于单克隆抗体具备纯度高、特异性强、可以提高各种血清学方法检测抗原的敏感性及特异性的特点，因此以胞内分枝杆菌HBHA单克隆抗体为包被抗体，建立胞内分枝杆菌双抗夹心ELISA检测方法，可以提高检测的特异性与敏感性。对胞内分枝杆菌病的诊断和防制具有重要的现实意义，涉及到畜牧业健康发展和国计民生，具有广阔的发展前景和巨大的市场需求。
【IPC分类】G01N33/577, G01N33/569
【公开号】CN104897894
【申请号】CN201510325952
【发明人】葛淑敏, 张淑华, 陈玉娟, 王准
【申请人】长春理工大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月15日
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