一种利用免疫生物传感器检测组胺的方法
一种利用免疫生物传感器检测组胺的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物传感器技术领域，更具体地，涉及一种利用免疫生物传感器检测 组胺的方法。
【背景技术】
[0002] 我国鱼类资源丰富，也是水产品生产和消费大国，水产品及其加工在国民经济和 消费中都占有重要地位。组胺（Histamine)是游离组氨酸在组氨酸脱羧酶的催化下发生 脱羧反应形成的，是一种具有毒性的生物胺，广泛存在于各种生物体及食品中，主要为水产 品，尤其是青皮红肉特征的中上层海水鱼及其加工产品。研宄表明，若过量摄入组胺会引起 头痛恶心、反胃呕吐、腹泻、心悸、瘙痒性皮瘆、血压变化等一系列的过敏反应。摄入8~40mg 组胺会产生轻微的中毒症状，超过40mg产生中等中毒症状，超过100mg产生严重中毒症 状。美国FDA通过对爆发组胺中毒的大量数据的研宄，确定组胺的危害作用水平为500mg/ kg(食品）。近年来，我国在广东、浙江、山东等多地都爆发过组胺中毒事件，据报道，仅杭州 下城区，在1997年至2006年的十年间就发生7次组胺中毒事件。因此，组胺含量对于保障 消费者健康具有十分重要的意义，目前国内外把组胺列为水产品的必检项目。
[0003] 组胺作为小分子，仅有一个抗原活性位点，很难实现直接检测，目前食品中组胺测 定的方法主要有偶氮试剂比色法、高效液相色谱法、荧光分析法、气相色谱法等等。这些方 法都存在一定的缺陷，如仪器及耗材较为昂贵，成本高，步骤较繁琐，耗时长，试剂有毒，有 的则需要技术熟练的操作人员，都不适合现场快速检测。
[0004] 电化学免疫传感器是将高特异性的抗原抗体结合反应与高灵敏的传感技术相结 合，是21世纪最有前途的检测手段之一。但是，组胺分子量极小（111Da)，而且只有一个抗 原活性位点，很难实现直接电化学免疫检测。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种利用免疫生物传感器检测组胺的方法。 所述方法通过建立一种直接竞争免疫传感器法实现对组胺的定量检测，从而可通过检测海 产食品和鱼组织中的组胺值来判断海产食品和鱼制品的新鲜度和腐败程度。该方法适用于 在非实验室设置中测定海产食品和鱼组织中的组胺值，实现监管部门的现场快速监测。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现上述目的的。
[0007] -种利用免疫生物传感器检测组胺的方法，包括如下步骤： 51. 免疫生物传感器的制备：普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜修饰电极，然后，将组 胺包被原固定在电极表面，滴涂封闭液制得所述免疫生物传感器，检测该传感器的工作曲 线，待用； 52. 组胺单克隆抗体的制备； 53. 酶标抗体的制备：用辣根过氧化酶标记S2制得的组胺抗体； 54. 传感器检测组胺：将等体积的待测样液和S3制得的酶标抗体混匀后，滴涂在电极 工作区域，将所述电极浸在测试液中，并添加过氧化氢，通过前后峰电流值的变化大小定量 测定组胺浓度； 其中，所述组胺包被原的包被浓度为0. 001 ~1mg/mL; S4所述酶标抗体的原液浓度为5mg/mL，稀释10 ~1000倍使用。
[0008] 本发明采用普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜修饰电极，普鲁士蓝 (Fe4[Fe(CN)6]3)是非常好的导电媒介体，可以加速电子的传递；壳聚糖具有较好的粘度和 较小的空间位阻，使其具有良好的生物相容性和成膜性；纳米金在电化学反应中也具有突 出的优良特性。本发明将普鲁士蓝、壳聚糖、纳米金组成复合膜，其电流响应比单独沉积普 鲁士蓝或纳米金具有明显地稳定性。复合膜中壳聚糖作为导电分子因其自身表面带正电及 生物相容性好而被广泛应用在传感器中生物分子的固定，普鲁士蓝膜具有非常好的电催化 活性，而纳米金颗粒与组胺包被原结合加速生物界面与蛋白活性位点间的电子传递。将电 极浸入沉积液中，施加电压后，铁离子会发生自身的氧化还原反应，而纳米金和壳聚糖分子 则依附离子运动一起沉积到电极表面形成普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜。这三者的复 合是相互协调，缺一不可的。若沉积液中非氧化还原成分增多则会影响以普鲁士蓝为核心 的复合膜沉积效果，且三种材料的制备都相对容易，适于大批量制备并在市场中推广应用。
[0009] 组胺包被原是组胺与蛋白的偶联复合物，在一定浓度范围内，调整包被原的浓度 可以得到不同线性范围的工作曲线，但是包被原浓度过高的话会阻碍电子传递而使免疫传 感器的灵敏度下降。将组胺包被原固定在电极表面，检测时，仅需添加等体积的酶标抗体和 待测样液，固定在电极表面的组胺包被原和样液中衍生的组胺会竞争结合酶标组胺抗体， 和电极上包被原结合的组胺抗体就可以"存在"电极表面；而与游离组胺结合的抗体就被缓 冲溶液冲洗"离开"电极表面。然后添加测试液和过氧化氢，对免疫传感器进行循环伏安法 扫描测试，辣根过氧化酶可以在一定的电位下催化过氧化氢进行自身的氧化还原反应，同 时通过双电子传递过程测试液也被氧化，还原峰变大，通过前后峰电流值变化的大小来定 量测定组胺浓度。检测过程中发生的反应如下： HRP(Fe3+) +H202 ?Compound(I) +H20 (1) Compound(I) +QH?Compound(II) +Q (2) Compound(II) +QH?HRP(Fe3+) +Q+H20 (3) Q+H+2e- ?QH(电化学反应） （4) 其中，QH代表测试液，Q代表测试液的氧化态。
[0010] 优选地，S3所述酶标抗体中辣根过氧化酶和组胺抗体的质量比为3:1。
[0011] 优选地，所述S3包括如下步骤：将辣根过氧化酶溶解于缓冲液中，加入0.lmol/L NaI04溶液，溶液呈黄绿色，再加入2. 5%乙二醇溶液；再加入S3制得的组胺抗体，混匀；将 上述混合溶液加入透析袋中，在缓冲液中透析过夜；透析后加入5mg/mLNaBH4溶液，再加入 等量的饱和硫酸铵溶液，离心，将沉淀溶于缓冲液中，再次透析过夜，离心，取上清液作为酶 标抗体。
[0012] 更优选地，所述S3包括如下步骤：将6mg辣根过氧化酶HRP溶解于pH为5. 4~5. 8 的缓冲液中，加入〇. 05~0. 2mL0. 1mol/LNaI04溶液，4~6°C避光反应20~40min，溶液呈 黄绿色；再加入0. 05~0. 2mL2. 5%乙二醇溶液，室温下反应20~40min;再加入2mgS1制 备的组胺抗体，混匀；将上述混合溶液加入透析袋中，在浓度为0. 05mol/L、pH为9. 4~9. 8 的缓冲液中透析过夜；透析后加入0. 02~0. 06mL5mg/mL的NaBH4溶液，混匀，4~6 °C静 置1~3h，再加入等量的饱和硫酸铵溶液，4~6°C反应20~40min后3000~5000r/min离心 10~20min，将沉淀溶于少量磷酸缓冲液中，再次透析过夜，离心，取上清液，混匀作为酶标 抗体。
[0013] 优选地，S4所述测试液含有1 ~ 5mmol/L对苯二酚和1/100 ~ 1/15mol/L磷酸 缓冲液。
[0014] 优选地，S4所述过氧化氢的浓度为0? 96~7. 2mmol/L。
[0015] 优选地，S4所述过氧化氢添加量为20~60yL。
[0016] 优选地，S4所述测试液为4~10mL。
[0017] 优选地，所述组胺包被原的初始浓度为4mg/mL，分别稀释4~4000倍后进行电极 表面包被原固定。
[0018] 优选地，S1所述复合膜中纳米金与普鲁士蓝的摩尔浓度比为1:2000~1:20,壳聚 糖质量体积含量为〇. 〇1~〇. 05%。
[0019] 优选地，配制含普鲁士蓝、壳聚糖和纳米金的沉积液，将电极浸在所述沉积液中， 在+0. 4V的电压下沉积60~300s，使普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜修饰电极。
[0020] 优选地，S1所述工作曲线的检测方法为：配制一系列的组胺标准液，在-0. 6V到 +0. 8V电压下进行循环扫描，得到工作曲线。
[0021] 优选地，S1所述工作曲线的检测方法为：配制浓度分别为0,0. 001，0. 01，0. 1， 0? 25,0? 4,0? 5,0? 625,0? 8,1. 0,10,100ng/mL的组胺标准液，在-0? 6V到 +0? 8V电压下进行 循环扫描，得到工作曲线。
[0022] 优选地，所述电极为丝网印刷电极，所述丝网印刷电极将工作电极、参比电极和辅 助电极集为一体。
[0023] 优选地，将S1所述组胺包被原用pH9. 6的缓冲液稀释后，通过物理吸附固定在所 述电极表面。
[0024] 优选地，将组胺包被原滴涂在电极工作区域，4°C孵育8~14h。
[0025] 优选地，将S1所述封闭液滴涂在电极工作区域，37°C孵育l~3h。
[0026] 优选地，所述封闭液为5%脱脂奶粉。
[0027] 优选地，S1所述沉积液的制备方法为：将普鲁士蓝加入壳聚糖溶液，超声分散，得 到稳定的暗绿色分散液，再向分散液中加入纳米金溶液，超声分散至完全溶解，制得沉积 液。更优选地，将 〇.5~5mMFeCl3/K3[Fe(CN)6]，0. 1MKC1 以及 1~10mMHC1 的复合溶液 溶于0.OP/p〇. 05%壳聚糖溶液中，在室温下超声分散，得到稳定的暗绿色分散液；再向分散 液中加入纳米金胶使其终浓度为2. 5 ~25mM，超声分散至完全溶解，制得沉积液。
[0028] 优选地，所述待测样液的制备方法为：选取水产品海鱼样品，去除皮、骨、内脏 和结缔组织后用绞肉机充分绞碎，等重量鱼肉和蒸馏水混合制成肌肉匀浆，用乙腈萃取， 2000~4000rpm离心5~20min，用PBST缓冲溶液将有机层稀释10倍，所得稀释液即为待测 样液。
[0029] 与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果是： (1)本发明提供一种利用免疫生物传感器检测组胺的方法，该方法具有检测限低、灵敏 度高、线性范围广、适用于现场检测等优点，可用于样品中组胺检测。本发明检测方法可通 过检测海产食品和鱼组织中的组胺值来判断海产食品和鱼制品的新鲜度和腐败程度，适用 于在非实验室设置中测定海产食品和鱼组织中的组胺值，实现监管部门的现场快速监测， 为海产品安全生产与消费提供残留检测的技术支撑。
[0030] (2)本发明将普鲁士蓝、壳聚糖、纳米金组成复合膜用于修饰免疫生物传感器的工 作电极，其电流响应比单独沉积普鲁士蓝或纳米金具有明显地稳定性，复合膜比表面积大， 易于电子传递。本发明制备的免疫传感器相对已报道的检测组胺方法(如利用二胺氧化酶 催检）具有特异性好、检测灵敏度高等优势。
【附图说明】
[0031] 图1为本发明免疫生物传感器检测组胺的原理示意图。
[0032] 图2为酶标组胺抗体、组胺抗体及辣根过氧化酶的紫外扫描图。
[0033] 图3为本发明免疫传感器电沉积后的电化 学表征图。
[0034] 图4为本发明免疫传感器检测组胺的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对 本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常 规试剂、方法和设备。
[0036] 实施例1免疫生物传感器的制备 本实施例提供一种检测组胺的免疫生物传感器，采用表面有普鲁士蓝-壳聚糖-纳米 金复合膜的电极，所述电极上固定有组胺包被原。
[0037] 所述复合膜中纳米金与普鲁士蓝的摩尔浓度比为1:2000~1:20,壳聚糖含量为 0. 01%~0. 05%。
[0038] -种上述免疫生物传感器的制备方法，包括如下步骤： S1.将0. 05g壳聚糖溶于100mL1. 0%的醋酸溶液中，室温下搅拌3h，使壳聚糖完全溶 解，配制成 0.05% 壳聚糖溶液。将 0.0406gFeCl3,0.0822gK3[Fe(CN)6]，0.7455gKC1 以及 lmL浓盐酸加入100mL上述壳聚糖溶液中，在室温下超声分散，直至得到稳定的暗绿色分 散液；再将制备好的lmL的纳米金胶加入已混合好的上述溶液中，再在室温下超声分散0. 5 h至完全溶解，制备得到沉积液； 将丝网印刷电极分别在乙醇和超纯水中超声处理lmin，氮气吹干，再将丝网印刷电极 在+0. 4V电压下浸在配制好的沉积液中，沉积时间为60~300s; 电极浸在〇. 1MKC1/0. 1MHC1溶液中在-0. 6V到+0. 8V之间扫描循环伏安图直至 图像稳定，使电极表面获得普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜。
[0039] S2.在电极表面滴涂用0. 1M的碳酸盐缓冲液（pH9. 6)稀释后浓度为10ug/mL 的包被原，使其在微碱的环境下能更好地将包被原固定在纳米膜修饰的电极表面，4°C孵育 12h〇
[0040] S3.滴涂5%脱脂奶粉以封闭电极表面非特异性位点，37°C孵育lh，用0. 01M磷酸 盐冲洗、风干，制备得到所述免疫生物传感器。
[0041] 制备得到的免疫生物传感器检测组胺的原理示意图见图1，电沉积后该免疫传感 器的电化学表征图见图3。
[0042] 进一步地，配制浓度分别为 0? 001ng/mL、0? 01ng/mL、0? 1ng/mL、1ng/mL、10 ng/mL、100ng/mL的组胺标准液，按照上述制备方法进行循环伏安扫描，得到该免疫传感 器的工作曲线为y=29. 916-20. 456*x(R2=0. 993)，检测范围为0? 085~0. 95ng/mL及检测限 为 0.042ng/mL，见图 4。
[0043] 对该免疫生物传感器的精确度和稳定性进行评价：反复测试5次得到电流响应值 相对偏差小于2. 8%，10天内间断测试后，电流响应值仍为初始电流的92%以上。
[0044] 实施例2组胺单克隆抗体的制备及高效酶标记 本实施例提供一种组胺单克隆抗体的制备及高效酶标记的方法，包括如下步骤： 首先，将衍生后的组胺与牛血清蛋白偶联得到免疫原去免疫小白鼠；然后，取有免疫效 果的小白鼠脾脏细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合得到产特异性组胺抗体的细胞株；最后， 培养足量杂交瘤细胞后注射到小鼠腹腔，取腹水纯化。至此，组胺单克隆抗体制备完成。
[0045] 称取6mgHRP酶溶解于0.2mL0.2mol/LpH值5. 6的醋酸盐缓冲液中，加入 0. 1mL现配的0. 1mol/LNaI04溶液，4 °C避光反应30min，溶液呈黄绿色；在上述溶液中 加入2. 5%乙二醇溶液0.2mL，室温（20°C±1°C)下反应30min;而后继续加入2mg已 纯化的组胺抗体，混匀，搅拌30min后将上述溶液装入透析袋中，用5000mL浓度为0.05 mol/L，pH值9. 6的碳酸缓冲液中透析，4°C下透析过夜；将0? 04mL现配的5mg/mLNaBH4 溶液加入到透析后溶液中，混匀，4 °C下静置2h，加入等量的饱和硫酸铵溶液，4 °C反应 30min后4000r/min离心10~20min。弃上清，沥干，将沉淀溶于少量PBS(0.02moL/ L，pH=7. 4)中，然后装入透析袋中，4 °C透析过夜。取透析液，在4 °C，4000rpm条件下离 心10~ 20min后，吸取的上清液，加入等量甘油，混匀分装，-20 °C保存备用。
[0046] 酶标组胺抗体、组胺抗体及辣根过氧化酶的紫外扫描图见图2。
[0047] 实施例3检测组胺 从当地市场上购买冷冻鲣鱼，用刀片刮除鱼鳞，取肉5g左右置于离心管中，加入等量 的超纯水。用自制的振荡器反复震荡2~10min，得到鱼肉匀浆液，然后2000 ~4000rpm/ s离心5~20min。取上清液即为待测样液，并利用实施例1制得的免疫生物传感器，按下 述步骤检测待测样液的组胺浓度：将等体积的待测样液和实施例2制得的酶标抗体混合均 匀后，在电极工作区域滴涂6uL上述混合液，再将电极浸在10mL测试液中，测试液含有1 mmol/L对苯二酚和1/15mol/L磷酸缓冲液；再添加30yL过氧化氢，通过前后峰电流值的 变化大小并比对传感器的工作曲线，测定得到待测样液的组胺浓度，重复试验三次，结果见 表1。
[0048] 本次添加回收实验中，回收率为97. 8%，且电极间变异系数为小于10%，说明该传 感器性能比较稳定，重复性好。
[0049] 对比例1 本对比例检测组胺的方法大体与实施例1~3相同，不同之处在于组胺包被原的包被浓 度与酶标抗体的浓度采用如下处理：处理①组胺包被原的包被浓度为2mg/mL;处理②S4 所述酶标抗体的原液浓度为5mg/mL，稀释8倍使用。
[0050] 采用上述处理检测组胺的结果见表1，处理①检测结果具有较高的假阴性，原因可 能是包被原浓度过高，游离的组胺无法有效的竞争结合酶标抗体，处理②检测结果具有较 高的假阴性，原因可能是酶标抗体过量，按常规操作不能有效控制抗体的非特异性吸附。因 此，只有在本发明提供的包被原及酶标抗体的比例范围内进行条件优化才能得到良好的工 作曲线，应用于实际检测。
[0051] 对比例2 本对比例检测组胺的方法大体与实施例1~3相同，不同之处在于S3所述酶标抗体的制 备采用如下处理：处理①HRP酶取10mg，已纯化的组胺抗体取2mg，即两者比例为5:1 ;处 理②NaI04溶液为0. 06mol/L，乙二醇溶液为0. 18mol/L，NaBH4溶液为4mg/mL。
[0052] 采用上述处理检测组胺的结果见表1，结果处理①检测结果具有较高的假阴性， 原因可能是未标抗体的酶在电极表面发生非特异性吸附；处理②检测结果具有较高的假阳 性，原因可能是酶标抗体的数量较少，峰电流变化值偏小。
[0053] 对比例3 采用上述处理检测组胺的结果见表1，本对比例采用二胺氧化酶催化检测实施例3得 到的待测样品，按同样电沉积的方法构建生物界面，通过自组装的方法固定二胺氧化酶在 电极表面，对组胺进行检测。结果是回收率偏低，可能原因有很多，最主要的原因是酶的固 定与酶活性的保持。
[0054] 表1不同检测方法对组胺检测的影响
【主权项】
1. 一种利用免疫生物传感器检测组胺的方法，其特征在于，包括如下步骤： si.免疫生物传感器的制备：普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜修饰电极，然后，将组 胺包被原固定在电极表面，滴涂封闭液制得所述免疫生物传感器，检测该传感器的工作曲 线，待用；52. 组胺单克隆抗体的制备；53. 酶标抗体的制备：用辣根过氧化酶标记S2制得的组胺抗体；54. 传感器检测组胺：将等体积的待测样液和S3制得的酶标抗体混匀后，滴涂在电极 工作区域，将所述电极浸在测试液中，并添加过氧化氢，通过前后峰电流值的变化大小定量 测定组胺浓度； 其中，所述组胺包被原的包被浓度为〇. 〇〇1~1mg/mL; S4所述酶标抗体的原液浓度为5mg/mL，稀释10 ~1000倍使用。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S3所述酶标抗体中辣根过氧化酶和组胺 抗体的质量比为3:1。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述S3包括如下步骤：将辣根过氧化酶 溶解于缓冲液中，加入〇.lmol/LNaIO4溶液，溶液呈黄绿色，再加入2. 5%乙二醇溶液；再加 入S3制得的组胺抗体，混匀；将上述混合溶液加入透析袋中，在缓冲液中透析过夜；透析后 加入5mg/mLNaBH4溶液，再加入等量的饱和硫酸铵溶液，离心，将沉淀溶于缓冲液中，再次 透析过夜，离心，取上清液作为酶标抗体。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S4所述测试液含有1~5mmol/L对苯二酚 和1/100 ~ 1/15mol/L磷酸缓冲液。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S4所述过氧化氢在测试液中的终浓度为 0. 96- 7. 2mmol/L。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S4所述测试液为4~10mL。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述组胺包被原的初始浓度为4mg/mL， 分别稀释4~4000倍后进行电极表面包被原固定。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，Sl所述复合膜中纳米金与普鲁士蓝的摩 尔浓度比为1:2000~1:20,壳聚糖质量体积含量为0. 01~0. 05%。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，配制含普鲁士蓝、壳聚糖和纳米金的沉积 液，将电极浸在所述沉积液中，在+〇. 4V的电压下沉积60~300s，使普鲁士蓝-壳聚糖-纳 米金复合膜修饰电极。10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，Sl所述工作曲线的检测方法为：配制一 系列的组胺标准液，在-0. 6V到+0. 8V电压下进行循环扫描，得到工作曲线。
【专利摘要】本发明属于生物传感器技术领域，具体公开了一种利用免疫生物传感器检测组胺的方法。所述方法包括如下步骤：S1.免疫生物传感器的制备，检测该传感器的工作曲线，待用；S2.组胺单克隆抗体的制备；S3.酶标抗体的制备；S4.传感器检测组胺：将等体积的待测样液和S3制得的酶标抗体混匀后，滴涂在电极工作区域，将所述电极浸在测试液中，并添加过氧化氢，通过前后峰电流值的变化大小定量测定组胺浓度。该方法具有检测限低、灵敏度高、线性范围广、适用于现场检测等优点，可用于样品中组胺检测，适用于在非实验室设置中测定海产食品和鱼组织中的组胺值，实现监管部门的现场快速监测，为海产品安全生产与消费提供残留检测的技术支撑。
【IPC分类】G01N33/577
【公开号】CN104897897
【申请号】CN201510287378
【发明人】孙远明, 董秀秀, 徐振林, 陈子键, 雷红涛, 杨金易, 王弘, 沈玉栋, 罗林
【申请人】华南农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月29日
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物传感器技术领域，更具体地，涉及一种利用免疫生物传感器检测 组胺的方法。
【背景技术】
[0002] 我国鱼类资源丰富，也是水产品生产和消费大国，水产品及其加工在国民经济和 消费中都占有重要地位。组胺（Histamine)是游离组氨酸在组氨酸脱羧酶的催化下发生 脱羧反应形成的，是一种具有毒性的生物胺，广泛存在于各种生物体及食品中，主要为水产 品，尤其是青皮红肉特征的中上层海水鱼及其加工产品。研宄表明，若过量摄入组胺会引起 头痛恶心、反胃呕吐、腹泻、心悸、瘙痒性皮瘆、血压变化等一系列的过敏反应。摄入8~40mg 组胺会产生轻微的中毒症状，超过40mg产生中等中毒症状，超过100mg产生严重中毒症 状。美国FDA通过对爆发组胺中毒的大量数据的研宄，确定组胺的危害作用水平为500mg/ kg(食品）。近年来，我国在广东、浙江、山东等多地都爆发过组胺中毒事件，据报道，仅杭州 下城区，在1997年至2006年的十年间就发生7次组胺中毒事件。因此，组胺含量对于保障 消费者健康具有十分重要的意义，目前国内外把组胺列为水产品的必检项目。
[0003] 组胺作为小分子，仅有一个抗原活性位点，很难实现直接检测，目前食品中组胺测 定的方法主要有偶氮试剂比色法、高效液相色谱法、荧光分析法、气相色谱法等等。这些方 法都存在一定的缺陷，如仪器及耗材较为昂贵，成本高，步骤较繁琐，耗时长，试剂有毒，有 的则需要技术熟练的操作人员，都不适合现场快速检测。
[0004] 电化学免疫传感器是将高特异性的抗原抗体结合反应与高灵敏的传感技术相结 合，是21世纪最有前途的检测手段之一。但是，组胺分子量极小（111Da)，而且只有一个抗 原活性位点，很难实现直接电化学免疫检测。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种利用免疫生物传感器检测组胺的方法。 所述方法通过建立一种直接竞争免疫传感器法实现对组胺的定量检测，从而可通过检测海 产食品和鱼组织中的组胺值来判断海产食品和鱼制品的新鲜度和腐败程度。该方法适用于 在非实验室设置中测定海产食品和鱼组织中的组胺值，实现监管部门的现场快速监测。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现上述目的的。
[0007] -种利用免疫生物传感器检测组胺的方法，包括如下步骤： 51. 免疫生物传感器的制备：普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜修饰电极，然后，将组 胺包被原固定在电极表面，滴涂封闭液制得所述免疫生物传感器，检测该传感器的工作曲 线，待用； 52. 组胺单克隆抗体的制备； 53. 酶标抗体的制备：用辣根过氧化酶标记S2制得的组胺抗体； 54. 传感器检测组胺：将等体积的待测样液和S3制得的酶标抗体混匀后，滴涂在电极 工作区域，将所述电极浸在测试液中，并添加过氧化氢，通过前后峰电流值的变化大小定量 测定组胺浓度； 其中，所述组胺包被原的包被浓度为0. 001 ~1mg/mL; S4所述酶标抗体的原液浓度为5mg/mL，稀释10 ~1000倍使用。
[0008] 本发明采用普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜修饰电极，普鲁士蓝 (Fe4[Fe(CN)6]3)是非常好的导电媒介体，可以加速电子的传递；壳聚糖具有较好的粘度和 较小的空间位阻，使其具有良好的生物相容性和成膜性；纳米金在电化学反应中也具有突 出的优良特性。本发明将普鲁士蓝、壳聚糖、纳米金组成复合膜，其电流响应比单独沉积普 鲁士蓝或纳米金具有明显地稳定性。复合膜中壳聚糖作为导电分子因其自身表面带正电及 生物相容性好而被广泛应用在传感器中生物分子的固定，普鲁士蓝膜具有非常好的电催化 活性，而纳米金颗粒与组胺包被原结合加速生物界面与蛋白活性位点间的电子传递。将电 极浸入沉积液中，施加电压后，铁离子会发生自身的氧化还原反应，而纳米金和壳聚糖分子 则依附离子运动一起沉积到电极表面形成普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜。这三者的复 合是相互协调，缺一不可的。若沉积液中非氧化还原成分增多则会影响以普鲁士蓝为核心 的复合膜沉积效果，且三种材料的制备都相对容易，适于大批量制备并在市场中推广应用。
[0009] 组胺包被原是组胺与蛋白的偶联复合物，在一定浓度范围内，调整包被原的浓度 可以得到不同线性范围的工作曲线，但是包被原浓度过高的话会阻碍电子传递而使免疫传 感器的灵敏度下降。将组胺包被原固定在电极表面，检测时，仅需添加等体积的酶标抗体和 待测样液，固定在电极表面的组胺包被原和样液中衍生的组胺会竞争结合酶标组胺抗体， 和电极上包被原结合的组胺抗体就可以"存在"电极表面；而与游离组胺结合的抗体就被缓 冲溶液冲洗"离开"电极表面。然后添加测试液和过氧化氢，对免疫传感器进行循环伏安法 扫描测试，辣根过氧化酶可以在一定的电位下催化过氧化氢进行自身的氧化还原反应，同 时通过双电子传递过程测试液也被氧化，还原峰变大，通过前后峰电流值变化的大小来定 量测定组胺浓度。检测过程中发生的反应如下： HRP(Fe3+) +H202 ?Compound(I) +H20 (1) Compound(I) +QH?Compound(II) +Q (2) Compound(II) +QH?HRP(Fe3+) +Q+H20 (3) Q+H+2e- ?QH(电化学反应） （4) 其中，QH代表测试液，Q代表测试液的氧化态。
[0010] 优选地，S3所述酶标抗体中辣根过氧化酶和组胺抗体的质量比为3:1。
[0011] 优选地，所述S3包括如下步骤：将辣根过氧化酶溶解于缓冲液中，加入0.lmol/L NaI04溶液，溶液呈黄绿色，再加入2. 5%乙二醇溶液；再加入S3制得的组胺抗体，混匀；将 上述混合溶液加入透析袋中，在缓冲液中透析过夜；透析后加入5mg/mLNaBH4溶液，再加入 等量的饱和硫酸铵溶液，离心，将沉淀溶于缓冲液中，再次透析过夜，离心，取上清液作为酶 标抗体。
[0012] 更优选地，所述S3包括如下步骤：将6mg辣根过氧化酶HRP溶解于pH为5. 4~5. 8 的缓冲液中，加入〇. 05~0. 2mL0. 1mol/LNaI04溶液，4~6°C避光反应20~40min，溶液呈 黄绿色；再加入0. 05~0. 2mL2. 5%乙二醇溶液，室温下反应20~40min;再加入2mgS1制 备的组胺抗体，混匀；将上述混合溶液加入透析袋中，在浓度为0. 05mol/L、pH为9. 4~9. 8 的缓冲液中透析过夜；透析后加入0. 02~0. 06mL5mg/mL的NaBH4溶液，混匀，4~6 °C静 置1~3h，再加入等量的饱和硫酸铵溶液，4~6°C反应20~40min后3000~5000r/min离心 10~20min，将沉淀溶于少量磷酸缓冲液中，再次透析过夜，离心，取上清液，混匀作为酶标 抗体。
[0013] 优选地，S4所述测试液含有1 ~ 5mmol/L对苯二酚和1/100 ~ 1/15mol/L磷酸 缓冲液。
[0014] 优选地，S4所述过氧化氢的浓度为0? 96~7. 2mmol/L。
[0015] 优选地，S4所述过氧化氢添加量为20~60yL。
[0016] 优选地，S4所述测试液为4~10mL。
[0017] 优选地，所述组胺包被原的初始浓度为4mg/mL，分别稀释4~4000倍后进行电极 表面包被原固定。
[0018] 优选地，S1所述复合膜中纳米金与普鲁士蓝的摩尔浓度比为1:2000~1:20,壳聚 糖质量体积含量为〇. 〇1~〇. 05%。
[0019] 优选地，配制含普鲁士蓝、壳聚糖和纳米金的沉积液，将电极浸在所述沉积液中， 在+0. 4V的电压下沉积60~300s，使普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜修饰电极。
[0020] 优选地，S1所述工作曲线的检测方法为：配制一系列的组胺标准液，在-0. 6V到 +0. 8V电压下进行循环扫描，得到工作曲线。
[0021] 优选地，S1所述工作曲线的检测方法为：配制浓度分别为0,0. 001，0. 01，0. 1， 0? 25,0? 4,0? 5,0? 625,0? 8,1. 0,10,100ng/mL的组胺标准液，在-0? 6V到 +0? 8V电压下进行 循环扫描，得到工作曲线。
[0022] 优选地，所述电极为丝网印刷电极，所述丝网印刷电极将工作电极、参比电极和辅 助电极集为一体。
[0023] 优选地，将S1所述组胺包被原用pH9. 6的缓冲液稀释后，通过物理吸附固定在所 述电极表面。
[0024] 优选地，将组胺包被原滴涂在电极工作区域，4°C孵育8~14h。
[0025] 优选地，将S1所述封闭液滴涂在电极工作区域，37°C孵育l~3h。
[0026] 优选地，所述封闭液为5%脱脂奶粉。
[0027] 优选地，S1所述沉积液的制备方法为：将普鲁士蓝加入壳聚糖溶液，超声分散，得 到稳定的暗绿色分散液，再向分散液中加入纳米金溶液，超声分散至完全溶解，制得沉积 液。更优选地，将 〇.5~5mMFeCl3/K3[Fe(CN)6]，0. 1MKC1 以及 1~10mMHC1 的复合溶液 溶于0.OP/p〇. 05%壳聚糖溶液中，在室温下超声分散，得到稳定的暗绿色分散液；再向分散 液中加入纳米金胶使其终浓度为2. 5 ~25mM，超声分散至完全溶解，制得沉积液。
[0028] 优选地，所述待测样液的制备方法为：选取水产品海鱼样品，去除皮、骨、内脏 和结缔组织后用绞肉机充分绞碎，等重量鱼肉和蒸馏水混合制成肌肉匀浆，用乙腈萃取， 2000~4000rpm离心5~20min，用PBST缓冲溶液将有机层稀释10倍，所得稀释液即为待测 样液。
[0029] 与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果是： (1)本发明提供一种利用免疫生物传感器检测组胺的方法，该方法具有检测限低、灵敏 度高、线性范围广、适用于现场检测等优点，可用于样品中组胺检测。本发明检测方法可通 过检测海产食品和鱼组织中的组胺值来判断海产食品和鱼制品的新鲜度和腐败程度，适用 于在非实验室设置中测定海产食品和鱼组织中的组胺值，实现监管部门的现场快速监测， 为海产品安全生产与消费提供残留检测的技术支撑。
[0030] (2)本发明将普鲁士蓝、壳聚糖、纳米金组成复合膜用于修饰免疫生物传感器的工 作电极，其电流响应比单独沉积普鲁士蓝或纳米金具有明显地稳定性，复合膜比表面积大， 易于电子传递。本发明制备的免疫传感器相对已报道的检测组胺方法(如利用二胺氧化酶 催检）具有特异性好、检测灵敏度高等优势。
【附图说明】
[0031] 图1为本发明免疫生物传感器检测组胺的原理示意图。
[0032] 图2为酶标组胺抗体、组胺抗体及辣根过氧化酶的紫外扫描图。
[0033] 图3为本发明免疫传感器电沉积后的电化 学表征图。
[0034] 图4为本发明免疫传感器检测组胺的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对 本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常 规试剂、方法和设备。
[0036] 实施例1免疫生物传感器的制备 本实施例提供一种检测组胺的免疫生物传感器，采用表面有普鲁士蓝-壳聚糖-纳米 金复合膜的电极，所述电极上固定有组胺包被原。
[0037] 所述复合膜中纳米金与普鲁士蓝的摩尔浓度比为1:2000~1:20,壳聚糖含量为 0. 01%~0. 05%。
[0038] -种上述免疫生物传感器的制备方法，包括如下步骤： S1.将0. 05g壳聚糖溶于100mL1. 0%的醋酸溶液中，室温下搅拌3h，使壳聚糖完全溶 解，配制成 0.05% 壳聚糖溶液。将 0.0406gFeCl3,0.0822gK3[Fe(CN)6]，0.7455gKC1 以及 lmL浓盐酸加入100mL上述壳聚糖溶液中，在室温下超声分散，直至得到稳定的暗绿色分 散液；再将制备好的lmL的纳米金胶加入已混合好的上述溶液中，再在室温下超声分散0. 5 h至完全溶解，制备得到沉积液； 将丝网印刷电极分别在乙醇和超纯水中超声处理lmin，氮气吹干，再将丝网印刷电极 在+0. 4V电压下浸在配制好的沉积液中，沉积时间为60~300s; 电极浸在〇. 1MKC1/0. 1MHC1溶液中在-0. 6V到+0. 8V之间扫描循环伏安图直至 图像稳定，使电极表面获得普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜。
[0039] S2.在电极表面滴涂用0. 1M的碳酸盐缓冲液（pH9. 6)稀释后浓度为10ug/mL 的包被原，使其在微碱的环境下能更好地将包被原固定在纳米膜修饰的电极表面，4°C孵育 12h〇
[0040] S3.滴涂5%脱脂奶粉以封闭电极表面非特异性位点，37°C孵育lh，用0. 01M磷酸 盐冲洗、风干，制备得到所述免疫生物传感器。
[0041] 制备得到的免疫生物传感器检测组胺的原理示意图见图1，电沉积后该免疫传感 器的电化学表征图见图3。
[0042] 进一步地，配制浓度分别为 0? 001ng/mL、0? 01ng/mL、0? 1ng/mL、1ng/mL、10 ng/mL、100ng/mL的组胺标准液，按照上述制备方法进行循环伏安扫描，得到该免疫传感 器的工作曲线为y=29. 916-20. 456*x(R2=0. 993)，检测范围为0? 085~0. 95ng/mL及检测限 为 0.042ng/mL，见图 4。
[0043] 对该免疫生物传感器的精确度和稳定性进行评价：反复测试5次得到电流响应值 相对偏差小于2. 8%，10天内间断测试后，电流响应值仍为初始电流的92%以上。
[0044] 实施例2组胺单克隆抗体的制备及高效酶标记 本实施例提供一种组胺单克隆抗体的制备及高效酶标记的方法，包括如下步骤： 首先，将衍生后的组胺与牛血清蛋白偶联得到免疫原去免疫小白鼠；然后，取有免疫效 果的小白鼠脾脏细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合得到产特异性组胺抗体的细胞株；最后， 培养足量杂交瘤细胞后注射到小鼠腹腔，取腹水纯化。至此，组胺单克隆抗体制备完成。
[0045] 称取6mgHRP酶溶解于0.2mL0.2mol/LpH值5. 6的醋酸盐缓冲液中，加入 0. 1mL现配的0. 1mol/LNaI04溶液，4 °C避光反应30min，溶液呈黄绿色；在上述溶液中 加入2. 5%乙二醇溶液0.2mL，室温（20°C±1°C)下反应30min;而后继续加入2mg已 纯化的组胺抗体，混匀，搅拌30min后将上述溶液装入透析袋中，用5000mL浓度为0.05 mol/L，pH值9. 6的碳酸缓冲液中透析，4°C下透析过夜；将0? 04mL现配的5mg/mLNaBH4 溶液加入到透析后溶液中，混匀，4 °C下静置2h，加入等量的饱和硫酸铵溶液，4 °C反应 30min后4000r/min离心10~20min。弃上清，沥干，将沉淀溶于少量PBS(0.02moL/ L，pH=7. 4)中，然后装入透析袋中，4 °C透析过夜。取透析液，在4 °C，4000rpm条件下离 心10~ 20min后，吸取的上清液，加入等量甘油，混匀分装，-20 °C保存备用。
[0046] 酶标组胺抗体、组胺抗体及辣根过氧化酶的紫外扫描图见图2。
[0047] 实施例3检测组胺 从当地市场上购买冷冻鲣鱼，用刀片刮除鱼鳞，取肉5g左右置于离心管中，加入等量 的超纯水。用自制的振荡器反复震荡2~10min，得到鱼肉匀浆液，然后2000 ~4000rpm/ s离心5~20min。取上清液即为待测样液，并利用实施例1制得的免疫生物传感器，按下 述步骤检测待测样液的组胺浓度：将等体积的待测样液和实施例2制得的酶标抗体混合均 匀后，在电极工作区域滴涂6uL上述混合液，再将电极浸在10mL测试液中，测试液含有1 mmol/L对苯二酚和1/15mol/L磷酸缓冲液；再添加30yL过氧化氢，通过前后峰电流值的 变化大小并比对传感器的工作曲线，测定得到待测样液的组胺浓度，重复试验三次，结果见 表1。
[0048] 本次添加回收实验中，回收率为97. 8%，且电极间变异系数为小于10%，说明该传 感器性能比较稳定，重复性好。
[0049] 对比例1 本对比例检测组胺的方法大体与实施例1~3相同，不同之处在于组胺包被原的包被浓 度与酶标抗体的浓度采用如下处理：处理①组胺包被原的包被浓度为2mg/mL;处理②S4 所述酶标抗体的原液浓度为5mg/mL，稀释8倍使用。
[0050] 采用上述处理检测组胺的结果见表1，处理①检测结果具有较高的假阴性，原因可 能是包被原浓度过高，游离的组胺无法有效的竞争结合酶标抗体，处理②检测结果具有较 高的假阴性，原因可能是酶标抗体过量，按常规操作不能有效控制抗体的非特异性吸附。因 此，只有在本发明提供的包被原及酶标抗体的比例范围内进行条件优化才能得到良好的工 作曲线，应用于实际检测。
[0051] 对比例2 本对比例检测组胺的方法大体与实施例1~3相同，不同之处在于S3所述酶标抗体的制 备采用如下处理：处理①HRP酶取10mg，已纯化的组胺抗体取2mg，即两者比例为5:1 ;处 理②NaI04溶液为0. 06mol/L，乙二醇溶液为0. 18mol/L，NaBH4溶液为4mg/mL。
[0052] 采用上述处理检测组胺的结果见表1，结果处理①检测结果具有较高的假阴性， 原因可能是未标抗体的酶在电极表面发生非特异性吸附；处理②检测结果具有较高的假阳 性，原因可能是酶标抗体的数量较少，峰电流变化值偏小。
[0053] 对比例3 采用上述处理检测组胺的结果见表1，本对比例采用二胺氧化酶催化检测实施例3得 到的待测样品，按同样电沉积的方法构建生物界面，通过自组装的方法固定二胺氧化酶在 电极表面，对组胺进行检测。结果是回收率偏低，可能原因有很多，最主要的原因是酶的固 定与酶活性的保持。
[0054] 表1不同检测方法对组胺检测的影响
【主权项】
1. 一种利用免疫生物传感器检测组胺的方法，其特征在于，包括如下步骤： si.免疫生物传感器的制备：普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜修饰电极，然后，将组 胺包被原固定在电极表面，滴涂封闭液制得所述免疫生物传感器，检测该传感器的工作曲 线，待用；52. 组胺单克隆抗体的制备；53. 酶标抗体的制备：用辣根过氧化酶标记S2制得的组胺抗体；54. 传感器检测组胺：将等体积的待测样液和S3制得的酶标抗体混匀后，滴涂在电极 工作区域，将所述电极浸在测试液中，并添加过氧化氢，通过前后峰电流值的变化大小定量 测定组胺浓度； 其中，所述组胺包被原的包被浓度为〇. 〇〇1~1mg/mL; S4所述酶标抗体的原液浓度为5mg/mL，稀释10 ~1000倍使用。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S3所述酶标抗体中辣根过氧化酶和组胺 抗体的质量比为3:1。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述S3包括如下步骤：将辣根过氧化酶 溶解于缓冲液中，加入〇.lmol/LNaIO4溶液，溶液呈黄绿色，再加入2. 5%乙二醇溶液；再加 入S3制得的组胺抗体，混匀；将上述混合溶液加入透析袋中，在缓冲液中透析过夜；透析后 加入5mg/mLNaBH4溶液，再加入等量的饱和硫酸铵溶液，离心，将沉淀溶于缓冲液中，再次 透析过夜，离心，取上清液作为酶标抗体。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S4所述测试液含有1~5mmol/L对苯二酚 和1/100 ~ 1/15mol/L磷酸缓冲液。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S4所述过氧化氢在测试液中的终浓度为 0. 96- 7. 2mmol/L。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S4所述测试液为4~10mL。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述组胺包被原的初始浓度为4mg/mL， 分别稀释4~4000倍后进行电极表面包被原固定。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，Sl所述复合膜中纳米金与普鲁士蓝的摩 尔浓度比为1:2000~1:20,壳聚糖质量体积含量为0. 01~0. 05%。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，配制含普鲁士蓝、壳聚糖和纳米金的沉积 液，将电极浸在所述沉积液中，在+〇. 4V的电压下沉积60~300s，使普鲁士蓝-壳聚糖-纳 米金复合膜修饰电极。10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，Sl所述工作曲线的检测方法为：配制一 系列的组胺标准液，在-0. 6V到+0. 8V电压下进行循环扫描，得到工作曲线。
【专利摘要】本发明属于生物传感器技术领域，具体公开了一种利用免疫生物传感器检测组胺的方法。所述方法包括如下步骤：S1.免疫生物传感器的制备，检测该传感器的工作曲线，待用；S2.组胺单克隆抗体的制备；S3.酶标抗体的制备；S4.传感器检测组胺：将等体积的待测样液和S3制得的酶标抗体混匀后，滴涂在电极工作区域，将所述电极浸在测试液中，并添加过氧化氢，通过前后峰电流值的变化大小定量测定组胺浓度。该方法具有检测限低、灵敏度高、线性范围广、适用于现场检测等优点，可用于样品中组胺检测，适用于在非实验室设置中测定海产食品和鱼组织中的组胺值，实现监管部门的现场快速监测，为海产品安全生产与消费提供残留检测的技术支撑。
【IPC分类】G01N33/577
【公开号】CN104897897
【申请号】CN201510287378
【发明人】孙远明, 董秀秀, 徐振林, 陈子键, 雷红涛, 杨金易, 王弘, 沈玉栋, 罗林
【申请人】华南农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月29日
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