一种前列腺小体外泄蛋白抗原及其抗体与应用
一种前列腺小体外泄蛋白抗原及其抗体与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种前列腺小体外泄蛋白抗原，具体涉及一种该前列腺小体外泄蛋白 抗原及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 慢性前列腺炎（ChronicProstatitis，CP)是泌尿外科中青年男性最常见的疾病 之一，据报道其占门诊量的30%。据流行病学调查，我国成人男性人群中，10%以上有前列腺 炎样症状，50%男性不同时期均患过前列腺炎。说明潜在的慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛 (CPPS)患者众多。同时，由化学品、物理因素或生物制剂引起的炎症过程还是人类癌症的发 病机制中重要因子。在前列腺癌中，炎症的存在及细胞上皮组织损伤后再生被认为是恶性 转化的关键因素（DeMarzoetal.，2007)。前列腺组织受到炎性细胞的浸润，从而释放出各种 活性物质，这些物质的释放还与细菌及病毒感染、尿酸增高及食用前列腺致癌物有关。在过 去10年中，炎症和癌症之间的联系，以及前列腺炎作为前列腺癌高危因素的假说已经在流 行病学、临床、形态学、病原学、细胞和分子水平上进行充分的研究并得到证实。事实上，文 献中指出，大约12%以上前列腺炎症，如不及时治疗可转化为前列腺癌。所以前列腺炎严重 影响男性健康（陈智彬etal.，2009 ;那彦群etal.，2011)。
[0003] 前列腺炎临床表现因患者个体差异而缺乏特异性，因此在临床上治疗效果一直 不满意（Kriegeretal.，1999 ;Engeleretal.，2012 ;那彦群etal.，2011)。根据 1997 年 美国国立卫生研究院（NIH)对前列腺炎的分类，即NIH分类法（Kriegeretal.,1999;陈 智彬etal.，2009)，包括I型：急性细菌性前列腺炎（ABP) ;II型：慢性细菌性前列腺炎 (CBP) ;111型：又分为IIIA，慢性非细菌性前列腺炎（CAP)和IIIB，慢性骨盆疼痛综合征 (CPPS) ;IV型：无症状的炎症性前列腺炎（AIP)。临床实践中，通常以III型慢性前列腺炎多 见，约占90%左右，所以慢性前列腺炎主要指的是III型慢性前列腺炎。在临床实际工作中， 泌尿男科医师对首诊的CAP和CPPS患者选择的检查方法（多选）前3位是尿常规（80. 3%)、 前列腺按摩液检查（71. 0%)、体检（包括直肠指检）（63. 2%)。前列腺按摩液检查和直肠指 检对患者有一定侵入性，而大多数诊断却仍然依赖于临床表征和医生经验，因此非常需要 简便无侵入性，同时准确可靠的分子诊断方法。
[0004] 中国申请CN102998455A公开了 一种检测或诊断前列腺癌的试剂盒，其包含 5 -catenin吸附抗体、包被缓冲液、洗漆缓冲液、封闭缓冲液、5 -catenin检测抗体、酶标 抗体。或包含S-catenin吸附抗体、包被缓冲液、洗漆缓冲液、封闭缓冲液、S-catenin检 测抗体、纳米量子点标记。所述试剂盒能够从病人尿液中用ELISA方法检测与前列腺癌成 高度相关性的S-catenin蛋白，而且ELISA方法成熟，敏感性和特异性较高，对病人是非侵 袭性的，能够重复采取，病人乐于接受。纳米量子点（QD)标记法取样量小，将ELISA方法中 所用的抗体与QD结合，能更灵敏地检测尿液中S-catenin蛋白的变化，从而用于诊断前列 腺癌。但是，该试剂盒仅适用于前列腺癌检测，不能很好区分慢性前列腺炎症病人和正常人 样品，故不适用于前列腺炎症检测。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一目的即在于提供一种可用于前列腺炎症检测的前列腺小体外泄蛋 白抗原。
[0006] 本发明所述的前列腺小体外泄蛋白抗原，采用如下方法制备而成：
[0007] 取500毫升慢性前列腺炎症病人晨尿中段尿，加入等量pH7. 3的HEPES缓冲液和 蛋白酶抑制剂，用纱布过滤；取过滤液分别置于10只50毫升离心管，在4°C低温下400g 离心10分钟，去沉淀，取上清液在4°C低温下10, 000g离心20分钟，去沉淀，取上清液分别 置于200只3毫升超速离心管，在4°C低温下100,000g离心120分钟；倒去上清液，取沉淀 加入2. 5毫升pH7. 8的TBS缓冲液和蛋白酶抑制剂，混匀；在4°C低温下100,000g离心 120分钟，倒去上清液，取沉淀分别溶于2. 5毫升0. 5%NP-40,80mMNaCl, 0. 2%Deoxycholate ，50mMTris，pH8.0和蛋白酶抑制剂；在4°C低温下100,000g离心20分钟；取上清液，上样 TSKgelG3000PW，280纳米读数，取在40kDa区域峰值蛋白，-80°C冷冻保存，即得。
[0008] 同时，本发明进一步保护了上述前列腺小体外泄蛋白抗原的制备方法：
[0009] 取500毫升慢性前列腺炎症病人晨尿中段尿，加入等量pH7. 3的HEPES缓冲液和 蛋白酶抑制剂，用纱布过滤；取过滤液分别置于10只50毫升离心管，在4°C低温下400g 离心10分钟，去沉淀，取上清液在4°C低温下10, 000g离心20分钟，去沉淀，取上清液分别 置于200只3毫升超速离心管，在4°C低温下100,000g离心120分钟；倒去上清液，取沉淀 加入2. 5毫升pH7. 8的TBS缓冲液和蛋白酶抑制剂，混匀；在4°C低温下100,000g离心 120分钟，倒去上清液，取沉淀分别溶于2. 5毫升0. 5%NP-40,80mMNaCl, 0. 2%Deoxycholate ，50mMTris，pH8.0和蛋白酶抑制剂；在4°C低温下100,000g离心20分钟；取上清液，上样 TSKgelG3000PW，280纳米读数，取在40kDa区域峰值蛋白，-80°C冷冻保存，即得。
[0010] 上述制备方法可以快速批量制备所述的前列腺小体蛋白外泄蛋白抗原，所述方法 稳定可再现，便于推广应用。
[0011] 本发明的另一目的在于保护与上述抗原特异对应的抗体。
[0012] 本发明的再一目的在于保护上述抗原和抗体在制备检测或诊断前列腺癌的试剂 盒中的应用。
[0013] 上述试剂盒可采用现有技术公开的多种制备方法制备而成，本领域技术人员可知 晓，在得到本发明所述前列腺小体外泄蛋白抗原及其抗体的情况下，基于这种特殊抗原及 抗体对前列腺小体外泄蛋白准确的检测作用，无论采用哪种制备方法，都能得到可用于检 测或诊断前列腺癌的试剂盒。
[0014] 本发明优选所述的试剂盒采用ELISA法或胶体金法制备而成。
[0015] 本发明所述的试剂盒包含针对前列腺小体外泄蛋白抗原的单克隆检测抗体、包被 缓冲液、洗涤缓冲液、封闭缓冲液、酶标抗体。具体组成为本领域技术人员所理解，本发明对 此不作特别限定。
[0016] 其中，本发明所述前列腺小体外泄蛋白抗原检测抗体为单克隆鼠抗人前列腺小体 外泄蛋白抗原的抗体。
[0017] 进一步地，该试剂盒还包含标准品和阴性对照；所述标准品为对前列腺小体外泄 蛋白检测抗体产生免疫反应的人前列腺小体外泄蛋白抗原。
[0018] 其中，所述试剂盒包被缓冲液为碳酸盐或dPBS;所述洗涤缓冲液为含洗涤剂的 dPBS。
[0019] 所述检测抗体识别前列腺小体外泄蛋白抗原。
[0020] 本发明所述的试剂盒，使用时，具体的流程如下：
[0021] 1、准备：
[0022] ①从2_8°C冷藏环境中取出试剂盒，将BSA粉剂倒入PBS缓冲液瓶中预制封闭液 (必要时在倒空粉剂后再用移液器把PBS缓冲液吸入BSA粉剂管中，摇匀后再倒入PBS缓冲 液瓶中，以免粉剂粘附在管壁上)，充分混匀。
[0023] ②将20X浓缩清洗液50ml(两瓶）摇匀后完全倒入洗板机的洗液瓶中（如有沉淀 晶体可置于37°C条件下溶解)，再倒入纯化水（电阻率在15MQ以上)，定容至1000ml，充分 混匀。
[0024] 2、编号：从铝箔袋中取出微孔板。A1为空白孔，A2-A6孔包被了阳性标准品的5个 工作浓度：〇.lng;lng;2ng;5ng; 10ng。其余各孔按照需要顺序编号。
[0025] 3、加 样：除阳性标准孔和空白孔外，其余按编号分别在相应的孔中加入尿样(轻拍 微孔板边缘以防止有气泡)。90人份/盒每孔加一个受检人尿样100yl(空白对照孔不进 行加尿样、封闭、加一抗、加二抗等操作，其余各步操作相同）。用封板膜封板后将微孔板放 入37 °C恒温箱(或水浴箱）一小时。
[0026] 4、清洗：在洗板机上用清洗液洗涤5遍(视情况设定每次每孔用清洗液300yl左 右，浸泡时间5秒钟)，将洗过的板取出，必要时在纸巾上拍打，以去除孔内残液(包括后面所 有的拍板都不能用手指抵住板底，以防止影响最后的测定效果)。
[0027] 5、封闭：除空白孔外，在各孔(含阳性标准孔，不含空白对照孔）中加入100yl预 制好的封闭液，用封板膜封板后将微孔板放入37°C恒温箱(或水浴箱）40分钟。
[0028] 6、清洗：在洗板机上用清洗液洗涤5遍(视情况设定每次每孔用清洗液300yl左 右，浸泡时间5秒钟)，将洗过的板取出，必要时在纸巾上拍打，以去除孔内残液。
[0029] 7、加PSEP抗体：给各孔(含阳性标准孔，不含空白对照孔)中加入PSEP抗体50ill (轻拍微孔板边缘以防止有气孔)。用封板膜封板后将微孔板放入37 °C恒温箱(或水浴箱)40 分钟。
[0030] 8、清洗：在洗板机上用清洗液洗涤5遍(视情况设定每次每孔用清洗液300yl左 右，浸泡时间5秒钟)，将洗过的板取出，必要时在纸巾上拍打，以去除孔内残液。
[0031] 9、加酶标抗体：给各孔(含阳性标准孔，不含空白对照孔）中加入酶标抗体lOOyl (轻拍微孔板边缘以防止有气孔)。用封板膜封板后将微孔板放入37 °C恒温箱(或水浴箱)20 分钟。
[0032] 10、清洗：在洗板机上用清洗液洗涤5遍(视情况设定每次每孔用清洗液300yl左 右，浸泡时间5秒钟)，将洗过的板取出，必要时在纸巾上拍打，以去除孔内残液。
[0033] 11、显色：给每孔(含阳性标准孔和空白孔)注入50ill显色液A和50ill显色液B (轻拍微孔板边缘使其混匀并防止有气孔)，将其常温避光放置20分钟。
[0034] 12、终止：给每孔(含阳性标准孔和空白孔）注入50yl终止液(轻拍微孔板边缘使 其混匀并防止有气孔)。
[0035] 13、测定：将微孔板放入酶免分析仪，使用双波长450nm/630nm测定各孔0D值并记 录结果。
[0036] 14、结果判定：根据PSEP抗体检测特点，PSEP阳性结果：用标准曲线评估被测样 本，浓度值> 1. 20ng/ml;
[0037] PSEP阴性结果：用标准曲线评估被测样本，浓度值彡1. 20ng/ml;0D值小于0. 10 无效。
[0038] 本发明提供了一种前列腺小体外泄蛋白抗原及与其特异对应的抗体，并可进一步 得到基于前列腺小体外泄蛋白定量的间接酶联免疫吸附的试剂盒，以有效用于检测和诊断 慢性前列腺炎。前列腺小体（prostasomes)是存在于前列腺液中的直径约30~150纳米 的超微结构，由前列腺上皮或间质细胞等外吐（exocytosis)或外泄（excretion)形成，与 其他组织中的外吐小体（exosome)结构，大小，成分相似但不相同。
[0039] 虽然目前外吐途径，信号传导机制了解甚少，但近年来研究发现，前列腺 小体中存在核酸，蛋白，糖类，脂肪，小分子代谢物等。前列腺小体外泄蛋白（其 命名为prostateexosomalprotein,或简称PSEP)非常多，目前尚未完全鉴定 (Lietal2008;Luetal.，2009;)。本申请从慢性前列腺炎病人分离的前列腺小体为抗原，进 行筛选，获得特异的抗体，是为抗前列腺小体外泄蛋白（PSEP)的鼠抗人抗体，用于进一步 研究其针对慢性前列腺炎检测的灵敏度和特异性。
[0040] 目前诊断前列腺炎症所用EPS方法，用前列腺按摩液，对病人有很大侵犯性和不 适，而本发明基于特殊的前列腺小体外泄蛋白抗原提供的检测方法简便可靠，灵敏度达到 85%，是一种可用于慢性前列腺炎诊断的一种新颖的非侵入性的，无痛分子检验手段。
【附图说明】
[0041] 图1是对PSEP试剂盒准确性检验（R0C曲线分析）的评价，其中横坐标为特异性， 纵坐标为灵敏度。
【具体实施方式】
[0042] 以下对本发明原理和特征进行举实例描述，所举实例只用于解释本发明，并非用 于限定本发明的范围。
[0043] 实施例1
[0044] 前列腺小体外泄蛋白抗原（PSEP)的制备：取500毫升慢性前列腺炎症病人晨尿 中段尿，加入等量ffiPES缓冲液（pH7. 3)和蛋白酶抑制剂（美国Sigma公司），，用纱布过 滤。取过滤液，分别置于10只50毫升离心管，在4°C低温下400g离心10分钟。去沉淀，取 上清液。在4°C低温下10, 000g离心20分钟。去沉淀，取上清液。分别置于200只3毫升 超速离心管，在4°C低温下100,000g离心120分钟。倒去上清液，取沉淀。加入2. 5毫升 TBS缓冲液（pH7. 8)和蛋白酶抑制剂（美国Sigma公司），混匀。在4°C低温下100,000g 离心120分钟。倒去上清液，取沉淀。分别溶于2. 5毫升0. 5%NP-40,80mMNaCl，0. 2%Deoxyc holate，50mMTris，pH8.0和蛋白酶抑制剂（美国Sigma公司）。在4°C低温下100,000g离 心20分钟。取上清液，上样TSKgelG3000PW(美国Sigma公司），280纳米读数，取在40kDa 区域峰值蛋白。-80°C冷冻保存。
[0045] 实施例2
[0046] 本实施例所述试剂盒组成如下：前列腺炎症病人的中段尿液；封闭液；前列腺小 体外泄蛋白抗原（PSEP) ;PSEP检测抗体；清洗液；显色剂；终止液。
[0047] 利用上述试剂盒对前列腺炎的检测或诊断的具体方法如下：
[0048] 1.标本来源：按照"中国泌尿外科疾病诊断治疗指南手册"中前列腺炎的诊断标 准（那彦群etal.，2011)收集前列腺炎症病人的中段尿液213份，选择完全符合临床综合 诊断的慢性前列腺炎176例。年龄16-72岁，平均年龄34岁。正常人体检尿液100份，年 龄20-68岁。平均年龄34岁。尿常规均正常。尿液收取后立即检测，或放-20°C冰箱保存。
[0049] 2.前列腺小体外泄蛋白抗原（PSEP)的制备：取500毫升慢性前列腺炎症病人晨 尿中段尿，加入等量ffiPES缓冲液（pH7. 3)和蛋白酶抑制剂（美国Sigma公司），，用纱布 过滤。取过滤液，分别置于10只50毫升离心管，在4°C低温下400g离心10分钟。去沉淀， 取上清液。在4°C低温下10, 000g离心20分钟。去沉淀，取上清液。分别置于200只3毫 升超速离心管，在4°C低温下100,000g离心120分钟。倒去上清液，取沉淀。加入2. 5毫升 TBS缓冲液（pH7. 8)和蛋白酶抑制剂（美国Sigma公司），混匀。在4°C低温下100,000g 离心120分钟。倒去上清液，取沉淀。分别溶于2. 5毫升0. 5%NP-40,80mMNaCl，0. 2%Deoxyc 11〇13七6,5011111'1^8，口118.0和蛋白酶抑制剂（美国31811^公司）。在4°〇低温下100,00(^离 心20分钟。取上清液，上样TSKgelG3000PW(美国Sigma公司），280纳米读数，取在40kDa 区域峰值蛋白。-80°C冷冻保存。
[0050] 3.PSEP检测抗体的制备：解冻PSEP蛋白，用BCA(美国ThomasFisherScientific) 公司试剂盒测定浓度。取6只BALB/c小鼠，每只第一次注射50微克。2星期后，再次注射。 10天后，取小鼠血液，用PSEP蛋白50纳克铺板的96孔板作ELISA滴度测定。然后作第三 次注射免疫。2星期后滴度达到1:10, 000以上，做第四次加强注射。10天以后，取滴度最 高的2只小鼠的脾脏与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合。取培养细胞上清液对PSEP蛋白 ELISA进行筛选，获得对PSEP特 异抗体克隆株。在RPMI1640+小牛血清扩大培养后用慢性 前列腺炎症尿液验证阳性抗体并对免疫球蛋白分型得到IgG。培养液扩大到3000毫升，取 上清液，加样到蛋白A/G层析柱上进行纯化得到PSEP纯化抗体。
[0051] 2?试剂和仪器：96孔聚苯乙烯检查板由美国Becton-Dickson及美国 ThomasFisherScientific提供；HRP标记的羊抗鼠抗体IgG购自Sigma公司；清洗液、显色 齐U、终止液采用本室配制品，并与上海科华生物技术有限公司产品进行了比较。TMB、过氧化 氢脲、吐温20、柠檬酸、乙酸钠、EDTA、硫代硫酸等均购自国药集团化学试剂苏州有限公司。
[0052] DEM-III自动酶标洗板机，采用北京拓普分析仪器有限公司。酶标仪（680型） 购自BI0-RAD公司。WHS型智能恒湿恒温箱，购自宁波江南仪器厂。微量移液器，采用 Eppendorf,Gilson品牌。
[0053] 二、方法
[0054] 1.ELISA检测：（间接ELISA方法）
[0055] 将稀释为一定比例的PSEP蛋白标准品包被在96孔板中（A2-A6孔），其余孔加尿 液标本，37°C恒温箱孵育1小时，洗板机洗板5次后，加1%BSA封闭，每孔100微升，37°C恒 温箱孵育40分钟，洗板5次。加入特异性PSEP检测抗体，37°C恒温箱孵育40分钟，洗板 后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG，37°C恒温箱孵育20分钟，洗板后避光显色20分钟，加入终 止液，终止反应。用酶标仪测定各反应孔在双波450nm/630nm处的0D值。根据不同浓度的 标准品0D值绘出标准曲线，将病人的数值与阳性标准孔数值比较，从而得出被测试者尿样 本的实际PSEP浓度。
[0056] 2.自配清洗液、显色剂、终止液：清洗液为含0. 05%吐温-20的PBS溶液；显色剂 A含柠檬酸、乙酸钠、过氧化脲；显色剂B含柠檬酸、EDTA、TMB盐酸盐、1%硫代硫酸钠溶液； 终止液为2mol/LH2S04。
[0057] 3.样本检测：用间接ELISA方法检测前列腺炎症和正常人尿样本。根据临床样本 检测真阳性a、假阳性b、假阴性c、真阴性d，求出检测灵敏度、特异度、阳性预期值、阴性预 期值并计算Cutoff值。
[0058] 4?方法学鉴定：
[0059] 4. 1分析精密度：批内变异：用两个浓度水平的样本(炎症和正常人）各重复检测 10次，计算10次测量浓度结果的平均值M和标准差SD，得出变异系数CV。
[0060] 批间差：用3个批号的试剂盒分别检测同样两份标本，各重复10次，计算30次结 果的平均值M和标准差SD，求出变异系数CV。
[0061] 4. 2各组成部分的稳定性实验：检测酶联板、特异性抗体、酶标抗体、显色剂、阳性 标准品等在37°C分别保存3天、5天、7天后所测得的0D值。并将各个组成部分放入4°C冰 箱，每月检测一次，观察有效期限。
[0062] 4. 3正交实验：把特异性结合抗体按照1:50、1:100稀释；酶标抗体按照1:2000、 1:2500、1:3000、1:5000稀释，然后先加样本37°C孵育一小时，洗板封闭后，加不同浓度的 特异性抗体后，37°C孵育40分钟，洗板5次后加入不同浓度的酶标抗体，37°C孵育20分钟 后，洗板显色。根据0D值数据选出最佳的特异抗体和酶标抗体的使用浓度。
[0063] 4. 4样本孵育时间的验证：样本的孵育时间将直接影响测试效果，因此在确定所 用抗体、试剂的前提下测定样本的孵育时间。本实施例比较了不同的孵育时间（2小时、1小 时、40分钟）对检测结果的影响，从而找出对临床检测的最佳孵育时间。
[0064] 4. 5不同显色剂的比较：本实施例用上海科华的显色剂作为对照，检测所配制的 显色剂的显色性能。
[0065] 4. 6不同检测方法的比较（ELISA双抗夹心法和间接法）：检测方法的确定对于检 测效果具有至关重要的作用，在确定了抗体和试剂及测试时间以后必须对检测方法进行筛 选，本实施例比较了双抗夹心法和间接法对检测结果的影响。
[0066] 5.统计学处理：采用SPSS17. 0统计软件进行统计学处理。炎症病人与正常人的 样本差异比较采用秩和检验。P< 0. 05为差异有统计学意义。
[0067] 试验结果
[0068] 一、临床样本检测结果：应用本试验所建立的间接ELISA检测方法，分别对176份 慢性前列腺炎患者的尿样和100例正常人的尿样进行检测，结果如下：慢性前列腺炎患者 经由临床症状，前列腺炎按摩液卵磷脂小体减少，无其他相关疾病为参照。正常人群参照为 无临床症状，尿常规正常。
[0069] 表1慢性前列腺炎患者和对照人群中PSEP蛋白含量对照
[0081] *表注：PSEP含量为ng/ml，根据检测吸光度的0D值，由标准曲线换算获得。同时， 每个数据重复三次测量，取平均值计算。
[0082] 表2患者和正常人群中PESP含量比较（ng/ml)
[0085] * 表注：Z=10. 74P〈0. 05
[0086] 患者和对照人群中PSEP含量数据分析显示，就目前数据而言，PSEP含量在前列 腺炎患者中和正常人中呈非正态分布。采用秩和检验对两组数据加以比较，显示患者和对 照组中PSEP含量的分布存在显着性差异，患者样本中检测到的PSEP的浓度高于对照组中 PSEP的浓度。
[0087] 根据图1，从本研究得出，如果临界点设置为1. 17ng/ml，PSEP试剂盒检测慢性前 列腺炎症的灵敏度可达82. 39%，特异性可达87%。在R0C区域下面积可达0.89.表示PSEP 试剂盒对慢性前列腺炎具有较好的诊断价值。
[0088] 表3R0C曲线不同截断点的灵敏度和特异度
[0090] 选择Youden指数最大的点对应的介值作为慢性前列腺炎的诊断标准，得出PSEP 的诊断点为1. 17ng/ml。
[0091] 表4以PSEP抗体检测慢性前列腺炎的灵敏度和特异度
[0093] 二、PSEP检测方法学鉴定
[0094] 1.分析精密度：用两个浓度水平的样本(慢性前列腺炎阳性和阴性）各重复检测 10次，计算10次测量浓度结果（0D)的平均值M和标准差SD，得出变异系数CV小于8%。用 3个批号的试剂盒分别检测同样两份标本，（阳性和阴性)各重复10次，计算30次结果的平 均值M和标准差SD，其变异系数CV为10. 1%。结果见表5。从以下数据可以看出该试剂盒 反应体系具有良好的精密度。
[0095] 表5反应体系的精密度检测
[0098] 2.试剂盒在37°C条件下稳定性的评价：将组装好的前列腺炎PSEP蛋白检测试剂 盒置于37°C进行加速破坏试验，结果见表6。发现在37°C恒温箱中7天时，其阳性样本0D 值为当天配制试剂检测的81%，P/N>4。如按照每次的标准曲线换算为ng值，7天后的阳性 样本数值仍是〇天的阳性样本数值的96%。从实验结果可以看出37°C保存7天后，实验结 果基本保持稳定。包被在酶联板上的抗原标准品分别放入37°C恒温箱3天、5天、7天后， 阳性标准品的标准曲线R 2值都大于0. 99。有文献指出37°C每保存一天相当于4°C保存45 天，所以可以推算试剂盒主要成分可以在低温保存多月而保持稳定。
[0099] 表637°C破坏性试验结果
[0101] 3.试剂盒在4°C条件下保存的稳定性实验评价：
[0102] 本实施例进一步将前列腺炎PSEPELISA试剂盒置4°C条件下干燥保存，每月定期 抽检直至12个月，检测前列腺炎阳性样本和正常人样本。结果见表7。从表中数据可见 1-12月，阳性样本ng值每月无明显降低，阴性样本数值稳定，均在lng以下。P/NM.7。各 月的标准品曲线R 2值都在〇. 99以上，非常接近1。在保存12个月后，阳性 样本ng值依然 达到正常情况的90%。说明试剂盒各个成分在低温保存12个月可以保持稳定。
[0103] 表7试剂盒4°C保存实验
[0105]
[0106] 4. PSEP特异结合抗体与酶标抗体最佳稀释度的选择：
[0107] 选择不同浓度的PSEP特异结合抗体与酶标抗体对检测结果的影响见表8。
[0108] 表8不同浓度PSEP特异结合抗体和酶标抗体的反应结果
[0110] 从表中我们可以看出，当酶标抗体浓度高时，阴性样本0D值偏高，容易导致假阳 性出现；而当酶标抗体浓度在1:5000比例稀释时，阳性样本数值偏低。综合考虑，选择PSEP 特异结合抗体1: 1〇〇稀释，酶标抗体1:2500稀释为好。
[0111] 5.不同孵育时间对检测结果的影响：
[0112] 本实施例比较了三个不同孵育时间对检测结果的影响。发现对阳性样本来说。 37°C孵育2h与lh没有明显差异，p > 0. 05。37°C孵育2h与40分钟相比，有显着差异，p < 0. 05。对阴性样本来说，37°C孵育2h与lh和40分钟之间相比，均无差异，p > 0. 05。故 检测试剂盒的温育时间选择为37°C lh。
[0113] 表9不同孵育时间对结果的影响
[0114] 孵育时间
[0116]
[0117] P :positive (阳性）；N:negative (阴性）
[0118] 6.自配显色剂与上海科华公司显色剂的比较：我们用自配显色剂测出的病人和 正常人样本的0D值均高于外购的上海科华公司显色液测出的0D值，但二者间无统计学差 异，P>0. 05,说明自配的显色液有很好的显色效果。
[0119] 表10自配显色剂与上海科华公司显色剂的比较（0D)
[0121] 从以上结果可以看出前列腺炎患者和对照组正常人尿液中PSEP含量的分布存在 显着性差异，患者样本中检测到的PSEP的浓度明显高于对照组中PSEP的浓度。PSEP外泌 蛋白的检测可以为临床前列腺炎诊断提供一个可靠的根据。同时该试剂盒经过严格的37°C 毁损实验和4°C条件下长时间保存实验，检测结果稳定，符合国家食品药品监督局体外诊断 试剂考核标准。
[0122] 慢性骨盆疼痛综合征/慢性前列腺炎（CPPS/CP)是泌尿科男性就诊主要疾病之 一，更是影响中青年男性健康的常见病。它们是一种不均一性的综合症，定义为"在过去6 个月里至少有3个月骨盆区域不适或疼痛，附带泌尿/生殖系统功能失调"并且没有任何 可鉴别的癌症，感染以及解剖异常病理存在。它们还常常导致消极认知，行为，性，或情绪低 下。另外，癌症基因组景观研究令人信服地证明促癌基因突变从青年时代即已经开始类集。 慢性骨盆疼痛综合征/慢性前列腺炎常见于20~50岁男性，多年以后才会体现前列腺癌 症症状。按照在前列腺癌中，炎症的存在及细胞上皮组织损伤后再生被认为是恶性转化的 关键因素。显然，早期诊治慢性骨盆疼痛综合征/慢性前列腺炎对减少或防治前列腺癌具 有重大意义。
[0123] 目前，慢性骨盆疼痛综合征/慢性前列腺炎诊断主要基于临床经验和症状剔除。 临床检测中没有任何简便可行的分子或免疫方法来用于指导或辅助诊断，导致临床诊断主 观，不准确和误诊。这不仅进一步导致治疗困难，也不利寻找治疗用新药开发。所以，本发 明基于PSEP的尿液检测试剂盒是全球首创的慢性骨盆疼痛综合征/慢性前列腺炎分子免 疫诊断试剂盒，经反应体系的精密度检测，稳定性试验，破坏性检验其试剂质量都显示高度 可批量生产。其应用是真正非侵入性的，易于操作，简便，并且具有高灵敏度和特异性。它 将不仅减轻由于慢性骨盆疼痛综合征/慢性前列腺炎的病者痛苦，而且早期诊治将会进一 步加强对前列腺癌的防治，具有广泛的应用前景。
[0124] 虽然，上面以最佳实施例详细说明了本发明，但本领域技术人员应当知晓，在不偏 离本发明思想和精神的前提下，对本发明做出的任何改进和修饰，仍属于本发明要求保护 的范围之内。
【主权项】
1. 一种前列腺小体外泄蛋白抗原，其特征在于，采用如下方法制备而成： 取500毫升慢性前列腺炎症病人晨尿中段尿，加入等量pH7. 3的HEPES缓冲液和蛋白 酶抑制剂，用纱布过滤；取过滤液分别置于10只50毫升离心管，在4°C低温下400g离心 10分钟，去沉淀，取上清液在4°C低温下10,OOOg离心20分钟，去沉淀，取上清液分别置于 200只3毫升超速离心管，在4°C低温下100,OOOg离心120分钟；倒去上清液，取沉淀加入 2. 5毫升pH7. 8的TBS缓冲液和蛋白酶抑制剂，混匀；在4°C低温下100,000g离心120分 钟，倒去上清液，取沉淀分别溶于2. 5毫升0.5 %NP_40,80mMNaCl, 0.2%Deoxycholate, 50mMTris，pH8. 0和蛋白酶抑制剂；在4°C低温下100,OOOg离心20分钟；取上清液， 上样TSKgelG3000PW，280纳米读数，取在40kDa区域峰值蛋白，-80°C冷冻保存，即得。2. -种前列腺小体外泄蛋白抗原的制备方法，其特征在于， 取500毫升慢性前列腺炎症病人晨尿中段尿，加入等量pH7. 3的HEPES缓冲液和蛋白 酶抑制剂，用纱布过滤；取过滤液分别置于10只50毫升离心管，在4°C低温下400g离心 10分钟，去沉淀，取上清液在4°C低温下10,OOOg离心20分钟，去沉淀，取上清液分别置于 200只3毫升超速离心管，在4°C低温下100,OOOg离心120分钟；倒去上清液，取沉淀加入 2. 5毫升pH7. 8的TBS缓冲液和蛋白酶抑制剂，混匀；在4°C低温下100,000g离心120分 钟，倒去上清液，取沉淀分别溶于2. 5毫升0.5 %NP_40,80mMNaCl, 0.2%Deoxycholate, 50mMTris，pH8. 0和蛋白酶抑制剂；在4°C低温下100,OOOg离心20分钟；取上清液， 上样TSKgelG3000PW，280纳米读数，取在40kDa区域峰值蛋白，-80°C冷冻保存，即得。3. -种与权利要求1所述抗原特异对应的抗体。4. 权利要求1所述抗原和权利要求3所述抗体在制备检测或诊断前列腺癌的试剂盒中 的应用。5. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒采用ELISA法或胶体金法 制备而成。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒包含针对前列腺小体外泄 蛋白抗原的单克隆检测抗体、包被缓冲液、洗涤缓冲液、封闭缓冲液、酶标抗体。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：其特征在于，前列腺小体外泄蛋白抗原检 测抗体为单克隆鼠抗人前列腺小体外泄蛋白抗原的抗体。8. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：其特征在于，还包含标准品和阴性对照； 所述标准品为对前列腺小体外泄蛋白检测抗体产生免疫反应的人前列腺小体外泄蛋白抗 原。9. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述包被缓冲液为碳酸盐或dPBS;所述 洗涤缓冲液为含洗涤剂的dPBS。10. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述检测抗体识别前列腺小体外泄蛋 白抗原。
【专利摘要】本发明涉及一种前列腺小体外泄蛋白抗原、与其特异对应的抗体及应用，并以此为基础进一步得到基于前列腺小体外泄蛋白定量的间接酶联免疫吸附的试剂盒，以有效用于检测和诊断慢性前列腺炎。该基于PSEP抗体-抗原反应的尿液检测试剂盒经反应体系的精密度检测，稳定性试验，破坏性检验其试剂质量都显示高度可批量生产。其应用是真正非侵入性的，易于操作，简便，并且具有高灵敏度和特异性。它将不仅减轻由于慢性骨盆疼痛综合征/慢性前列腺炎的病者痛苦，而且早期诊治将会进一步加强对前列腺癌的防治，具有广泛的应用前景。
【IPC分类】G01N33/577, G01N33/68
【公开号】CN104897900
【申请号】CN201410074972
【发明人】钱泽, 陆群, 曾燕, 张娇
【申请人】昂科生物医学技术(苏州)有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月3日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种前列腺小体外泄蛋白抗原，具体涉及一种该前列腺小体外泄蛋白 抗原及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 慢性前列腺炎（ChronicProstatitis，CP)是泌尿外科中青年男性最常见的疾病 之一，据报道其占门诊量的30%。据流行病学调查，我国成人男性人群中，10%以上有前列腺 炎样症状，50%男性不同时期均患过前列腺炎。说明潜在的慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛 (CPPS)患者众多。同时，由化学品、物理因素或生物制剂引起的炎症过程还是人类癌症的发 病机制中重要因子。在前列腺癌中，炎症的存在及细胞上皮组织损伤后再生被认为是恶性 转化的关键因素（DeMarzoetal.，2007)。前列腺组织受到炎性细胞的浸润，从而释放出各种 活性物质，这些物质的释放还与细菌及病毒感染、尿酸增高及食用前列腺致癌物有关。在过 去10年中，炎症和癌症之间的联系，以及前列腺炎作为前列腺癌高危因素的假说已经在流 行病学、临床、形态学、病原学、细胞和分子水平上进行充分的研究并得到证实。事实上，文 献中指出，大约12%以上前列腺炎症，如不及时治疗可转化为前列腺癌。所以前列腺炎严重 影响男性健康（陈智彬etal.，2009 ;那彦群etal.，2011)。
[0003] 前列腺炎临床表现因患者个体差异而缺乏特异性，因此在临床上治疗效果一直 不满意（Kriegeretal.，1999 ;Engeleretal.，2012 ;那彦群etal.，2011)。根据 1997 年 美国国立卫生研究院（NIH)对前列腺炎的分类，即NIH分类法（Kriegeretal.,1999;陈 智彬etal.，2009)，包括I型：急性细菌性前列腺炎（ABP) ;II型：慢性细菌性前列腺炎 (CBP) ;111型：又分为IIIA，慢性非细菌性前列腺炎（CAP)和IIIB，慢性骨盆疼痛综合征 (CPPS) ;IV型：无症状的炎症性前列腺炎（AIP)。临床实践中，通常以III型慢性前列腺炎多 见，约占90%左右，所以慢性前列腺炎主要指的是III型慢性前列腺炎。在临床实际工作中， 泌尿男科医师对首诊的CAP和CPPS患者选择的检查方法（多选）前3位是尿常规（80. 3%)、 前列腺按摩液检查（71. 0%)、体检（包括直肠指检）（63. 2%)。前列腺按摩液检查和直肠指 检对患者有一定侵入性，而大多数诊断却仍然依赖于临床表征和医生经验，因此非常需要 简便无侵入性，同时准确可靠的分子诊断方法。
[0004] 中国申请CN102998455A公开了 一种检测或诊断前列腺癌的试剂盒，其包含 5 -catenin吸附抗体、包被缓冲液、洗漆缓冲液、封闭缓冲液、5 -catenin检测抗体、酶标 抗体。或包含S-catenin吸附抗体、包被缓冲液、洗漆缓冲液、封闭缓冲液、S-catenin检 测抗体、纳米量子点标记。所述试剂盒能够从病人尿液中用ELISA方法检测与前列腺癌成 高度相关性的S-catenin蛋白，而且ELISA方法成熟，敏感性和特异性较高，对病人是非侵 袭性的，能够重复采取，病人乐于接受。纳米量子点（QD)标记法取样量小，将ELISA方法中 所用的抗体与QD结合，能更灵敏地检测尿液中S-catenin蛋白的变化，从而用于诊断前列 腺癌。但是，该试剂盒仅适用于前列腺癌检测，不能很好区分慢性前列腺炎症病人和正常人 样品，故不适用于前列腺炎症检测。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一目的即在于提供一种可用于前列腺炎症检测的前列腺小体外泄蛋 白抗原。
[0006] 本发明所述的前列腺小体外泄蛋白抗原，采用如下方法制备而成：
[0007] 取500毫升慢性前列腺炎症病人晨尿中段尿，加入等量pH7. 3的HEPES缓冲液和 蛋白酶抑制剂，用纱布过滤；取过滤液分别置于10只50毫升离心管，在4°C低温下400g 离心10分钟，去沉淀，取上清液在4°C低温下10, 000g离心20分钟，去沉淀，取上清液分别 置于200只3毫升超速离心管，在4°C低温下100,000g离心120分钟；倒去上清液，取沉淀 加入2. 5毫升pH7. 8的TBS缓冲液和蛋白酶抑制剂，混匀；在4°C低温下100,000g离心 120分钟，倒去上清液，取沉淀分别溶于2. 5毫升0. 5%NP-40,80mMNaCl, 0. 2%Deoxycholate ，50mMTris，pH8.0和蛋白酶抑制剂；在4°C低温下100,000g离心20分钟；取上清液，上样 TSKgelG3000PW，280纳米读数，取在40kDa区域峰值蛋白，-80°C冷冻保存，即得。
[0008] 同时，本发明进一步保护了上述前列腺小体外泄蛋白抗原的制备方法：
[0009] 取500毫升慢性前列腺炎症病人晨尿中段尿，加入等量pH7. 3的HEPES缓冲液和 蛋白酶抑制剂，用纱布过滤；取过滤液分别置于10只50毫升离心管，在4°C低温下400g 离心10分钟，去沉淀，取上清液在4°C低温下10, 000g离心20分钟，去沉淀，取上清液分别 置于200只3毫升超速离心管，在4°C低温下100,000g离心120分钟；倒去上清液，取沉淀 加入2. 5毫升pH7. 8的TBS缓冲液和蛋白酶抑制剂，混匀；在4°C低温下100,000g离心 120分钟，倒去上清液，取沉淀分别溶于2. 5毫升0. 5%NP-40,80mMNaCl, 0. 2%Deoxycholate ，50mMTris，pH8.0和蛋白酶抑制剂；在4°C低温下100,000g离心20分钟；取上清液，上样 TSKgelG3000PW，280纳米读数，取在40kDa区域峰值蛋白，-80°C冷冻保存，即得。
[0010] 上述制备方法可以快速批量制备所述的前列腺小体蛋白外泄蛋白抗原，所述方法 稳定可再现，便于推广应用。
[0011] 本发明的另一目的在于保护与上述抗原特异对应的抗体。
[0012] 本发明的再一目的在于保护上述抗原和抗体在制备检测或诊断前列腺癌的试剂 盒中的应用。
[0013] 上述试剂盒可采用现有技术公开的多种制备方法制备而成，本领域技术人员可知 晓，在得到本发明所述前列腺小体外泄蛋白抗原及其抗体的情况下，基于这种特殊抗原及 抗体对前列腺小体外泄蛋白准确的检测作用，无论采用哪种制备方法，都能得到可用于检 测或诊断前列腺癌的试剂盒。
[0014] 本发明优选所述的试剂盒采用ELISA法或胶体金法制备而成。
[0015] 本发明所述的试剂盒包含针对前列腺小体外泄蛋白抗原的单克隆检测抗体、包被 缓冲液、洗涤缓冲液、封闭缓冲液、酶标抗体。具体组成为本领域技术人员所理解，本发明对 此不作特别限定。
[0016] 其中，本发明所述前列腺小体外泄蛋白抗原检测抗体为单克隆鼠抗人前列腺小体 外泄蛋白抗原的抗体。
[0017] 进一步地，该试剂盒还包含标准品和阴性对照；所述标准品为对前列腺小体外泄 蛋白检测抗体产生免疫反应的人前列腺小体外泄蛋白抗原。
[0018] 其中，所述试剂盒包被缓冲液为碳酸盐或dPBS;所述洗涤缓冲液为含洗涤剂的 dPBS。
[0019] 所述检测抗体识别前列腺小体外泄蛋白抗原。
[0020] 本发明所述的试剂盒，使用时，具体的流程如下：
[0021] 1、准备：
[0022] ①从2_8°C冷藏环境中取出试剂盒，将BSA粉剂倒入PBS缓冲液瓶中预制封闭液 (必要时在倒空粉剂后再用移液器把PBS缓冲液吸入BSA粉剂管中，摇匀后再倒入PBS缓冲 液瓶中，以免粉剂粘附在管壁上)，充分混匀。
[0023] ②将20X浓缩清洗液50ml(两瓶）摇匀后完全倒入洗板机的洗液瓶中（如有沉淀 晶体可置于37°C条件下溶解)，再倒入纯化水（电阻率在15MQ以上)，定容至1000ml，充分 混匀。
[0024] 2、编号：从铝箔袋中取出微孔板。A1为空白孔，A2-A6孔包被了阳性标准品的5个 工作浓度：〇.lng;lng;2ng;5ng; 10ng。其余各孔按照需要顺序编号。
[0025] 3、加 样：除阳性标准孔和空白孔外，其余按编号分别在相应的孔中加入尿样(轻拍 微孔板边缘以防止有气泡)。90人份/盒每孔加一个受检人尿样100yl(空白对照孔不进 行加尿样、封闭、加一抗、加二抗等操作，其余各步操作相同）。用封板膜封板后将微孔板放 入37 °C恒温箱(或水浴箱）一小时。
[0026] 4、清洗：在洗板机上用清洗液洗涤5遍(视情况设定每次每孔用清洗液300yl左 右，浸泡时间5秒钟)，将洗过的板取出，必要时在纸巾上拍打，以去除孔内残液(包括后面所 有的拍板都不能用手指抵住板底，以防止影响最后的测定效果)。
[0027] 5、封闭：除空白孔外，在各孔(含阳性标准孔，不含空白对照孔）中加入100yl预 制好的封闭液，用封板膜封板后将微孔板放入37°C恒温箱(或水浴箱）40分钟。
[0028] 6、清洗：在洗板机上用清洗液洗涤5遍(视情况设定每次每孔用清洗液300yl左 右，浸泡时间5秒钟)，将洗过的板取出，必要时在纸巾上拍打，以去除孔内残液。
[0029] 7、加PSEP抗体：给各孔(含阳性标准孔，不含空白对照孔)中加入PSEP抗体50ill (轻拍微孔板边缘以防止有气孔)。用封板膜封板后将微孔板放入37 °C恒温箱(或水浴箱)40 分钟。
[0030] 8、清洗：在洗板机上用清洗液洗涤5遍(视情况设定每次每孔用清洗液300yl左 右，浸泡时间5秒钟)，将洗过的板取出，必要时在纸巾上拍打，以去除孔内残液。
[0031] 9、加酶标抗体：给各孔(含阳性标准孔，不含空白对照孔）中加入酶标抗体lOOyl (轻拍微孔板边缘以防止有气孔)。用封板膜封板后将微孔板放入37 °C恒温箱(或水浴箱)20 分钟。
[0032] 10、清洗：在洗板机上用清洗液洗涤5遍(视情况设定每次每孔用清洗液300yl左 右，浸泡时间5秒钟)，将洗过的板取出，必要时在纸巾上拍打，以去除孔内残液。
[0033] 11、显色：给每孔(含阳性标准孔和空白孔)注入50ill显色液A和50ill显色液B (轻拍微孔板边缘使其混匀并防止有气孔)，将其常温避光放置20分钟。
[0034] 12、终止：给每孔(含阳性标准孔和空白孔）注入50yl终止液(轻拍微孔板边缘使 其混匀并防止有气孔)。
[0035] 13、测定：将微孔板放入酶免分析仪，使用双波长450nm/630nm测定各孔0D值并记 录结果。
[0036] 14、结果判定：根据PSEP抗体检测特点，PSEP阳性结果：用标准曲线评估被测样 本，浓度值> 1. 20ng/ml;
[0037] PSEP阴性结果：用标准曲线评估被测样本，浓度值彡1. 20ng/ml;0D值小于0. 10 无效。
[0038] 本发明提供了一种前列腺小体外泄蛋白抗原及与其特异对应的抗体，并可进一步 得到基于前列腺小体外泄蛋白定量的间接酶联免疫吸附的试剂盒，以有效用于检测和诊断 慢性前列腺炎。前列腺小体（prostasomes)是存在于前列腺液中的直径约30~150纳米 的超微结构，由前列腺上皮或间质细胞等外吐（exocytosis)或外泄（excretion)形成，与 其他组织中的外吐小体（exosome)结构，大小，成分相似但不相同。
[0039] 虽然目前外吐途径，信号传导机制了解甚少，但近年来研究发现，前列腺 小体中存在核酸，蛋白，糖类，脂肪，小分子代谢物等。前列腺小体外泄蛋白（其 命名为prostateexosomalprotein,或简称PSEP)非常多，目前尚未完全鉴定 (Lietal2008;Luetal.，2009;)。本申请从慢性前列腺炎病人分离的前列腺小体为抗原，进 行筛选，获得特异的抗体，是为抗前列腺小体外泄蛋白（PSEP)的鼠抗人抗体，用于进一步 研究其针对慢性前列腺炎检测的灵敏度和特异性。
[0040] 目前诊断前列腺炎症所用EPS方法，用前列腺按摩液，对病人有很大侵犯性和不 适，而本发明基于特殊的前列腺小体外泄蛋白抗原提供的检测方法简便可靠，灵敏度达到 85%，是一种可用于慢性前列腺炎诊断的一种新颖的非侵入性的，无痛分子检验手段。
【附图说明】
[0041] 图1是对PSEP试剂盒准确性检验（R0C曲线分析）的评价，其中横坐标为特异性， 纵坐标为灵敏度。
【具体实施方式】
[0042] 以下对本发明原理和特征进行举实例描述，所举实例只用于解释本发明，并非用 于限定本发明的范围。
[0043] 实施例1
[0044] 前列腺小体外泄蛋白抗原（PSEP)的制备：取500毫升慢性前列腺炎症病人晨尿 中段尿，加入等量ffiPES缓冲液（pH7. 3)和蛋白酶抑制剂（美国Sigma公司），，用纱布过 滤。取过滤液，分别置于10只50毫升离心管，在4°C低温下400g离心10分钟。去沉淀，取 上清液。在4°C低温下10, 000g离心20分钟。去沉淀，取上清液。分别置于200只3毫升 超速离心管，在4°C低温下100,000g离心120分钟。倒去上清液，取沉淀。加入2. 5毫升 TBS缓冲液（pH7. 8)和蛋白酶抑制剂（美国Sigma公司），混匀。在4°C低温下100,000g 离心120分钟。倒去上清液，取沉淀。分别溶于2. 5毫升0. 5%NP-40,80mMNaCl，0. 2%Deoxyc holate，50mMTris，pH8.0和蛋白酶抑制剂（美国Sigma公司）。在4°C低温下100,000g离 心20分钟。取上清液，上样TSKgelG3000PW(美国Sigma公司），280纳米读数，取在40kDa 区域峰值蛋白。-80°C冷冻保存。
[0045] 实施例2
[0046] 本实施例所述试剂盒组成如下：前列腺炎症病人的中段尿液；封闭液；前列腺小 体外泄蛋白抗原（PSEP) ;PSEP检测抗体；清洗液；显色剂；终止液。
[0047] 利用上述试剂盒对前列腺炎的检测或诊断的具体方法如下：
[0048] 1.标本来源：按照"中国泌尿外科疾病诊断治疗指南手册"中前列腺炎的诊断标 准（那彦群etal.，2011)收集前列腺炎症病人的中段尿液213份，选择完全符合临床综合 诊断的慢性前列腺炎176例。年龄16-72岁，平均年龄34岁。正常人体检尿液100份，年 龄20-68岁。平均年龄34岁。尿常规均正常。尿液收取后立即检测，或放-20°C冰箱保存。
[0049] 2.前列腺小体外泄蛋白抗原（PSEP)的制备：取500毫升慢性前列腺炎症病人晨 尿中段尿，加入等量ffiPES缓冲液（pH7. 3)和蛋白酶抑制剂（美国Sigma公司），，用纱布 过滤。取过滤液，分别置于10只50毫升离心管，在4°C低温下400g离心10分钟。去沉淀， 取上清液。在4°C低温下10, 000g离心20分钟。去沉淀，取上清液。分别置于200只3毫 升超速离心管，在4°C低温下100,000g离心120分钟。倒去上清液，取沉淀。加入2. 5毫升 TBS缓冲液（pH7. 8)和蛋白酶抑制剂（美国Sigma公司），混匀。在4°C低温下100,000g 离心120分钟。倒去上清液，取沉淀。分别溶于2. 5毫升0. 5%NP-40,80mMNaCl，0. 2%Deoxyc 11〇13七6,5011111'1^8，口118.0和蛋白酶抑制剂（美国31811^公司）。在4°〇低温下100,00(^离 心20分钟。取上清液，上样TSKgelG3000PW(美国Sigma公司），280纳米读数，取在40kDa 区域峰值蛋白。-80°C冷冻保存。
[0050] 3.PSEP检测抗体的制备：解冻PSEP蛋白，用BCA(美国ThomasFisherScientific) 公司试剂盒测定浓度。取6只BALB/c小鼠，每只第一次注射50微克。2星期后，再次注射。 10天后，取小鼠血液，用PSEP蛋白50纳克铺板的96孔板作ELISA滴度测定。然后作第三 次注射免疫。2星期后滴度达到1:10, 000以上，做第四次加强注射。10天以后，取滴度最 高的2只小鼠的脾脏与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合。取培养细胞上清液对PSEP蛋白 ELISA进行筛选，获得对PSEP特 异抗体克隆株。在RPMI1640+小牛血清扩大培养后用慢性 前列腺炎症尿液验证阳性抗体并对免疫球蛋白分型得到IgG。培养液扩大到3000毫升，取 上清液，加样到蛋白A/G层析柱上进行纯化得到PSEP纯化抗体。
[0051] 2?试剂和仪器：96孔聚苯乙烯检查板由美国Becton-Dickson及美国 ThomasFisherScientific提供；HRP标记的羊抗鼠抗体IgG购自Sigma公司；清洗液、显色 齐U、终止液采用本室配制品，并与上海科华生物技术有限公司产品进行了比较。TMB、过氧化 氢脲、吐温20、柠檬酸、乙酸钠、EDTA、硫代硫酸等均购自国药集团化学试剂苏州有限公司。
[0052] DEM-III自动酶标洗板机，采用北京拓普分析仪器有限公司。酶标仪（680型） 购自BI0-RAD公司。WHS型智能恒湿恒温箱，购自宁波江南仪器厂。微量移液器，采用 Eppendorf,Gilson品牌。
[0053] 二、方法
[0054] 1.ELISA检测：（间接ELISA方法）
[0055] 将稀释为一定比例的PSEP蛋白标准品包被在96孔板中（A2-A6孔），其余孔加尿 液标本，37°C恒温箱孵育1小时，洗板机洗板5次后，加1%BSA封闭，每孔100微升，37°C恒 温箱孵育40分钟，洗板5次。加入特异性PSEP检测抗体，37°C恒温箱孵育40分钟，洗板 后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG，37°C恒温箱孵育20分钟，洗板后避光显色20分钟，加入终 止液，终止反应。用酶标仪测定各反应孔在双波450nm/630nm处的0D值。根据不同浓度的 标准品0D值绘出标准曲线，将病人的数值与阳性标准孔数值比较，从而得出被测试者尿样 本的实际PSEP浓度。
[0056] 2.自配清洗液、显色剂、终止液：清洗液为含0. 05%吐温-20的PBS溶液；显色剂 A含柠檬酸、乙酸钠、过氧化脲；显色剂B含柠檬酸、EDTA、TMB盐酸盐、1%硫代硫酸钠溶液； 终止液为2mol/LH2S04。
[0057] 3.样本检测：用间接ELISA方法检测前列腺炎症和正常人尿样本。根据临床样本 检测真阳性a、假阳性b、假阴性c、真阴性d，求出检测灵敏度、特异度、阳性预期值、阴性预 期值并计算Cutoff值。
[0058] 4?方法学鉴定：
[0059] 4. 1分析精密度：批内变异：用两个浓度水平的样本(炎症和正常人）各重复检测 10次，计算10次测量浓度结果的平均值M和标准差SD，得出变异系数CV。
[0060] 批间差：用3个批号的试剂盒分别检测同样两份标本，各重复10次，计算30次结 果的平均值M和标准差SD，求出变异系数CV。
[0061] 4. 2各组成部分的稳定性实验：检测酶联板、特异性抗体、酶标抗体、显色剂、阳性 标准品等在37°C分别保存3天、5天、7天后所测得的0D值。并将各个组成部分放入4°C冰 箱，每月检测一次，观察有效期限。
[0062] 4. 3正交实验：把特异性结合抗体按照1:50、1:100稀释；酶标抗体按照1:2000、 1:2500、1:3000、1:5000稀释，然后先加样本37°C孵育一小时，洗板封闭后，加不同浓度的 特异性抗体后，37°C孵育40分钟，洗板5次后加入不同浓度的酶标抗体，37°C孵育20分钟 后，洗板显色。根据0D值数据选出最佳的特异抗体和酶标抗体的使用浓度。
[0063] 4. 4样本孵育时间的验证：样本的孵育时间将直接影响测试效果，因此在确定所 用抗体、试剂的前提下测定样本的孵育时间。本实施例比较了不同的孵育时间（2小时、1小 时、40分钟）对检测结果的影响，从而找出对临床检测的最佳孵育时间。
[0064] 4. 5不同显色剂的比较：本实施例用上海科华的显色剂作为对照，检测所配制的 显色剂的显色性能。
[0065] 4. 6不同检测方法的比较（ELISA双抗夹心法和间接法）：检测方法的确定对于检 测效果具有至关重要的作用，在确定了抗体和试剂及测试时间以后必须对检测方法进行筛 选，本实施例比较了双抗夹心法和间接法对检测结果的影响。
[0066] 5.统计学处理：采用SPSS17. 0统计软件进行统计学处理。炎症病人与正常人的 样本差异比较采用秩和检验。P< 0. 05为差异有统计学意义。
[0067] 试验结果
[0068] 一、临床样本检测结果：应用本试验所建立的间接ELISA检测方法，分别对176份 慢性前列腺炎患者的尿样和100例正常人的尿样进行检测，结果如下：慢性前列腺炎患者 经由临床症状，前列腺炎按摩液卵磷脂小体减少，无其他相关疾病为参照。正常人群参照为 无临床症状，尿常规正常。
[0069] 表1慢性前列腺炎患者和对照人群中PSEP蛋白含量对照
[0081] *表注：PSEP含量为ng/ml，根据检测吸光度的0D值，由标准曲线换算获得。同时， 每个数据重复三次测量，取平均值计算。
[0082] 表2患者和正常人群中PESP含量比较（ng/ml)
[0085] * 表注：Z=10. 74P〈0. 05
[0086] 患者和对照人群中PSEP含量数据分析显示，就目前数据而言，PSEP含量在前列 腺炎患者中和正常人中呈非正态分布。采用秩和检验对两组数据加以比较，显示患者和对 照组中PSEP含量的分布存在显着性差异，患者样本中检测到的PSEP的浓度高于对照组中 PSEP的浓度。
[0087] 根据图1，从本研究得出，如果临界点设置为1. 17ng/ml，PSEP试剂盒检测慢性前 列腺炎症的灵敏度可达82. 39%，特异性可达87%。在R0C区域下面积可达0.89.表示PSEP 试剂盒对慢性前列腺炎具有较好的诊断价值。
[0088] 表3R0C曲线不同截断点的灵敏度和特异度
[0090] 选择Youden指数最大的点对应的介值作为慢性前列腺炎的诊断标准，得出PSEP 的诊断点为1. 17ng/ml。
[0091] 表4以PSEP抗体检测慢性前列腺炎的灵敏度和特异度
[0093] 二、PSEP检测方法学鉴定
[0094] 1.分析精密度：用两个浓度水平的样本(慢性前列腺炎阳性和阴性）各重复检测 10次，计算10次测量浓度结果（0D)的平均值M和标准差SD，得出变异系数CV小于8%。用 3个批号的试剂盒分别检测同样两份标本，（阳性和阴性)各重复10次，计算30次结果的平 均值M和标准差SD，其变异系数CV为10. 1%。结果见表5。从以下数据可以看出该试剂盒 反应体系具有良好的精密度。
[0095] 表5反应体系的精密度检测
[0098] 2.试剂盒在37°C条件下稳定性的评价：将组装好的前列腺炎PSEP蛋白检测试剂 盒置于37°C进行加速破坏试验，结果见表6。发现在37°C恒温箱中7天时，其阳性样本0D 值为当天配制试剂检测的81%，P/N>4。如按照每次的标准曲线换算为ng值，7天后的阳性 样本数值仍是〇天的阳性样本数值的96%。从实验结果可以看出37°C保存7天后，实验结 果基本保持稳定。包被在酶联板上的抗原标准品分别放入37°C恒温箱3天、5天、7天后， 阳性标准品的标准曲线R 2值都大于0. 99。有文献指出37°C每保存一天相当于4°C保存45 天，所以可以推算试剂盒主要成分可以在低温保存多月而保持稳定。
[0099] 表637°C破坏性试验结果
[0101] 3.试剂盒在4°C条件下保存的稳定性实验评价：
[0102] 本实施例进一步将前列腺炎PSEPELISA试剂盒置4°C条件下干燥保存，每月定期 抽检直至12个月，检测前列腺炎阳性样本和正常人样本。结果见表7。从表中数据可见 1-12月，阳性样本ng值每月无明显降低，阴性样本数值稳定，均在lng以下。P/NM.7。各 月的标准品曲线R 2值都在〇. 99以上，非常接近1。在保存12个月后，阳性 样本ng值依然 达到正常情况的90%。说明试剂盒各个成分在低温保存12个月可以保持稳定。
[0103] 表7试剂盒4°C保存实验
[0105]
[0106] 4. PSEP特异结合抗体与酶标抗体最佳稀释度的选择：
[0107] 选择不同浓度的PSEP特异结合抗体与酶标抗体对检测结果的影响见表8。
[0108] 表8不同浓度PSEP特异结合抗体和酶标抗体的反应结果
[0110] 从表中我们可以看出，当酶标抗体浓度高时，阴性样本0D值偏高，容易导致假阳 性出现；而当酶标抗体浓度在1:5000比例稀释时，阳性样本数值偏低。综合考虑，选择PSEP 特异结合抗体1: 1〇〇稀释，酶标抗体1:2500稀释为好。
[0111] 5.不同孵育时间对检测结果的影响：
[0112] 本实施例比较了三个不同孵育时间对检测结果的影响。发现对阳性样本来说。 37°C孵育2h与lh没有明显差异，p > 0. 05。37°C孵育2h与40分钟相比，有显着差异，p < 0. 05。对阴性样本来说，37°C孵育2h与lh和40分钟之间相比，均无差异，p > 0. 05。故 检测试剂盒的温育时间选择为37°C lh。
[0113] 表9不同孵育时间对结果的影响
[0114] 孵育时间
[0116]
[0117] P :positive (阳性）；N:negative (阴性）
[0118] 6.自配显色剂与上海科华公司显色剂的比较：我们用自配显色剂测出的病人和 正常人样本的0D值均高于外购的上海科华公司显色液测出的0D值，但二者间无统计学差 异，P>0. 05,说明自配的显色液有很好的显色效果。
[0119] 表10自配显色剂与上海科华公司显色剂的比较（0D)
[0121] 从以上结果可以看出前列腺炎患者和对照组正常人尿液中PSEP含量的分布存在 显着性差异，患者样本中检测到的PSEP的浓度明显高于对照组中PSEP的浓度。PSEP外泌 蛋白的检测可以为临床前列腺炎诊断提供一个可靠的根据。同时该试剂盒经过严格的37°C 毁损实验和4°C条件下长时间保存实验，检测结果稳定，符合国家食品药品监督局体外诊断 试剂考核标准。
[0122] 慢性骨盆疼痛综合征/慢性前列腺炎（CPPS/CP)是泌尿科男性就诊主要疾病之 一，更是影响中青年男性健康的常见病。它们是一种不均一性的综合症，定义为"在过去6 个月里至少有3个月骨盆区域不适或疼痛，附带泌尿/生殖系统功能失调"并且没有任何 可鉴别的癌症，感染以及解剖异常病理存在。它们还常常导致消极认知，行为，性，或情绪低 下。另外，癌症基因组景观研究令人信服地证明促癌基因突变从青年时代即已经开始类集。 慢性骨盆疼痛综合征/慢性前列腺炎常见于20~50岁男性，多年以后才会体现前列腺癌 症症状。按照在前列腺癌中，炎症的存在及细胞上皮组织损伤后再生被认为是恶性转化的 关键因素。显然，早期诊治慢性骨盆疼痛综合征/慢性前列腺炎对减少或防治前列腺癌具 有重大意义。
[0123] 目前，慢性骨盆疼痛综合征/慢性前列腺炎诊断主要基于临床经验和症状剔除。 临床检测中没有任何简便可行的分子或免疫方法来用于指导或辅助诊断，导致临床诊断主 观，不准确和误诊。这不仅进一步导致治疗困难，也不利寻找治疗用新药开发。所以，本发 明基于PSEP的尿液检测试剂盒是全球首创的慢性骨盆疼痛综合征/慢性前列腺炎分子免 疫诊断试剂盒，经反应体系的精密度检测，稳定性试验，破坏性检验其试剂质量都显示高度 可批量生产。其应用是真正非侵入性的，易于操作，简便，并且具有高灵敏度和特异性。它 将不仅减轻由于慢性骨盆疼痛综合征/慢性前列腺炎的病者痛苦，而且早期诊治将会进一 步加强对前列腺癌的防治，具有广泛的应用前景。
[0124] 虽然，上面以最佳实施例详细说明了本发明，但本领域技术人员应当知晓，在不偏 离本发明思想和精神的前提下，对本发明做出的任何改进和修饰，仍属于本发明要求保护 的范围之内。
【主权项】
1. 一种前列腺小体外泄蛋白抗原，其特征在于，采用如下方法制备而成： 取500毫升慢性前列腺炎症病人晨尿中段尿，加入等量pH7. 3的HEPES缓冲液和蛋白 酶抑制剂，用纱布过滤；取过滤液分别置于10只50毫升离心管，在4°C低温下400g离心 10分钟，去沉淀，取上清液在4°C低温下10,OOOg离心20分钟，去沉淀，取上清液分别置于 200只3毫升超速离心管，在4°C低温下100,OOOg离心120分钟；倒去上清液，取沉淀加入 2. 5毫升pH7. 8的TBS缓冲液和蛋白酶抑制剂，混匀；在4°C低温下100,000g离心120分 钟，倒去上清液，取沉淀分别溶于2. 5毫升0.5 %NP_40,80mMNaCl, 0.2%Deoxycholate, 50mMTris，pH8. 0和蛋白酶抑制剂；在4°C低温下100,OOOg离心20分钟；取上清液， 上样TSKgelG3000PW，280纳米读数，取在40kDa区域峰值蛋白，-80°C冷冻保存，即得。2. -种前列腺小体外泄蛋白抗原的制备方法，其特征在于， 取500毫升慢性前列腺炎症病人晨尿中段尿，加入等量pH7. 3的HEPES缓冲液和蛋白 酶抑制剂，用纱布过滤；取过滤液分别置于10只50毫升离心管，在4°C低温下400g离心 10分钟，去沉淀，取上清液在4°C低温下10,OOOg离心20分钟，去沉淀，取上清液分别置于 200只3毫升超速离心管，在4°C低温下100,OOOg离心120分钟；倒去上清液，取沉淀加入 2. 5毫升pH7. 8的TBS缓冲液和蛋白酶抑制剂，混匀；在4°C低温下100,000g离心120分 钟，倒去上清液，取沉淀分别溶于2. 5毫升0.5 %NP_40,80mMNaCl, 0.2%Deoxycholate, 50mMTris，pH8. 0和蛋白酶抑制剂；在4°C低温下100,OOOg离心20分钟；取上清液， 上样TSKgelG3000PW，280纳米读数，取在40kDa区域峰值蛋白，-80°C冷冻保存，即得。3. -种与权利要求1所述抗原特异对应的抗体。4. 权利要求1所述抗原和权利要求3所述抗体在制备检测或诊断前列腺癌的试剂盒中 的应用。5. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒采用ELISA法或胶体金法 制备而成。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒包含针对前列腺小体外泄 蛋白抗原的单克隆检测抗体、包被缓冲液、洗涤缓冲液、封闭缓冲液、酶标抗体。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：其特征在于，前列腺小体外泄蛋白抗原检 测抗体为单克隆鼠抗人前列腺小体外泄蛋白抗原的抗体。8. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：其特征在于，还包含标准品和阴性对照； 所述标准品为对前列腺小体外泄蛋白检测抗体产生免疫反应的人前列腺小体外泄蛋白抗 原。9. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述包被缓冲液为碳酸盐或dPBS;所述 洗涤缓冲液为含洗涤剂的dPBS。10. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述检测抗体识别前列腺小体外泄蛋 白抗原。
【专利摘要】本发明涉及一种前列腺小体外泄蛋白抗原、与其特异对应的抗体及应用，并以此为基础进一步得到基于前列腺小体外泄蛋白定量的间接酶联免疫吸附的试剂盒，以有效用于检测和诊断慢性前列腺炎。该基于PSEP抗体-抗原反应的尿液检测试剂盒经反应体系的精密度检测，稳定性试验，破坏性检验其试剂质量都显示高度可批量生产。其应用是真正非侵入性的，易于操作，简便，并且具有高灵敏度和特异性。它将不仅减轻由于慢性骨盆疼痛综合征/慢性前列腺炎的病者痛苦，而且早期诊治将会进一步加强对前列腺癌的防治，具有广泛的应用前景。
【IPC分类】G01N33/577, G01N33/68
【公开号】CN104897900
【申请号】CN201410074972
【发明人】钱泽, 陆群, 曾燕, 张娇
【申请人】昂科生物医学技术(苏州)有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月3日
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